Name: Akut Beyin Dilimleri nöronal Mikro şemalar Elektrofizyolojik ve Morfolojik Karakterizasyonu Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıtlar Kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Öğrenin akut beyin dilimlerinde eşleştirilmiş patch-kelepçe kayıtları kullanarak sinaptik bağlantıların elektrofizyolojik ve morfolojik karakterizasyonunu. Bu yöntem nöronal mikrodevreleri yapısal ve fonksiyonel olarak analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nörobilim ve Tıp Enstitüsü, INM-2, Jülich Araştırma Merkezi'ndeki 'Nöronal Mikro Devrelerin İşlevi' Grubunun tüm üyelerine ve Psikiyatri, Psikoterapi ve Psikosomatik Bölümü, Tıp Fakültesi, JARA, RWTH Aachen Üniversitesi'ndeki 'Kortikal Mikro Devrelerin İşlevi' Grubuna verimli tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Barrel Cortex Function (BaCoFun) üzerine DFG araştırma grubu tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneysel prosedürler Hayvanları Koruma, Alman Hayvan Refahı Yasası AB Direktifi (Tierschutzgesetz) ve Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Derneği Federasyonu Kurallarına uygun olarak yapılmıştır. Elektrofizyoloji 1. Set-up Eşleştirilmiş kayıt başlamadan önce, bir elektrofizyoloji set-up inşa edilmelidir. Böyle bir set-up aşağıda verilmiştir monte nasıl kısa bir anahat: <ol><li> Mikroskop, manipülatörler ve diğer tüm ekipmanlar alınacaktır hangi bir anti-titreşim tablo takın. NOT: Titreşim veya hareketin başka türlü bu (kayıt elektrot yerine arama elektrot) pipetler bir değişiklik gerektirdiğinden sinaptik bağlantıları kayıt yaparken mümkün olduğunca küçük olması gerekir. </li><li> Elektriksel gürültü azaltmak için titreşim önleyici masa etrafında bir Faraday kafesi yerleştirin. Faraday ca içindeki tüm donanımları bağlayınelektrik zemine ge. </li><li> Üreticinin yönergelerine göre anti-vibrasyon masaya bir motorlu xy tablosuna dayalı bir motorlu odak ekseni ile bir mikroskop takın. Bu güvenilir o neokortekste translaminar bağlantıları olduğu gibi aynı görüş alanında olmayan nöronlar için mikroskop hareket etmesine olanak sağlar. </li><li> Mikroskop kamera bağlantı noktasına bir video kamera takın ve dilim hazırlanması ve elektrotların hareketini gözlemlemek ve / veya dijital ekranları analog bağlayın. Sinaptik birleştiğinde nöronal hücre çiftinin, sırasıyla, bir düşük ve bir bakış elde etmek için yüksek-güç büyütme ve yakın çekim görüntü arasında geçiş olabilir, bir kamera kullanın. Bu aynı zamanda yama elektrot hareketini kontrol etmeye yardımcı olur. </li><li> Banyo odası için bir girinti içeren bir örnek tablo kurun beyin dilim hazırlanması için (bir Perspex bloğundan in-house delinmiş). Bu örnek tablo bağlı olmamalıdırmikroskop, yani hava masaya tespit edilmelidir ve mikroskop altında manevra kabiliyeti olmalıdır. </li><li> Montaj iki (veya gerekirse daha fazla) her üç boyutta hareket ettirilebilir yüksek hassasiyetli mikromanipülatörler. Manipülatörler yama-kelepçe pre-amplifikatör takın ve ana amplifikatör bağlayın. NOT: Gerekli ek manipülatörler, örneğin için ikiden fazla ön amplifikatörler, hücre dışı uyarım elektrotları, ilaç-taşıyıcı sistemleri, vb monte edilebilir ise </li><li> Numune tablosunda banyo odasına yerleştirin. Bir çözüm girişi yükleyin ve çıkış ve perfüzyon sistemine bağlayın. </li><li> / Dakika uygun dilim canlılığı için 6 ml - 4 arasında sabit bir akış hızında (Tablo 1 ACSF) yapay beyin-omurilik sıvısı ile kayıt odasının perfüzyon muhafaza edilmesi için bir peristaltik pompa kullanılır. NOT: ASCF türbülans ve dilim dolayısıyla hareketi neden olur ölçüde bu akış hızını aşmayın. </li&gt; <li> Örnek masaya sıcaklık probu ve Ag / AgCl elektrot zemin için sahipleri yükleyin. Bu bölme içinde banyo örnek prob ve elektrodu izin vermek için gereklidir. </li><li> Dilim hazırlık nöronların iyi bir görünürlük için mikroskop kızılötesi aydınlatma kullanın. Bu nedenle ışık dağılmasını ve görüntü bulanıklığı azaltır. Mikroskop &#39;3D&#39; gibi görselleştirme ulaşmak için diferansiyel girişim kontrast optik ile donatılmış olduğundan emin olun. Bu nöronlar yama yardım ve dilim (60 mm veya daha derin) derin nöronları hedef sağlayacaktır. </li><li> Deneme sırasında, altta bir cam lamel ile deneysel odasında beyin dilimleri tutmak. Yüzen dilim önlemek için dilimin üstüne bir &#39;platin arp&#39; koyun. Bir platin harp yapıştırılmış diş ipi ip ile U-şeklinde düzleştirilmiş platin telden yapılır. </li><li> Opt sağlamak için 35 ° C - 32 arasındaki bir sıcaklıkta dilim perfüze ACSF tutunoksijenlenme ve pH proksimal kontrolü. Bu banyo odasına ACSF girişi yakın yüklü Peltier cihazı ile çözüm ısıtarak yapılabilir. NOT: ultra ince kapak yüksek sayısal açıklık ve kısa çalışma mesafesi bile mikroskop kondansatörler numune üzerinde odaklanmış böylece kayıyor. Bu dilim optimal aydınlatma gereklidir. Bir görüntü ve beyin dilim hazırlık eşleştirilmiş kayıtları için optimize bir elektrofizyoloji set-up açıklaması için Ref. 34 Şekil 4&#39;e bakınız. </li></ol> 2. Beyin Dilim Hazırlık <ol><li> Hafif beyin dokusu izofluran (nihai konsantrasyon &lt;% 0.1) ile alınmalıdır hangi hayvan uyutmak. Not: diğer anestetikler de kullanılabilir. Anestezi kullanımı, ilgili hayvan komitenin önerileri ve kurallara uymalıdır. Her zaman hayvan ekledikten sonra tahriş ya da stres altında olmadığından eminanestezik. </li><li> , Hayvan decapitate kafatası açın ve Refs açıklanan prosedür. 