Akut Beyin Dilimleri nöronal Mikro şemalar Elektrofizyolojik ve Morfolojik Karakterizasyonu Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıtlar Kullanma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, morfolojik olarak tanımlanmış nöronlar arasındaki sinaptik bağlantıların hem işlevsel hem de yapısal olarak nasıl karakterize edildiğini göstermektir. Bu, belirli bir sinaptik bağlantıyı incelemek için optimize edilmiş akut beyin dilimleri elde edilerek elde edilir. Yama klempleme daha sonra sinaptik olarak eşleşmiş nöronları test etmek için kullanılır.

Bunun için, bireysel bir prospektif post-sinaptik nöron yamalanır ve daha sonra sinaptik bir bağlantının varlığını belirlemek için çevredeki nöronları uyarmak için ikinci bir pipet kullanılır. Herhangi bir yanıt görülmezse, uyarıcı elektrot hareket ettirilir. Bir bağlantı bulunduğunda, presinaptik nöron toptan satış modunda yeniden eşleştirilir.

Bu nöronlardan alınan elektrofizyolojik kayıtlar ve eş zamanlı biyotin dolgularını takiben dilim sabitlenir, biyotin için işlenir ve nöronların bilgisayar destekli 3 boyutlu rekonstrüksiyonları yapılır. Sonuç olarak, yöntemimiz nöronal mikro devrelerin ilişkili kantitatif yapısal ve fonksiyonel analizini amaçlamaktadır. Sinaptik olarak eşleşmiş nöronlardan eşleştirilmiş kayıtların ana avantajı, nöronal mikro devrelerde hem sinaptik öncesi hem de postsinaptik nöronların ilişkili yapısal ve fonksiyonel analizini yapabilmemizdir.

Daha da yakın zamanlarda, nöronların optik stimülasyonu gibi tanıtılan teknikler şimdiye kadar bunu çok ayrıntılı bir şekilde başaramamıştır. Bu yöntem, morfolojik olarak tanımlanmış nöron tiplerinin uyarılma ve inhibisyonu etkileşimlerinin ve aktivitenin nasıl modüle edildiğinin incelenmesini sağlar. Evcil hayvan kayıtları için prosedürleri gösteren Guan olacaktır.

Laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan o. Hedef bölgenin dilimlerini hazırladıktan sonra, bu süre zarfında inkübe etmelerine izin verin, uzun ve ince bir sapa sahip olması gereken yama pipetlerini çekin. Bir deney odasında bir beyin dilimini platin arp ile sabitledikten sonra, bir kayıt pipetini dahili çözelti ile doldurun.

Pipeti ön amplifikatöre yerleştirin ve potasyum tuzlarının sodyum tuzları ile değiştirildiği dahili bir çözelti ile doldurulmuş sekiz ila 10 mega ohm dirençli bir arama yaması pipeti kullanarak tüm hücre modunda varsayılan bir sinaptik sonrası nöronu yamalayın. Gevşek bir hücrede potansiyel bir presinaptik nöronu yamamak için arama pipetine hafif emme uygulayın. Ekli yapılandırma.

Akım kelepçesi modunda gevşek conta altındaki membran potansiyelini eksi 30 ile eksi 60 milivolt arasında tutun. Ardından, potansiyel presinaptik hücrede bir aksiyon potansiyeli ortaya çıkarmak için 0.2 ila iki nano amperlik büyük akım darbeleri uygulayın. Bu aksiyon potansiyelini voltaj tepkisi üzerinde küçük bir spikelet olarak gözlemleyin.

Postsinaptik yanıtın bozulmasını önlemek için stimülasyon frekansını 0.1 hertz'e ayarlayın. Postsinaptik nöron, test edilen potansiyel olarak presinaptik nöron yamasının uyarılmasına yanıt vermezse, gevşek sızdırmazlık modunda yeni bir potansiyel presinaptik nöron. Bu şekilde 30'a kadar potansiyel presinaptik nöronu test edin.

30 mega ohm'dan daha büyük dirence sahip bir conta oluşturulabildiği sürece aynı arama yaması elektrodu kullanılmaya devam edilebilir. Gevşek sızdırmazlık modunda stimülasyon, postsinaptik nöronda beş milisaniyeden daha az gecikme süresine sahip bir EPSP veya IPSP ile sonuçlanırsa, dört ila sekiz mega ohm'luk bir dirence sahip düzenli iç çözelti içeren biyotin ile doldurulmuş bir kayıt yama elektrodu kullanarak presinaptik nörondan arama pipetini çıkarın. Presinaptik nöronu yamalayın ve tüm hücre akımı kelepçe modunda kaydedin.

Presinaptik nöronlarda akım enjeksiyonu ile aksiyon potansiyellerini ortaya çıkarın ve postsinaptik yanıtı kaydedin. Verileri daha sonra çevrimdışı analiz etmek için bir bilgisayarda depolayın. Kayıt boyunca, biyotin yeterli boyama elde etmek için nörona yayılır.

