Kök ve Ağ Kültürlerde Biyolojik nörotoksinlerin Fonksiyonel Değerlendirme Merkezi Sinir Sistemi Nöronlar Hücre-türetilmiş

Bu prosedürün amacı, fare embriyonik kök hücrelerinden türetilen nöron ağ kültürlerinde, Clostridial nörotoksinlerin sinaptik iletim üzerindeki etkisini kesin olarak ölçmektir. Bu işlem, öncelikle embriyonik kök hücrelerin besleyici hücre içermeyen bir süspansiyon kültürüne adapte edilmesi ve adapte edilen hücrelerin pluripotent durumda tutulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, süspansiyona adapte edilmiş kök hücrelerin, dörtlü farklılaşma tekniğinin bir varyasyonu kullanılarak nöronlara veya ESN'lere farklılaştırılmasıdır.

Ardından, ESN'ler sinaptik olarak aktif ağlanmış nöronlara olgunlaşmalarını teşvik etmek amacıyla bir dizi besiyerine tabi tutulur. Son adım, ESN'lerin klostridyal nörotoksinler veya diğer nörotoksinlerle işlenmesi ve bütün hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) elektrofizyolojisi kullanılarak monosinaptik aktivite üzerindeki etkilerin ölçülmesidir. Nihayetinde, spontan monosinaptik aktivite üretimindeki değişiklikler, yaş ve lot eşleşmeli kontrol nöronlarına göre normalize edilen elektrofizyolojik kayıtlardan nicelleştirilir ve dozlar, süreler veya ilaç tedavileri gibi farklı koşullar arasında karşılaştırılır.

Bu tekniğin temel avantajı, ESN'lerin, botulizm ve tetanozun klinik belirtilerinden sorumlu olan fonksiyonel patolojileri replike eden ilk hücre tabanlı model olmasıdır. Bu yöntemle ilgili fikri ilk olarak, ESN'lerin snare protein yıkımına dayalı tüm klostridiyal nörotoksinlere karşı oldukça duyarlı olduğunu ve ayrıca gelişen ağ davranışında spontan sinaptik aktivite gösterdiğini keşfettiğimizde edindik. Prosedürü, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Bayan Megan Lyman uygulamalı olarak gösterecektir. Besleyici hücre içermeyen, adapte edilmiş süspansiyon kültürünün transferi ile başlayın.

ESC agregatlarını 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve agregatların sıkı bir pelet oluşturacak şekilde çökmesini bekleyin. Agregatlar çöktüğünde, hücre peletini bozmamaya dikkat ederek supernatantı aspire edin. Ardından, hücreleri yıkamak için beş mililitre PBS ekleyin ve 100 ×g'de 2,5 dakika santrifüjleyin.

PBS'yi dikkatlice aspire edin ve ardından 500 µL tripsin ekleyip hücre peletini nazikçe dağıtmak için tüpü birkaç kez ters yüz edin. Daha sonra tüpü 37 °C'lik su banyosuna yerleştirin ve üç dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon süresi dolduktan sonra tüpü doku kültürü kabinine geri getirin ve tripsini seyreltmek için 500 µL ESC medyumu ekleyin.

Ardından, tek hücre süspansiyonu elde etmek için CEL süspansiyonunu P 1000 pipet ile beş ila 10 kez titre edin. Hemositometre kullanarak hücrelerin bir kısmını sayın ve hücre süspansiyonunun geri kalanını 200 ×g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı aspire ettikten sonra, hücreleri ESC medyumu ile mililitrede 1 x 10⁷ hücre olan nihai bir konsantrasyona kadar süspande edin.

Ardından, süspansiyonun 150 µL'sini, 10 cm'lik bir bakteri plağındaki 10 mL ESC besiyerine aktarın ve 37 °C'de, %5 CO2 ortamında inkübe edin. ESC'ler rutin olarak bu protokol kullanılarak pasajlanır. Rutin hücre pasajı sırasında, her 48 saatte bir ESC'lerin nöronlara farklılaşması başlar.

ESC'leri daha önce olduğu gibi ayrıştırın, ancak nöronal diferansiyasyon için ek bir plak ekleyin. Hücre süspansiyonunun 350 microliter'ini, 25 milliliters diferansiyasyon mediumu içeren 10 centimeter'lik düşük tutunmalı bir kaba aktarın. Kabı, 37 degrees Celsius ve %5 carbon dioxide ortamındaki bir doku kültürü inkübatörünün içinde, 30 ila 45 RPM'ye ayarlanmış bir orbital sarsıcının üzerine yerleştirin ve 48 saat boyunca inkübe edin.

48 saat sonra, farklılaşan hücre agregalarını 50 mililitrelik konik tüpe aktarmak için 25 mililitrelik bir pipet kullanın. Hemen ardından Petri kabına 25 mililitre taze farklılaşma medyumu ekleyin.

