Name: Sıtma verici Sivrisinekler için bir çok algılama Deneyi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Öğrenin, sıtma taşıyıcı sivrisineklerin tür, insektisit direnci ve parazit enfeksiyonu gibi özelliklerini MALDI-TOF SNP genotipleme platformu ile aynı anda tespit etmek için geliştirilen bu çoklu algılama yöntemini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dr teşekkür ederim. Tanzanya&#39;dan sivrisinek örnekleri sağlamak için Glasgow Üniversitesi UC Davis ve Dr. Katharina Kreppel Anthony Cornel ve Laura Norris. Biz Zambiya sivrisinek örnekleri paylaşmak için Halk Sağlığı Johns Hopkins School Bayan Smita Das Dr. Douglas Norris teşekkür ederim. Biz de tahlil tasarımı eğitimi için Veteriner Genetik Laboratuvarı&#39;nda Bay Lee V. Millon teşekkür ederim. Bu çalışma R01AI 078.183 ve R21AI062929 hibe Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

1. PCR Amplifikasyonu <ol><li> Bir 1.5ml mikrotüp tüm PCR primerleri (ek Tablo S1 bakınız) karıştırın. Her bir SNP iki primer (ileri ve geri) sahiptir. Her bir PCR primeri stok konsantrasyonu, 100 uM muhafaza emin olun. (Ek Tablo S2 bakınız) tezgah hata ve süresini azaltmak için pipetle 500-1.000 reaksiyonlar için yeterli primer karışımı olun. Arzu edildiği takdirde, -20 ° C&#39;de tüp ve mağaza 100-200 reaksiyonlar için alikotları hazırlamak. </li><li> Üreticinin protokolü (Tablo 1) &#39;de tarif edildiği gibi PCR kokteyli hazırlanır. 96 reaksiyonlar için hacim üzerinden% 20 bir çıkıntı içerir. Vorteks 2000 x g&#39;de 30 saniye için PCR hafifçe kokteyl ve santrifüj içeren tüp. </li><li> Bir her kuyuya, PCR kokteyli 3 ul koyun 96 plaka olmayan etekli. Bir tekrarlayıcı pipet, bu işlem için zamandan tasarruf edebilirsiniz. </li><li> Her bir çukura sivrisinek uygun genomik DNA, 2 ul ekle. Not: m genomik DNA elde Süreci<html> osquito dokular (baş / göğüs, karın veya tüm vücut) Diğer edebiyatlarında 29-32 açıklanmıştır. (Baş / göğüs içinde Plasmodium) enfektif sivrisinek kan (karın) içinde Plasmodium olanlar ayırt etmek için uygun bir DNA ekstraksiyon protokolünü seçin. Biz genellikle sivrisinekler vücut parçaları (baş / göğüs veya karın) çıkarılan DNA kullanmak, yani DNA konsantrasyonu 0.05-2ng / ul değişir. Toplam DNA giriş üreticinin tavsiyesine (5-10ng / rxn) daha düşük olsa da, biz genellikle sağlam SNP tüm genom amplifikasyon olmadan DNA örneklerinin% 98 çağrıları olsun. </li><li> 370 x g&#39;de 1 dakika karıştırın veya vorteks ve santrifüj yavaşça, plaka basım. </li><li> PCR amplifikasyonunun yapılması için aşağıdaki PCR protokolü kullanarak: (1) 94 ° C sıcaklıkta 2 dk için, (2) 94 ° C&#39;de 30 saniye, (3) 1 dakika 30 saniye için 56 ° C, (4) 72 ° C (5) tekrar aşama (2) - (4) 45 çevrim için, (6), 1 dakika ve 4 ° C&#39;de beklemeye için 72 ° C. </li></ol>Yurt &quot;&gt; 2. SAP Tedavi <ol><li> 96 oyuklu bir plaka içerisinde, SAP enzim çözeltisi hazırlayın (Tablo 2). Bir plaka 96 örnekleri işleyin. 96 reaksiyonlar için hacim üzerinden% 20 bir çıkıntı içerir. </li><li> Vorteks 2000 x g&#39;de 30 saniye için SAP enzim hafifçe çözeltisi ve santrifüj tüpü. Her kuyuya, SAP enzim solüsyonu 2 ul koyun. Yine, bir tekrarlayıcı pipet, bu işlem için zamandan tasarruf edebilirsiniz. </li><li> 370 x g&#39;de 1 dakika karıştırın veya vorteks ve santrifüj yavaşça, plaka basım. 40 dakika boyunca (1), 37 ° C, (2) 85 ° C, 5 dakika için enzimler inaktive edildi (3) 4 ° C&#39;de tutun, aşağıdaki gibidir: plaka inkübe edin. Bu aşamanın tamamlanmasından sonra, işleme devam etmeden önce -20 ° C&#39;de plaka saklayın. 2 hafta içinde saklanan plaka işleyin. </li></ol> 3. SNP Uzatma <ol><li> Numune levhası, SAP, muameleden sonra dondurulur, bu devam etmeden önce, oda sıcaklığına kadar çözünmesine izin. </li><li> Uzatma primer karışımı (Ek Tablo S2) hazırlayın. Her SNP bir EXTE vardırnsion astar. 