Name: İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Öğrenin, enzimatik sindirim kullanmadan taze insan dokusunu hızla tek hücre süspansiyonuna dönüştürme yöntemini. Akış sitometrisiyle tümör infiltratif lenfositlerinin kalitatif ve kantitatif analizini gerçekleştirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hibe tarafından desteklenen bu çalışma Bilimsel Araştırma (FNRS), Les Amis de l&#39;Institut Bordet, FNRS-Opération Télévie, Belçika Planı Kanser, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson ve Fonds Barsy Belçika Fonu verdiğinde.

NOT: Tüm örnekler, her hastadan alınan yazılı bilgilendirilmiş onayı ile Enstitü Jules Bordet Tıp Etiği Komitesi tarafından onaylanan bir protokol kullanılarak elde edildi. Doku homojenatı hazırlanması 1. <ol><li> Rezeke dokular (ameliyathane gelen rezeke malign ve normal doku) teşrih hemen pikap için eğitilmiş personel tarafından patoloji laboratuarında vardır. Tümör, NANT (mümkün olduğunca tümör uzak mesafe alınmıştır) ve normal doku parçaları rutin 1 içinde işlenir - insan dokularında için standart biyogüvenlik prosedürleri kullanarak BSL2 laboratuarda cerrahi eksizyon 3 saat. Protokolün bir akış şeması, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> Tüm doku parçaları (normal NANT ve tümör) tartılır ve uzunluk, genişlik ve yükseklik (uzunluk x genişlik x yükseklik) ölçer. Bu hücre alt sonraki normalizasyonu için önemli bir adım, ekstre RNA, vb olduğunu HAYIRTE: örneklem büyüklüğü aralığı hiç yağ mümkünse 100 10.000 mm 3. </li><li> Doku aslında tümör parçası olduğunu doğrulamak için, H &amp; E boyama için bir cam slayt tümör fragmanı basar. <ol><li> Tümör fragmanı bir cam mikroskop lamı basarak ve bir kaç saniye için parmaklarınızla hafif baskı uygulayarak bunu yapın. </li><li> Su içinde bir yıkama aşaması takip 2 dakika boyunca, izopropanol ile slayt sabitleyin. Mayer&#39;in hematoksilen ile 30 saniye boyunca doku Counterstain. </li><li> Su altı banyolarında slayt yıkayın. 15 sn için floksin B% 2 Leke. </li><li> Suyun bir banyo ile izopropanol ve bitiş dört banyoları ve ardından bir su banyosu içinde yıkayın. </li><li> 1 dakika ve drenaj için izopropanol içinde inkübe edin. Ksilen iki hamam Temizle. </li><li> Ksilen bazlı montaj orta ile monte edin. Tümör selülarite (Şekil 2) için inceleyin. NOT: - stromal, lenfoid veya reklam Temelde, tümör hücrelerinin baskılı slayt sopaipose hücreler nadiren tümör hücreleri arasındaki boşlukların (Şekil 2) kalır. </li></ol></li><li> Steril kullanılarak - kimyasal olarak tanımlanmış, serumsuz hematopoietik hücre ortamının 1 ml içeren küçük bir kültür kabı içinde doku parçasını yerleştirin küçük parçalar (2 mm 2 ~ 1) içine, oda sıcaklığında, (bundan sonra ortam olarak anılacaktır) ve zar Neşter. </li><li> Mekanik ayıracı C tüpüne (doku parçaları + orta) her şeyi aktarın. </li><li> Pasteur pipeti kullanarak ortam 2 ml petri kabı ve bir neşter durulayın ve C boru (ayrışması için ortamının hacmi = 3 mi) bunu ekleyin. </li><li> Tek bir hücre süspansiyonu içine doku parçaları homojenize C tüpler için mekanik ayıracı programı A.01 (en nazik programı) kullanın. (Bir döngü = 25 sn) aparat C tüpü yerleştirin ve arka arkaya iki kez programı çalıştırın. NOT: Bu homojenizasyon işlemi kurulmuş ve insan meme dokusu, diğer tum için valide edilmiştirda doku tipleri farklı bir program kullanmanız gerekebilir ilk test edilmelidir. </li><li> Aparat C tüpünü çıkarın ve bir 50 ml tüp üzerinde oturan 40 mikron hücre süzgecinden doğrudan Homojenat süzün. Adım 1.6 aynı Pasteur pipet kullanarak, hücre süzgecinden C tüp içinde kalan herhangi bir sıvı transferi. </li><li> 1 ml mikropipet ucu kullanılarak 15 ml tüp içine süzülmüş sıvı aktarın. Geçici hücre süzgeç ve 50 ml&#39;lik tüp tutmak. </li><li> Ortamın, fazladan bir 3 ml Cı tüp yıkayın ve daha da iyisi 50 mi tübünün üzerine yerleştirilmiş hücre süzgecinden için, Aşama 1.6 ile aynı Pasteur pipeti kullanarak, bu aktarın. Yavaşça sonradan eluatının kirletmesini önlemek için atılır temiz Pasteur pipet veya 1 ml ucu ile süzgeç etrafında hareket ettirerek 50 ml tüp içine unhomogenized dokuda sıkışıp kalan sıvı maksimum miktarda sıkın. </li><li> Ters t hücre süzgeç yerleştirino