Agregatların iki ila beş dakika boyunca çökelmesine izin vererek, bir ila iki milimetre derinliğinde görünür bir pelet oluşmasını sağlayın. Süspansiyon halindeki tekil hücreleri veya küçük agregatları dikkate almadan medyumu dikkatlice aspire edin ve hücre peletini Petri kabına geri transfer etmek için bir P 1000 pipet kullanın. Kabı inkübatördeki döner çalkalayıcıya geri yerleştirin.

48 saat sonra, besiyeri değişim prosedürünü tekrarlayın. Bu kez, altı mikromolar all trans retinoik asit ile desteklenmiş 30 mililitre diferansiyasyon besiyeri kullanın. Hücreler inkübe edildikten sonra oluşan pelet artık iki ila dört milimetre derinliğinde olacaktır.

Daha önce yapıldığı gibi, retinoik asit takviyeli besiyeri değişim prosedürünü son kez tekrarlayın. Ertesi gün bu noktada pelet derinliği dört ila sekiz milimetre olacaktır. Plaklama yüzeylerini, plaklamanın yapılacağı gün öğleden sonra, protokolün yazılı bölümünde belirtildiği şekilde hazırlayın veya 37 °C'de beşer mililitre ön kaplamalı MPC tripsin besiyeri ve %0,1 Soya tripsin inhibitörü hazırlayın.

Ardından, farklılaşan agregatları kültür plağından 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için 25 mililitrelik bir pipet kullanın. Agregatların çökelmesi için üç ila beş dakika bekleyin ve ardından peleti rahatsız etmeden medyumu dikkatlice aspire edin. Daha sonra, peleti beş ila 10 mililitre PBS ile yıkayın ve agregatlar çökelene kadar bekleyin.

PBS'yi aspire edin ve yıkama işlemini tekrarlayın. İkinci PBS yıkamasından sonra, pelete beş mililitre MPC'leştirme ortamı ekleyin ve 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sırasında tüpü iki ila üç kez hafifçe vurun. Ardından, hücrelere beş mililitre %0,1 soya fasulyesi tripsin inhibitörü ekleyin ve tersyüz ederek hızlıca karıştırın. Daha sonra, nispeten homojen bir hücre süspansiyonu oluşana kadar hücreleri 10 mililitrelik bir pipetle 10 ila 15 kez nazikçe trite edin.

Hücre süspansiyonunu, 50 mililitrelik konik bir tüp üzerine yerleştirilmiş 40 veya 70 mikronluk bir hücre süzgecinden yavaşça süzün. Süspansiyonun tamamı süzüldüğünde, süzgeçte kalan hücreleri yıkamak için bir mililitre N2 medium ekleyin. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 200 ×g'de altı dakika boyunca santrifüjleyin. Peleti rahatsız etmeden medyumu aspire ettikten sonra iki mililitre N2 medium ile tritüre edin, ardından toplam hacim 10 mililitre olacak şekilde N2 medium ekleyin.

200 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Besiyerini aspire edin ve pelet yıkama işlemini tekrarlayın. Peleti 10 mililitre N2 besiyerinde resüspansiyon yaparak süspansiyona getirin.

Hücrelerden bir alikot alıp hemositometre ile sayın ve ardından santrifüj işlemini tekrarlayın. Hücreleri, mililitre başına 1 × 10⁷ hücre final konsantrasyonuna ulaşacak şekilde N2 medyumunda süspanse edin ve santimetrekare başına 150.000 ila 200.000 hücre yoğunluğunda ekim yapın. Bu işlem DIV-1'de hazırlanır ve 37 °C'deki doku kültürü inkübatörüne yerleştirilir.

ESN'leri yazılı protokoldeki talimatlara göre koruyun. Öncelikle, botulinum nörotoksin serotip A'yı ESN kültür ortamında istenen nihai konsantrasyonun 100 katı olacak şekilde seyreltin ve 37 °C'ye ısıtın. Ardından, DIV 21 artı ESN kültürlerine uygun hacimde toksin ekleyin.

Kültür kabını şişirin ve istenen zamanda inkübatöre geri yerleştirin. ESN kültür ortamını uç aspiratörle çekin ve hücre dışı kayıt tamponu veya ERB ile iki kez yıkayın. Ardından, aksiyon potansiyellerini bloke etmek için beş mikromolar tetrodotoksin ve GABA_A reseptör aktivitesini antagonize etmek için 10 mikromolar bikulin ilave edilmiş dört mililitre ERB ekleyin.

Ardından, kabı elektrofizyoloji düzeneğine aktarın. Sinaptik iletimin ölçülen inhibisyonu veya mist analizi için perfüzyona veya sıcaklık kontrolüne gerek yoktur. Mikro pipet çekici kullanılarak beş ila 10 mega ohm dirençte borosilikat pipetler çekildikten sonra, bir pipeti hücre içi kayıt tamponu ile doldurun.

Ardından pipeti nazikçe silikon reajenine batırın. Kayıt pipetini elektrot tutucuya sabitleyin ve elektrot tutucuya bağlı olan boru hattına hava dolu bir şırınga takın. Kayıt pipetini ERB içerisine indirirken şırınga aracılığıyla sabit pozitif basınç uygulayın.

