Name: Kimyasal Fiksasyon X-ışını Floresans Görüntüleme Değme Hücreleri hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Keşfedin, X-ışını floresans mikroskobisi ile adezyon hücrelerinde metal dağılımını görüntülemek için kimyasal fiksasyon protokolünü. Silikon nitrür pencereler üzerinde hücre yetiştirme ve örnek hazırlama adımlarını öğrenin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Stefan Vogt'a bu yazıda gösterilen temsili verilerin yerleştirilmesindeki yardımı ve yardımcı tartışmalar için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Chris Jacobsen'e QJ'ye verdiği destek için teşekkür eder. 
Argonne Ulusal Laboratuvarı'nda Gelişmiş Foton Kaynağı, 2-ID-E ve 8-BM-B ışın hatlarının kullanımı, ABD Enerji Bakanlığı, Bilim Ofisi, Temel Enerji Bilimleri Ofisi tarafından Sözleşme No. kapsamında desteklenmiştir. DE-AC02-06CH11357.

Göstergeler, Materyalden, Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık <ol><li> Silikon nitrür (Si 3 N 4) pencere Taşıma. <ol><li> Öte yandan, kapsül diğer ucunu dönerken, hafif, pencerenin kendisinin sıkmak üzere olan bir şekilde bir pencere ihtiva eden bir ucu sıkarak kapsül açın. </li><li> Ters bir çift kontrol, stereomicroscope altında ince uçlu cımbız ucunda hiçbir yapıştırıcı, boşluklar veya virajlı olmadığından emin olmak için. Aksi takdirde, pencere cımbız ile kırık veya sonraki adımları sırasında onları uçtuğunu olabilir. </li><li> Yavaşça pencerenin kenarları çıkıp gereken yere kapsül geniş yapmak amacıyla bir yönde basınç uygulayarak açık uca yakın kapsülü sıkarken, dikkatle cımbız ile pencerenin çerçevesini tutarak kapsülden pencereyi çıkarın. </li></ol></li><li> Pencere ön yıkama (opsiyonel). <ol><li> Hafifçe batırarak, ön yıkama pencere Eğer istenirse% 70 etanol içinde 2 dakika yıkama ve% 100 etanol içinde 2 dakika yıkama ve ardından 5 saniye için damıtılmış su içine. </li></ol></li><li> Iliştirilmesi ve kültür çanak pencereleri sterilize. <ol><li> Pencereleri tutturmak için, kültür çanak altındaki düz tarafı yukarı pencereyi ayarlamak, temiz bir cam slayt bir parça bant koyun. Bandın uzun kenarı aşağı çeyrek inç şerit kapalı yaklaşık kesin. Temiz bir jilet ile (&quot;¾ tarafından&quot; ⅛ at) kısa tarafı kapalı bant bir dilim alın. </li><li> Izgara veya pencerenin kenarına bant dilim uygulamak için cımbız kullanın. Güvenli pencere açıklığı kendisini kapsayan olmadan uymak için yeterli kullanın. Cımbız ile yapıştırılır bant kurgulama, kültür çanak alt üzerine aşağı pencere ayarlayın. Sıkıca kültür çanak alt bandı yapıştırmak için cımbız ucu kullanın. </li><li> Diğer kenarına başka bir teyp şeridi uygulayın ve sıkıca cımbız ucuyla altına bu uygun. </li><li> Bir kez tüm pencereleri vardırbantlanmış, ultraviyole (UV) radyasyon ile kültür yemekleri pencereleri sterilize. Yaklaşık 1 saat boyunca bir laminar akış başlığı içinde UV lambası altında çanak yerleştirerek başarmak. </li><li> Pencere, poli-lisin ile önceden kaplanmış edilecek (İsteğe bağlı), yani pencere Sterilizasyondan sonra yoktur. Kaplama, daha sonra 10 37 ° C kuluçka makinesi içinde, 1 saat boyunca steril% 0.01 Poli-L-lisin çözeltisinin ul ve pencere kültür ortamı ile geri kalan çözelti ile durulama. </li></ol></li><li> XFM önce son yıkama için tamponlar hazırlayın. <ol><li> Tris-glükoz ya da piperazin-N ya da hazırlama N-bis (etansülfonik asit) (BORU), kalsiyum ve magnezyum içermeyen Dulbecco fosfat tampon tuzlu suyla (D-PBS) ile osmolalite ve pH eşdeğer olan herhangi bir eser metallerin serbest tampon -sucrose. Hücreler kimyasal sabit sonra hücrelerin durulama için bu tamponlar birini kullanın. <ol><li> Tris-glükoz çözeltisi (10 mM Tris, 260 mM glukoz, 9 mM asetik asit) yapmak