500 mcM her uzatma astar stok konsantrasyonunu tutun. İsteğe bağlı olarak, -20 ° C de tüp ve mağaza 100-200 reaksiyonlar için kısım. </li><li> 96 reaksiyon hacmi% 20 bir çıkıntı içerir, Tablo 3&#39;de tarif edildiği gibi uzatma karışımı hazırlayın. </li><li> Vorteks 2000 x g&#39;de 30 saniye boyunca hafifçe uzantısı kokteyl ve santrifüj tüpü. Her kuyuya uzatma kokteyli 2 ul koyun. Yine, bir tekrarlayıcı pipet, bu işlem için zamandan tasarruf edebilirsiniz. </li><li> 370 x g&#39;de 1 dakika karıştırın veya vorteks ve santrifüj yavaşça, plaka basım. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, levha Thermocycle. Bu noktada, kütle spektrometrisi devam ya da 2 haftaya kadar -20 ° C de plaka saklayın. </li></ol> 4. Klima SNP Uzatma Ürün Kütle Spektrometre Analiz Optimize <ol><li> Örnek plakası SNP uzantısı sonra donmuş ise, devam etmeden önce oda sıcaklığına çözülme sağlar. </li><li> Bunu conta reçinenin, 15 mg transferuzatılmış kaşık kullanarak gamze plaka üzerine INER. Gamze plaka kuyu içine reçine yaymak için kazıyıcı kullanın. Reçine yaymak için gamze plaka üzerinde yan yana gelen kazıyıcı Sweep. Reçine, her kuyuda olduğundan emin olun. </li><li> Kazıyıcı kullanarak gamze plaka kapalı aşırı reçine kazıyın. Reçine en az 20 dakika gamze plakasında bekletin. Reçine, gamze plaka standı örnek plakasının her bir kuyunun HPLC dereceli su 41 ul ekleyin icar ederken. </li><li> Yavaşça gamze plaka üzerine örnek plaka ters, yerleştirin. Gamze plaka kuyulardan numune plaka kuyular hizalar gamze plaka küçük yuvarlak yazı, karşı örnek plaka sıfırlar emin olun. </li><li> Reçine örnek plaka kuyu içine gamze plaka düşer, böylece birlikte numune plaka ve gamze plaka Holding, onları hafifçe çevirin. Reçine numune plaka içine düşer, böylece gamze plaka dokunun. Di emin tüm reçine olunmple plaka örnek plaka kuyu içine düşer. 30 saniye boyunca 3.200 xg&#39;de plaka santrifüjleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca, bir döndürücü üzerinde örnek plaka döndürün. Rotator örnek plakası uzun ekseni etrafında 360 ° döndürmek gerekir. </li><li> 5 dakika boyunca 3.200 xg&#39;de örnek plaka santrifüjleyin. Bu adımdan sonra, bir sonraki adıma geçmeden önce 2 hafta -20 ° C&#39;de örnek plaka saklayın. </li></ol> 5. MALDI-TOF Kütle Spektrometrisi <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre gibi SpectroCHIP gibi bir bioarray üzerine klimalı SNP uzatma ürünü aktarın. Bu aşama için MassARRAY Nanodispenser kullanın. </li><li> Transfer tamamlandığında, tahliller ve plakalar tahlil veritabanında kurulacak nasıl tanımlar. Her plaka özel tahlil tasarımı (Ek Tablo S3) bağlanan benzersiz bir kimliğe sahiptir, öyle ki tahlil ve plakaları adlandırın. </li><li> Deney ve plaka tanımlandıktan sonra, bir kütle spektrometresi kullanılarak spektrumları kazanır. </li></ol><ol><li> Böyle Typer Analyzer veya TyperViewer (Sequenom) gibi gerçek zamanlı PCR analizi veri yorumlama yazılımı kullanarak veri analizi yapın. Her iyi örnek düzeni, kitle spektrogram içeren .xml formatında veri elde, adı da dahil olmak işaretleyici bilgileri, ilgili SNP her varyant için beklenen kütle ve herhangi bir hata veya her reaksiyon ile ilişkili uyarı mesajları. Elde edilen kütle Spektrogram&#39;ın için Şekil 2 bakınız. </li><li> . Ve her genotip için izin tolerans / Varyans (gürültü oranı büyüklüğü veya sinyali) algılama eşiği ayarlayarak SNP genotip kümeleme analizi yürütmek 3 04.707-KDR 2. SNP genotip kümeleri bir örneğini göstermektedir. </li><li> Bir elektronik tablo programı içine çıkan SNP genotip aramaları verin. </li></ol>