orijinal C boru ve unhomogenized doku geri C tüpüne düşer ve böylece orta 3 ml ile yıkayın. </li><li> A.01 program iki döngü Aşama 1.7&#39;de olduğu gibi yeniden homojen hale getirilir. </li><li> 50 ml tüp üzerinde oturan hücre süzgecinden bu ikinci homojenatın dökün, (adım 1.10 gibi) 3 ml ortam ile tekrar C tüp durulayın ve tekrar maksimum sıkma 50 ml tüp oturan hücre süzgecinden Pasteur pipeti ile aktarmak hücre süzgecinden tutulan kalıntı bağ dokusu sıvı miktarı. </li><li> Bu noktada, ~ 2.5 ml&#39;lik bir hacim 15 ml tüp içinde ve ~ 50 ml tüp içinde 9 mi. </li></ol> Doku yüzer madde ve Hücreler 2. Ayırma <ol><li> Oda sıcaklığında 600 x g&#39;de 15 dakika boyunca 15 ml homojenatları ve 50 ml tüpler santrifüjleyin. </li><li> Temiz bir tüp içine, 15 ml tüp SN süzün ve geçici olarak 4 ° C&#39;de muhafaza edin. Bu yüzer = primer tümör, NANT veya normal tissue SN (nihai hacim 2.5 mi) daha sonra açıklık ve gelecekteki analizleri (aşağıya bakınız), -80 ° C&#39;de saklama öncesi örnek olarak alındı. </li><li> 50 ml tüpten atın. </li><li> Yavaşça 1 ml ortam içinde nihai hacimde iki hücre pelletleri yeniden süspanse edin. Kısaca, ilk yavaşça (sert bir yüzeye tüp dokunarak) her iki tüpler hücre pelet kırmak. Ortamının 500 ul, 50 ml gevşek hücre pelletini ve ikinci pelet tekrar süspansiyon 15 ml&#39;lik bir tüpe, bu hücre süspansiyonu aktarın. Hücrelerin maksimum kurtarma için orta ikinci 500 ul kez bu adımı tekrarlayın. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak canlı hücre sayısını ve: küçük bir tüp transfer hücre süspansiyonu, 10 ul, tripan mavisi 10 ul (1 seyreltme 1) ile karıştırın. NOT: Bu noktada, hücre süspansiyonunun bir fraksiyonu, aynı zamanda, hücre boyutu, granüllü değerlendirmek için akış sitometrisi ile analiz edilebilir ve daha PREC için alt popülasyonu, belirteçlerin sınırlı sayıda arzu edildiği takdirdeönce kapsamlı analiz veya deneylere homojenatında göreceli hücre dağılımının imkb değerlendirmesi. Akışı ile tüm analizler sitometri alt popülasyonlar normalleşmesi için CD45 etiketleme dahil. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. tümör, NANT veya normal dokudan hücrelerin artık daha fazla arıtılmadan ya da analiz için hazırdır. Ameliyat ile aynı günde yapılan Bu ek adımlar en iyisidir. Not: akış sitometrik analiz için derhal 1 saniye girdap hücre pelletine alyuvar lisiz tamponu 0.4 mi eklenmesi ve oda sıcaklığında 10 dakika, en az inkübe edilerek Antikor etiketleme işleminden sonra lize gereken Elde edilen kırmızı kan hücreleri sıralama baz istasyonu analizden önce sıcaklığı (ışıktan korumalı). </li></ol> Doku süpernatan 3. Açıklama <ol><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 15,000 x g&#39;de doku SN 1.5 ml tüpler santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle t kaldırmakO dokunmadan veya pelet bozmadan süpernatanlarına. Sayısı istenen alikotları hacmine bağlı olarak, temiz bir tüpe (veya borular) aktarın. </li><li> Gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de süpernatan saklayın. </li></ol> 4. Hasta Kan <ol><li> Heparinli tüplere Venipunktür tarafından kontrol ameliyattan önce günde her hastadan kan örneği toplayın. Plazma ve buffy coat elde etmek fren kapalı olan 20 ºC de 10 dakika boyunca 400 xg&#39;de kan santrifüj. </li><li> Plazma çıkarın ve 20 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüj ile bir açıklık. Gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de kısım ve mağaza plazma. Orta buffy coat seyreltin </li><li> Hemen analiz alt popülasyonu izole DNA / RNA / protein ekstraksiyonu veya dondurarak saklama önce, standart bir Ficoll-hipak gradyan santrifüjlemesi kullanılarak, tek çekirdekli hücreler ayırın. </li></ol> 5. Akış Sitometri <ol><li> Üretim göre etiket hücreleriışıksız bir ortamda 4 ° C &#39;de r&#39; talimatları. Hücre pelletine hücre parçalama tamponu içinde 0.4 ml ilave etmek suretiyle Antikor etiketleme işleminden sonra, doku parçalarından hücre süspansiyonlarında Lyse kırmızı kan hücreleri. </li><li> Vorteks hemen 1 saniye ve ışıksız bir ortamda oda sıcaklığında 10 dakika, en az, inkübe edilir. Yıkamadan veri toplama için bir akış sitometresinde etiketli hücreler geçirin. </li></ol>