glukoz 1.4 g Tris baz, 36 mg eklemek veUltra-saf su, 20 ml asetik asit ve 16 ul. Daha sonra, aşırı saf su ile 30 ml nihai hacim ayarlayın. Hiçbir pH ayarlaması gereklidir. Bir haftaya kadar oda sıcaklığında saklayın. </li><li> BORULARI sakaroz (20mM PIPES, 200 mM sükroz) BORU 0.18 g ve ultra saf su 20 ml sükroz 2.0 g&#39;ı eklenmekte ve konsantre asetik asit ve küçük miktarlarda pH&#39;ı 7.4&#39;e ayarlayın yapmak. Daha sonra, aşırı saf su ile 30 ml nihai hacim ayarlayın. Bir haftaya kadar oda sıcaklığında saklayın. Not: son durulama PBS kullanarak engellemek için bir neden PBS fosfat, klorür ve potasyum konsantrasyonları tamamen hava ile kurutma işleminden önce çıkarılması değilse bu XFM engelleyebilir kadar yüksek olmasıdır. </li></ol></li></ol></li><li> Hücre kaplama için tampon hazırlayın. <ol><li> Hazırlama veya RPMI ortamı 1640 gibi tüm medya, çıkarma, 1x tripsin-EDTA çözeltisi, D-PBS, ve normal olarak yapışmış olan hücrelerin O pasaj için yapıldığı gibi, özellikle yapışkan hücre hattı için gereken başka herhangi bir reaktiff faiz ve 37 ° C onları sıcak. </li></ol></li></ol> Hücreler 2. Kaplama <ol><li> Laminar akış başlığı içinde pencere ihtiva eden sterilize edilmiş kültür kabı için, hafifçe eğimli bir zeminde onunla kültür çanak tarafındaki, ortam (100 mm kültür çanağı için 10 mi) ilave edin. Gereksiz yüzey gerilimini oluşturma veya silisyum nitrür pencere yüzeyine doğrudan medya bırakarak kaçının. Medya ilave olarak, yavaş yavaş kaplamak eğim açısı medya ile ızgara ve pencere rahatlatmak. </li><li> Trypsinizing veya hücre hattı pasaj için her zamanki gibi plakalar kapalı hücreler kazıma, uygun faiz yapışık hücre hattı hazırlayın. Taze plaka hücreleri uygulamadan önce gerekli herhangi bir hücre sayımı, ya da diğer hazırlık yapın. </li><li> Tipik haliyle, 24-72 saat içinde% 50-% 70 izdiham ulaşmak için gerekli olan bir hücre yoğunluğunda pencereli kültür tabağına hücreleri ekleyin ve% 5 karbon dioksit ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li&gt; <li> Istenilen hücre yoğunluğuna kadar (genellikle 50% -70% izdiham) ulaşıldığında, bir ters ışık mikroskobu kullanılarak, zaman zaman hücrelerin büyümesini dikkate alınmalıdır. </li></ol> Hücreler 3. Sabitleme <ol><li> Satın alınan stok (örneğin,% 25 paraformaldehit) seyreltilmesi ve (numuneye aşırı sodyum ilave önlemek için), asetik asit ile 7.4&#39;e pH değerinin ayarlanması ile D-PBS içinde% 4 paraformaldehid, taze hazırlayın. </li><li> Hücreler istediğiniz gibi yetiştirilen ve (örneğin Hoescht gibi) herhangi bir hayati lekeler uygulanmış ve görüntülü edildiğinde, tek elle bir 45 ° açıyla çanak eğerek, nazik aspirasyon ortamı çıkarın ve diğer el pipet ile aspire . NOT: yerine pipet harcanan medya, alternatif, pencere pick up kez D-PBS ile mikrosantrifüj tüpler içine pencere daldırma ve sonra PBS yıkama 2 kat, ardından 20 dakika boyunca sabitleyici çözümleri ile yeni bir kültür kabına onu yerleştirmektir artık fiksatif kaldırmak için. Bu seçilirse, dir gitmekectly 3.5 adıma. </li><li> D-PBS ile hafifçe çanak durulayın ve yemeğin tarafına doğru, 45 ° açıyla pipetlenmesini çanak tutarak yavaşça taze% 4 PFA / PBS ekleyerek, ve yavaş yavaş izin eğim açısını rahatlatıcı hemen kaldırıldı sıvı yerine sabitleştirici çözüm pencereleri kapatmak için. Oda sıcaklığında 20 dakika için sabitleyici ile kaplı hücreler tutun. </li><li> Biraz çanak eğerek ve elle aspire, yukarıdaki gibi yine, nazik aspirasyonu ile sıvı çıkarın. </li><li> Yavaşça, BORU / sakaroz çözeltisi bazı ekleme Adım 3.3 tarif devirme ve pipetleme yöntemi kullanılarak uzaklaştırıldı sıvıyı değiştirin. </li><li> Tekrar 3.4 ve 3.5 adımları. </li><li> Kurutma için malzeme