İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, kalitatif ve kantitatif analiz ve spesifik lenfosit alt popülasyonlarının izolasyonu için enzimatik sindirim olmaksızın insan doku fragmanlarını tek bir hücre süspansiyonuna hızlı bir şekilde homojenize etmektir. Bu, önce doku parçalarını küçük parçalara ayırmak için steril bir neşter kullanılarak gerçekleştirilir. Daha sonra, doku bulamacı mekanik olarak ayrışmış bir tüpe aktarılır, burada parçalar tek hücreli bir süspansiyona daha fazla homojenize edilir.

Hücreler daha sonra aşağı akış analizi için santrifüjleme ile toplanır. Sonuç olarak, akış sitometrisi, sızan lenfositleri, Asyalı alt popülasyonları analiz etmek için kullanılabilir. Laboratuvarım bu tekniği geliştirdi çünkü tümör sızan lenfositleri, doğal durumlarını önemli ölçüde etkilemeden görüntüleyebileceğimiz bir yol arıyorduk.

Hücreleri hızlı bir şekilde izole edebileceğimiz ve ameliyatta oldukları gibi analiz edebileceğimiz bir şey istedik. Bu teknik laboratuvarımızda 300'den fazla meme tümörü ve normal doku üzerinde kullanılmıştır ve kullanımı kolaydır ve günlük olarak kullanılabilir. Prognostik belirteçleri, tedaviye yanıtı ve uzun vadeli klinik sonuçları incelemek için kullanılabilir.

Bugün bu tekniği gösteren John Nicola Loic olacak. Laboratuvarımdaki bir teknisyen Doku örneğini tartarak ve ardından dokunun uzunluğunu, genişliğini ve yüksekliğini ölçerek başlayın. Daha sonra doku parçasını, uygun, kimyasal olarak tanımlanmış serum serbest hematopoietik hücre ortamının bir mililitresini içeren küçük bir Petri kabına aktarın ve örnekleri küçük bir ila iki milimetre karelik parçalara ayırmak için steril bir neşter kullanın.

Daha sonra, çanak içeriğini mekanik bir ayrışma C tüpüne aktarın ve tabağı ve neşteri iki mililitre orta ile durulayın. Yıkamayı C tüpüne ekleyin ve ardından doku parçalarını tek bir hücre süspansiyonuna nazikçe homojenize etmek için 0.01 mekanik ayrışma programını art arda iki kez çalıştırın. İkinci döngüden sonra, homojenatı 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik konik bir tüpe boşaltın.

Ardından, C tüpünde kalan sıvıyı hücre süzgecine aktarmak için pipetinizin Petri kabını yıkamasından kaynaklanan aynı haşereyi kullanın. Ardından, filtrelenmiş sıvıyı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için bir mililitrelik bir mikro pipet kullanın ve C tüpünü ek üç mililitre ortamla durulayın. Bu yıkamayı hücre süzgecinden geçirerek 50 mililitrelik tüpe aktarın.

Daha sonra, dokuda sıkışan maksimum kalıntı sıvı miktarını 50 mililitrelik tüpe sıkmak için homojenize edilmemiş dokuyu temiz bir mililitrelik uçla süzgecin etrafında nazikçe hareket ettirin. Şimdi, hücre süzgecini orijinal C tüpünün üzerine baş aşağı yerleştirin ve süzgeci üç mililitre daha orta ile durulayın, böylece homojenize edilmemiş doku C tüpüne geri düşer. Dokuyu az önce gösterildiği gibi iki döngü daha yeniden homojenize edin ve ardından bu ikinci homojenatı hücre süzgecinden dökün.

Yine, C tüpünü üç mililitre daha orta ile durulayın. Daha sonra süpernatanı süzgeçten süzün ve kalan sıvıyı az önce gösterildiği gibi dokudan sıkın. Bu noktada, 15 mililitrelik tüpte yaklaşık 2,5 mililitrelik bir hacim bulunmalı ve 50 mililitrelik tüpte yaklaşık dokuz mililitre gözlenmelidir.

Doku süpernatantını hücrelerin ilk santrifüjünden ayırmak için, her iki homojenat tüpü de 600 Gs'de ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca, süpernatanı 15 mililitrelik tüpten 1.5 mililitrelik bir tüpe boşaltın, dört santigrat dereceye yerleştirin ve süpernatanı 50 mililitrelik tüpten atın. Ardından, hücre topaklarının her birini parçalamak için her bir tüpü sert bir yüzeye hafifçe vurun. 50 mililitrelik tüpteki gevşek hücre peletini 500 mikrolitre ortamla yeniden süspanse edin ve ikinci peleti yeniden süspanse etmek için hücreleri 15 mililitrelik tüpe aktarın.

Daha sonra 50 mililitrelik tüpü başka bir 500 mikrolitre ortamla durulayın ve maksimum hücre geri kazanımı için yıkamayı 15 mililitrelik tüpe aktarın. Trian mavisi dışlama ile canlı hücrelerin sayısını saydıktan sonra, hücre süspansiyonunu peletleyin. Son olarak, ayrılmış doku süpernatanı aşağı doğru döndürün.

Ardından, süpernatanı pelete dokunmadan veya rahatsız etmeden en az bir temiz tüpe dikkatlice aktarın ve gelecekteki aşağı akış analizi için eksi 80 santigrat derecede saklayın. Bu grafiklerde, ayrışmış tümör hücresi homojenatlarının temsili akış sitometrisi nokta grafikleri, ardından lökositlere karşı spesifik antikorlar ve epitel hücre belirteçleri ile etiketleme gösterildiği gibi gösterilmiştir. Bu protokol, CD 45 pozitif hücrelerin canlılığını önemli ölçüde değiştirmez.

Bununla birlikte, canlı EPAM pozitif hücrelerde önemli bir kayıp vardır. Bu uygulanabilir EPAM pozitif ve CD 45 pozitif alt kümeler, büyüklüklerine ve yapılarına göre büyük epitelyal tümör hücrelerine, küçük epitel hücrelerine veya büyük ve küçük CD 45 pozitif hücrelere ayrılabilir. Majör tümör infiltre eden alt kümelerin temsili akış sitometrisi nokta grafikleri, CD 45 pozitif hücrelerin canlılığına bağlı lenfositler ile burada gösterilmektedir.

Son olarak, meme kanseri süpernatanında bulunan sitokin ekspresyonu veya toplam immünoglobulinler, bu temsili deneyde gösterildiği gibi, tümör dokusu ile ilişkili her iki protein tipinde de artışlar ortaya çıkaran normal meme dokusundan süpernatant ile karşılaştırılabilir. Katılımcı prosedür sırasında, hızlı ve temiz çalışmayı ve yeterli sayıda hücre elde etmek için prosedürün her adımında maksimum miktarda materyali geri kazanmayı hatırlamak önemlidir. Uç nokta analiziniz.