<ol><li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncology+meets+immunology%3A+the+cancer-immunity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle.</a> Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+%27elite+hacker%27%3A+breast+tumors+exploit+the+normal+microenvironment+program+to+instruct+their+progression+and+biological+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity.</a> Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).</li>
<li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li>
<li>Quezada, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+tumor+infiltration+by+activated+T+effector+cells+restricts+the+therapeutic+activity+of+regulatory+T+cell+depletion+against+established+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma.</a> J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).</li>
<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+and+functional+analysis+of+human+tumor+immune+infiltration+after+mechanical+and+enzymatic+disaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation.</a> J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).</li>
<li>McCauley, H. A., Guasch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+orthotopic+transplantation+of+epithelial+tumors+in+single-cell+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension.</a> Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+cells+obtained+from+the+blood+but+not+from+the+tumor+can+suppress+T-cell+proliferation+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma.</a> Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).</li>
<li>Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+B+cell+characterization+in+blood%2C+lymph+nodes%2C+and+tumors+from+patients+with+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies.</a> J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).</li>
<li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29+follicular+helper+T+cell+infiltration+predicts+breast+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival.</a> J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).</li>
<li>Buisseret, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+Infiltrating+Breast+Cancer+%3A+Density%2C+Composition+And+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).</li>
<li>Garaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+B+Cells+Infiltrating+Human+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 18(2014).</li>
<li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cxcl13-Producing+Follicular+Helper+T+Cells+In+Human+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).</li>
<li>Yee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+endogenous+T+cells+for+adoptive+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The use of endogenous T cells for adoptive transfer.</a> Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).</li>
<li>Butler, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+human+CD8%2B+T+cells+using+autologous+CD4%2B+T+cell+help%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help.</a> PLoS One. 7 (1), 30229(2012).</li>
<li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+artificial+antigen+presenting+cells+facilitate+direct+and+efficient+expansion+of+tumor+infiltrating+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes.</a> J Transl Med. 9, 131(2011).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Bu çalışma, daha sonra hücre sıralama, ekstraksiyon, dondurarak saklama ve / veya CD45 + altgrupları fenotipik analizi için enzimatik sindirme, normal ve habis meme doku homojenatlarında hızlı hazırlanması için iyileştirilmiş bir yöntem tarif etmektedir. Bu deneysel yaklaşımın amacı yakından in vivo durumunu yansıtır ve ameliyathane taze dokuların az manipülasyon ile normal dokulara bunları karşılaştırmak TIL görüntüleri üretmektir. Bugüne kadar, bizim laboratuvar&gt; 250 taze M.Ö. dokuları (tümör ve...