<ol><li>Ayala, F. J., Coluzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+speciation%3A+humans%2C+Drosophila%2C+and+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).</li>
<li>Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+African+malaria+mosquitoes+belonging+to+the+Anopheles+gambiae+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Today%22%5BJournal%5D)">Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex.</a> Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).</li>
<li>Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+ribosomal+DNA+polymorphisms+discriminating+among+chromosomal+forms+of+Anopheles+gambiae+s.s%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s.</a> Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).</li>
<li>Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, della, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+identification+of+species+and+molecular+forms+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+PCR-RFLP%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Vet+Entomol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP.</a> Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).</li>
<li>Santolamazza, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analyses+reveal+discrepancies+among+results+of+commonly+used+methods+for+Anopheles+gambiae+molecular+form+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification.</a> Malar J. 10, 215(2011).</li>
<li>Santolamazza, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+polymorphisms+of+SINE200+retrotransposons+within+speciation+islands+of+Anopheles+gambiae+molecular+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms.</a> Malar J. 7, 163(2008).</li>
<li>Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+report%3A+A+new+polymerase+chain+reaction-restriction+fragment+length+polymorphism+method+to+identify+Anopheles+arabiensis+from+An.+gambiae+and+its+two+molecular+forms+from+degraded+DNA+templates+or+museum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples.</a> Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).</li>
<li>Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multiplex+SNP+genotyping+assay+for+detecting+hybridization+and+introgression+between+the+M+and+S+molecular+forms+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol Resour. , (2013).</li>
<li>Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+single+specimens+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction.</a> Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).</li>
<li>White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+association+of+physically+unlinked+islands+of+genomic+divergence+in+incipient+species+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).</li>
<li>Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+evidence+for+biased+co-transmission+of+speciation+islands+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).</li>
<li>Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multiplex+SNP+genotyping+assay+for+detecting+hybridization+and+introgression+between+the+M+and+S+molecular+forms+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).</li>
<li>Reimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+kdr+mutation+and+resistance+to+pyrethroid+and+DDT+insecticides+in+natural+populations+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae.</a> J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).</li>
<li>Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kdr+mutation+occurs+in+the+Mopti+form+of+Anopheles+gambiae+s.s.+through+introgression%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression.</a> Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).</li>
<li>Tripet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+survey+of+knockdown+resistance+to+pyrethroid+%28kdr%29+in+Mali%2C+West+Africa%2C+and+evidence+of+its+emergence+in+the+Bamako+form+of+Anopheles+gambiae+s.s%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s.</a> Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).</li>
<li>Martinez-Torres, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+pyrethroid+knockdown+resistance+%28kdr%29+in+the+major+malaria+vector+Anopheles+gambiae+s.s%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s.</a> Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).</li>
<li>Diabate, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDR+mutation%2C+a+genetic+marker+to+assess+events+of+introgression+between+the+molecular+M+and+S+forms+of+Anopheles+gambiae+%28Diptera%3A+Culicidae%29+in+the+tropical+savannah+area+of+West+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa.</a> J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).</li>
<li>Chandre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+distribution+of+a+pyrethroid+resistance+gene+%28kdr%29+in+Anopheles+gambiae+complex+from+west+Africa+and+further+evidence+for+reproductive+isolation+of+the+Mopti+form%5BTitle%5D)+AND+%22Parassitologia%22%5BJournal%5D)">Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form.</a> Parassitologia. 41, 319-322 (1999).</li>
<li>Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+anthropophily+in+the+potential+secondary+malaria+vectors+Anopheles+coustani+s.l.+and+Anopheles+squamosus+in+Macha%2C+Zambia%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).</li>
<li>Snounou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+of+detection+of+human+malaria+parasites+by+the+use+of+nested+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction.</a> Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).</li>
