Kök ve Ağ Kültürlerde Biyolojik nörotoksinlerin Fonksiyonel Değerlendirme Merkezi Sinir Sistemi Nöronlar Hücre-türetilmiş

Bu prosedürün amacı, Clostridial nörotoksinlerin, fare embriyonik kök hücrelerinden türetilen nöronların ağa bağlı kültürlerinde sinaptik iletim üzerindeki etkisini kesin olarak ölçmektir. Bu, önce embriyonik kök hücrelerin bir besleyici hücresiz süspansiyon kültürüne uyarlanması ve adapte edilmiş hücrelerin pluripotent bir durumda tutulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, süspansiyona adapte olmuş kök hücreleri, dört dört farklılaşma tekniğinin bir varyasyonunu kullanarak nöronlara veya ESN'lere farklılaştırmaktır.

Daha sonra, ESN'ler, sinaptik olarak aktif ağa bağlı nöronlara olgunlaşmayı teşvik etmek için bir dizi medya ile muamele edilir. Son adım, ESN'leri clostridial, nörotoksinler veya diğer nörotoksinlerle tedavi etmek ve tüm hücre yama klemp elektrofizyolojisini kullanarak monos sinaptik aktivite üzerindeki etkileri ölçmektir. Sonuç olarak, monos sinaptik aktivitenin spontan üretimindeki değişiklikler, yaşa ve lot uyumlu kontrol nöronlarına normalize edilmiş elektrofizyolojik kayıtlardan ölçülür ve dozlar, süreler veya ilaç tedavileri gibi farklı koşullar arasında karşılaştırılır.

Bu tekniğin temel avantajı, ESN'lerin botulizm ve tetanozun klinik belirtilerinden sorumlu fonksiyonel patolojileri kopyalayan ilk hücre bazlı model olmasıdır. Bu yöntem için ilk olarak, ESN'lerin snare protein bölünmesine dayalı tüm klostridyal nörotoksinlere karşı oldukça duyarlı olduğunu ve ayrıca ortaya çıkan ağ davranışında spontan sinaptik aktivite gösterdiğini bulduğumuzda aklımıza geldi. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Bayan Megan Lyman olacak Besleyici hücresiz süspansiyon kültürünü adapte ederek başlayın.

ESC, 15 mililitrelik bir konik boruya toplanır ve agregaların kompakt bir pelet haline gelmesine izin verir. Agregalar yerleştikten sonra, hücre peletini bozmamaya dikkat ederek SUP natantını aspire edin. Daha sonra hücreleri yıkamak için beş mililitre PBS ekleyin ve 2,5 dakika boyunca 100 kez G'de santrifüjleyin.

PBS'yi dikkatlice aspire edin ve ardından 500 mikrolitre tripsin ekleyin ve hücre peletini nazikçe bozmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. Ardından tüpü 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin ve üç dakika inkübe edin. İnkübasyon süresi geçtikten sonra, tüpü doku kültürü başlığına geri koyun ve tripsini seyreltmek için 500 mikrolitre ESC ortamı ekleyin.

Ardından, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için CEL süspansiyonunu P 1000 pipet ile beş ila 10 kez itin. Bir hemo, sitometre kullanarak hücrelerin bir eloqua'sını sayın ve hücre süspansiyonunun geri kalanını üç dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin. Supinatı aspire ettikten sonra, hücreleri ESC ortamı ile mililitrede yedi hücre olmak üzere bir kez sentlik bir nihai konsantrasyona askıya alıyoruz.

Daha sonraki transfer, 150 mikrolitre süspansiyonu 10 santimetrelik bir bakteri kabında 10 mililitre ESC ortamına aktarın ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. E ESC'ler bu protokol kullanılarak rutin olarak geçilir. Her 48 saatte bir, ESC'lerin nöronlara farklılaşması, rutin bir hücre geçişi sırasında başlar.

ESC'leri daha önce olduğu gibi ayırın, ancak nöronal farklılaşma için ek bir plaka ekleyin. 350 mikrolitre hücre süspansiyonunu, 25 mililitre farklılaşma içeren 10 santimetrelik alçak bir bağlantı kabına aktarın. Orta. Çanağı, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir doku kültürü inkübatörü içinde 30 ila 45 RPM'ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin ve 48 saat inkübe edin.

48 saat sonra, farklılaşan hücre agregalarını 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için 25 mililitrelik bir pipet kullanın. Hemen ardından 25 mililitre taze farklılaşma ekleyin. Petri kabına orta.

Agregaların iki ila beş dakika çökmesine izin verin ve bir ila iki milimetre derinliğinde görünür bir pelet üretin. Hala süspansiyonda olan tek hücreleri veya küçük agregaları göz ardı ederek ortamı dikkatlice aspire edin ve hücre paletini Petri kabına geri aktarmak için bir P 1000 pipet kullanın. Çanağı inkübatördeki döner çalkalayıcıya geri koyun.