hazırlayın. <ol><li> Böyle Kimwipes gibi tüy bırakmayan havlu toplayın, ve çok hızlı ve kolay kullanışlı böylece kutunun bir out çekin. </li><li> Pencere kurumaya ayarlamak için bir temiz olmayan düz bir yer hazırlayın. Sırtlar yüzden sahip elektron mikroskobu kullanılan türden, bir lastik ızgara hasır Setkuruduktan ise pencere bir ucunda sütyen olabilir. Bu kurudukça kurutma yüzeyine yapışmış getting pencere tutmak, ve numune kenarına kalan tampon drenaj olacaktır. </li></ol></li><li> Dikkatle sıvı pencereden dışarı tutmak için pencereye bağlı bandı tweeze. Ters cımbız ile onları toplayıp sonra onları yüzer almak için BORULARI / sakaroz küçük bir miktar uygulayarak tarafından bant dökülmek pencereleri alın. </li><li> Dikkatle iyice ve (pencere kendisi dokunmadan) bir Kimwipe ile pencerenin kenarından taşan BORULARI / sakaroz sıvamak. Ayrıca Kimwipe bir yuvarlak kat kullanarak arka girintili alan sıvamak. Not: amacı mümkün olduğunca pencere yüzeyinde tuzları veya tamponlar gibi az kristalleşme sahip olmaktır. </li><li> Izgara hasır üzerine pencereyi yerleştirin. Pencere ızgara mat düz yalan değil emin olun, ama (ızgara mat sırtlar kullanarak) ve ızgara gibi küçük dokunmadan bir kenarında sütyenmümkün mat. Pencere kurumasını bekleyin. </li></ol> 4. Numune Montaj ve Görüntüleme <ol><li> Örnek kuruduktan sonra, bir ışık mikroskobu kullanarak windows hücrelerin varlığını doğrulamak. Bir sinkrotron ulaşım için numune hazırlamadan önce, bu doğrulamayı gerçekleştirin. </li><li> Denemenizi barındırma sinkrotron beamline ulaşım için pencereleri paketleyin. Yavaşça, sonra bir cam slayt iki tarafta bant ile yapıştırın pencereler plastik Petri kabı alt bant ile cam slayt yapıştırın. Petri kabı kapalı Teyp. NOT: Bu noktadan önce, bu aşamalar herhangi bir tipik laboratuarda gerçekleştirilebilir. Aşağıdaki adımlar en iyi şekilde bir sinkrotron beamline yapılabilir olacaktır. </li><li> Cımbız ile hafifçe penceresinden bandı çıkarın. Sinkrotronu de beamline işbirlikçileri tarafından sağlanan bir alüminyum sahibine pencereleri güvenli, pencerenin kenarında ince bir hatta kaplamada, oje kullanın. </li><li> Içine alüminyum tutucu yerleştirinkinematik bir montaj ve X-ışını mikroskop konuma yerleştirin. Beamline de örnek odasının içine, motorlu aşamaları bağlayarak bir destek üzerine monte örnek. </li><li> Örnek X-ışını mikroskobu enstrüman alanı (kurşun dolu duvarlar yapılmış bir baraka), kurulum tarama çıktıktan sonra. Bir video çapraz saç ile donatılmış bir kamera kullanarak örnek üzerinde X-ışını konumunu görüntülerken, tarama numunenin uygun alanı seçmek, beamline özel bir yazılım kullanılarak önceden hizalanmış bir alt scintillator kamera ile. </li><li> Çevrede küçük özelliği büyüklüğü bir tahmine dayalı bir numune için uygun çözünürlük, seçin. Tek memeli hücrelerini görüntüleme için (~ boyutu 20-40 mikron), 0,25-0,5 mikron çözünürlük kullanın. Dokuların alanları görüntülenmesi ve birbirinden hücre tabakaları ayırmak için, 2-20 um çözünürlüğü kullanır. </li><li> Araya miktarının bir tahmine dayalı numune için uygun bekleme süresi, SeçinFaiz mevcut ark. Metallerin yüksek miktarlarda varsa hızlı bir bakış tarama için, ya da, piksel başına 30-300 msn bekleme süreleri ile sinek taramaları kullanın. Az malzeme varsa, ya da, düşük bağıl bolluğu metaller ölçmek piksel başına 1-2 sn bekleme süreleri ile adım taramaları kullanmak için. </li><li> Beamline özel yazılım içine taramaları Program. Bir raster tarama görüntü elde. Her element için karakteristik enerji zirveleri tespit edecek yazılımı ile verileri analiz etmek beamline işbirlikçileri ile birlikte çalışın. </li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

