Name: Bir Proteoliposome Tabanlı effluks Deney Cl Tek-molekül Properties belirleme - Kanallar ve Nakliyeciler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Öğrenin, klorür kanallarının ve taşıyıcıların tek molekül özelliklerini proteolipozom tabanlı effluks deneyiyle nasıl belirleneceğini. Bu yöntem, birimsel taşıma hızını ve aktif protein kompleksinin geometrisini nicel olarak ölçer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, NIH hibe GM085232 ve Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award (A.A.'ya) tarafından desteklenmiştir.

1. Lipid Preparasyonu <ol><li> Saydam bir cam tüp içine istenilen miktarda lipit bölmeyin. Kullanım E. E. coli kutuplu lipit özü, ama en lipit bileşimler kullanılabilir. Lipidler toz biçiminde ise, 20 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar kloroform bunları yeniden süspanse edin. Bütün solvent buharlaşana kadar N2 gazı altında oda sıcaklığında lipitler kurutun. </li><li> Pentan lipitleri tekrar ve kloroform kalan izleri kaldırmak için yeniden gaz N 2 akışı kurutun. Kuru bütün solvent çekinceye kadar. Kurutma sırasında, lipid altındaki bir biçim verme yoğun kütle yerine borunun alt üçte birini örtmekte olan eşbiçimli bir film dağıtılır ve böylece tüp hafifçe döndürün. </li><li> Sulandırma tamponu içeren bir deterjan ekleme (300 mM KCI, 50 mM sitrik asit, 25 mM K 2 HPO 4, pH 4.5, 35 mM CHAPS) lipidler eritin. Protein CHAPS&#39;tan kötü hoşgörülü ise bu adım için diğer hafif deterjanlar kullanın. </li><li> ResuspenBir su banyosu sonikatör kullanarak netlik lipidler d. Kısa (30 sn-1 dk) ile kısa (30 sn-1 dk) bakliyat maksimum güçte su banyosunda sonikatör merkezinde tüp daldırın duraklar. Çözelti berrak hale gelmelidir. Not: açıklık son derece elde kullanılan spesifik yağ bileşimine bağlıdır. Da nominal olarak denk lipidler arasında bu adımda bazı partiden partiye değişkenlik, aynı zamanda mümkündür. Kalıntı bulanıklık santrifüjleme ile çıkarılabilir süspansiyonda büyük parçacıklar tarafından ışık saçılımı kaynaklanmaktadır. </li><li> 20-60 dakika boyunca oda sıcaklığında yeniden süspansiyon haline lipitler inkübe edin. </li></ol> 2. Proteoliposome Formasyonu Not: birkaç strateji lipozomlara deterjan çözülmüş protein eklemek için kullanılabilir. CLC-EC1 için diyaliz iyi çalışır ve bu nedenle tercih 6,9,10 bir yöntemdir. <ol><li> Saflaştırılmış protein ekleyin istenen protein-to-lipid ug o ifade (P / L) oranı (<html> F proteinine mg / lipid). P / L oranının seçimi deney amacına bağlıdır. <ol><li> Amaç, ilgi konusu proteinin aktivitesini değerlendirmek yüksek P tekrar oluşturmak için, her lipozom proteininin birden fazla kopyasını içerdiğinden / L ile, sinyali en üst düzeye çıkarmak için. Her bir kesecik ortalama 1 protein ihtiva edecek şekilde aktivitesi ve / veya proteinin üniter nakil oranını ölçmek için, düşük P / L&#39;nin de bir Poisson seyreltme rejiminde sulandırın. Her rejimi kullanmak için ne zaman bir daha derinlemesine analiz için Adım 7 ve Tartışma bakın. </li></ol></li><li> Farklı tedavi rejimleri için uygun P / L değerlerini belirlemek için, protein konsantrasyonu 8,11-13 bir fonksiyonu olarak aktivitesi tam bir titrasyon yapmak. Bununla birlikte, aktif biriminin moleküler ağırlığı (MW kDa olarak belirtilmiştir) için kullanılan herhangi bir protein için, aşağıdaki P / L değerleri ilk guesstimates olarak kullanılabilir bilinmektedir: pg &quot;/&gt; <img alt="Denklem 2" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq2.jpg" /></li><li> Önceden ıslatılmış diyaliz tüp veya bir kaset protein ve lipit karışımı yükleyin. 500-1,000x lipit yeniden oluşturma tampon hacmi ihtiva eden bir beher içinde diyaliz cihazı yerleştirin (yani, yağ yeniden süspanse edilmesi için 1 ml 1 L tamponu) hafif karıştırma altında. <ol><li> Değişim tampon aralıkları&gt; 3 saatte 3-4 kez. Her çözelti, değişiminde, kaset / boru ve damıtılmış su ile beher yıkayın ve taze tampon maddesi ile yeniden oluşturma beher doldurun. Çözelti değişikliği için 1-2 O / N aralıklarını ekleyin. çözüm değişiklikleri tam sayısı ve süresi kullanılan tam lipid ve deterjanlar bağlıdır. </li></ol></li><li> Son adım tamamlandıktan sonra, diyaliz tekneden lipozomlar kaldırmak tüpler onları bölmeyin ve flaş -80 ° C&#39;de sıvı N 2 veya dondurularak onları dondurmak. </li></ol> 3. Kayıt Ayarı &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; NOT: Kayıt set-up (Şekil 2A) iki odadan (düz tabanlı silindir, ~ 3-4 ml hacimli), bir Cl oluşur - elektrot, bir analog bir pH metre (aşağıya bakınız) dijital elektrik çıkışı, bir sayısallaştırıcı ve uygun bir satın alma yazılımı ile bilgisayar veya. <ol><li> PH metre elektrodu, bilgisayara bağlı olan sayısallaştırıcıya pHmetrenin çıkışını - Cl bağlayın. Bir odasında referans elektrot ve diğer (Şekil 2B) içinde recoding teli yerleştirin. NOT: ΔV Cal pozitif (Adım 6.4 ve 7.2) ise tellerin kutuplarının doğru. </li><li> Kayıt odasına (Şekil 1B) ve bir karıştırma çubuğu olan bir karıştırma plakası üzerinde odaları yerleştirin. Karıştırma çubuğu elektrot temas etmediğinden emin olun. </li><li> Bir agar köprü (Şekil 2B) (100 mM KCI ve% 2 agar) ile ölçme cihazı. 