<li>Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genus-+and+species-specific+nested+polymerase+chain+reaction+malaria+detection+assay+for+epidemiologic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies.</a> Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).</li>
<li>Oyedeji, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+PCR-based+detection+of+Plasmodium+falciparum+infections+based+on+single+and+multicopy+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes.</a> Malar J. 6, 112(2007).</li>
<li>Gama, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+versus+conventional+PCR+for+malaria+parasite+detection+in+low-grade+parasitemia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+parasitology%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia.</a> Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).</li>
<li>Kent, R. J., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mammalian+blood+meals+in+mosquitoes+by+a+multiplexed+polymerase+chain+reaction+targeting+cytochrome%5BTitle%5D)+AND+%22B.+Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome.</a> B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).</li>
<li>Fornadel, C. M., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+endophily+by+the+malaria+vector+Anopheles+arabiensis+in+southern+Zambia+and+identification+of+digested+blood+meals%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals.</a> Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).</li>
<li>Teeter, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+variable+genomic+architecture+of+isolation+between+hybridizing+species+of+house+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice.</a> Evolution. 64, 472-485 (2010).</li>
<li>Han, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+of+survival+in+small-cell+lung+cancer+patients+treated+with+irinotecan+plus+cisplatin+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+pharmacogenomics+journal%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy.</a> The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).</li>
<li>Chakraborti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+polyethyleneimine-functionalized+ZnO+nanoparticles+with+bovine+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).</li>
<li>Marsden, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+differentiation%2C+and+linkage+disequilibrium%3A+prospects+for+association+mapping+in+the+malaria+vector+Anopheles+arabiensis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis.</a> G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).</li>
<li>Methods in Anopheles Research. , Second edition, MR4. Available from:
 <a target="_blank" href="
 http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx">
 http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx</a> 1725-1732 (2010).</li>
<li>Tripet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+analysis+of+transferred+sperm+reveals+significant+levels+of+gene+flow+between+molecular+forms+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).</li>
<li>Slotman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+subdivision+within+the+M+molecular+form+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).</li>
<li>Basu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassARRAY+Spectrometry+is+More+Sensitive+Than+PreTect+HPV-Proofer+and+Consensus+PCR+for+Type-Specific+Detection+of+High-Risk+Oncogenic+HPV+Genotypes+in+Cervical+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer.</a> J Clin Microbiol. , (2011).</li>
<li>Fu, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassARRAY+assay%3A+a+more+accurate+method+for+JAK2V617F+mutation+detection+in+Chinese+patients+with+myeloproliferative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders.</a> Leukemia. 22, 660-663 (2008).</li>
<li>Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+using+the+Sequenom+MassARRAY+iPLEX+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform.</a> Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).</li>
<li>Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+MassARRAY+technology+for+high+throughput+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).</li>
<li>Wright, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+MassARRAY+spectrometry+%28iPLEX%29+produces+a+fast+and+economical+test+for+56+familial+hypercholesterolaemia-causing+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations.</a> Clin Genet. 74, 463-468 (2008).</li>
<li>Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+islands+of+speciation+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae.</a> PLoS Biol. 3, e285(2005).</li>
<li>Turner, T. L., Hahn, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-population-specific+selection+and+differentiation+between+incipient+species+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae.</a> Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).</li>
<li>Stump, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-proximal+differentiation+and+speciation+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).</li>
<li>Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphisms+for+high-throughput+genotyping+of+Anopheles+arabiensis+in+East+and+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa.</a> J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).</li>
<li>Holt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298, 129-149 (2002).</li>
<li>Lawniczak, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+divergence+between+incipient+Anopheles+gambiae+species+revealed+by+whole+genome+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences.</a> Science. 330, 512-514 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