Kayıt pipeti, kayıt yapılacak nöronun SOR'suna nazikçe yerleştirildikten sonra, şırıngadaki sızdırmazlığı bozarak pozitif basınç uygulandığını görün. Şırıngayı tekrar bağlayın ve giga ohm sızdırmazlık oluşturmak için nazik bir aspirasyonla sürekli negatif basınç uygulayın.

Gigaohm sızdırmazlığı sağlandıktan sonra, tutma voltajını -70 milivolt'a düşürün. Ardından, tam hücre konfigürasyonuna geçmek için şırıngayı kullanarak dikkatlice kısa negatif basınç darbeleri uygulayın. Yamamanın stabil olduğunu doğrulamak için 30 saniye boyunca kapasitans sıçramalarını izleyin.

HEA yazılımındaki kapasitans spike'larını iptal edin ve sıvı eklem potansiyelleri için ayarlama yapmadan dinlenim membran potansiyelini izlemek ve kaydetmek için akım kenetleme (current clamp) moduna geçin. Dinlenim membran potansiyeli eksi 67 ile eksi 82 milivolt arasında olabilir. Kazancı (gain) piko amper başına iki milivolt olarak ayarlayın.

Voltaj kenetleme moduna geçin ve minyatür eksitatör post-sinaptik akımları tespit etmek için üç ila beş dakika boyunca sürekli -70 mV kayıt gerçekleştirin. Mini analizdeki AMPA reseptörü EPC'leri için varsayılan ayarları kullanarak, me PSC'leri tespit etmek amacıyla kaydedilen verilerin üç ila beş dakikasını analiz edin; tespit edilen olaylar hakkındaki bilgileri toplayın ve kaydedin. Her maruziyet durumu için sekiz ila 12 kontrol ve sekiz ila 12 botulinum nörotoksin uygulanmış örnekte M-E-P-S-C frekanslarını toplayın.

Sıklığı, yaş ve lot eşleşmeli kontrollere karşı analiz edin, ardından div 7'den div 49'a kadar, uygun istatistiksel testleri kullanarak sinaptik aktivitenin yüzde inhibisyonunun istatistiksel anlamlılığını belirleyin; ESN'ler nörotropik kompartmanlar ifade eder ve sinaptik delikler oluşturur. Takso dendritik arayüzler. ESN'ler, botulinum nörotoksin serotipleri a TG ve tetanus toksinine maruz kaldıklarında sinaptik aktivite inhibisyonuna uğrarlar.

ESN'lerden elde edilen bu temsilci izler, botulinum nörotoksin serotipleri A, TG tetanoz nörotoksin veya araç eklendikten 20 saat sonra toplanmıştır. Her bir nörotoksin, kontrollere kıyasla sinaptik aktiviteyi %95'ten fazla azaltmıştır. Aşağıdaki dört görüntü, botulinum nörotoksin serotip A ilele işleme tabi tutulmuş ESN'lerde monosinaptik aktiviteyi ölçmek için mPatch kullanımının hassasiyetini göstermektedir.

Bu ilk görüntü, botulinum nörotoksin serotip A'nın banyo uygulamasıyla verilmesinden 20 saat sonra sinaptik aktiviteye dair kaydedilen ölçümlerden temsilci izler göstermektedir. Voltaj klemp iz segmentleri, botulinum nörotoksin serotip A'ya maruz kaldıktan sonra M-E-P-S-C frekansında bir azalma sergilemiştir. Bu görüntü M-E-P-S-C frekansının kantifikasyonunu göstermekte ve M-E-P-S-C frekansındaki doza bağımlı azalmayı doğrulamaktadır. Medyan inhibitör konsantrasyon, dört parametreli değişken eğimli doğrusal olmayan bir regresyonun en küçük kareler uyumu ile belirlenmiştir. Not: SNS'deki tespit sınırı en az 0,005 picaMolar'dır.

Bu sütun grafiği, western blot ile ölçülen SNAP 25 parçalanmasının sitometri kantitasyonunu göstermektedir. Toksin etkisinin bir göstergesi olarak snare protein parçalanmasının düşük hassasiyetine dikkat edin. Mist ile karşılaştırıldığında, tek bir yıldız 0,05'ten küçük bir P değerini belirtir.

Üç yıldız, 0,001'den küçük bir P değerini belirtir. Bu bulgular, kök hücre türevli nöronların ağ oluşturmuş popülasyonlarının, klostridyal nörotoksin zehirlenmesi için fizyolojik olarak ilgili hücre tabanlı bir model sunduğunu göstermektedir. SNS kullanımı, fare letalite deneyine uygun bir alternatif olarak hizmet ederek, hız, özgünlük ve hassasiyetteki artış avantajıyla birlikte hayvan stresini ve ölümlerini önemli ölçüde azaltacaktır.

Bu teknik, nörotoksikoloji alanındaki araştırmacıların, clostridial nörotoksinler için terapötik taramayı ve toksin tespitini kolaylaştırmak amacıyla nöronal ağ aktivitesine dayalı orta ölçekli tarama teknikleri kullanmalarının yolunu açmaktadır.