X-ışını floresans görüntüleme yerbilimleri, malzeme bilimi ve kimya biyoloji 26-34 olmak üzere birçok alanda, yararlıdır. Sinkrotron X-ışınları gelişmeler ve onların odaklanarak, çok yüksek yoğunluklu ışınları üretmişlerdir. Odaklı X-ışını mevcut silikon sürüklenme detektörü teknolojisi ile ölçülebilir sinyalinin oluşturulması, şu anda varolan hücreler endojen metallerin uyarmak için yeterli kirişler. Ve hücrede metallerin kimyasal biyoloji okuyan bu alandaki son gelişmelerin birçoğu kullanan özellikle bir uy...

Floresan Görüntüleme kimlik ve bir numunede bulunan elementlerin nicelik sağlar X-ışını uzaysal çözülmesi. Olay X-ışınları, ilgi konusu ağır elemanının bağlanma enerjisi elektron daha büyük olacak şekilde seçilir, bir enerji, hücre çekirdeğinin 1 iç kabuk elektronların bağlanma enerjisi üstesinden gelir. Bu elektron kabuğu bir &#39;delik&#39; oluşturur. Yüksek enerjili elektronlar bu deliklerin içine düşmek gibi, floresan X-ışınları dalga boyu bu orbitallerinin enerji ayrımı bağlıdır yayılır. Orbital enerji aralığı, belirli bir elemanın karakteristik olduğu için, X-ışını floresans emisyon da aletin göre karakteristik dalga boylarında, yer alır. Mevcut elemanların belirlenmesini sağlar karakteristik dalga boyunda bu emisyon olduğunu. Floresan yoğunluğunun kalibrasyonu bulunan elementlerin kantitatif sağlar. X-ışını flüoresans mikroskopy (XFM) kısmen böyle Bahar-8 Japonya&#39;da, Avrupa Radyasyon Sinkrotron Tesisi Fransa&#39;da (SDBY), ve İleri Foton Kaynağı (olanların çok parlak X-ışını sinkrotron kaynaklarının gelişimine, giderek kullanılan haline gelmiştir ABD&#39;de 2 APS). Bu kaynaklar çok yüksek yoğunluklu X-ışını kirişler sağlamak. Aynı zamanda, böyle bir bölge plaka teknolojisi gibi X-ışını optik gelişmeler, oldukça verimsiz 3 olsa, alt-mikron noktalar bu kirişlerin odaklanarak izin. Çok yüksek yoğunluklu kirişler, mevcut detektör teknoloji ile ölçülebilir hücrelerde endojen metallerin uyarmak için yeterlidir odaklanabilir ışık bile nispeten küçük bir miktarı, üretim sinyali ile. Böylece, hücrenin içindeki metallerin kimyasal biyoloji okuyan bu teknikle 4-10 son gelişmelerin birçoğu kullanan özellikle bir uygulamadır. App sırasında dikkate alınması gereken birçok kritik faktör vardırXFM yatan kültürlenmiş memeli hücreleri veya diğer biyolojik örneklerin temel dağılımı ve miktarının araştırılması. İlk olarak, numune anlamlı olması için ölçme amacıyla, hem yapısal ve elementel kompozisyon bakımından, sağlam tutulması gerekir. Bu odaklanmış bir X-ışını neden olabilir, radyasyona karşı dayanıklı olacak şekilde İkinci olarak, örnek de bir şekilde korunmalıdır. Bir örnek bir seferde bu iki ölçütü karşılayan bir yolu, hızlı bir şekilde camsı, amorf buz 11,12 içine dondurulacaksa. Hızlı dondurma genellikle dalma dondurma ya da yüksek basınçlı 13-16 dondurma gibi çeşitli dondurarak saklama teknikleri ile elde edilir. Genellikle, dondurarak saklama mümkün yerli halde yakın olarak biyolojik numunelerde toplam hücresel bir yapıya ve kimyasal bileşimleri muhafaza ettiği kabul edilmektedir. Hücrelere ve dokulara fiksatif yavaş ve seçici penetrasyon nedeniyle diğer taraftan Kimyasal sabitleme, well membran geçirgenliği olarak sonradan yapılacak değişiklikler, çeşitli hücresel iyonları özellikle Cl, Ca ve K gibi yayılabilir iyonlar böylece 17-19 suboptimaldir bu unsurların soruşturma render, süzülür kayıp ya da taşındı izin verebilir. Özellikle yapışık memeli hücrelerinde genel olarak kimyasal sabitleme, üzerinde cryo-tespitin net avantajına rağmen, Kriyoprezervasyonun çeşitli sınırlamalar 20-23 sahiptir. En belirgin değil, her araştırma laboratuvarı dondurarak saklama araçlarına kolay erişim olmasıdır. Hatta En güncel yüksek basınç dondurucular veya dondurucular sadece kadar hücreler kuluçkaya yerden olabilir cryo tesisleri bir alt tarafından pahalı ve sahip olduğu vardır dalma. kryoprezervasyon yararı hücreleri üzerinde yerleştirilen seyahat stres dezavantajı işlem olabilir. Dondurulması kesinlikle X-ışını floresans analizi için numune korumak için en titiz şekilde Böylece, bu kesinlikle her koşulda tüm araştırmacılara en erişilebilir değil;ne de her zaman önemlidir - ilgi metaller sıkı düzeltilebilir makromoleküllerin bağlı ve numune yansıması olacak hangi çözünürlük kurutma sırasında meydana gelebilecek ultra mikro hasar büyükse eğer. Uyarılar 24 Dikkatli, kimyasal tespiti ve kurutma uygun bir seçim olabilir. Başarılı bir X-ışını fluoresans görüntüsü elde deneyde diğer faktörler uygun analiz içerir. X-ışını floresans görüntüleme temelde uzaysal çözünürlüğü sağlamak için raster tarama ile birlikte X-ışını floresans emisyon spektroskopisi olduğunu. Toplanan X-ışını floresans emisyon spektrumları emisyon zirveleri, arka plan, ve olay kirişin elastik ve inelastik saçılma doruklarına örtüşen bir kombinasyonunu içerir. Bu katkıların de-büklüm, ve emisyon doruklarına montajını sağlayan yazılım, bu alanda 25 kritik gelişme olmuştur. Ayrıca, geliştirme ve ticari distMalzeme miktar floresan yoğunluğu göreceli kalibre etmek için kullanılır bilinen kompozisyon, ince film standartlarının ribution, aynı zamanda çok önemli olmuştur. Bu protokol, kimyasal sabitleme ve hava kurutma ile yapışan hücrelerin hazırlanması için bir tanımını sağlar. Bu süreçte hayati bir adım genellikle başarı için belirli bir moda anahtarı nazik durulama yaparak, iyi uymayan silisyum nitrür windows hücrelerin büyüme.