100 mM KCl Agar köprüleri saklayın. </li&gt; </ol> Cl 4. hazırlanması - Elektrot <ol><li> Eski ve -possibly- çalışmayan pH elektrodu alın. Tamamen gümüş teller ortaya çıkarmak için cam kaplama kırın. </li><li> Dikkatlice neşter bıçak kullanarak gümüş teller kaplama çıkarın. H2, O ve EtOH bol miktarda kullanarak telleri temizleyin. </li><li> Teller kadar FeCl3 (ya da ağartıcı) bir doymuş çözeltisi içinde yer AgCİ muntazam bir koyu kaplama ile kaplanmıştır. </li></ol> Tek tabakalı veziküller 5. N- <ol><li> deneyler önceki gece, dış tamponu, 15 ml (1 mM KCI, SO 4, 25 mM sitrik asit, pH 4.5, 150 mM K 2), hafif sallama ile (kımıldamam) içinde Sephadex G-50 taneleri 1 g kabarma Kullanmadan önce oda sıcaklığında en az 3 saat. Her bir deney, şişmiş boncuk ~ 3 ml gerektirir. En fazla birkaç gün 4 ° C&#39;de şişmiş boncuk tutun. </li><li> Lipozomlar oda sıcaklığında çözülmesi ederken, her sütun ~ 3 m dökmekşişmiş G-50 taneleri l. Oda sıcaklığında yerçekimi akışı ile onları kuru edelim; Bu genellikle 1-2 dakika sürer. </li><li> 0.4 m, teflon kesme kullanarak Mini-ekstruderinden proteoliposomes 11 kes ekstrude tek lamelli kesecikler hazırlanır. </li><li> Plastik yuvarlak dipli bir tüp içinde sütun yerleştirin. Fazla çözüm kaldırmak için sütunları Spin. Bir klinik santrifüj cihazında 1400 x g&#39;de 20-30 saniye santrifüjleyin. </li><li> 13 x 100 mm cam tüpe akış yoluyla yer sütun atın ve kolona ekstrüde veziküller 100 ul ilave edin. Bir klinik santrifüj cihazında 500 xg&#39;de 1 dakika için sütun dönerler. </li><li> Aşama 6.5 kayıt odasına eklenecek akış yoluyla ve ~ 200 ul toplayın. </li></ol> 6. akış ölçümü <ol><li> Referans (toprak) bölmesi içinde 100 mM KCl 2 ml ve dış tampon 1.8 ml yerleştirin (1 mM KCI, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM sitrik asit, pH 4.5), kayıt odasına. İç arasındaki hafif ozmotik dengesizlikve dış çözümler etkilemez </li><li> Satın alma programını başlatın. Bu birkaç dakika sürebilir, temel muvazene edelim. </li><li> Sinyal istikrarlı bir temel (lipozomlar hazır ve sütunlar kurumaya) ulaştığında, (Şekil 3A) kaydetmeye başlayın. </li><li> Sistem (Şekil 2A) kalibre edilmesi için bir 10 mM KCI çözeltisi 15 ul ekle. </li><li> Lipozomlar ekleyin. Proteoliposomes (Şekil 3A) - küçük atlama nedeniyle dış Cl eksik çıkarılması için görünür olabilir. Bazal stabilize kadar bekleyin. </li><li> Valinomycin ekleyin (1 mg EtOH / ml 1 ul) akış (Şekil 3A) gerçekleştirmek için kullanılır. </li><li> Akış zamanı kursu bu yaylalar kadar (Şekil 3A) çalıştıralım. </li><li> Tüm lipozomlar (Şekil 3A), çözünmesi için dış tamponu içinde hazırlanmış 1.5 M β-oktilglükozit (β-RG) 40 ul ekle. Kaydı bitirmek. </li></ol> 7. Veri Analysis <ol><li> Bir ASCII veya metin biçiminde gelen izleme dosyası dışa ve seçim analizi programına ithal. </li><li> Aşağıdaki noktaları (Şekil 3A) Gerilim ölçün: Kaydın başlangıcında (V 0); Ayarlama sinyali (V cal) ilave edildikten sonra; Lipozomlar (V lipo) ilave edildikten sonra; Efflux (V kanat) sonunda; Deterjan (V tot) ilave edildikten sonra; Temel gerilimler böylece V 0 = 0. </li><li> Deneysel değerini belirlemek için, Nernst-Plank denklemi kullanın <img alt="Denklem 3" fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq3.jpg" /> ölçülerek <img alt="Denklem 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq4.jpg" /> Nerede Cilt Cal ul kalibrasyon nabız hacmi deneyi ifade başında odası hacmi, 1.800 olduğunu1; - kalibrasyon nabız ve mM dış tampon konsantrasyonları ve ΔV cal kalibrasyon darbesi sonrasında ölçülen mV atlama l [CI] cal / Cl vardır. NOT: α Bu ampirik belirlenmesi üç amaca hizmet eder: sistem düzgün yanıt olmasını sağlar, deneyler arasındaki enstrümanın tepki tutarlılık ölçüsü sunuyor yanı sıra hiçbir hata çözüm yapımında yapılmış olduğunu kontrol etmek. </li><li> Aşağıdaki gibi her adımdan sonra Cl konsantrasyonları hesaplayın: <img alt="Denklem 5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq5.jpg" /> <img alt="Denklem 6" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq6.jpg" /> <img alt="Denklem 7" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq7.jpg" /> faktör 3/400 2000 ul nihai hacim içinde 15 ul kalibrasyon darbe seyrelmesi gelir. </li><li> CalculHer adımda, fin ΔCl lipo / / tot de [Cl] değişiklikleri yedik. </li><li> Ile Cl (t) v (t) dönüştürme <img alt="Denklem 8" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq8.jpg" /> Doğrudan kritik noktalarda [CI] değerlerini belirlemek ve bir iç kontrol olarak hesaplanan değerler bunları karşılaştırmak. </li><li> Iz Normale Cl rel = 0 lipo ve Cl rel tot = 1 böylece <img alt="Denklem 9" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq9.jpg" /></li><li> Aşağıdaki denkleme akış süresi kursu Fit: <img alt="Denklem 10" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq10.jpg" /> Deneysel olarak Cl ölçülerek belirlenir sızıntısı - - L Cl oranı olduğu durumda, aynı koşullar ve τ hazırlanan proteinsiz lipozomlardan akışını işleminin zaman sabitidir. </li><li> V, ilk hız hesaplayın: Nerede ΔCl fin milimolar ifade ve V ul odasının hacmi olduğunu. </li><li> Taşıma hızı / iletkenlik hesaplayın <img alt="Denklem 12" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq12.jpg" /> P P / L olduğu durumda, molekül ağırlığı aktif kompleks molekül ağırlığı kDa olarak ifade edilen </li></ol>