Tümör mikroçevresi, her birinin tümör oluşumunda farklı ve önemli roller oynadığını gösteren çok sayıda çalışma ile çeşitli hücre tiplerinden oluşur1,2. Bunlar, bunlarla sınırlı olmamak üzere, sızan bağışıklık hücrelerini, stromal hücreleri, endotel hücrelerini ve tümör hücrelerini içerir3. Tümör infiltre eden lenfositlerin (TIL; Taze insan dokusu örneklerinden elde edilen CD45 + hücreleri veya lökositler, düşük frekansları, araştırma için sıklıkla mevcut olan küçük örnek boyutları ve ekstraksiyon sırasında canlılık kaybı potansiyeli nedeniyle zorlaştırılır. Tümörlere sızan bağışıklık hücreleri genellikle kalıcı sakinler yerine genellikle yolcu olarak mevcut olduklarından, doku matrisinden salınmaları daha kolaydır.
Hücresel bütünlüğü korurken tümör dokusunu ayırmak teknik olarak zordur ve geleneksel olarak tek hücreli süspansiyonları hazırlamak için mekanik ve enzimatik adımların bir kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilmiştir4-8. Bu yaklaşım, uzun inkübasyon dönemlerini içerir ve hücre canlılığında önemli bir azalmanın yanı sıra enzimatik bölünme ile hücre yüzeyi reseptörlerinin kaybı ile ilişkilidir. Tümör mikroçevresinde TIL'i karakterize eden yüksek kaliteli akış sitometrik çalışmalarının yanı sıra CD45+ alt popülasyonlarının akış sitometrisi veya antikor kaplı boncuklar ile temiz saflaştırılması, enzimle sindirilen tümör dokusundan elde etmek daha zordur. Ek olarak, elde edilen tümör homojenatından elde edilen süpernatant (SN), enzimatik sindirimde protein bozunması potansiyeli nedeniyle, salgılanan proteinlerin (sitokinler, kemokinler, immünoglobulinler veya tümör antijenleri) miktar tayini veya normal hücrelerin deneysel tedavisi dahil olmak üzere daha ileri analizlere uygun değildir.
Enzimatik sindirim olmadan meme dokularından [tümör, bitişik olmayan tümör olmayan (NANT) ve normal (meme küçültmelerinden) meme dokuları dahil] tek hücreli homojenatları hazırlamak için bir yöntem arayışımızda, çeşitli mekanik homojenizasyon tekniklerini test ettik. Mekanik bir ayrıştırıcı kullanılarak hazırlanan homojenatlar, yüzey reseptör ekspresyonunu korurken hücre canlılığını (2 kat) ve toplam hücre geri kazanımını (2 kat) arttırdı. Kalan çözünmeyen materyalin enzimatik sindirimi, ek CD45 + hücrelerini geri kazanmadı, bu da hepsinin ilk homojenatta salındığını düşündürdü. Bu nedenle, bu hızlı ve basit yaklaşım, çeşitli normal ve malign insan dokularında bulunan CD45+ alt popülasyonlarının hem kalitatif hem de kantitatif değerlendirmesine izin verir. Bu yaklaşımın ek bir avantajı, ilk homojenattan (birincil doku SN) gelen SN'nin daha fazla analiz veya deney için toplanabilmesi ve saklanabilmesidir.

