Tetracistronic minigenomlar İçeren virüs benzeri partiküller ile Biyogüvenlik Seviyesi 2 Koşullarında Ebola virüsü Ömrü Modelleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yüksek derecede patojenik olan Ebola virüsünün yaşam döngüsünü biyogüvenlik seviyesi iki koşulları altında modellemektir. Bu, Ebola virüs partikülleri ile aynı protein kompozisyonuna sahip olan ancak viral genom yerine mini genom taşıyan virüs benzeri partiküller üretilerek gerçekleştirilir. Mini genom, viral genlerin çıkarılıp yerine lusiferaz gibi bir raporlayıcı genin yerleştirildiği viral genomun minyatür bir versiyonudur.

Önemli bir nokta olarak, bu deneyde kullanılan mini genom, viral proteinleri (VP40, GP-bir iki ve VP24) kodlayan bir dizi viral geni hâlâ taşımaktadır. Virüs benzeri partiküller, üretici hücreler olarak adlandırılan 293T hücrelerinde, mini genomun RNP proteinleri olarak da adlandırılan np, VP35, VP30 ve L viral proteinleri ile birlikte eksprese edilmesiyle üretilir.

Mini genom daha sonra viral proteinler tarafından replike edilir ve mRNA'lara transkribe edilir. mRNA'lar Luciferase raporlayıcısını ve ek viral proteinler olan VP40, GP-one two ve VP24'ü kodlar. Bu üç protein birlikte, içlerindeki nükleokapsidler genom replikasyonu ve transkripsiyon gerçekleştirebildiği için transkripsiyon ve replikasyon yetenekli virüs benzeri parçacıklar veya TRVLP'ler olarak adlandırılan virüs benzeri parçacıkların üretimine yol açar. TLP'ler Ebola virüsü glikoproteini GP-one two taşıdıkları için hedef hücreleri enfekte edebilirler.

Bu hedef hücreler, np, VP35, VP30 ve L için ekspresyon plazmidi ile önceden transfekte edilmiştir. Birlikte bu RNP proteinleri, TRVLP'ler aracılığıyla hedef hücrelere getirilen mini genomu tanır. Ardından mini genom replike edilir ve transkribe edilerek raporlayıcı aktiviteye ve yeni hedef hücreleri enfekte etmek için yeniden kullanılabilecek yeni TRVLP'lerin üretimine yol açar.

Önemli bir husus olarak, mini genom replikasyonu için gerekli olan genetik bilgiyi taşımaz. Bu nedenle, TRVLPs dört RNP proteinini eksprese etmeyen hücreleri üretken bir şekilde enfekte edemez. Bu durum, sistemin biyogüvenlik düzey iki koşulları altında kullanılmasını güvenli hale getirir.

Bu yöntemin temel avantajı; genom replikasyonu, viral gen ürünlerinin ekspresyonu, virüs partiküllerinin üretimi ve hedef hücrelerin enfeksiyonu dahil olmak üzere tüm virüs yaşam döngüsünü, biyogüvenlik seviye iki koşulları altında birden fazla injekt faktör döngüsü boyunca modellememize olanak tanımasıdır. Bu durum, canlı Ebola virüsleri ile çalışmak için gerekli olan maksimum korumalı bir laboratuvara ihtiyaç duyulmadan bu çalışmanın yapılabileceği anlamına gelir. Bu yöntem, hücresel faktörlerin RNA aracılı nakavt edilmesi (knockdown) veya bu faktörlerin aşırı ekspresyonu gibi diğer tekniklerle birleştirilerek, söz konusu faktörlerin virüs biyolojisindeki rolünün incelenmesinde kullanılabilir. Ayrıca, bu virüs genlerinin ve gen ürünlerinin virüs biyolojisindeki rolünü araştırmak için virüs genlerine mutasyonlar getirebiliriz.

%80 ila %90 konfluensle ulaşmış 293T hücrelerinden besiyerini uzaklaştırarak, hücreleri iki kez PBS ile yıkayıp üzerlerine iki mililitre tripsin ekleyerek hücreleri bölünmeye hazırlayın. Hücreler yuvarlaklaşana kadar bekleyin.

Ardından, flaska vurarak ve hücrelere %10 FBS içeren sekiz mL besiyeri ekleyerek onları yerinden ayırın. Hücreleri otomatik bir hücre sayıcı kullanarak sayın, ardından hücreleri mililitrede iki x 10⁵ olacak şekilde seyreltin ve altı kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa iki mL ekleyin. Hücreleri %5 CO2 içeren, nemlendirilmiş 37 °C'lik inkübatöre geri yerleştirin. 24 saat sonra, TRVLPs üretimi için gerekli plazmitlerle hücreleri transfekte edin. Bir BSC içinde, filtreli uçlar kullanarak DNA'yı bir tüpe pipetleyin. Negatif kontrol olarak, bir kuyucukta viral polimeraz L'yi kodlayan plazmit atlanmalı; bunun yerine, transfeksiyon etkinliğini görselleştirmek için GFP kodlayan bir plazmit transfekte edilebilir. Ardından, DNA'nın üzerine her kuyucuk için 100 µL optimum ekleyin. Tüpü vorteksleyin ve santrifüjle çöktürün.

Ardından, seyreltilmiş DNA'ya 7,5 µL transIT LT-one transfeksiyon reaktifi ekleyin. Tüpü hafifçe vorteksleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 15 dakika sonra, transfeksiyon karışımını pipetleme yöntemiyle nazikçe karıştırın ve ardından altılı kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna damla damla 100 µL ekleyin.