- Uçuş (MALDI-TOF) kütle spektrometrisi 33-37 zaman PCR amplifikasyonu, karides alkalin fosfatazı (SAP) Reaksiyon SNP uzantısı, uzatma şartlandırma ve matris destekli lazer çıkarma / iyonlaşma MDA beş ana adımdan oluşur. İlk PCR amplifikasyon adımı yeterli şablon DNA SNP uzatma aşamasında sunulacak böylece her SNP yan DNA güçlendirir. SAP reaksiyonu aşağıdaki SNP uzatma adımı engelleyebilir kullanılmayan dNTPs nötralize eder. SNP uzatma SNP lokusu ve kitle-modifiye terminatör nükleotidler başına tek bir uzant...

Anopheles arabiensis Anopheles coluzzii ve Anopheles gambiae Afrika 1 malarya iletilmesinden sorumlu başlıca vektörlerdir. Bu üç tür morfolojik 2 ayırt edilemez ve sadece moleküler deneyleri 3-9 ile ayırt edilebilir. Buna ek olarak, rutin epidemiyolojik ve nüfus genetiği çalışmaları yardım için yapılan birçok mansap tahliller vardır. Bu Türleşmenin adaları 10-12 (1), bir genotip analizi, (2) bir amino asit kodonu para geninin pozisyonda inci 1014 olmayan ayn SNP tanıyan bir genotipleme deneyi (knock-down direnç veya KDR SNP) 13 yer alır -18 (3), parazit tespiti, PCR 19-23 ve sivrisinek midguts 24,25 konak-spesifik DNA (4) taraması. Biz amacı ile, tek bir çoklu tepkime Tüm bu deneyler birleştiren çok deteksiyon deneyi (MDA) geliştirmiştirAfrika&#39;da sıtma vektörlerin epidemiyolojik önemli özelliklerini alyzing. MDA tahlili, çok sayıda (1) bir tür tespit edilmesi için markörler olarak kullanılmışlardır (A arabiensis, Anopheles gambiae, A. coluzzii veya üç) başka (yok) KDR SNP temsil, (2) bir insektisit direnci içerir (L1014F ve L1014S her ikisi de) iki ana sıtma parazitlerinin, (3) bulunması, Plasmodium falciparum ve P. Vivax, ve bir, kuş ve memeli altı konaklardan (4) kan kaynağı. Geleneksel olarak, bu deneyler, farklı polimeraz zincir reaksiyonları yapılmıştır. Tüm bu deneyler geleneksel PCR platformu kullanılarak yapılır, 8-10 PCR reaksiyon deneyleri yürüten ve jel elektroforezi adımlarını eşlik gerektirir. Burada sunulan MDA yöntemi bütününde yaklaşık 5 saat sürer iken belgeleyen sonuçlarına hazırlık Her birey PCR reaksiyonu, 4-5 saat sürer. Bu, tek başına işgücü maliyetlerinde% 90 tasarruf eşdeğerdir. MDA Burada sunulan 5 $ maliyetinumune başına 33 SNP genotiplemesi için. Bu önemli ölçüde daha az pahalı bir numune başına yaklaşık 1,50 $ maliyeti tek agaroz jel bazlı tahlillerde daha azdır. MDA kapsamındaki tüm özelliklerini tespit Tahliller numune başına $ 12-15 bir maliyetle 8-10 ayrı agaroz jel bazlı testlerin en az gerektirecektir. Dahası, MDA ölçüde her parazit veya ana bilgisayar kaynak tespiti için en az üç işaretçileri kullanarak bir yanlış pozitif veya negatif üretme şansını azaltır. Kullandığımız bir platform sıtma vektörleri ile sınırlı değildir, ancak bu tıp, veterinerlik ve temel biyoloji 26-28 gibi çok geniş bir uygulama çeşitli kullanılabilir. Derinlemesine örneklerinin büyük (100s sırasına göre) numarası içeren dernek çalışmaları veya popülasyon genetiği çalışmaları aynı anda birden fazla belirteçler için maliyet-etkin testler tarama gerektirir. Iki veya daha fazla ayrı PCR deneyleri kullanan çalışmaların çoğu düşük maliyetle daha hızlı sonuçlar için MDA uygulamak. </p&gt;