<table><tbody><tr><td>GentleMacs Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>BD Medimachine biraz eşdeğerdir</td></tr><tr><td>Santrifüj 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>veya diğer standart masa üstü santrifüj</td></tr><tr><td>Santrifüj 5417 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>veya diğer standart mikrosantrifüj</td></tr><tr><td>Esco Sınıf II A2 Biyogüvenlik Kabini</td><td>ESCO global</td><td></td><td>veya diğer standart BSL2 başlık</td></tr><tr><td>Ters Mikroskop</td><td>Nikon eclipse TS100</td><td></td><td>veya hemasitometre</td></tr><tr><td>B&uuml için uyumlu başka bir mikroskop; rker Odası</td><td>Marienfield&nbsp;</td><td>640210</td><td>veya diğer standart hemasitometre</td></tr><tr><td>Navios Akış Sitometresi</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>veya diğer akış sitometresi (8-10 renk önerilir)</td></tr> <tr><td>GentleMacs C-Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-344</td><td>BD Medimachine, Filcon</td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Kabı</td><td>Sarstedt</td><td>72,710</td><td>veya diğer pirojenik olmayan plastik ürünleri</td></tr> kullanır <tr><td>Tek Kullanımlık Neşter</td><td>Swann-Morton</td><td>0510</td><td>veya standart tek kullanımlık steril neşter</td></tr><tr><td>BD Hücre Süzgeci 40 & m</td><td>Becton Dickinson</td><td>734-0002</td><td>veya diğer pirojenik olmayan plastik ürünler</td></tr><tr><td>BD Falcon Tüpü 50 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352070</td><td>veya diğer pirojenik olmayan plastik eşyalar</td></tr><tr><td>BD Falcon Tüpü 15 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352097</td><td>veya diğer pirojenik olmayan plastik eşyalar</td></tr><tr><td>BD FACS Tüpü 5 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352008</td><td>veya diğer pirojenik olmayan plastik ürünler</td></tr><tr><td>Steril Pasteur Pipet 5 ml</td><td>VWR</td><td>612-1685</td><td>veya diğer pirojenik olmayan plastik eşyalar</td></tr><tr><td>Mikrofüj Tüpü 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>7805-00</td><td>veya diğer pirojenik olmayan plastik ürünler</td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>BE04-448Q</td><td>serumsuz ortam önerilir</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>standart fizyolojik PBS</td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>VWR</td><td>17942E</td><td>veya diğer hayati lekeler</td></tr><tr><td>Akış sitometrisi deneyleri için</td> <td>VersaLyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>A09777</td> Akış sitometrisi</tr><tr><td>deneyleri için</td><td>sabitlenebilir canlılık Boya eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td></tr><tr><td>anti-CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>akış</td><td>sitometrisi deneyleri için 345763 akış sitometrisi deneyleri</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td> için anti-CD3 Vio Blue Miltenyi Biotec 130-094-363</tr><tr><td>akış</td><td>sitometrisi deneyleri için</td>anti-CD4 PE <td>BD Biosciences</td><td>345769</td> akış sitometrisi</tr><tr><td>deneyleri için</td><td>anti-CD4 APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-232</td></tr><tr>akış sitometrisi deneyleri için<td>anti-CD8</td><td>ECD Beckman Coulter</td><td>737659</td><td>akış sitometrisi deneyleri için</td></tr><tr><td>anti-CD8 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>345774</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD19 APC-Vio770</td><td>Akış</td><td>sitometrisi deneyleri için</td>Miltenyi Biotec <td>130-096-643</td> akış sitometrisi</tr><tr><td>deneyleri için</td> <td>anti-CD45 VioGreen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-906</td></tr></tbody></table>

İnfiltratif lenfositlerinin analiz olmayan enzimatik ayırmak taze İnsan dokusuna basit ve hızlı protokolü