Nöronun boyutuna bağlı olarak biyotinin en az 15 ila 30 dakika yayılmasına izin verin. Yüksek bağlantı oranına sahip nöronal mikro devreler için bir arama elektrodu kullanılmaz. Bunun yerine, tüm hücre modunda doğrudan bir presinaptik nöronu yamalayarak başlayın.

Daha sonra, tüm hücre modunda da potansiyel bir postsinaptik nöron olan düzenli iç çözelti yaması ile doldurulmuş bir yama elektrotu kullanılarak, her iki hücre de akım kelepçesi kontrolü altında olmalıdır. Presinaptik hücrede bir aksiyon potansiyeli ortaya çıkarın ve postsinaptik potansiyel için prospektif postsinaptik nöronu izleyin. Nöron presinaptik stimülasyona bir yanıt göstermezse, tüm hücre modunda tekrar yeni bir nöronu yamalamak için yeni bir elektrot kullanın.

Bir bağlantı bulunduğunda, yama pipetini değiştirmeden daha önce gösterildiği gibi kayda devam edin. Dilimleri metin protokolünde anlatıldığı gibi sabitleyip monte ettikten sonra, biotin etiketli nöronları ışık mikroskobu altında inceleyin. Aksonal copların ve dendritik dikenlerin açıkça görülebildiğinden emin olun.

Ticari bir nöron izleme sistemi kullanarak, nöronları veya sinaptik olarak eşleşmiş nöron çiftlerini manuel olarak izleyin. Küçük aksonal veya dendritik teminatları bile dahil ettiğinizden emin olun. 3B nöronal rekonstrüksiyonları elde etmek için izleri kullanın, izleme programının uygun bölümünde üç uzamsal boyutta da büzülme için nöronal rekonstrüksiyonları düzeltin.

Gömme ortamı için büzülme düzeltme faktörleri, x ve y yönleri için yaklaşık 1,1 ve Z yönü için yaklaşık 2,1'dir. Dikenli bir yıldız ve nörona hızlı bir şekilde yayılan karşılıklı olarak bağlanmış bir hücre çifti. Kortikal tabakada dördüncü kısım biotin ile doluydu.

Kayıt sırasında, yeşil noktalar, pre-sinaptik dikenli nöron ile post-sinaptik inter nöron arasındaki varsayılan uyarıcı sinaptik temasları gösterir. Mavi noktalar varsayılan karşılıklı inhibitör sinaptik temasları gösterir. Sinaptik kontakların yüksek güçlü görüntüleri burada gösterilmektedir.

Yeşil açık daireler uyarıcı temasları gösterir ve mavi açık daireler inhibitör temasları gösterir. Karşılıklı olarak bağlı bu hücre çiftinin nöro berrak bir rekonstrüksiyonu burada gösterilmiştir. İnter-nöronlar akson mavi renkle, soma ve dendriti ise kırmızı renkle gösterilmiştir.

Dikenli nöronlar akson yeşil renkte, soma ve dite ise beyaz renktedir. İç kısım, pre-sinaptik nöronların somato dendritik bölmelerini gösterir. Varsayılan sinaptik temaslarla birlikte, akut beyin diliminden yapılan düşük güçlü parlak alan fotoğraf mikrograflarında namlu konturları tanımlandı.

Çok düşük bir bağlantı oranına sahip temsili bir sinaptik bağlantı burada gösterilmiştir. Altıncı katman parametal hücredeki bir presinaptik aksiyon potansiyeli, bir katman dört yıldızlı parametal nöronda bir monos sinaptik uyarıcı postsinaptik potansiyel uyandırdı. Bu trans laminer bağlantının burada gösterilen üç milisaniyeden fazla gecikmesi, yerel intra laminer bağlantılarda gözlemlenen yaklaşık bir milisaniyelik gecikmeden çok daha uzundur.

Altıncı katman parametal hücresinde ortaya çıkan 10 hertz'de iki aksiyon potansiyeli, burada gösterilen katman dört yıldızlı parametal nöronunda post-sinaptik potansiyelleri tetikledi. Kısa vadeli kolaylaştırmaya dikkat edin. Eğik çizgi koşulunun belirli bir sinaptik bağlantı için optimize edilmesi gerektiğini ve kayıt sırasında kurulumun kesinlikle kararlı olması gerektiğini ve ardından optimum kayıt anlayışının garanti edildiğini hatırlamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, neokorteksteki nöronal mikro devrelerin yapısal ve işlevsel özelliklerinin genel bir resmini elde etmek için elektrofizyolojik ölçümlerin ve morfolojik rekonstrüksiyonların nasıl kullanıldığını iyi anlamış olmalısınız.