34,35 kullanarak mümkün olduğunca çabuk beyin kaldırmak. </li><li> % 95 O2 ve% 5 CO2 ile karbojen gazı karışımı ile gazlı soğutulmuş (4 ° C), yapay beyin-omurilik sıvısı içine beyin aktarın. </li><li> Incelenmesi gereken bir beyin bölgesini izole edin. NOT: parametreler optimum koruma ve dendrit öncesi ve postsinaptik nöronların akson minimal kesme elde etmek için soruşturma altında her nöronal bağlantı ve gelişim aşaması için önceden tespit edilmelidir. Optimal disseke beyin dilim, presinaptik nöron akson dilim yüzeyine paralel olması gerekli değildir. Aksine, onlar sığ bir açı ile dilimler halinde işaret etmelidir. postsinaptik piramidal nöronların apikal dendrit için geçerlidir; Bu ışık mikroskobu altında kontrol edilmelidir. Bu yerel olmayan ya da t için özellikle önemlidirranslaminar sinaptik bağlantıları, yani. öncesi ve postsinaptik somata fazla 200 mikron ayrı ve dendritik ve aksonal kesikler olasılığı yerel bağlantıları için önemli ölçüde daha yüksek olması muhtemeldir nerede. </li><li> Mikrotom odasına beyin aktarın. Ampirik bulgulara dayanarak, farklı hücre dışı dilimleme çözümleri hayvanın yaşına bağlı olarak kullanılmaktadır (; yararlı bilgiler de &#39;altında bulunabilir Tablolar 2 ve 3 bkz <a href="http://www.brainslicemethods.com/" target="_blank">http://www.brainslicemethods.com/</a> &#39;). </li><li> Hedef bölge görünür kadar beyin Trim. </li><li> Hayvan olgun olup olmadığını (3 hafta&gt;) 400 mikron kalınlığında beyin dilimleri - İyi bir hücre görünürlüğü ile dilimler elde etmek için, 300 kesti. Büyük ölçüde zarar hücre visib olmadan 800 mikron - Hayvan (1 2 st nd fareler ve sıçanlar için doğum sonrası hafta) dilimleri olgunlaşmamış ise ~ 600 kalınlığa kadar kesilebilirility. NOT: Bu &#39;olgunlaşmamış&#39; dilim istikrarı geliştirmek ve uzun menzilli dendritik ve aksonal teminatların olası kesikler sayısını azaltacaktır. </li><li> % 95 O2 ve% 5 CO2 karışımı ile gazlı dilimleme çözeltisi ile doldurulmuş bir inkübasyon odasına mikrotom bölmeden dilimleri aktarın. Deney türüne bağlı olarak, oda sıcaklığında ya da ~ 30 ° C de ya da en azından 30 dakika ila 1 saat boyunca inkübasyon odası içinde dilimleri tutun. </li></ol> 3. Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıt ve Biocytin Dolum Sinaptik bağlantı türüne bağlı olarak üç farklı yaklaşım sinaptik birleştiğinde nöronlar bulmak için kullanılır. (En uyarıcı bağlantıları için beklendiği gibi) bağlantı olasılığı düşüktür, aşağıdaki gibi devam edin: <ol><li> Düşük bağlantı ile Nöronal bağlantıları <ol><li> Listelenen bileşimin bir iç çözeltisi ile yama pipet doldurunTablo 4 &#39;de bütün hücre konfigürasyonunda yer alan kayıtlar için 3 arasındaki konsantrasyonlarda biocytin ekleyin -. öncesi ve postsinaptik nöronların iyi boyama sonuçları elde etmek için, iç (pipet) çözeltisine 5 mg / ml. (Nöron boyutuna bağlı olarak), 30 dakika - en az 15 için hücre içine yaygın biocytin olsun. NOT: Aşağıda belirtilen &#39;arama&#39; pipetler kullanılan çözüm biocytin katmayın. </li><li> Tam hücreli modunda varsayılan bir postsinaptik nöron yama. Uzun ve ince saplı yama pipetler kullanın. Bu hedef kapsamında pipet manevra kolaylaştırır ve elektrot dilim tanıtıldı oluşabilecek hareket eserler azaltır. </li><li> 10 MΩ direnci ve küçük bir ipucu çapı - Sonra, 8 bir &#39;arama&#39; yama pipet kullanarak bir hücre-bağlı yapılandırmada bir potansiyel presinaptik nöron yama. Bu pipetler ile &#39;gevşek&#39; hücre-bağlı yama kurmak. Fill K + presinaptik bir hücre için arama süresince nöronlar depolarize vermemek için, Na + (Tablo 5) ile ikame edildiği bir iç çözelti ile &#39;arama&#39; pipet. NOT: &#39;gevşek&#39; mühür direnci GΩ aralığında değil ama genellikle etrafında 30-300 MΩ. </li><li> Mevcut kelepçe modunda yaklaşık -30 mV -60 ila &#39;gevşek&#39; mühür altında membran potansiyelini tutun. Potansiyel presinaptik hücrede bir aksiyon potansiyeli ortaya çıkarmak için - (2 nA 0.2) Sonra, büyük akım darbelerini geçerlidir. Gerilim tepkisi üzerine küçük bir tane sayısı olarak bu eylem potansiyeli dikkate alınmalıdır. </li><li> Bir postsinaptik yanıt halsiz önlemek için 0.1 Hz stimülasyon frekansı ayarlayın. Beyin dokusu çok olgunlaşmamış ya da sinaptik bağlantı çok güvenilir olmaması halinde alt