48 saat daha sonra, medya değiştirme prosedürünü tekrarlayın. Bu sefer 30 mililitre farklılaşma ortamında, altı mikromolar tüm trans retinoik asit ile desteklenmiştir. Oluşan pelet, hücreleri inkübe ettikten sonra şimdi iki ila dört milimetre derinliğinde olacaktır.

Daha önce olduğu gibi, retinoik asit takviyesi ile medya değiştirme prosedürünü son kez tekrarlayın. Pelet, ertesi gün bu noktada dört ila sekiz milimetre derinliğinde olacaktır. Kaplama yüzeylerini, kaplama gününün öğleden sonra protokolün yazılı bölümünde belirtildiği gibi veya 37 santigrat derecede önceden kaplanmış MPC tripsin ortamının her biri ve% 0.1 Soya fasulyesi tryin inhibitörünün her biri beş mililitre hazırlayın.

Ardından, farklılaşan agregaları kültür plakasından 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için 25 mililitrelik bir pipet kullanın. Agregaların üç ila beş dakika dinlenmesine izin verin ve ardından peleti bozmadan ortamı dikkatlice aspire edin. Daha sonra, peleti beş ila 10 mililitre PBS ile yıkayın ve agregalar yerleştikten sonra.

PBS'yi aspire edin ve yıkamayı tekrarlayın. İkinci PBS yıkamasından sonra. Pelete beş mililitre MPC izasyon ortamı ekleyin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derece inkübe edin.

İnkübasyon sırasında tüpü iki ila üç kez hafifçe vurun. Daha sonra, hücrelere beş mililitre% 0.1 soya fasulyesi tripsin inhibitörü ekleyin ve ters çevirerek hızlı bir şekilde karıştırın. Daha sonra, nispeten homojen bir hücre süspansiyonu üretilene kadar hücreleri 10 mililitrelik bir pipetle 10 ila 15 kez nazikçe trite edin.

Hücre süspansiyonunu, 50 mililitrelik konik bir tüpün üzerine yerleştirilmiş 40 veya 70 mikronluk bir hücre süzgecinden yavaşça süzün. Daha sonra, tüm süspansiyon bir mililitre N iki'de süzüldükten sonra, kalan hücreleri süzgeçten yıkamak için filtreye orta hizada gönderilir. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın ve 200 kez G'de altı dakika santrifüjleyin. Pelet bozulmadan ortamı aspire ettikten sonra, iki mililitre N iki ortamda tritüre edin, ardından toplam 10 mililitre hacme N iki ortam ekleyin.

200 kez beş dakika santrifüjleyin. G. Ortamı aspire edin ve pelet yıkama işlemini tekrarlayın. Resus, peleti 10 mililitre N iki ortamda askıya alır.

Hücrelerin bir kısmını çıkarın ve bir hemo sitometre ile sayın ve ardından santrifüjleme Reese'i tekrarlayın. Hücreleri N iki ortamda, mililitre başına 10 ila yedi hücrenin bir katı nihai konsantrasyona kadar askıya alın ve santimetre kare başına 150.000 ila 200.000 hücre yoğunluğunda bir plaka. Hint, DIV eksi birde hazırlanır ve 37 santigrat derecede doku kültürü inkübatörüne yerleştirilir.

ESN'leri yazılı protokoldeki talimatlara göre koruyun. İlk olarak, botulinum nörotoksin serotip A'yı ESN kültüründe istenen nihai konsantrasyonun 100 katına, orta ve ılık olarak 37 santigrat dereceye kadar seyreltin. Daha sonra DIV 21 artı ESN kültürlerine uygun miktarda toksin ekleyin.

Kültür kabını şişirin ve istenen zamanda inkübatöre geri dönün. ESN kültür ortamını noktasal aspire edin ve hücre dışı kayıt tamponu veya ERB ile iki kez yıkayın. Daha sonra, aksiyon potansiyellerini bloke etmek için beş mikromolar tetrodatoksin ve gabaa reseptör aktivitesini antagonize etmek için 10 mikromolar bi kolin ile takviye edilmiş dört mililitre ERB ekleyin.

Ardından, çanağı elektrofizyoloji teçhizatına aktarın. Sinaptik iletimin veya sis tahlilinin ölçülen inhibisyonu için ne perfüzyon ne de sıcaklık kontrolü gerekli değildir. Beş ila 10 mega ohm dirençli bo silikat pipetleri çekmek için bir mikro pipet çektirmesi kullandıktan sonra, bir pipeti hücre içi kayıt tamponu ile doldurun.

Ardından pipeti yavaşça silikon reaktife batırın. Kayıt pipetini elektrot tutucusuna sabitleyin ve elektrot tutucusuna taşınan boruya hava dolu bir şırınga takın. Kayıt pipetini ERB'ye indirirken şırınga aracılığıyla sabit pozitif basınç sağlayın.