<ol><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14, 673-681 (2006).</li>
<li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li>
<li>Almo, S. C., Love, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+and+faster%3A+improvements+and+optimization+for+mammalian+recombinant+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production.</a> Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).</li>
<li>Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cells+to+improve+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering cells to improve protein expression.</a> Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).</li>
<li>Accardi, A., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+active+transport+mediated+by+a+prokaryotic+homologue+of+CLC+Cl-+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels.</a> Nature. 427, 803-807 (2004).</li>
<li>Nguitragool, W., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+of+a+CLC+Cl-%2FH%2B+exchange+transporter+by+polyatomic+anions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions.</a> J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).</li>
<li>Walden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+and+turnover+in+a+Cl-%2FH%2B+exchange+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter.</a> J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).</li>
<li>Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+currents+mediated+by+a+prokaryotic+homologue+of+CLC+Cl-+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels.</a> J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).</li>
<li>Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+required+for+H%28%2B%29%2FCl%28-%29+exchange+mediated+by+a+CLC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter.</a> Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).</li>
<li>Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+purified+human+Hv1+H%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels.</a> Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).</li>
<li>Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+TMEM16A+is+sufficient+to+form+Ca2%2B+activated+Cl-+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).</li>
<li>Malvezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-dependent+phospholipid+scrambling+by+a+reconstituted+TMEM16+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel.</a> Nature Communications. 4, 2367(2013).</li>
<li>Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basis+of+substrate+binding+and+conservation+of+selectivity+in+the+CLC+family+of+channels+and+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).</li>
<li>Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29+opens+the+defective+channel+gate+of+mutant+CFTR+in+a+phosphorylation-dependent+but+ATP-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner.</a> J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).</li>
<li>Stockbridge, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoride+resistance+and+transport+by+riboswitch-controlled+CLC+antiporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).</li>
<li>Menon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsin+is+a+phospholipid+flippase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Opsin is a phospholipid flippase.</a> Curr Biol. 21, 149-153 (2011).</li>
<li>Nimigean, C. M., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B+block+and+permeation+in+a+K%2B+channel+of+known+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure.</a> J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).</li>
<li>Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bernèche, S., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+substrate+binding+determines+the+stoichiometry+of+transport+of+a+prokaryotic+H%28%2B%29%2FCl%28-%29+exchanger%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger.</a> Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).</li>
<li>Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sided+functions+of+an+arginine-agmatine+antiporter+oriented+in+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes.</a> Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).</li>
<li>Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+a+prokaryotic+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel.</a> J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).</li>
<li>Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+bilayer+regulation+of+membrane+protein+function%3A+gramicidin+channels+as+molecular+force+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes.</a> J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).</li>
<li>Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoride-dependent+interruption+of+the+transport+cycle+of+a+CLC+Cl%28-%29%2FH%28%2B%29+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter.</a> Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).</li>
<li>Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+fluoride-specific+ion+channels+with+dual-topology+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture.</a> Elife. 2, e01084(2013).</li>
<li>Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cyclic+nucleotide+modulated+prokaryotic+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel.</a> J Gen Physiol. 124, 7(2004).</li>
<li>Brohawn, S. G., del Mármol,, J,, MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+the+Human+K2P+TRAAK%2C+a+Lipid-+and+Mechano-Sensitive+K%2B+Ion+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel.</a> Science. 335, 436-441 (2012).</li>
<li>Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+slow+CLC+Cl-%2FH%2B+antiporter+from+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium.</a> Biochemistry. 50, 788-794 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Saflaştırılmış anyon-seçici kanallar veya lipozomlar içinde yeniden taşıyıcıları aracılığı ile ulaşım - Biz detaylı Cl ölçmek için protokol tanımlanmıştır. CLC-EC1 eşanjöre - kullanılan örnek Prokaryotik H + / CI oldu. Söz konusu iyon için uygun biri ile AgCİ elektrot: Ancak, bu yöntemin hali hazırda ligandlar 12,13,15, gerilim 11,12, veya Ag değiştirerek farklı anyonik seçicilik 15,16 spor geçitleri kanalları çalışmaya adapte edilebilir. Elektrotlar Cl b...