stimülasyon frekansları kullanın. </li><li> Durumda &#39;postsinaptik&#39; nöron test &#39;presinaptik&#39; neu uyarılmasına yanıt vermiyorron, &#39;gevşek&#39; mühür modunda yeni bir nöron yama. 30 MΩ kurulan&gt; bir direnç ile mühür sürece &#39;arama&#39; yama elektrot yerine etmeyin. Bu şekilde 30 potansiyel presinaptik nöronlara kadar test edin. NOT: gevşek yama kelepçe ile arama işlemi sırasında nöron zarar vermemek için, sadece hafifçe emiş tüm hücre yama pipet uygulanan karşılaştırıldığında arama pipet uygulanmalıdır. </li><li> Bir gecikme ile bir EPSP / iPSP içinde &#39;gevşek&#39; mühür modu sonuçlarında stimülasyon &lt;postsinaptik nöron 5 msn presinaptik nörondan &#39;arama&#39; pipet çıkarın. </li><li> Biocytin içeren, düzenli iç solüsyonu ile dolu bir yama elektrot ile &#39;arama&#39; yama pipet değiştirin. Bu kayıt yama pipet olun 4 bir dirence sahiptir - 8 MΩ; elektrot direnci olabilir alt soma boyutunu daha büyük. </li><li> Presinaptik PatchBütün hücre, akım-kelepçe modunda nöron ve kayıt. Presinaptik nöronlar mevcut enjeksiyon yoluyla aksiyon potansiyelleri ortaya çıkarmak ve postsinaptik yanıt kaydedin. Daha sonra off-line analiz için bir bilgisayarda veri depolamak. </li></ol></li><li> Yüksek bağlantısı ile Nöronal bağlantıları NOT: Bir yüksek bağlantı oranı (&gt;% 30) ile nöronal microcircuits için sinaptik bağlantıları bulmak için farklı bir prosedür kullanın. Bu prosedür aşağıda özetlenmiştir ve sık sık uyarıcı bağlantıları 36 daha ortalama bir yüksek bağlantı oranı var inhibitör sinaptik bağlantı için kullanılır. Bağlantı oranı bu değerin altına düştüğünde bu kullanılmamalıdır. <ol><li> Tam hücreli modunda doğrudan bir presinaptik nöron yama. Sonra, bir potansiyel postsinaptik nöron yama aynı zamanda tüm hücre modunda. Her iki hücreler mevcut kelepçe kontrol altında olmalıdır. Presinaptik hücrede bir aksiyon potansiyeli Elicit. Bir postsy için prospektif postsinaptik nöron Monitörnaptic potansiyeli. </li><li> Durumunda nöron, presinaptik uyarısına yanıt gösteriyor düzenli iç çözeltisi ile dolu bir yama elektrodu kullanarak bütün hücre modunda yeni bir nöron yama değil. Bir bağlantı bulunursa, yama pipet değiştirmek ancak kayıt ile devam etmeyin. Sonra, adım 3.1.9 gibi devam edin. </li></ol></li><li> Gap-junction aracılığıyla Nöronal bağlantıları NOT: Elektrik (boşluk-kavşak) bağlantıları aramak için düşük olasılık bağlantıları için kullanılan bir değiştirilmiş versiyonu aşağıdaki yordamı kullanın. <ol><li> Bütün hücre yama kenetleme konfigürasyonunda bulunan bir sinaptik sonrası nöronu yama. </li><li> 10 MΩ direnç - 7 bir &#39;arama&#39; yama pipet kullanarak - Daha sonra, gevşek-mühür yapılandırmasında varsayılan bir presinaptik nöron (300 MΩ 30 düşük mühür direncini) yama. Bu pipet gevşek mühür uyarılması için modifiye yüksek Na + iç çözümü ile dolu olmalıdır. </li><li> Inject 100-300 msn &#39;gevşek&#39; mühür üzerinden uzun hiperpolarizan akım darbeleri; pipet komut potansiyeli yaklaşık -60 mV -70 ayarlanmış olmalıdır. &#39;Postsinaptik&#39; nöron küçük hiperpolarizan yanıt bu uyarım sonuçları ise bir boşluk kavşak bağlantısı gözlemleyin. </li><li> Bütün hücre modunda &#39;presinaptik&#39; nöron Repatch ve yukarıda tarif edildiği gibi devam edin. NOT: akson ve dendritik süreçlerin iyi bir boyama sağlamak aşağıda verilen protokolünü kullanmak için. Bu protokol, aşağıda kısaca tarif edilmektedir, bununla birlikte, laboratuvarda kullanılan histokimyasal işleme ayrıntılı protokol Ref verilmiştir. 37. </li></ol></li></ol> 4. Histokimyasal İşleme <ol><li> 0.1 M fosfat tampon içinde çözülmüş% 4 paraformaldehid içeren ufak bir şişede sinaptik bağlanmış nöronların çifti ile beyin dilim aktarın ve 24 saat süre ile dilim sabitleştirmek. Elektron mikroskobu için,% 2.5 Glutaraldehit kullanılarak dilim sabitleşmekaldehit ve% 1 paraformaldehit. </li><li> Bir sonraki gün, herhangi bir fiksatif ihtiva eden normal fosfat tampon maddesi içine dilim aktarın. 10 8 kat - - 6 fosfat tamponu ile dilimleri yıkayın 15 dakika her aşırı Fiksatif kaldırmak için. </li><li> Endojen peroksidaz reaksiyonu en aza indirmek için% 3 H 0.1 M fosfat tamponu içinde 2 O 2 çözeltisi, 20 dakika boyunca inkübe dilimleri. Güçlü kabarcık oluşumunu gözlemlemek. Başka bir kabarcıkları üretilir kadar reaksiyon devam edin. Kalan H 2 O 2 kaldırmak için (10 dakika her biri için) 8 kat - Sonra, 6 0.1 M fosfat tamponu dilimleri durulayın. </li><li> Immünositokimyasal ve kromojenik reaksiyon Biocytin doldurulmuş nöronların Görselleştirme diaminobenzidin ile katalize edilen bir streptavidin-biyotinlenmiş yaban turpu peroksidaz reaksiyona dayanır; Bu bir yüksek uzaysal çözünürlüğü ile net bir leke üretir karanlık bir çökelti oluşturur. Aşağıdaki prosedürler, kromojenik reaksiyon için kullanılır: &lt;ol&gt; <li> Imalatçının protokolüne göre ABC çözeltisi hazırlayın. (, Sadece ışık mikroskopi için Tablo 6) ve karanlıkta 30 dakika boyunca solüsyon tutmak 150 ul% 10 Triton X100 ile takviye 14.55 ml fosfat tampon maddesi ekleyin. Bu çözüm O&#39;da / N kullanımdan önce dilimleri inkübe. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat süre ile bir çalkalama düzenine ve karanlıkta ABC çözeltisi dilimleri inkübe edin. Daha sonra, bir buzdolabında 4 ° C&#39;de dilimleri O / N tutun. Ertesi sabah, bir saat daha oda sıcaklığında dilim inkübe edin. </li><li> Bundan sonra, fosfat tampon maddesi içinde 10 dakika için her dilimleri en az dört kez yıkayın. Daha sonra, bir nikel-yoğun 3-3&#39;-diaminobenzidin çözeltisi (Tablo 7), 2 ml karanlıkta 30 dakika süreyle bir çalkalayıcı içinde inkübe edilir. Diaminobenzidini taşıma ve sadece davlumbaz altında kullanırken çok dikkatli olun; bile çok düşük konsantrasyonlarda son derece kanserojen. </li><li> 6.5 ul% 3 H 2 O 2 Ekle diaminobenzidinin içerenÇözelti. Kahverengi-siyah lekeli nöronlar açıkça görülebilir kadar ışık mikroskobu altında kromojenik reaksiyonu izleyin. Daha sonra, fosfat tampon maddesi içinde bir kaç kez yıkanmasıyla dilimleri hemen reaksiyonu durdurun. </li><li> Yapıştırıcı, silan kaplı Histobond veya jelatinize standart nesne slaytlar üzerinde lekeli nöronlar Mount dilimleri. </li><li> En az% 80 nem O / N oranı ile bir nemli oda içinde slaytlar tutun. Ertesi gün, dilimler hava ile kurutulur, bir 10 dakika daha sürdü. Bunları kurutmak amacıyla, - (% 100 20), etanol içinde artan konsantrasyonlarda çözelti içinde transfer slaytlar gömme önce. NOT: dehidrasyon işlemi aksi dendritik ve aksonal süreçlerde çarpıtmalar 37 meydana gelme olasılığı yavaş olmalıdır. Alternatif bir gömme işlemi seçilirse, örneğin gliserol bazlı Moviol olan, bir dehidrasyon gerekli değildir; Ancak bu nedenle homojen olmayan bir dilim sıkıştırma ve çarpıtılmış nöronal morfolojik sonuçlanması muhtemeldirgy. </li><li> Son olarak, ksilolde 10 dakika inkübe ışık mikroskobu için bir hidrofobik gömme orta dilim embed ve üstünde ultra-ince lamelleri yerleştirin. Slaytlar, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca kurumasına izin verin. </li></ol></li></ol> 5. Nöronal İmar ve Synaptic İletişim Yerelleştirme <ol><li> 60X / 100X immersiyon yağı objektif ve optimal uzamsal çözünürlük için yüksek sayısal diyafram ile Yoğuşturuculu bir ışık mikroskobu altında biocytin-etiketli nöronlar ile slaytlar inceleyin. Bu akson BOUTONS olun ve dendritik dikenler açıkça görülebilir. </li><li> Sistemi izleme ticari bir nöron kullanılarak nöronlar veya sinaptik birleştiğinde nöron çiftleri Trace 3D nöronal rekonstrüksiyon elde etmek için (Belirli Malzemeleri / Ekipman Tablo). Hatta küçük aksonal veya dendritik teminat tespit etmek için sürekli görsel denetim altında elle izleme yürütmek. Sinaptik birleştiğinde nöronlardan eşleştirilmiş kayıtları için manuel izleme hala yöntemseçim, örneğin, öncesi veya postsinaptik nöronun ya bir aksonal profilin atıf önemli imar deneyim gerektirir çünkü. </li><li> Gerekirse, aksonal boutons ve / veya dendritik dikenler sayılarını yapmak. Dikenler ya da omurga alt tipleri ve aksonal boutons örneğin, kortikal katmana veya alana göre belirli bir dağılım ve yoğunluk gösterebilir, çünkü bu nöronal hücre tiplerini karakterize yardımcı olabilir. </li><li> Sinaptik birleştiğinde nöron çiftleri için, mümkün olan en yüksek büyütmede yakın apozsiyonları için presinaptik akson ve dendrit postsinaptik kontrol edin. Bir akson bouton gözlemleyin ve bir postsinaptik dendritik omurga ya da şaft farazi bir sinaptik temas olarak kabul edilebilir aynı odak düzlemi olduğunu. Yeniden bu kişiyi işaretleyin. </li><li> Izleme programının uygun bölümünde üç mekansal boyutta küçülme için nöronal rekonstrüksiyon düzeltin. NOT: fiksasyon sırasında, histokimyasal işlemeve dehidratasyon önemli mekanik deformasyon ve daralma meydana; Bu akson ve dendritik uzunluğu ölçümleri etkileyebilir ve ciddi mekansal düzenleme deforme olacaktır. Gömme ortamı için Küçülme düzeltme faktörleri z-doğrultusunda 37 ~ x ve y yönlerinde için 1.1 ve 2.1 ~ vardır. </li><li> Kantitatif morfolojik analiz için (Belirli Malzemeleri / Ekipman Tabloya bakınız) nörofizyolojiye için bir veri analizi programı kullanın. </li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Sinaptik birleştiğinde eksitatör ve / veya inhibitör nöronlar Eşli kayıtlar nöronal microcircuits çalışma için çok yönlü bir yaklaşım vardır. Sadece bu yaklaşım bir nöron tipleri arasındaki sinaptik bağlantı tahmin izin değil, aynı zamanda bağlantı öncesi ve postsinaptik nöronların morfolojisi fonksiyonel özelliklerinin belirlenmesi veriyor etmez. Ayrıca, agonist ve / veya antagonist kolayca slice preparatlarda nöronlara uygulanabilir. Bu bir örnek için, sinaptik iletim 32 özellikleri kullanılarak veya bir ta...