<table><tbody><tr><td>Silisyum nitrür pencereler</td><td>Silson Ltd/JJ Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, Birleşik Krallık</td><td>SiRN-5.0-200-2.0-200. Boyuta göre sırala. Membran boyutu: 1,5 mm x 1,5 mm. Kalınlık: 200&nbsp; Nm. Çerçeve boyutu: 5&nbsp; mm x 5 mm'dir. Çerçeve kalınlığı: 200 &mikro; m.</td><td>Alternatif kaynak: SPI Malzemeleri / Yapı Probu, Inc. West Chester, PA.</td></tr><tr><td>Ters cımbız</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri, Posta Kutusu 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Ücretsiz: 800-523-5874, Faks: 215-412-8450</td><td>78520-5X</td><td>EMS 5X, NC &ndash; Ultra İnce Cımbız</td></tr><tr><td>Kauçuk ızgara paspası</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri, Posta Kutusu 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Ücretsiz: 800-523-5874, Faks: 215-412-8450</td><td>71170</td><td>Yuvarlak Izgara Mat</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Ladin St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Faks: 800-325-5052</td><td>338826</td><td>eser metal sınıfı konsantre asetik asit</td></tr><tr><td>BORU tamponu</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Faks: 800-325-5052</td><td>P6757</td><td>katı BORULAR tamponu</td></tr><tr><td>Formaldehit stok çözeltisi</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri, Posta Kutusu 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Ücretsiz: 800-523-5874, Faks: 215-412-8450</td><td>RT 17113</td><td>10 x 10 ml ampul %20 sulu paraformaldehit</td></tr></tbody></table>