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

doğal ve adaptif immün yanıtların hem tümör kaçış ile karakterize bağışıklık sistemini, kaçmak için malign hücrelerin yeteneği şimdi kanser önemli bir ayırt edici niteliği olarak kabul edilmektedir. Meme kanseri ile ilgili araştırma tümör infiltre lenfositleri tümör ilerlemesi ve hasta sonuç oynadığı aktif rolü üzerinde duruluyor. Bu hedefe doğru, biz onların yerli devlet onları yakın değerlendirmek için bir çaba, normal ve anormal dokuların sağlam lenfoid hücrelerin hızlı izolasyonu için bir metodoloji geliştirdi. Yüzey reseptörü ifadesi karşılaştırıldığında için enzim-sindirilmiş dokuları koruyarak mekanik ayıracı gösterisi hem artan canlılık ve hücre kurtarma kullanılarak hazırlanan Homojenatlar. Ayrıca, kalan çözünmeyen malzemenin enzimatik sindirim birincil homojenatında nicel ve nitel ölçümler olasılıkla gerçekten doku fragmanının içinde infiltre subpopülasyonunun yansıttığını belirten ek CD45 + hücreler geri vermedient. Bu homojenatlarında lenfoid hücreleri kolayca immünolojik (fenotip, proliferasyon, vs.) ya da moleküler (DNA, RNA ve / veya proteini) ile karakterize edilen yaklaşmaktadır. CD45 + hücreleri, alt popülasyonu saflaştırma in vitro genişlemesi veya iyileştirilmesi için de kullanılabilir. Bu yaklaşımın bir başka faydası da homojenatlarında birincil doku süpernatan normal ve habis dokular sitokinleri, kemokinleri immünoglobinlerin ve bu antijenleri karakterize etmek ve karşılaştırmak için kullanılabilir olmasıdır. Bu protokol, son derece düzgün şekilde insan meme dokularında ve normal ve anormal doku çeşitli için geçerli olmalıdır.

Ticari olarak temin edilebilen doku ayrılma çözeltiler ya da kollajenaz çeşitli laboratuar karışımları DNase ve / veya hiyaluronidaz önleyicileri ya da doku parçalarının enzimatik sindirim, hücre yüzeyi üzerindeki reseptörler çeşitli bölmektedir. Ilk olarak göğüs tümörlerini nüfuz eden CD4 + T hücreleri üzerinde duruldu Çalışmalarımız, hızlı bir şekilde bağlı standart enzimatik sindirim protokolleri 4-8 kullanılarak yüzey CD4 reseptör ayrılması için önemli bir teknik sorun sunulmuştur. Bu yüksek le...

Bu protokol, çeşitli normal ve malign insan dokularında bulunan CD45+ hücrelerinin (lenfositler/lökositler) kalitatif ve kantitatif değerlendirmesi için taze insan doku fragmanlarının hızlı enzimatik olmayan ayrışmasını tanımlar. Ek olarak, birincil doku homojenatından elde edilen süpernatant, daha fazla analiz veya deney için toplanabilir ve saklanabilir.

İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Bu prosedürün genel amacı, kalitatif ve kantitatif analizler ile spesifik lenfosit alt popülasyonlarının izolasyonu için, insan doku fragmanlarını enzimatik sindirim olmadan hızla tek hücre süspansiyonuna dönüştürerek homojenize etmektir. Bu işlem, öncelikle doku fragmanlarının steril bir skalpel kullanılarak küçük parçalara ayrılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, doku bulamacı, fragmanların tek hücre süspansiyonu haline gelene kadar daha fazla homojenize edildiği mekanik bir disosiyasyon tüpüne aktarılır.Hücreler daha sonra sonraki analizler için santrifüjle toplanır. Nihayetinde, infiltre olan lenfositleri ve alt popülasyonları analiz etmek için akış sitometrisi kullanılabilir. Laboratuvarım bu tekniği, tümör infiltre lenfositlerini doğal durumlarını ciddi şekilde etkilemeden görüntüleyebileceğimiz bir yol aradığımız için geliştirdi.Hücreleri hızla izole edebileceğimiz ve ameliyat anındaki durumlarıyla analiz edebileceğimiz bir yöntem istedik. Bu teknik, laboratuvarımızda 300'den fazla meme tümörü ve normal doku üzerinde kullanılmış olup kullanımı kolaydır ve günlük olarak uygulanabilir. Prognostik belirteçlerin, tedaviye yanıtın ve uzun vadeli klinik sonucun incelenmesinde kullanılabilir.Bu tekniği bugün, laboratuvarımdaki bir teknisyen olan John Nicola Loic gösterecek. Doku örneğini tartarak ve ardından dokunun uzunluğunu, genişliğini ve yüksekliğini ölçerek başlayın. Daha sonra doku parçasını, bir mililitre uygun, kimyasal olarak tanımlanmış serumsuz hematopoetik hücre ortamı içeren küçük bir Petri kabına aktarın ve örnekleri bir ila iki kare milimetrelik küçük parçalara bölmek için steril bir bistüri kullanın.Ardından, kap içeriğini mekanik disosyasyon C tüpüne aktarın ve kabı ile bisturiyi iki mililitre besiyeri ile durulayın. Yıkama sıvısını C tüpüne ekleyin ve ardından doku parçalarını nazikçe homojenize ederek tek hücre süspansiyonu elde etmek için 0.01 mekanik disosyasyon programını art arda iki kez çalıştırın. İkinci döngüden sonra, homojenatı 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirerek 50 mililitrelik konik bir tüpe boşaltın.Ardından, Petri kabını yıkamak için kullandığınız aynı pipeti, C tüpünde kalan sıvıyı hücre süzgecine aktarmak için kullanın. Sonra, filtrelenmiş sıvıyı 15 mL'lik konik bir tüpe aktarmak için bir mililitrelik mikropipet kullanın ve C tüpünü ek üç mL besiyeri ile durulayın. Bu yıkama sıvısını hücre süzgeci aracılığıyla 50 mL'lik tüpe aktarın.Ardından, dokuda hapsolmuş maksimum miktardaki kalıntı sıvıyı 50 mL tüpe sıkmak için homojenize edilmemiş dokuyu temiz bir 1 mL uç yardımıyla süzgeç içinde nazikçe hareket ettirin. Şimdi, hücre süzgecini orijinal C tüpünün üzerine ters bir şekilde yerleştirin ve homojenize edilmemiş dokunun tekrar C tüpüne düşmesi için süzgeci 3 mL daha besiyeri ile durulayın. Dokuyu az önce gösterildiği gibi iki döngü daha yeniden homojenize edin ve ardından bu ikinci homojenatı hücre süzgecinden geçirin.C tüpünü tekrar üç mililitre daha besiyeri ile durulayın. Ardından süpernatantı süzgeçten geçirin ve az önce gösterildiği gibi dokudaki kalıntı sıvıyı sıkın. Bu noktada, 15 mililitrelik tüpte yaklaşık 2,5 mililitre tek hücre süspansiyonu, 50 mililitrelik tüpte ise yaklaşık dokuz mililitre bulunmalıdır.Doku süpernatantını hücrelerden ayırmak için, her iki homojenat tüpünü oda sıcaklığında 600 Gs'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin, 15 mililitrelik tüpteki süpernatantı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktararak dört santigrat dereceye yerleştirin ve 50 mililitrelik tüpteki süpernatantı atın. Ardından, hücre peletlerini parçalamak için her bir tüpü sert bir yüzeye hafifçe vurun. 50 mililitrelik tüpteki gevşek hücre peletini 500 mikrolitre besiyeri ile yeniden süspande edin ve ikinci peleti yeniden süspand etmek için hücreleri 15 mililitrelik tüpe aktarın.Ardından 50 mililitrelik tüpü başka bir 500 mikrolitre besiyeri ile durulayın ve maksimum hücre geri kazanımı için yıkama sıvısını 15 mililitrelik tüpe aktarın. Trian blue dışlama yöntemiyle canlı hücre sayısını belirledikten sonra hücre süspansiyonunu pelletleyin. Son olarak, ayrılan doku süpernatantını santrifüjleyerek çöktürün.Ardından, pelete dokunmadan veya onu bozmadan süpernatanı dikkatlice en az bir temiz tüpe aktarın ve gelecekteki alt analizler için -80 °C'de saklayın. Bu grafiklerde, disosiye edilmiş tümör hücresi homojenatlarının ardından lökositler ve epitel hücre belirteçlerine karşı spesifik antikorlarla işaretlenmesinin temsilci akış sitometrisi nokta grafikleri gösterilmiştir. Bu protokol, CD 45 pozitif hücrelerin canlılığını önemli ölçüde değiştirmez.Ancak, canlı EPAM pozitif hücrelerde önemli bir kayıp söz konusudur. Buna rağmen, canlı EPAM pozitif ve CD 45 pozitif alt kümeler; boyutlarına ve yapılarına göre büyük epitelial tümör hücreleri, küçük epitelial hücreler veya büyük ve küçük CD 45 pozitif hücreler şeklinde ayrıştırılabilir. Temel tümör infiltrasyon alt kümelerine ait temsilci akış sitometrisi nokta grafikleri, lenfositlerin CD 45 pozitif hücrelerin canlılığına göre kapılandığı (gated) haliyle burada gösterilmiştir.Son olarak, meme kanseri süpernatantındaki sitokin ekspresyonu veya toplam immünoglobulinler, normal meme dokusundan elde edilen süpernatant ile karşılaştırılabilir; bu durum, bu temsili deneyde gösterildiği üzere, tümör dokusuyla ilişkili her iki protein türünde de artışlar olduğunu ortaya koymaktadır. Bu prosedür uygulanırken, uç nokta analiziniz için yeterli sayıda hücre elde etmek amacıyla hızlı ve temiz çalışmak ve prosedürün her adımında maksimum miktarda materyal geri kazanmak gerektiğini unutmamak önemlidir.