İki sinaptik birleştiğinde nöronlar arasındaki Nöronal yongalar beyinde büyük ölçekli ağların yapı taşlarıdır ve sinaptik bilgi işleme temel birimleridir. Bu tür nöronal microcircuits karakterizasyonu için bir önkoşul morfolojisi öncesi ve postsinaptik nöronların ortağı hem de fonksiyonel özelliklerini, sinaptik bağlantı (lar) ve yapısı ve fonksiyonel bir mekanizma türü bilmektir. Bununla birlikte, sinaptik bağlantıların pek çok araştırmada, bir mikrodevre nöronların en az bir iyi anlaşılamamıştır. Bu genellikle sinaptik bağlantı çalışmalarda kullanılan nispeten belirsiz stimülasyon protokolleri kaynaklanır. Bu nedenle, presinaptik nöronların yapısal ve fonksiyonel özellikleri ya hiç ya da sadece oldukça küçük bir ölçüde tespit edilmemiş (yani, işaretleyici proteinlerin sentezlenmesi, vb). Belirteçler s tarafından hücre içi boyama ile birlikte eşleştirilmiş kayıtlarıbiocytin, neurobiotin ya da floresan boyalar gibi bakanın küçük nöronal mikro devreler çalışmak için daha uygundur. Bu teknik, tek, aynı zamanda, bir morfolojik olarak belirlendi sinaptik bağlantı pek çok yapısal ve işlevsel parametreleri incelemek sağlar. İki nöron arasındaki sözde &#39;üniter&#39; monosinaptik bağlantıları akut dilim hazırlıklarını kullanarak hem kortikal ve subkortikal beyin bölgelerinde 1-10 araştırılmıştır. Başlangıçta, sert Mikroelektronlar, bu deneylerde kullanıldı; Daha sonra, yama kelepçe kayıt daha düşük bir gürültü seviyesi ve geliştirilmiş zamansal çözünürlüğe sahip sinaptik sinyallerin kayıtları elde etmek için kullanılmıştır. Bir önemli teknik ilerleme kızılötesi diferansiyel girişim kontrast (IR-DIC) optik 11-14, önemli ölçüde mümkün t oldu böylece beyin dilim nöronlar görünürlüğünü ve kimlik geliştirilmiş bir mikroskobik tekniği kullanılması olduo görsel tespit sinaptik bağlantıları 15-17 kayıtları edinin. Genel olarak, eşleştirilmiş kayıtlar akut dilim hazırlıkları yapılır; Sadece çok az yayın vivo 18-20 sinaptik bağlı nöronların temin raporlama kayıtları vardır. eşleştirilmiş kayıtların en önemli avantajı fonksiyonel karakterizasyonu ışık ve elektron mikroskobik düzeyde hem de bir morfolojik analizi ile kombine edilebilir olmasıdır (örneğin bkz., 7,16,21). Histokimyasal işleme sonra, sinaptik bağlı nöron çiftinin dendritik ve aksonal morfoloji izlenir. Daha sonra, bu parametreler daha sonra, belirli bir sinirsel bağlantının objektif sınıflandırılması için bir temel teşkil edebilir vs. uzunluk, uzamsal yoğunluğu, yönlendirme, dallanma modellerinin gibi morfolojik özelliklerini ölçmek mümkündür. Ayrıca, nöronal bağlant çalışmak için kullanılan en başka tekniklerle aksinevite, eşleştirilmiş kayıtları da üniter sinaptik bağlantıları için sinaptik temasların tanımlanmasına izin. Bu ışık ve elektron mikroskobu 16,21-27 bir arada kullanarak veya dendritik dikenler kalsiyum görüntüleme 28,29 ile doğrudan yapılabilir. Ancak, ikinci yaklaşım ile sadece uyarıcı değil inhibitör bağlantıları ele alınabilir o postsinaptik reseptör kanalları üzerinden kalsiyum girişini gerektirir. Tanımlanmış bir nöronal mikrodevreli eşleştirilmiş kayıtları sinaptik iletim ayrıntılı bir analiz ek olarak sinaptik plastisite kuralları 30,31 çalışma izin veya örneğin - asetilkolin 32 ve adenozin gibi nörotransmitterlerin sinaptik iletim modülasyonu - agonist / antagonist uygulaması ile birlikte 33.