<table><tbody><tr>Nükleik asitleri analiz etmek için <td>genomik uygulamalar için MassARRAY Analyzer Compact</td><td>Sequenom</td><td>MT9</td><td>MALDI-TOF kütle spektrometresi.</td></tr><tr><td>MassARRAY Nanodispenser</td><td>Sequenom</td><td>RS1000</td><td>Tamamlanan iPLEX reaksiyon ürünlerini,</td></tr><tr><td>SAP kiti de dahil olmak üzere iPLEX testi için kullanılan</td> <td>SpectroCHIP iPLEX Altın Genotipleme Reaktif Seti</td><td>Sequenom</td><td>10158</td> Reaktiflerine aktarır.</tr></tbody></table>

sıtma verici sivrisinekler için bir çok algılama deneyi

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Anofel gambiae türleri kompleksi Afrika&#39;da sivrisinek ileten önemli sıtma içerir. Bu tür, tıbbi önemi vardır, çünkü çok sayıda özellikleri tipik olarak epidemiyolojik çalışmalarda yardımcı olmak için moleküler tahliller kullanılarak karakterize edilir. Bu özellikler türler kimlik, insektisit direnci, parazit enfeksiyonu durumunu, ve ana tercihi vardır. Anopheles gambiae kompleksinin popülasyonları morfolojik olarak ayırt edilemez olduğundan, bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), geleneksel türleri tanımlamak için kullanılır. Türü bilinmektedir sonra, çok sayıda alt-deneyler, rutin daha özelliklerinin ortaya konması için uygulanır. Örneğin, bir para-geninde KDR olarak bilinen mutasyonlar DDT ve piretroid böcek karşı direnci tasdik etmektedirler. Buna ek olarak, enzime bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) ya da Plasmodium paraziti DNA tespit PCR deneyleri, sivrisinek dokularda mevcut parazitlerin tespit etmek için kullanılır. Son olarak, bir combinatioPCR ve sınırlama enzim sindirimleri konakçı spesifik DNA sivrisinek bloodmeal tarama ile bir ev sahibi tercih (örneğin, hayvan, kan ile insan) aydınlatmak için kullanılır. Tek seferde 96 ya da 384 numune için tek bir çoklu reaksiyon genotipleme 33SNPs Yukarıda adı geçen bütün deneylerde bir araya getiren çoklu tespit deneyi (MDA) geliştirdik. MDA türleri Plasmodium algılama ve ana kan tanımlanmasına yönelik olarak çoklu işaretleri içerir için, yanlış pozitif ya da negatif üretme olasılığı önemli ölçüde özelliği başına sadece bir işaretçi de ihtiva önceki deneylere azaltılır. Bu sağlam ve basit tahlil maliyet-etkin ve mevcut tahlillerin zaman bir kısmını bu anahtar sivrisinek özellikleri algılayabilir.

