Bir Proteoliposome Tabanlı effluks Deney Cl Tek-molekül Properties belirleme ^- Kanallar ve Nakliyeciler

Bu prosedürün genel amacı, sulandırılmış klorür kanallarının veya taşıyıcılarının taşıma aktivitesini kantitatif olarak belirlemektir. Bu, ilk önce saf saflaştırılmış taşıyıcının düşük yoğunlukta lipozomlara yeniden oluşturulmasıyla gerçekleştirilir, böylece her lipozom, dış klorür iyonlarını çıkardıktan sonra aktif kompleksin sıfır veya bir kopyasını içerir, böylece dışa doğru yönlendirilmiş bir iyonik gradyan olur, lipozomlar, klorür konsantrasyonunun klorüre duyarlı bir elektrot kullanılarak izlendiği kayıt odasına eklenir. Lipozomlardan gelen bir sonraki klorür flx, membran potansiyelini alevlendiren bir potasyum iyonoforu olan Val Mycin'in eklenmesiyle başlatılır.

Sinyal kararlı duruma ulaştığında, lipozomları çözmek için deterjan ilavesiyle deney sonlandırılır. Sonuç olarak, saflaştırılmış bir kanal veya taşıyıcı ile yeniden oluşturulan protea lipozomlarından klorür akış hızını ölçerek, aktif protein kompleksinin üniter taşıma hızını ve stokiyometrisini kantitatif olarak belirlemek mümkündür. Bu tekniğin, floresan bazlı akı ölçümleri gibi diğer mevcut yaklaşımlara göre temel avantajı, bu teknikle, üniter devir hızı ve kompleksin geometrisi gibi yeniden yapılandırılmış taşıyıcının temel parametrelerini nicel olarak belirlemenin mümkün olmasıdır.

Bu anahtar parametrelerin kantitatif ölçümlerini sağlamanın yanı sıra, bu yöntem, mutasyon küçük moleküllerinin etkisini hızlı ve kesin bir şekilde belirlemek ve yeniden yapılandırılmış transfer proteinindeki alt birimleri izlemek için kullanılabilir. Kayıt kurulumu iki oda, bir klorür elektrodu, analog veya dijital elektrik çıkışlı bir pH metre, bir sayısallaştırıcı ve uygun toplama yazılımına sahip bir bilgisayardan oluşur. Klorür elektrodunu pH metreye bağlayın, ardından pH metrenin çıkışını bilgisayara bağlı olan sayısallaştırıcıya bağlayın.

Referans elektrodunu bir hazneye ve yeniden kodlama telini diğerine yerleştirin. Ardından, karıştırma çubuğu kayıt haznesinde olacak şekilde hazneleri bir karıştırma plakasına yerleştirin. Karıştırma çubuğunun elektroda temas etmediğinden emin olun.

Deneylerden önceki gece bir agar köprüsü kullanarak odaları bağlayın, kullanmadan önce oda sıcaklığında en az üç saat hafifçe çalkalayarak 15 mililitre dış tamponda bir gram cidex G 50 boncuğu şişirin. Her deney, lipozomlar oda sıcaklığında çözülürken yaklaşık üç mililitre şişmiş boncuk gerektirir. Her sütuna yaklaşık üç mililitre şişmiş G 50 boncuk dökün.

Yerçekimi ile kurumaya bırakın. Oda sıcaklığında akış. Bu genellikle bir ila iki dakika sürer.

Daha sonra, protea lipozomlarını 0.4 mikronluk bir Teflon kesme kullanarak mini bir ekstrüderden 11 kez ekstrüde ederek üler vezikülleri hazırlayın. Daha sonra kolu, fazla çözeltiyi çıkarmak için bir klinik santrifüjde 1400 G'de 20 ila 30 saniye boyunca plastik yuvarlak tabanlı bir tüp santrifüjüne yerleştirin. Bundan sonra, akışı koruyarak, sütunu 13 x 100 milimetrelik bir cam tüpe yerleştirin ve sütuna 100 mikrolitre ekstrüde vezikül ekleyin.

Sütunu bir klinik santrifüj G.In 500'de bir dakika döndürün, kayıt odasına eklenecek olan akışın yaklaşık 200 mikrolitresini toplayın. Akış ölçümü yapmak için, referans odasına iki mililitre 100 milimolar potasyum klorür ve kayıt odasına 1,8 mililitre harici tampon yerleştirin. Satın alma programını başlatın.

Taban çizgisinin dengelenmesine izin verin. Bu işlem birkaç dakika sürebilir. Sinyal sabit bir taban çizgisine ulaştığında kayda başlayın.

Sistemi kalibre etmek için 15 mikrolitre tan molar potasyum klorür çözeltisi ekleyin. Sonra lipozomları ekleyin. Protea lipozomlarından dış klorürün tam olarak çıkarılmaması nedeniyle küçük bir sıçrama görülebilir.

Taban çizgisi stabilize olana kadar bekleyin. Ardından, flx'i başlatmak için CIN ekleyin. FLX'in plato yapana kadar zaman rotasını çalıştırmasına izin verin.

Bu noktada, tüm lipozomları çözmek için dış tamponda hazırlanan 40 mikrolitre 1.5 molar beta Octa glukozit ekleyin. Ardından 10 ila 15 saniye bekleyin. Kaydı sonlandırın ve metin protokolünde açıklandığı gibi veri analizine devam edin.

Yüksek iç klorür içeren lipozomlar, 300 kat klorür gradyanı üreten düşük klorüre daldırıldığında, net iyon akısı gözlenmez. Bunun nedeni, protein içermeyen lipozomların iyonlara karşı düşük içsel geçirgenliğe sahip olmasıdır. Proton bağlı klorür taşıyıcısı, C-L-C-E-C ile yeniden oluşturulan prot lipozomlardan makroskopik FLX gözlenmez.

Vesco'dan çıkan az miktarda klorür lipozomda net bir pozitif yük oluşturduğundan, CIN ilavesi potasyum iyonlarının zar boyunca hareket etmesine izin vererek elektrik potansiyelini giderir ve klorür flx'i başlatır. Reaksiyon sonlandırılır ve veziküllerde bulunan toplam klorür iyonu miktarı, yeniden yapılandırılmış tek proteinlerin özelliklerini belirlemek için ölçülür. Akış zaman seyrinin ham verileri önce milivolttan bir klorür konsantrasyonuna dönüştürülür ve daha sonra normalleştirilir, daha sonra zaman seyri uydurulur.

Akıntının zaman sabitinin 41 saniye olduğu ve C-L-C-E-C'nin sıfır aktif kopyasını içeren lipozomların fraksiyonunun 31. nokta olduğu, lipozomların yaklaşık üçte birinin bu değerlerden sıfır aktif protein içerdiğini gösteren ve en az bir C-L-C-E-C kopyası içeren veziküllerin klorür içeriğinin ölçülmesi, Saniyede yaklaşık 2.500 klorür iyonuna eşit olan C-L-C-E-C'nin üniter bir taşıma hızını belirlemek mümkündür. Bu videoyu izledikten sonra, bir nakliyecinin ciro ihtiyacını nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu deneyler dikkatli bir şekilde yapıldığında 10 ila 15 dakika içinde gerçekleştirilebilir.

Sızıntılar devir hızı tahminlerini olumsuz yönde etkilediğinden, lipozomların kalitesini dikkatli bir şekilde değerlendirmek çok önemlidir.