<table><tbody><tr><td>Amplifikatör</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 USB</td><td>Üçlü, 2 - 3 ön amplifikatör</td></tr><tr><td>ile Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>, 2 kamera bağlantı noktası, 4X objektif ve 40X suya daldırma objektifi</td></tr><tr><td>ile Kamera</td><td>TILL Photonics</td><td>VX55</td><td>kızılötesi CCD kamera</td></tr><tr><td>İş İstasyonu</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Infrapatch 240</td>, <td>motorlu bir x-y aşaması ve mikroskop için motorlu bir odak ekseni ile</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Luigs & 2</td><td>- 3 ön yükseltici için Neumann SM-5 x-y-z manipülatörleri</td><td></td></tr><tr><td>Faraday kafesi</td><td>Luigs & Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Titreşim önleyici masa</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome Microm</td><td>International</td><td>HM650V</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme</td><td>HEKA</td><td>Sutter P-97</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida sistemi</td><td>Neurolucida ve Neuroexplorer yazılımları ile</td> <td>Microbrightfield</td><td></td></tr></tbody></table>

akut beyin dilimleri nöronal mikro şemalar elektrofizyolojik ve morfolojik karakterizasyonu eşleştirilmiş patch-kelepçe kayıtlar kullanma

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

eşzamanlı hücre içi biocytin dolgulu akut beyin dilim hazırlıkları iki (veya daha fazla) sinaptik birleştiğinde nöronlar (eşleştirilmiş kayıtları) yama kelepçe kayıtları kombinasyonu yapısal ve fonksiyonel özellikleri bir korelasyon analizini sağlar. Bu yöntem ile, bunların morfolojisi ve elektrofizyolojik yanıt şekli ile öncesi ve postsinaptik nöronların belirlenmesi ve karakterize edilmesi mümkün olur. Eşli kayıtlar bu nöronlar arasındaki bağlantı modellerini yanı sıra hem kimyasal ve elektriksel sinaptik iletim özelliklerini inceleyerek izin verir. Burada, biz nöron morfolojisi optimal iyileşme ile birlikte güvenilir eşleştirilmiş kayıtları elde etmek için gerekli prosedürlerin bir adım-adım tanımını verir. Biz kimyasal sinaps veya boşluk bağlantıları aracılığıyla bağlanan nöronların çiftleri beyin dilim hazırlıkları tespit nasıl anlatacağız. Biz nöronlar Dendrit kendi 3D morfolojisi elde etmek için yeniden nasıl açıklayacağımic ve aksonal etki ve nasıl sinaptik kişileri tespit ve lokalize. Biz de özellikle beyin dilimleri hazırlanması sırasında dendritik ve aksonal kesikler ile ilgili olanlar, bu güçlü bağlantı tahminleri etkileyebilir çünkü, eşleştirilmiş kayıt tekniği uyarılar ve sınırlamalar görüşecek. Ancak, eşleştirilmiş kayıt yaklaşımının çok yönlülük beyindeki nöronal belirlenen microcircuits sinaptik iletim farklı yönlerini karakterize değerli bir araç olmaya devam edecektir.

Eşli kayıtlar morfolojik tespit tek veya çift yönlü sinaptik bağlantıları derinlemesine karakterizasyonu için tercih edilen yöntem olarak gap junction (elektrik) bağlantıları (Şekil 1). Somatosensori namlu korteks tabakası 4 bir eşleştirilmiş kaydın bir örneği, Şekil 1A&#39;da gösterilmiştir. Tek yönlü uyarıcı ve önleyici sinaptik bağlantıların (Şekil 1B, C) ​​karakterize edilebilir. Ayrıca eşleştirilmiş kayıtlar bir çift iki nöronlar öncesi ve birbirine postsinaptik ol...

Akut beyin dilimlerinde sinaptik olarak eşleşmiş nöronların yama-kelepçe kayıtları ve eş zamanlı hücre içi biyosit dolumu, yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin ilişkili bir analizine izin verir. Bu protokolün amacı, nöronal mikro devrelerden elektrofizyolojik kaydın temel teknik adımlarını ve bunların müteakip morfolojik analizlerini tanımlamaktır.

Akut Beyin Dilimleri nöronal Mikro şemalar Elektrofizyolojik ve Morfolojik Karakterizasyonu Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıtlar Kullanma