Son iki aşırı ifade eden ve zar nakil proteinleri saflaştırmak için yeteneği önemli ölçüde artmıştır yıllarda: iyon kanalları, birincil ve ikincil taşıyıcıları rutin heterolog sentezleme sistemleri ile olduğu gibi, doğal kaynaklardan saflaştırılır. Bu proteinlerin istikrar, ifade izlemek geliştirmek ve çıkarma kolaylaştırmak ve geliştirmek için yeni yaklaşımlar sürekli 1-5 geliştirilmektedir. Bu teknolojik devrimler da, kendi işlevinin yapısal üsleri anlayışımızı gelişmiş, membran proteinlerinin atom düzeyinde yapısal bilgi patlamasını tetikleyen vesile olmuştur. Buna karşılık, bizim yetenek bazı durumlarda yüksek çözünürlüklü yapısal bilgiler, böylece kantitatif yapı-tabanlı tahminler sınamak için yeteneğini sınırlayan, nitel verilerle fonksiyonel eşlik böylece, aynı oranda artmadı saflaştırılmış proteinlerin fonksiyonel özelliklerini incelemek için. Bu nedenle, gelişme içerisindenicel ve genellenebilir fonksiyonel testlerin t membran proteini fonksiyonu mekanik temellerinin aydınlatılması yönünde önemli bir adımdır. Kanal, taşıyıcı - Burada kantitatif saflaştınldı ve yeniden Cl anahtar işlevsel özelliklerini belirlemek için kullanılabilecek bir akış deneyi tarif eder. tahlil altında yatan ilkeler taşıma sistemlerinin çeşitli yanı sıra sigara iyon-taşıma proteinlerine jeneralize olabilir. Kanal / büyük Cl mevcudiyetinde taşıyıcıları - - Lipozomlar saflaştırılmış Cı ile yeniden degrade (Şekil 1A, B). Cı - akış bizim durumumuzda, karşı-iyon akışının izin vermek için bir iyonofor ilave edilerek başlatılır K + iyonoforu Valinomycin, Cl tarafından kurulan gerilim şant olan - gradyeni ve K denge potansiyeline ilk membran potansiyeli ayarlanmış + 6,7. T olmadanBir transmembran potansiyeli nesil tarafından engellenir gibi akış oluşur, - o anlamlı net Cl iyonofor&#39;un. - efflux, f 0, aktif protein içermeyen lipozomlar fraksiyonu τ, Cl zaman sabiti: Veri kantitatif iki ölçülebilir parametreler (Şekil 1C) ile tarif edilir. Τ ve f 0 yekpare Cı kaynaktan - taşıma hızı, aktif protein fraksiyonu ve aktif kompleks moleküler kütlesi 8 elde edilebilir. Bilinen yapısı ve fonksiyonu değiştirici - tekniği CLC-EC1, iyi karakterize CLC-tipi H + / Cl ile yeniden proteoliposomes kullanarak burada gösterilmektedir. Bu tahlil kolaylıkla aktivite gerilimi ve / veya ligandların varlığına bağlıdır farklı iyonik seçicilik veya kanallar veya nakliyecilere genelleştirilmiş. Bundan başka, bu deney, küçük moleküller, doğrudan yeniden protein etkileyip etkilemediğini belirlemek için kullanılabilir,Bu bileşiklerin ve nasıl membran bileşimi veya lipid-modifiye reaktifler yeniden kanalların ve taşıyıcıların fonksiyonunu etkileyebilir etkilerini ölçmek için.