kimyasal fiksasyon x-ışını floresans görüntüleme değme hücreleri hazırlanması

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

X-ışını floresan görüntüleme, büyük veya küçük numune alanları üzerinde aynı anda birden fazla elementin uzamsal dağılımını ve konsantrasyonunu tahribatsız bir şekilde ölçmemizi sağlar. Malzeme bilimi, jeoloji bilimi, kültürel miras eserlerinin incelenmesi ve kimyasal biyoloji dahil olmak üzere birçok bilim alanında uygulanmıştır. Örneğin, kimyasal biyoloji söz konusu olduğunda, hücreler içindeki metal dağılımlarını görselleştirmek, hem hücrelerde doğal olarak oluşan metal iyonlarını hem de ilaçlar ve nanopartiküller gibi dışsal olarak sokulan metalleri incelememize olanak tanır. Neredeyse tüm biyolojik numunelerin tamamen hidratlı doğası nedeniyle, kriyofiksasyon ve ardından kriyojenik sıcaklık altında görüntüleme, şu anda mevcut olan ideal görüntüleme yöntemini temsil eder. Bununla birlikte, böyle bir kombinasyonun kolayca erişilebilir veya pratik olmadığı koşullar altında, aldehit bazlı kimyasal fiksasyon yararlı ve bazen kaçınılmaz olmaya devam etmektedir. Bu makale, X-ışını floresan görüntüleme için kimyasal fiksasyon ile yapışık memeli hücrelerinin hazırlanmasında mümkün olduğunca ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Biyolojik örnekler hakkında bilgi temin etmek üzere X-ışını floresans görüntüleme yeteneği, bu örnekler, deney süresi ölçeğinde radyasyona karşı sağlam bir şekilde hazırlanmaktadır edilmesine bağlıdır ve yine kimyasal ve yapısal özellikleri iyi olan korunmuş. Tespit hücrenin bu yönleri, (Şekil 1) korunmuş olduğunu gösteren - yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmış ve görüntülenmiştir olan bir numune sonucu görüntüleme olarak, bu elemanlar varyasyon olduğunu görmek mümkündür. <p class="jove_content"...

Burada, senkrotron X-ışını floresansı kullanarak bir numunedeki metallerin miktarının ve dağılımının nasıl belirleneceğine dair bir protokol sunuyoruz. Yapışık hücrelere odaklanıyoruz ve bu numuneyi hazırlamak için kimyasal fiksasyon yöntemini açıklıyoruz. Daha sonra senkrotron X-ışınları kullanarak numunenin nasıl monte edileceğini ve görüntüleneceğini açıklıyoruz.