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, morfolojik olarak tanımlanmış nöronlar arasındaki sinaptik bağlantıların hem işlevsel hem de yapısal olarak nasıl karakterize edildiğini göstermektir. Bu, belirli bir sinaptik bağlantıyı incelemek için optimize edilmiş akut beyin dilimleri elde edilerek elde edilir. Yama klempleme daha sonra sinaptik olarak eşleşmiş nöronları test etmek için kullanılır.Bunun için, bireysel bir prospektif post-sinaptik nöron yamalanır ve daha sonra sinaptik bir bağlantının varlığını belirlemek için çevredeki nöronları uyarmak için ikinci bir pipet kullanılır. Herhangi bir yanıt görülmezse, uyarıcı elektrot hareket ettirilir. Bir bağlantı bulunduğunda, presinaptik nöron toptan satış modunda yeniden eşleştirilir.Bu nöronlardan alınan elektrofizyolojik kayıtlar ve eş zamanlı biyotin dolgularını takiben dilim sabitlenir, biyotin için işlenir ve nöronların bilgisayar destekli 3 boyutlu rekonstrüksiyonları yapılır. Sonuç olarak, yöntemimiz nöronal mikro devrelerin ilişkili kantitatif yapısal ve fonksiyonel analizini amaçlamaktadır. Sinaptik olarak eşleşmiş nöronlardan eşleştirilmiş kayıtların ana avantajı, nöronal mikro devrelerde hem sinaptik öncesi hem de postsinaptik nöronların ilişkili yapısal ve fonksiyonel analizini yapabilmemizdir.Daha da yakın zamanlarda, nöronların optik stimülasyonu gibi tanıtılan teknikler şimdiye kadar bunu çok ayrıntılı bir şekilde başaramamıştır. Bu yöntem, morfolojik olarak tanımlanmış nöron tiplerinin uyarılma ve inhibisyonu etkileşimlerinin ve aktivitenin nasıl modüle edildiğinin incelenmesini sağlar. Evcil hayvan kayıtları için prosedürleri gösteren Guan olacaktır.Laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan o. Hedef bölgenin dilimlerini hazırladıktan sonra, bu süre zarfında inkübe etmelerine izin verin, uzun ve ince bir sapa sahip olması gereken yama pipetlerini çekin. Bir deney odasında bir beyin dilimini platin arp ile sabitledikten sonra, bir kayıt pipetini dahili çözelti ile doldurun.Pipeti ön amplifikatöre yerleştirin ve potasyum tuzlarının sodyum tuzları ile değiştirildiği dahili bir çözelti ile doldurulmuş sekiz ila 10 mega ohm dirençli bir arama yaması pipeti kullanarak tüm hücre modunda varsayılan bir sinaptik sonrası nöronu yamalayın. Gevşek bir hücrede potansiyel bir presinaptik nöronu yamamak için arama pipetine hafif emme uygulayın. Ekli yapılandırma.Akım kelepçesi modunda gevşek conta altındaki membran potansiyelini eksi 30 ile eksi 60 milivolt arasında tutun. Ardından, potansiyel presinaptik hücrede bir aksiyon potansiyeli ortaya çıkarmak için 0.2 ila iki nano amperlik büyük akım darbeleri uygulayın. Bu aksiyon potansiyelini voltaj tepkisi üzerinde küçük bir spikelet olarak gözlemleyin.Postsinaptik yanıtın bozulmasını önlemek için stimülasyon frekansını 0.1 hertz'e ayarlayın. Postsinaptik nöron, test edilen potansiyel olarak presinaptik nöron yamasının uyarılmasına yanıt vermezse, gevşek sızdırmazlık modunda yeni bir potansiyel presinaptik nöron. Bu şekilde 30'a kadar potansiyel presinaptik nöronu test edin.30 mega ohm'dan daha büyük dirence sahip bir conta oluşturulabildiği sürece aynı arama yaması elektrodu kullanılmaya devam edilebilir. Gevşek sızdırmazlık modunda stimülasyon, postsinaptik nöronda beş milisaniyeden daha az gecikme süresine sahip bir EPSP veya IPSP ile sonuçlanırsa, dört ila sekiz mega ohm'luk bir dirence sahip düzenli iç çözelti içeren biyotin ile doldurulmuş bir kayıt yama elektrodu kullanarak presinaptik nörondan arama pipetini çıkarın. Presinaptik nöronu yamalayın ve tüm hücre akımı kelepçe modunda kaydedin.Presinaptik nöronlarda akım enjeksiyonu ile aksiyon potansiyellerini ortaya çıkarın ve postsinaptik yanıtı kaydedin. Verileri daha sonra çevrimdışı analiz etmek için bir bilgisayarda depolayın. Kayıt boyunca, biyotin yeterli boyama elde etmek için nörona yayılır.Nöronun boyutuna bağlı olarak biyotinin en az 15 ila 30 dakika yayılmasına izin verin. Yüksek bağlantı oranına sahip nöronal mikro devreler için bir arama elektrodu kullanılmaz. Bunun yerine, tüm hücre modunda doğrudan bir presinaptik nöronu yamalayarak başlayın.Daha sonra, tüm hücre modunda da potansiyel bir postsinaptik nöron olan düzenli iç çözelti yaması ile doldurulmuş bir yama elektrotu kullanılarak, her iki hücre de akım kelepçesi kontrolü altında olmalıdır. Presinaptik hücrede bir aksiyon potansiyeli ortaya çıkarın ve postsinaptik potansiyel için prospektif postsinaptik nöronu izleyin. Nöron presinaptik stimülasyona bir yanıt göstermezse, tüm hücre modunda tekrar yeni bir nöronu yamalamak için yeni bir elektrot kullanın.Bir bağlantı bulunduğunda, yama pipetini değiştirmeden daha önce gösterildiği gibi kayda devam edin. Dilimleri metin protokolünde anlatıldığı gibi sabitleyip monte ettikten sonra, biotin etiketli nöronları ışık mikroskobu altında inceleyin. Aksonal copların ve dendritik dikenlerin açıkça görülebildiğinden emin olun.Ticari bir nöron izleme sistemi kullanarak, nöronları veya sinaptik olarak eşleşmiş nöron çiftlerini manuel olarak izleyin. Küçük aksonal veya dendritik teminatları bile dahil ettiğinizden emin olun. 3B nöronal rekonstrüksiyonları elde etmek için izleri kullanın, izleme programının uygun bölümünde üç uzamsal boyutta da büzülme için nöronal rekonstrüksiyonları düzeltin.Gömme ortamı için büzülme düzeltme faktörleri, x ve y yönleri için yaklaşık 1,1 ve Z yönü için yaklaşık 2,1'dir. Dikenli bir yıldız ve nörona hızlı bir şekilde yayılan karşılıklı olarak bağlanmış bir hücre çifti. Kortikal tabakada dördüncü kısım biotin ile doluydu.Kayıt sırasında, yeşil noktalar, pre-sinaptik dikenli nöron ile post-sinaptik inter nöron arasındaki varsayılan uyarıcı sinaptik temasları gösterir. Mavi noktalar varsayılan karşılıklı inhibitör sinaptik temasları gösterir. Sinaptik kontakların yüksek güçlü görüntüleri burada gösterilmektedir.Yeşil açık daireler uyarıcı temasları gösterir ve mavi açık daireler inhibitör temasları gösterir. Karşılıklı olarak bağlı bu hücre çiftinin nöro berrak bir rekonstrüksiyonu burada gösterilmiştir. İnter-nöronlar akson mavi renkle, soma ve dendriti ise kırmızı renkle gösterilmiştir.Dikenli nöronlar akson yeşil renkte, soma ve dite ise beyaz renktedir. İç kısım, pre-sinaptik nöronların somato dendritik bölmelerini gösterir. Varsayılan sinaptik temaslarla birlikte, akut beyin diliminden yapılan düşük güçlü parlak alan fotoğraf mikrograflarında namlu konturları tanımlandı.Çok düşük bir bağlantı oranına sahip temsili bir sinaptik bağlantı burada gösterilmiştir. Altıncı katman parametal hücredeki bir presinaptik aksiyon potansiyeli, bir katman dört yıldızlı parametal nöronda bir monos sinaptik uyarıcı postsinaptik potansiyel uyandırdı. Bu trans laminer bağlantının burada gösterilen üç milisaniyeden fazla gecikmesi, yerel intra laminer bağlantılarda gözlemlenen yaklaşık bir milisaniyelik gecikmeden çok daha uzundur.Altıncı katman parametal hücresinde ortaya çıkan 10 hertz'de iki aksiyon potansiyeli, burada gösterilen katman dört yıldızlı parametal nöronunda post-sinaptik potansiyelleri tetikledi. Kısa vadeli kolaylaştırmaya dikkat edin. Eğik çizgi koşulunun belirli bir sinaptik bağlantı için optimize edilmesi gerektiğini ve kayıt sırasında kurulumun kesinlikle kararlı olması gerektiğini ve ardından optimum kayıt anlayışının garanti edildiğini hatırlamak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, neokorteksteki nöronal mikro devrelerin yapısal ve işlevsel özelliklerinin genel bir resmini elde etmek için elektrofizyolojik ölçümlerin ve morfolojik rekonstrüksiyonların nasıl kullanıldığını iyi anlamış olmalısınız.