<table><tbody><tr><td>Liposomicator, Avanti Polar Lipidler A.Ş.</td><td>&nbsp; Avanti Polar Lipidler A.Ş.</td><td>610200</td><td></td></tr><tr><td>IEC Centra CL2 Masaüstü</td><td>Termo Bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orion Araştırma Modeli 701A Dijital pH-mV ölçer</td><td></td><td></td><td>Bunlar Ebay'de bulunabilir.</td></tr><tr><td>İşlevsel olmayan pH probu</td><td></td><td></td><td>Gümüş telli herhangi bir pH metre probu çalışacaktır. Cam/plastik kaplamanın çıkarılması ve tellerin temizlenmesi gerekir.</td></tr><tr><td>DI-710 Veri Kaydedici</td><td>DATAQ cihazları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WinDAQ edinme yazılımı</td><td>DATAQ cihazları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce Tek Kullanımlık Plastik Kolonlar, Yerçekimi akışlı, 2ml</td><td>Pierce (Thermo Scientific)</td><td>29922</td><td></td></tr><tr><td>KIMAX Kültür Tüpleri, Tek Kullanımlık, Borosilikat Cam</td><td>Kimble Chase</td><td>73500-13100</td><td></td></tr><tr><td>Tutucu/Isıtma Bloklu</td> <td>Ekstruder SetiAvanti Polar Lipidler A.Ş.</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Bilgisayar</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bir proteoliposome tabanlı effluks deney cl tek-molekül properties belirleme<sup&gt; -</sup&gt; kanallar ve nakliyeciler

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Son 15 yıl, ökaryotlardan olduğu kadar prokaryotik organizmalardan gelen zar proteinlerini de aşırı eksprese etme ve saflaştırma yeteneğinde bir patlama ile karakterize edildi. Bu artış, büyük ölçüde, zar proteinleri hakkında yapısal bilgi elde etmek için yapılan başarılı itici güçten kaynaklanmaktadır. Bununla birlikte, bu proteinleri işlevsel olarak sorgulama yeteneği aynı oranda ilerlememiştir ve genellikle sınırlı kantitatif değere sahip kalitatif tahlillerle sınırlıdır, böylece sağlayabilecekleri mekanik içgörüleri sınırlar. Sulandırılmış Cl-kanallarının veya taşıyıcıların taşıma aktivitesini kantitatif olarak araştırmak için bir tahlil açıklanmaktadır. Tahlil, membran potansiyelini şöntlemek için K+ iyonofor valinomisinin eklenmesini takiben proteolipozomlardan Cl-'nin akış hızının ölçülmesine dayanmaktadır. İstenen protein ile yeniden oluşturulan proteolipozomlardan iyon akışının zaman seyrini takip etmek için iyona duyarlı bir elektrot kullanılır. Yöntem, üniter taşıma hızı, aktif proteinin fraksiyonu ve fonksiyonel birimin moleküler kütlesi gibi yeniden yapılandırılmış proteinin temel özelliklerinin kantitatif olarak belirlenmesine izin verdiği için mekanik çalışmalar için oldukça uygundur. Tahlil ayrıca, sulandırılmış proteini doğrudan inhibe eden/aktive eden küçük moleküllü bileşiklerin etkisini belirlemek ve ayrıca membran bileşiminin veya lipid modifiye edici reaktiflerin modülatör etkilerini test etmek için de kullanılabilir. Mümkün olduğunda, bu yöntem kullanılarak elde edilen sonuçlar arasında doğrudan karşılaştırmanın, elektrofizyolojik yaklaşımlar kullanılarak elde edilenlerle iyi bir uyum içinde olduğu bulunmuştur. Teknik, model sistem olarak CLC tipi bir H+/Cl- değiştirici olan CLC-ec1 kullanılarak gösterilmiştir. Akış testi, herhangi bir Cl ileten kanal / taşıyıcıyı incelemek için kullanılabilir ve minimum değişikliklerle, herhangi bir iyon taşıyan proteini incelemek için uyarlanabilir.