Kayıt pipetini kaydedilecek nöronun SOR'una nazikçe indirdikten sonra. Şırınga üzerindeki contayı kırarak pozitif basınca bakın. Şırıngayı yeniden bağlayın ve bir giga ohm conta oluşturmak için hafif inspirasyonla sürekli negatif basınç uygulayın.

Giga ome contası oluşturulduktan sonra, tutma voltajını eksi 70 milivolta düşürün. Ardından, tüm hücre konfigürasyonuna girmek için şırıngayı kullanarak kısa negatif basınç darbelerini dikkatlice uygulayın. Yamanın kararlı olduğunu doğrulamak için kapasitans artışlarını 30 saniye boyunca izleyin.

HEA yazılımındaki kapasitans artışlarını iptal edin ve sıvı bağlantı potansiyellerini ayarlamadan dinlenme membran potansiyelini izlemek ve kaydetmek için akım kelepçesi moduna geçin. Dinlenme zarı potansiyeli eksi 67 ile eksi 82 milivolt arasında olabilir. Kazancı pico amp başına iki milivolta ayarlayın.

Voltaj kelepçesi moduna geçin ve minyatür uyarıcı, post-sinaptik akımları tespit etmek için üç ila beş dakika boyunca sürekli eksi 70 milivolt kayıt yapın. Mini analizde AMPA reseptörü EPC'leri için varsayılan ayarları kullanarak PSC'leri tespit etmek için kaydedilen üç ila beş dakikalık kayıtlı verileri analiz edin, algılanan olaylar hakkında bilgi toplayın ve kaydedin. Her maruz kalma koşulu için sekiz ila 12 kontrol ve sekiz ila 12 botulinum nörotoksin ile muamele edilen numune için M-E-P-S-C frekansları toplandıktan sonra.

Yaşa ve lot eşleşen kontrollere karşı frekansı analiz edin, daha sonra div yediden div 49'a kadar uygun istatistiksel testleri kullanarak sinaptik aktivitenin yüzde inhibisyonunun istatistiksel anlamlılığını belirleyin, ESN'ler nörotropik bölmeleri eksprese eder ve sinaptik ponksiyon oluşturur. Takso dendritik arayüzler. ESN'ler, botulinum nörotoksin serotipleri, bir TG ve tetanoz toksinine maruz kaldıklarında sinaptik aktivitenin inhibisyonuna uğrarlar.

ESN'lerden elde edilen bu temsili izler, botulinum nörotoksin serotipleri, A TG tetanoz, nörotoksin veya aracın banyo baskısından 20 saat sonra toplandı. Her nörotoksin, kontrollere kıyasla sinaptik aktiviteyi %95'in üzerinde azalttı. Aşağıdaki dört görüntü, botulinum nörotoksin serotipi, A ile tedavi edilen ESN'lerde monos sinaptik aktiviteyi ölçmek için sis kullanmanın hassasiyetini göstermektedir.

Bu ilk görüntü, botulinum nörotoksin serotipi A'nın banyo baskısından 20 saat sonra kaçırılan sinaptik aktivite ölçümlerinden temsili izleri göstermektedir.Voltaj kelepçesi iz segmentleri, botulinum nörotoksin serotipi A'ya maruz kaldıktan sonra M-E-P-S-C frekansında bir azalma göstermiştir. Medyan inhibitör konsantrasyon, dört parametreli değişken eğim kullanılarak doğrusal olmayan bir regresyonun en küçük kareleri ile belirlendi. SNS'de buğu ile algılama sınırının en az 0.005 picaMolar olduğunu unutmayın.

Bu çubuk grafik, western blot ile ölçülen SNAP 25 bölünmesinin sitometri kantitasyonunu göstermektedir. Bir zehirlenme okuması olarak snare protein bölünmesinin azaltılmış hassasiyetine dikkat edin. Sis ile karşılaştırıldığında, tek bir yıldız işareti 0,05'ten küçük bir P değerini gösterir.

Üçlü yıldız işareti, 0,001'den küçük bir P değerini gösterir. Bu bulgular, kök hücre türevli nöronların ağ bağlantılı popülasyonlarının, fizyolojik olarak ilgili hücre bazlı bir clostridial nörotoksin zehirlenmesi modeli sunduğunu göstermektedir. SNS kullanımının, gelişmiş hız, özgüllük ve hassasiyet gibi ek bir fayda ile fare ölümcüllük testi için uygun bir ikame görevi görerek hayvan sıkıntısını ve ölümünü önemli ölçüde azaltması beklenmektedir.

Bu teknik, nörotoksikoloji alanındaki araştırmacıların, klostridyal nörotoksinler için terapötik tarama ve toksin tespitini kolaylaştırmak için nöronal ağ aktivitesine dayalı orta verimli tarama teknikleri kullanmalarının yolunu açmaktadır.