electrophysiological-morphological-characterization-neuronal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Hipokampal devresinde fonksiyonel değişikliklerin araştırıldığı A çok yönlü bir yaklaşım açıklanmıştır. Elektrofizyolojik teknikler hasar protokol, davranışsal testleri ve bölgesel diseksiyon yöntem ile birlikte tarif edilmiştir. Bu tekniklerin kombinasyonu diğer beyin bölgeleri ve bilimsel sorular için benzer bir şekilde uygulanabilir.

Hafif Travmatik Beyin Hasarı takiben Hipokampal Devre İşlev değişimler üzerine araştırmalar

İzole hipokampi akut beyin kesitleri, hem de astrosit ve nöronların eşzamanlı elektrofizyolojik...

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Bu video, bir beyin dilimini sabitleyerek, pipetleri tüm hücre konfigürasyonlarını elde etmek için konumlandırarak ve postsinaptik yanıtları kaydetmek için presinaptik nöronları uyararak sinaptik bağlantıları haritalama prosedürünü gösterir, böylece nöronal bağlantıyı aydınlatır.

Akut Beyin Dilimlerinde Nöronal Bağlantıların Eşleştirilmiş Yama Kelepçesi Kaydı

Kortikal ağları inhibitör küçük, ama farklı kümesi tarafından kontrol edilir. Internöronlar Fonksiyonel soruşturma dolayısıyla hedeflenen kayıt ve titiz belirlenmesini gerektirir. Hücre içi etiketleme, post-hoc morfolojik ve imünositokimyasal analizler nöronu tek ya da çiftli sinaptik çiftlerinden bütün hücre kayıtları içeren bir birleşik yaklaşım aşağıda tarif edilmiştir.

Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Kapalı döngü protokolleri günümüz elektrofizyolojisinde giderek yaygınlaşmaktadır. Kortikal piramidal nöronlarda in vitro olarak karmaşık elektrofizyolojik protokolleri gerçekleştirmenin basit, çok yönlü ve ucuz bir yolunu sunuyoruz.

Gerçek zamanlı Elektrofizyoloji: Probe Nöronal Dynamics ve Ötesi Kapalı çevrim Protokolleri Kullanma

Bu iletişim kuralı bir en iyi duruma getirilmiş Nuygulanmasını gösteren-metil-D-glucamine (NMDG) koruyucu kurtarma yöntemi beyin dilim hazırlık. Bir tek medya formülasyon güvenilir bir şekilde sağlıklı beyin dilimleri her yaştan ve çeşitli deneysel uygulamalar için hayvanlardan elde etmek için kullanılır.

En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

Bu protokol tüm hücre yama-kelepçe kayıtları gerçekleştirmek için temel usul adımları açıklar. Bu teknik nöronların elektriksel davranışının çalışma sağlar ve beyin dilimleri yapıldığında, hala nispeten iyi korunmuş beyin devreleri entegre edilmiştir nöronlardan farklı nöron işlevlerinin değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Dilim yama klemp tekniği içsel özelliklerini ve uyarıcı ya da inhibitör sinapslarda plastisite öğrenme kaynaklı değişiklikleri analiz etmek için etkili bir yöntemdir.

Dilim yama klemp tekniği öğrenme kaynaklı plastisite analiz etmek için

Bu protokol, standart in vitro elektrofizyoloji ekipmanı için yakın zamanda geliştirilen bir sistemi kullanarak otomatik görüntü yönlendirmeli patch-clamp deneylerini nasıl yürüttüreceğinizi açıklamaktadır.

Beyin dilimlerinde nöronların çalışması için otomatik görüntü yönlendirmeli Yama Kelepçesi Uygulaması

Burada, vitro omurilik dilim nöronlarda gözlemliyorum gelatinosa (SG) yapılan bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları için gerekli adımları açıklar. Bu yöntem, içsel membran özelliklerini, sinaptik iletimi ve morfolojik belirlenmesi için SG nöronlar karakterizasyonu sağlar.

Akut omurilik dilimleri hazırlanması gözlemliyorum Gelatinosa nöronlar bütün hücreli yama-kelepçe kayıt için

Burada, Bütün hücre yama kelepçe Elektrofizyoloji akut beyin dilimler halinde kullanarak fonksiyonel sinaptik çeşitlilik değerlendirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Sinaptik çeşitlilik bütün hücreli yama-kelepçe Elektrofizyoloji kullanarak değerlendirilmesi

Öğrenin akut beyin dilimlerinde eşleştirilmiş patch-kelepçe kayıtları kullanarak sinaptik bağlantıların elektrofizyolojik ve morfolojik karakterizasyonunu. Bu yöntem nöronal mikrodevreleri yapısal ve fonksiyonel olarak analiz etmenizi sağlar.

Akut Beyin Dilimleri nöronal Mikro şemalar Elektrofizyolojik ve Morfolojik Karakterizasyonu Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıtlar Kullanma (Video) | JoVE Journal

Akut Beyin Dilimleri nöronal Mikro şemalar Elektrofizyolojik ve Morfolojik Karakterizasyonu Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıtlar Kullanma

Daha fazla video keşfet