Değiştirici, lipozomlar içinde yeniden - saflaştırılmış CLC-EC1, bir prokaryotik CLC-tipi H + / Cl aracılığı taşıma - Biz detaylı ve sağlam Cl ölçmek için protokol açıklar. Deneyin şematik bir temsili Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir, saflaştırılmış CLC-EC1 ve yüksek iç Cl ihtiva ile yeniden Proteoliposomes -., Düşük Cl ihtiva eden bir banyo çözeltisine daldırıldığı -. Bu koşullar, net Cl altında - akış lipozom içinde verilebilir (Ş...

Proteolipozomlar, iyi tanımlanmış bir biyokimyasal ortamda yeniden oluşturulan saflaştırılmış kanalları ve taşıyıcıları incelemek için kullanılır. Bu proteinlerin aracılık ettiği akışı ölçmek için deneysel bir prosedür gösterilmiştir. Sulandırılmış proteinin fonksiyonel özelliklerini kantitatif olarak belirlemek için proteolipozomları hazırlama, kayıtları gerçekleştirme ve verileri analiz etme adımları açıklanmaktadır.

Bir Proteoliposome Tabanlı effluks Deney Cl Tek-molekül Properties belirleme<sup&gt; -</sup&gt; Kanallar ve Nakliyeciler