Türler tanımlama: Bir örnek, üç türün biri değilse aşağıdaki 5 SNP birlikte. Üç SNP (01073-213, 04679-157 ve 10.313 üç tür (A. arabiensis, A. ve A. coluzzii gambiae) (Tablo 4) tespit -052) yükseltmek için başarısız. insektisit direnci çıkarım için kdr genotipi: Para voltaj-kapılı sodyum kanalının 1014 inci kodon kdr karşılık gelir. 1014 inc...

Sıtma bulaştıran sivrisinekler, yalnızca moleküler teknikler kullanılarak tespit edilebilen epidemiyolojik olarak önemli bir dizi özelliğe sahiptir. MALDI-TOF tabanlı bir SNP genotipleme platformu kullanarak, sıtma vektörlerinin birden fazla temel özelliğini (tür, böcek ilacı direnci, parazit enfeksiyonu ve konakçı seçimi) aynı anda tespit etmek için bir test geliştirdik.

Sıtma verici Sivrisinekler için bir çok algılama Deneyi

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

a-multi-detection-assay-for-malaria-transmitting-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Sıtma için potansiyel bir gen refrakter olarak tespit edildikten sonra, bu sivrisinek içinde Plasmodium enfeksiyonları önlemede rolü için değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu protokol, sivrisinek Plasmodium enfeksiyonların ölçüde test nasıl göstermektedir. Gametocyte kültür, membran beslenmesi sivrisinek insan kanı hazırlamak ve sivrisinek midgut viral titreleri assaying teknikler gösterilmiştir.

Sivrisinekler ve Enfeksiyon Fenotip belirlenmesi Plasmodium falciparum Enfeksiyonlar Protokol

Kemirgen sıtma parazitleri Genetik haçlar sivrisineklerin genetik olarak iki farklı parazitler besleyerek yapılmaktadır. Rekombinant döl sivrisinek enfekte farelerde ısırık izin sonra fare kandan klonlanmış. Bu video genetik haçlar üretmek nasıl...

Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

Bu video, dişi sivrisinekler üzerinde yeni etki modlarına sahip test bileşiklerinin mortalitesini ve doğurganlığını değerlendirmek için bir kanla besleme testini göstermektedir. Bu teknik, dirençli sivrisinek popülasyonunu öldürmek ve hastalığın yayılmasını kontrol etmek için yeni böcek ilacı sınıflarının taranmasına yardımcı olur.

Sivrisinek Besleme Deneyi: Yetişkin Dişi Sivrisineklerin Mortalitesi ve Doğurganlığı Üzerindeki Test Bileşiği Etkilerini Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Yüksek çözünürlüklü erime analizi heterojen nüfus içinde tek nükleotid polimorfizmlerinin ayırt yeteneği sunarken, mutant alel amplifikasyon önyargı, bir numune içinde nispeten düşük oranlarda bulunan allel tespit kabiliyetini artırabilir. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü erime analizinin duyarlılığını artırmak geliştirmeleri açıklanır.