Transfeksiyon komplekslerini hücrelere ekledikten sonra, plakayı ileri geri ve yanlara doğru sallayın. Plakayı dairesel hareketlerle çevirmeyin, çünkü bu durum düzensiz transfeksiyona yol açacaktır. Ardından hücreleri inkübatöre geri yerleştirin. Transfeksiyondan 24 saat sonra, hücrelerin üzerindeki süpernatantı uzaklaştırın. Daha sonra hücrelere 4 mL %5FBS içeren besiyeri ekleyin ve hücreleri inkübatöre geri koyun.

Üretici hücrelerin transfeksiyondan 24 saat sonra, 293T hücrelerini daha önce tarif edildiği şekilde bölün. Bölünmeden 24 saat sonra, bu hücreleri Ebola virüsü RNP proteinlerini ve Ebola virüsleri için bir adezyon faktörü görevi gören Tim-one'i kodlayan plazmidlerle transfekte edin. Üretici hücrelerin transfeksiyondan 72 saat ve hedef hücrelerin transfeksiyondan 24 saat sonra, üretici hücrelerin süpernatantını toplayın ve bir 15 mililitrelik tüpe pipetleyin.

Süpernatantı topladıktan sonra, kalan tüm sıvıyı uzaklaştırın, hücrelerin üzerine 250 µL glow lizis tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında en az 10 dakika inkübe edin. Bunun ardından, bu videonun üçüncü adımında açıklandığı şekilde lusiferaz aktivitesini belirleyin. Bu sırada, üretici hücrelerden elde edilen süpernatantı oda sıcaklığında 800 g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, hedef hücrelerdeki besiyerini uzaklaştırın ve P-sıfır hücrelerinden elde edilen açıklığa kavuşturulmuş süpernatanttan üç mililitreyi hedef hücrelere ekleyin. Bu işlemi her seferinde tek bir kuyucuk için gerçekleştirin. İşlemi tamamladığınızda, hedef hücreleri inkübatöre geri yerleştirin. Enfeksiyondan 24 saat sonra.

Hedef hücrelerdeki süpernatantı uzaklaştırın. Ardından hücrelere %5 FBS içeren dört mililitre besiyeri ekleyin ve hücreleri inkübatöre geri yerleştirin. Üretici veya hedef hücrelerdeki reporter aktivitesini belirlemek için, üretici hücreler durumunda transfeksiyondan 72 saat sonra, hedef hücreler durumunda ise enfeksiyondan 72 saat sonra hücreler hasat edilir.

Bunu yapmak için, hücrelerin üzerindeki süpernatantı uzaklaştırın, hücrelere 250 µL glow liziz tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında en az 10 dakika inkübe edin. İstenirse, süpernatant taze bir hedef hücre setini enfekte etmek için kullanılabilir. Bu durumda, süpernatantı toplayın ve bu videonun ikinci adımında açıklandığı gibi hedef hücreleri enfekte edin.

Bu sırada, kuyucuk başına 40 µL lüsiferaz analiz tamponunu çözdürün ve tampona, hacmin yüzde biri oranında lüsiferaz substratı ekleyin. Hazırlanan lüsiferaz reaktifini vorteksleyin ve devam etmeden önce oda sıcaklığına ulaştığından emin olun. Ardından, reaktiften 40 µL'yi beyaz opak bir 96 kuyucuklu plakaya pipetleyin. Çapraz etkileşim (crosstalk) sorunlarını önlemek için örnek kuyucukları arasında bir kuyucuğu boş bırakmanız önerilir. 10 dakikalık inkübasyon tamamlandıktan sonra, hücreleri pipetleme yöntemiyle liziz tamponuna yıkayın ve hücre lizatını bir tüpe aktarın. Lizatları oda sıcaklığında, 10,000 g'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Bundan sonra, lizatlardan 40 µL'yi lüsiferaz reaktifi içeren 96 kuyucuklu plakaya pipetleyin. Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. 10 dakikanın ardından, bir lüminometre kullanarak lüsiferaz aktivitesini ölçün. Lüminesans ölçümü için entegrasyon süresi bir saniye olmalıdır. Bir Modulus mikroplaka lüminometresi ile pozitif kontrol için tipik lüminesans sinyalleri yaklaşık 1x10⁶ ile 1x10⁷ arasında olmalı, negatif kontrol için sinyal ise en az iki ila üç log daha düşük olmalıdır. Sonraki pasajlarda, pozitif kontrollerdeki reporter aktivitesi stabil kalmalı, negatif kontrollerdeki reporter aktivitesi ise arka plan seviyelerine düşmelidir.

Bu videoyu izledikten sonra, Ebola virüsü replikasyonu ve transkripsiyonu yeteneğine sahip virüs benzeri partiküller üretebilmeli, bunları hedef hücreleri enfekte etmek için kullanabilmeli ve hem üretici hem de hedef hücrelerde raporlayıcı aktivitesini ölçebilmelisiniz.

Önemli bir nokta olarak, bu yöntem, bu faktörlerin virüs biyolojisindeki rolünü incelemek için RNA aracılı hücresel faktörlerin susturulması (knockdown) gibi diğer tekniklerle birleştirilebilir. Ayrıca, Ebola virüsü yaşam döngüsünde bu bileşenlerin rolünü çalışmak amacıyla, bu yöntemde kullanılan viral bileşenlerde mutasyonlar oluşturulabilir. Daha fazla deneysel ayrıntı ve spesifik reaktifler, bu videoya eşlik eden makalede bulunabilir.