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Bu prosedürün genel amacı, yeniden oluşturulmuş klorür kanallarının veya taşıyıcılarının transport aktivitesini kantitatif olarak belirlemektir. Bu işlem, öncelikle saflaştırılmış taşıyıcının, dış klorür iyonları uzaklaştırılarak dışa yönlü bir iyonik gradyan oluşturulduktan sonra, her bir lipozomun aktif kompleksin sıfır veya bir kopyasını içereceği düşük bir yoğunlukta lipozomlara yeniden aktarılmasıyla gerçekleştirilir; ardından lipozomlar, klorür konsantrasyonunun klorür duyarlı bir elektrot kullanılarak izlendiği kayıt odasına eklenir. Sonrasında, membran potansiyelini ortadan kaldıran bir potasyum ionoforu olan Valinomisin'in eklenmesiyle lipozomlardan klorür akışı başlatılır.Sinyal kararlı duruma ulaştığında, lipozomları çözmek için deterjan eklenerek deney sonlandırılır. Nihayetinde, saflaştırılmış bir kanal veya taşıyıcı ile yeniden oluşturulmuş protea lipozomlarından klorür çıkış hızının ölçülmesiyle, birim taşıma hızı ve aktif protein kompleksinin stokiyometrisi nicel olarak belirlenebilir. Bu tekniğin, floresan tabanlı akış ölçümleri gibi mevcut diğer yaklaşımlara göre temel avantajı, yeniden oluşturulan taşıyıcının birim devir hızı ve kompleksin geometrisi gibi temel parametrelerin bu teknikle nicel olarak belirlenebilmesidir.Bu yöntem, söz konusu temel parametrelerin kantitatif ölçümlerini sağlamanın yanı sıra, küçük molekül mutasyonlarının etkisini hızlı ve hassas bir şekilde belirlemek ve yeniden oluşturulmuş transfer proteinindeki alt birimleri izlemek için de kullanılabilir. Kayıt düzeneği; iki hazne, bir klorür elektrodu, analog veya dijital elektriksel çıkışlı bir pH metre, bir dijitalleştirici ve uygun veri toplama yazılımına sahip bir bilgisayardan oluşur. Klorür elektrodunu pH metreye, ardından pH metrenin çıkışını bilgisayara bağlı olan dijitalleştiriciye bağlayın.Referans elektrodu bir hazneye ve kayıt telini diğer hazneye yerleştirin. Ardından, kayıt haznesindeki manyetik balıkla birlikte hazneleri bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin. Manyetik balığın elektroda temas etmediğinden emin olun.Deneylerden önceki gece odacıkları bir agar köprüsü ile bağlayın; kullanmadan önce bir gram cidex G 50 boncuğunu, oda sıcaklığında en az üç saat boyunca hafifçe çalkalayarak 15 mililitre dış tampon içerisinde şişirin. Lipozomlar oda sıcaklığında çözünürken, her deney için yaklaşık üç mililitre şişmiş boncuk gereklidir. Her bir kolona yaklaşık üç mililitre şişmiş G 50 boncuğu dökün.Kendi ağırlıklarıyla kurumaya bırakın. Oda sıcaklığında akışa izin verin. Bu işlem genellikle bir ila iki dakika sürer.Ardından, protea lipozomlarını 0,4 mikronluk bir Teflon kesici kullanarak bir mini ekstrüderden 11 kez geçirerek unilamelar vezikülleri hazırlayın. Daha sonra, fazla çözeltiyi uzaklaştırmak için kolonu plastik yuvarlak tabanlı bir tüpe yerleştirip klinik bir santrifüjde 1400 G'de 20 ila 30 saniye santrifüjleyin. Bunun ardından, akışı koruyarak kolonu 13 x 100 milimetrelik bir cam tüpe yerleştirin ve kolona 100 µL ekstrüde edilmiş vezikül ekleyin.Kolonu 500 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Klinik bir santrifüj kullanarak, kayıt odasına eklenecek olan akış sıvısından yaklaşık 200 µL toplayın. Effluks ölçümü gerçekleştirmek için, referans odasına iki mL 100 mM potasyum klorür ve kayıt odasına 1,8 mL eksternal tampon ekleyin. Veri toplama programını başlatın.Baz hattının dengelenmesini bekleyin. Bu işlem birkaç dakika sürebilir. Sinyal kararlı bir baz hattına ulaştığında kayda başlayın.Sistemi kalibre etmek için 10 mM potasyum klorür çözeltisinden 15 µL ekleyin. Ardından lipozomları ekleyin. Protea lipozomlarından harici klorürün tam olarak uzaklaştırılamaması nedeniyle küçük bir sıçrama görülebilir.Bazal seviye stabilize olana kadar bekleyin. Ardından, flx başlatmak için CIN ekleyin. FLX'in plato seviyesine ulaşana kadar zaman seyri boyunca çalışmasına izin verin.Bu aşamada, tüm lipozomları çözmek için harici tampon içerisinde hazırlanmış 40 µL 1.5 M beta Octa glucocide ekleyin. Ardından 10 ila 15 saniye bekleyin. Kaydı sonlandırın ve metin protokolünde açıklandığı şekilde veri analizine geçin.İçerikleri yüksek klorür içeren lipozomlar, 300 katlık bir klorür gradyanı oluşturacak şekilde düşük klorürlü ortama daldırıldığında, net bir iyon akışı gözlemlenmez. Bunun nedeni, protein içermeyen lipozomların iyonlara karşı düşük içsel geçirgenliğe sahip olmasıdır. Protonla eşleşmiş klorür taşıyıcısı C-L-C-E-C 1 ile yeniden yapılandırılmış protolipozomlardan herhangi bir makroskobik FLX gözlemlenmez.Veziküllerden çıkan az miktardaki klorür, lipozomda net bir pozitif yük birikimine neden olduğundan, CIN eklenmesi potasyum iyonlarının membrandan geçmesine izin vererek elektriksel potansiyeli hafifletir ve klorür akışını başlatır. Reaksiyon sonlandırılır ve tekil rekonstitüe proteinlerin özelliklerini belirlemek için veziküllerde bulunan toplam klorür iyonu miktarı ölçülür. Eflluks zaman seyri ham verileri önce milivolt'tan klorür konsantrasyonuna dönüştürülür ve ardından normalize edilir; sonrasında zaman seyri eğrisi uydurulur.Eflluks zaman sabitinin 41 saniye olduğu ve sıfır aktif C-L-C-E-C 1 kopyası içeren lipozomların oranının 0,31 olduğu belirlenmiştir; bu değerler, lipozomların yaklaşık üçte birinin sıfır aktif protein içerdiğini göstermektedir. Bu değerlerden ve en az bir kopya C-L-C-E-C 1 içeren veziküllerin klorür içeriği ölçülerek, C-L-C-E-C 1 için saniyede yaklaşık 2.500 klorür iyonuna eşit bir birim taşıma hızı belirlemek mümkündür. Bu videoyu izledikten sonra, bir taşıyıcının döngü hızının (turnover) nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir. Bu deneyler, dikkatli bir şekilde yürütüldüğünde 10 ila 15 dakika içinde tamamlanabilir.Sızıntılar, devir hızının tahminlerini olumsuz etkilediğinden, lipozomların kalitesinin dikkatle değerlendirilmesi kritik öneme sahiptir.

a-proteoliposome-based-efflux-assay-to-determine-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz gramicidin kanal aktivitesinin bir ölçüsü olarak floresan su verme hızı monitörleri hızlı bir floresan bazlı analiz tanıtmak. Gramicidin kanalları, çift katlı kapsayan proteinler tarafından algılanan, çift katlı lipid özellikleri değişiklikleri izlemek için moleküler kuvvet dönüştürücüler olarak kullanılır.