Yöntemler sıtma Tek Nükleotid Polimorfizm Genotipleme Erime Yüksek Çözünürlük Duyarlılığının Artırma

İnsan sıtma parazitlerine kemirgen sıtma parazitlerinin yaşam döngüsü ve biyolojisinin çarpıcı benzerlikleri nedeniyle, kemirgen sıtma modelleri sıtma araştırmaları için vazgeçilmez hale gelmiştir. Burada, vahşi tip ve transgenik kemirgen sıtma türlerinin fenotipeksi analizinde kullanılan en önemli tekniklerden bazılarını standardize ettik.

Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi

Geçerli Zika, chikungunya ve dang virüs karmaşık numune hazırlama ve pahalı araçları gerektirir ve düşük kaynak ortamlarda kullanmak zor tespit etmek için teşhis multiplexed. Algılamak ve yüksek duyarlılık ve özgüllük ile bu virüs ayırt etmek için hedef özgü strand displaceable probları ile izotermal amplifikasyon kullanan bir tanı gösteriyoruz.

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Sunulan protokol, Aedes aegypti sivrisinek popülasyonlarının Zika gibi belirli bir virüs için vektör yeterliliğini bir muhafaza ortamında belirleyebilir.

Zika Virüsü Kullanan Aedes aegypti Sivrisineklerinde Vektör Yetkinlik Analizleri

Bu protokol, gRNA kaynaklı Cas9 bölünmesi ve DNA onarımının ardından hedef sahalarda homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) olaylarının tanımlanması ve nicelleştirilmesi için analiz de dahil olmak üzere DNA ekstraksiyonundan dijital damlacık PCR (ddPCR) için deneysel kuruluma kadar adımları sağlar. Bu yöntemin diğer kullanımları arasında polimorfizm tespiti ve gen düzenleme varyant doğrulaması gibi uygulamalar yer almaktadır.

Genetiği Değiştirilmiş Anopheline Sivrisinek Popülasyonlarındaki Indels Mutasyonlarını Tespit Etmek için Dijital Damlacık PCR

Bu protokol, sivrisineklerde tükürük bezi sporozoitlerini tespit etmek için sandviç enzime bağlı bir immünosorbent testini tanımlar. Kolayca bulunabilen monoklonal antikorları kullanan yöntem, Plasmodium falciparum veya Plasmodium vivax taşıyan sivrisineklerin uygun maliyetli, yüksek verimli tespitini sağlar. Yöntem, vektör araştırmaları da dahil olmak üzere sıtma bulaşma araştırmaları için uygundur.

Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi Kullanılarak Anofel Sivrisineklerinde Plasmodium Sporozoitlerin Tespiti

Standart membran besleme testi (SMFA), potansiyel sıtma önleyici bileşiklerin değerlendirilmesi ve tanımlanması için altın standart olarak kabul edilir. Bu yapay besleme sistemi, bu tür bileşiklerin Plasmodium falciparum parazitinin yoğunluğu ve prevalansı üzerindeki etkilerini daha fazla değerlendirmek için sivrisinekleri enfekte etmek için kullanılır.

Anofellerde Plasmodium falciparum Enfeksiyonunun Tespiti için Standart Membran Besleme Testi

Multipleks floresan immünolojik testler, seroloji testleri için bir referans haline geliyor. Ancak bunların uygulamaları, karmaşıklık ve zaman alıcı boncuk-analit birleştirme işlemleri nedeniyle sınırlıdır. Bu rapor, standart yöntemle karşılaştırılabilir ve sonuç alma süresini önemli ölçüde azaltan yarı otomatik, tekrarlanabilir bir multipleks mikroküre boncuk birleştirme protokolü sunar.

Arbovirüslere Karşı Antikor Yanıtlarının Tespiti için Multipleks Serolojik Test

Öğrenin, sıtma taşıyıcı sivrisineklerin tür, insektisit direnci ve parazit enfeksiyonu gibi özelliklerini MALDI-TOF SNP genotipleme platformu ile aynı anda tespit etmek için geliştirilen bu çoklu algılama yöntemini.

Sıtma verici Sivrisinekler için bir çok algılama Deneyi

Daha fazla video keşfet