Kimyasal Fiksasyon X-ışını Floresans Görüntüleme Değme Hücreleri hazırlanması

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Bu prosedürün genel amacı, bir hücre popülasyonundaki metallerin dağılımını görüntülemektir. Bu işlem, önce steril silikon nitrür pencerelerin hazırlanması ve ardından hücrelerin bu pencereler üzerinde büyütülmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra hücreler fikse edilir, uyumlu bir tampon çözeltiye alınarak durulanır ve kurutulur.Son adım, hücrelerin hüzme hattında görüntülenmesidir. Nihayetinde, hücredeki metallerin dağılımını göstermek için X-ışını floresans mikroskopisi kullanılır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, pencereler çok kırılgan olduğu için zorlanacaklardır.Hücrelerin x-ray floresan alt tabakalara iyi tutunmaması nedeniyle, pencereler üzerinde minimum hücre agregasyonu ile hücre büyütme ve durulama adımları zorlayıcı olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir. İlk görev pencerenin izole edilmesidir. Öncelikle, bir stereoskop kullanarak, bir çift ters ince uçlu pensetin düzgünce hizalandığından ve temiz olduğundan emin olun.Ardından, pencereyi içeren kapsülü hafifçe açın. Bir ucu döndürürken pencerenin bulunduğu diğer ucu sıkın. Pencerenin kendisine baskı uygulamayın.Ardından, açılan uca yakın kısımdan kapsülü hafifçe sıkarak çerçeveyi cımbızla dikkatlice kavrayın. Pencere kenarlarının çıkacağı noktada kapsülü genişletmek için basınç uygulayın ve pencereyi çıkarın. Şimdi biraz yapışkan bant hazırlayın.Temiz bir lama bir parça bant yapıştırın ve lamın uzun kenarından çeyrek inçlik bir bant şeridi kesin. Ardından, kısa kenara bir bant parçası yerleştirin ve bant bölümünü cımbızla çıkarın. Bandı, yapışmasını sağlayacak kadar kuvvet uygulayarak pencerenin kenarına yapıştırın ve pencere açıklığını bantla kapatmamaya dikkat edin.Cımbız kullanarak pencereyi bir kültür kabının tabanına yerleştirin ve bandı kaba sıkıca bastırın. Ardından, pencerenin diğer tarafını bantlamak için işlemi tekrarlayın. Kap, şimdi bir saat boyunca UV ile sterilize edilmelidir.Bu protokol, hücrelerin ekli pencereyi içeren kaplarda %50 ila %70 konfluense ulaşana kadar büyütülmesini gerektirir. Herhangi bir canlı boyama uygulandıktan sonra, fiksasyona geçmeden önce hücrelerin görüntülenmesi gerekir. Besiyerini, kabı 45 derecelik bir açıyla eğerek nazikçe aspire ederek uzaklaştırın.Ardından kabı nazikçe DPBS ile durulayın. Çıkarılan sıvının yerine, taze %4 P-F-A-P-B-S'yi 45 derecelik bir açıyla ve kabın kenarına doğru nazikçe ekleyerek hemen yenisini koyun. Fiksasyon çözeltisinin pencereleri kaplamasını sağlamak için açıyı yavaşça gevşetin.Fiksasyondan sonra fiksatifleri hücrelerin üzerinde 20 dakika bekletin. Sıvıyı nazik bir aspirasyonla uzaklaştırın. Daha önce uygulanan nazik tekniği kullanarak, sıvıyı pipetlerle yavaşça değiştirin.Sükroz çözeltisi. Sıvının uzaklaştırılması ve yenilenmesi tekniği kritik öneme sahiptir çünkü hücreler substratlara iyi tutunmazlar. Bu aşama, ilk kez deney yapan birçok kişinin çalışmalarının başarısız olduğu noktadır.Ardından, kalan fiksatifleri temizlemek için borudaki sükroz çözeltisini nazikçe değiştirin. Şimdi, bandı cımbızla çekerek pencereyi çıkarın. Pencereler banttan ayrılırsa, eklenen çözelti ile pencereyi yüzeye çıkarın ve ters cımbızla alın.Şimdi, pencereye dokunmadan, kenarlardaki tüm çözeltiyi dikkatlice tamponlayarak temizleyin. Ayrıca, dokunun yuvarlatılmış bir katını kullanarak girintili alanı tamponlayın. Amaç, pencere üzerinde mümkün olduğunca az tuz veya tampon kristalleşmesi olmasını sağlamaktır.Son olarak, pencereyi, matın içindeki çıkıntıya karşı bir kenardan desteklenmiş ızgara matın üzerine dikkatlice yerleştirin. Pencere matın mümkün olan en az kısmına temas etmelidir. Örnek kuruduktan sonra, bir ışık mikroskobu kullanarak pencerelerde hücrelerin varlığını doğrulayın.Hücrelerin pencereler üzerinde olduğu onaylandıktan sonra, pencereleri sinkrotron ışın hattına taşımak üzere paketleyin. Pencerelerin iki kenarını nazikçe bir lam üzerine bantlayın. Ardından lamı plastik bir Petri kabına bantlayın ve Petri kabını bantla kapatın.Buraya kadar olan adımlar herhangi bir tipik laboratuvarda gerçekleştirilebilir; sonraki adımların bir senkrotron ışın hattında yapılması en uygunu olacaktır. Pencerenin paketinden çıkarılması, bandın cımbız yardımıyla nazikçe çıkarılmasıyla başlar. Ardından pencere, senkrot rondaki ışın hattı ortakları tarafından sağlanan bir alüminyum tutucuya aktarılır.Pencerenin kenarı boyunca ince ve eşit bir oje tabakası sürerek pencereyi sabitleyin. Şimdi, alüminyum tutucuyu kinematik bir yuvaya yerleştirin. Yuvayı, numune odasının içinde ve X-ışını mikroskobunun ışın hattı üzerinde bulunan motorlu sahneye bağlı bir brakete takın.Kurşun hat üzerinden X-ışını mikroskobu cihaz alanına çıktıktan sonra, hüzme hattına özel yazılımı kullanarak taramayı ayarlayın. X-ışını hüzmesinin numune üzerindeki konumunu izlerken, numunenin taranacak uygun alanını seçin. Video artı göstergesi ile donatılmış ve akış yönündeki sintilatör kamerasıyla önceden hizalanmış bir kamera kullanımıyla ilgili ek ayrıntılar metin protokolünde sunulmuştur.Bir örneğin röntgen görüntülerinde bu tekniklerin kullanılmasıyla, fiksasyonun bu insan HSY five Y hücresinde olduğu gibi hücrelerin bu yönlerini koruduğunu gösteren, mevcut elementlerde varyasyon olduğu görülebilmektedir. Ancak, kurutma sırasında tampon mevcut kalırsa, yaygın kristal oluşumu hücrelerde yapısal hasar oluşturur ve röntgen floresans spektrumlarının toplanmasını engeller. Bu durum, kötü işlenmiş bir RET B 1 0 3 hücresinde görülebilir.Bu videoyu izledikten sonra, X-ışını floresans görüntüleme için kimyasal tespit ile adherent hücrelerin nasıl hazırlandığına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Formaldehit ve biyolojik materyallerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun KKD kullanımı ve kurumsal kılavuzlara uyum gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

preparing-adherent-cells-for-x-ray-fluorescence-imaging-chemical

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Kaynak: Schumacher, D. ve diğerleri. Yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus'un tam vejetatif hücre döngüsünün floresans canlı hücre görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, yavaş büyüyen bir toprak bakterisi olan Myxococcus xanthus'un hazırlanma ve görüntülemesini gösteriyor. Kültür, floresan mikrokürelerle örtülü bir örtü üzerine uygulanır ve hidrasyon ile besin tedarikini desteklemek için önceden ısıtılmış agaroz yastığı ile örtülür. Bu düzen, bakteriyel hücre bölünmesi sırasında...