Gramicidin tabanlı Floresan Testi; çift katlı lipid Özellikleri değiştirmek için Küçük Moleküller Potansiyel Belirleme

Bu protokol, büyük unilamellar lipid veziküller içine peptid translokasyonu kantitatif ölçmek için bir yöntem. Bu yöntem ayrıca membran translokasyon oranı hakkında bilgi sağlar ve çift katlı lipit katmanını etkin ve kendiliğinden geçtiğini peptidler tanımlamak için kullanılabilir.

Büyük Unilamellar Veziküller Ölçme Peptid Translokasyon

Biz, Pseudomonas aeruginosa'dan akış pompaları in vitro incelenmesi için bir protokol mevcut. Bu protokol, lipozom zarı içinde sağlam, tersinir ve ayarlanabilir proton gradyanının oluşturulması için izin verir ve bu nedenle protomotive güç ile enerji herhangi bir zar proteini için uyarlanabilir olmalıdır.

Pseudomonas aeruginosa itibaren MexAB dışa atım pompa in vitro olarak incelenmesi

Burada anlatılan Kistik Fibrozis kusurlu olan bu klorür kanalı, etkinliğini korur saflaştırılmış yabani tip ve mutant CFTR proteininin fonksiyonel yeniden bir hızlı ve etkili bir yöntemdir. CFTR aracılık ettiği yeniden proteoliposomes gelen iyodür akış kanalı aktivitesinin çalışmaları ve küçük moleküllerin etkilerini sağlar.

Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

Sunulan protokol, gözenekleri kapsayan solvent içermeyen lipid çift katmanları kullanılarak tek taşıyıcı seviyesinde membran protein aracılı taşımanın analizini açıklar. Bu, yüksek derecede paralel veri toplama ve analizi ile birleştirilen toplu olarak üretilen nanopor dizi çiplerinin oluşturulmasıyla elde edilir ve gelecekte membran protein efektör taramalarının kurulmasını sağlar.

Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Opsin ile sulandırılmış büyük unilameller lipozomlarda fosfolipid karıştırmayı ölçmek için floresan bazlı bir test tarif ediyoruz.

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Burada, proton translocation moleküler mekanizması tek lipozomlar, lipid membranlar üzerinde çalışmak için bir protokol sitokrom bo3  örnek olarak kullanarak mevcut. Birleştirerek elektrokimya ve floresan mikroskopisi, lumen tek veziküller, tek içeren veya birden fazla enzim, pH değişiklikler algıladı ve ayrı ayrı analiz.

Proton pompalama membran enzimler elektrokimya ve floresan mikroskopisi kullanılarak incelenmesi için tek lipozom ölçümleri

Bu protokol lipozomların imalatını ve bunların bir yüzeyüzerinde nasıl hareketsiz hale getirilebildiğini ve floresan mikroskopi kullanılarak büyük bir paralel şekilde tek tek nasıl görüntülenebileceğini açıklar. Bu, popülasyonun tek lipozomları arasındaki boyutun ve bileşimsel homojenliğin nicelikselleştirilmesine olanak sağlar.

Bireysel Lipozomlar Arasındaki Bileşimsel Homojenliği Saptamak için Kantitatif Floresan Mikroskopesi Bazlı Tek Lipozom Testi

Nanobodies yapısal biyolojide önemli araçlardır ve tedavilerin gelişimi için büyük bir potansiyel oluşturur. Bununla birlikte, inhibitör özelliklere sahip nanobodies seçimi zor olabilir. Burada elektrojenik membran taşıyıcılarını hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan nanobodların sınıflandırılması için katı destekli membran (SSM) tabanlı elektrofizyolojinin kullanımını gösteriyoruz.

Katı Destekli Membran (SSM) Tabanlı Elektrofizyoloji ile Taşıyıcı Hedefli inhibitör nanobodies seçimi

Lipozomal membran geçirgenliğini değerlendirmek için geleneksel tekniklere göre üstün hassasiyet ve çözünürlükle uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz. Yeni bir kapsüllenmiş ligand ikame reaksiyonu kullanan bu teknik, model membranlarda fosfolipaz A2 ile indüklenen değişiklikleri tespit eder. Standart analizlerle kolayca entegre edilen bu erişilebilir yaklaşım, membran biyofiziği ve toksin etkileşimlerini incelemek için çözünürlüğü artırır.

Fosfatidilinositol Fosfat Gruplarının Venom PLA2'nin Membranotropik Etkisi Üzerindeki Etkilerini Araştırmak için Bir Lipozom Membran Geçirgenlik Testi

Öğrenin, klorür kanallarının ve taşıyıcıların tek molekül özelliklerini proteolipozom tabanlı effluks deneyiyle nasıl belirleneceğini. Bu yöntem, birimsel taşıma hızını ve aktif protein kompleksinin geometrisini nicel olarak ölçer.

Bir Proteoliposome Tabanlı effluks Deney Cl Tek-molekül Properties belirleme

Daha fazla video keşfet