Canlı Hücre Görüntüleme İçin Myxococcus Xanthus Örneklerinin Hazırlanması

Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

Burada hızla PhenoRipper, son zamanlarda geliştirilmiş görüntü analiz platformu kullanarak floresan mikroskopi görüntülerin koleksiyonları analiz ve keşfetmek için bir iş akışını açıklar.

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Burada, poliakrilamid jellerin çok kuyulu plaka formatında hızlı, verimli ve ucuz bir şekilde hazırlanmasını sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve herhangi bir araştırma laboratuvarı tarafından kolayca benimsenebilir. Sertliğe bağlı hücre tepkilerini anlamaya odaklanan araştırmalarda özellikle yararlı olacaktır.

Basit Poliakrilamid-tabanlı Sertlik bağımlı Hücre Yanıtların Çalışmaları multiwell Sertlik Deneyi

Hızlı ve yüksek çözünürlüklü izin gelişmiş bir mikroskop düşsel hem, izole plazma zarı ve çevredeki hücre içi hacim sunulacak. Yüksek edinme hesaplı en fazla 3,5 canlı görüntüleme deneyler bir kurulum disk ve toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik entegrasyon sağlar görüntü yığını başına s.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

Çok kuyulu mikro plakalar kullanan otomatik tahliller, tek bir deneyde çok sayıda koşulun değerlendirilmesine izin vererek yol düzenleyicilerini tanımlamak için avantajlı yaklaşımlardır. Burada, köklü makropinozom görüntüleme ve niceleme protokolünü 96 kuyulu bir mikro plaka formatına uyarladık ve çok modlu bir plaka okuyucu kullanarak otomasyon için kapsamlı bir anahat sağladık.

Floresan Etiketli Makropinozomların Nicelleştirilmesi için Otomatik Görüntüleme ve Analiz

Burada, kriyo-elektron tomografisi için hücresel numunelerin hazırlanmasına rehberlik etmek için 3D bağıntılı odaklanmış iyon ışını frezeleme için bir boru hattı sunuyoruz. İlgilenilen floresan etiketli proteinlerin 3 boyutlu konumu önce kriyo-floresan mikroskobu ile belirlenir ve daha sonra öğütme için hedeflenir. Protokol memeli, maya ve bakteri hücreleri için uygundur.

Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-Elektron Tomografisi için 3D Korbağıntılı Odaklanmış İyon Işını Frezeleme ile Numune Hazırlama

İki foton uyarma floresan mikroskobu (2PEF) ile entegre olan döteryum-oksit (ağır suD2O) problu uyarılmış Raman saçılımı (DO-SRS) mikroskobu kullanılarak amino asitler tarafından düzenlenen hücrelerdeki metabolik aktiviteleri doğrudan görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz.

Aromatik Amino Asitler Tarafından Düzenlenen Hücre Metabolizmasının Biyoortogonal Kimyasal Görüntülenmesi

Burada, pnömatik olarak çalıştırılan ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi ile uyumlu çok yönlü bir eşbiaksiyel germe cihazı sunuyoruz.

Yüksek Büyütmeli Canlı Hücre Konfokal Floresan Mikroskobu için Equibiaxial Germe Cihazı

Bir Nile Red boyama prosedürü kullanılarak alg hücrelerinin nötral lipid içeriğini belirlemek için basit bir protokol tarif edilmektedir. Bu zaman tasarrufu tekniği geleneksel gravimetrik esaslı lipid miktar protokoller için bir alternatif sunuyor. Bu izleme biyoproses performansı belirli bir uygulama için tasarlanmıştır.

Floresan kullanma Alg hücrelerinde nötral Lipidler Ölçüm Basit ve Hızlı Protokolü

Keşfedin, X-ışını floresans mikroskobisi ile adezyon hücrelerinde metal dağılımını görüntülemek için kimyasal fiksasyon protokolünü. Silikon nitrür pencereler üzerinde hücre yetiştirme ve örnek hazırlama adımlarını öğrenin.

Kimyasal Fiksasyon X-ışını Floresans Görüntüleme Değme Hücreleri hazırlanması

Daha fazla video keşfet