a-simple-rapid-protocol-to-non-enzymatically-dissociate-fresh-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, canlı hücreler elde etmek için taze insan dokusunun enzimatik olmayan ayrışmasını açıklar. Teknik, çeşitli normal ve malign insan dokularında bulunan CD45 pozitif hücrelerin (lenfositler/lökositler) kalitatif ve kantitatif analizi için kullanılır.

Mekanik Ayrışma: Bir Dokudan Canlı Hücre Elde Etme Yöntemi

Bu protokol, antijen yoğunluğuna tek bir hücre süspansiyonu santrifüj ve ilgi hücre popülasyonlarının son olarak manyetik ve / veya FACS ayıklama, ardından doku enzimatik sindirimi farklı adımları ile insan timus hücreleri sunan izole etmek için bir yöntem göstermektedir.

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

Statik yapışma deneyi T lenfositler ve diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimleri modellemek için kullanılabilecek bir güçlü bir araçtır. Etkileşimler, bir plaka okuyucu seri yıkama aşağıdaki yapışık hücre sayısını ölçmek için kullanılır ise, yapışma molekülleri ile kaplanmış oyuklarına etiketli T hücrelerinin enjekte edilerek üretilir.

T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi

Lenf nodu stromal hücrelerinin izolasyonu, fibroblastik retiküler hücreler, lenfatik ve kan endotel hücreleri elde etmek için enzimatik sindirim ve mekanik ayrıştırmayı içeren çok aşamalı bir prosedürdür. Tarif edilen prosedürde, canlı lenf nodu stromal hücrelerinin yüzey işaretleyici bozulmasını en aza indirmek için kısa bir sindirim otomatik mekanik ayrıştırma ile birleştirilir.

Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu

Deride yerleşik T hücrelerini insan derisi biyopsilerinden etkili bir şekilde izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, akım sitometrik analizi ve ex vivo kültür için yeterli sayıda canlı insan derisinde yerleşik lenfosit sağlar.

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Bu protokolün amacı floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS) kullanılarak insan lenfatik malformasyon kiste benzer damarları ve derisini astar lenfatik endotel hücreleri izole etmektir. Daha sonra hücre kültürü ve bu hücrelerin genişlemesi, genetik proteomik, işlevsel ve hücre farklılaşması çalışmaları için deney sofistike yeni bir düzeyde izin verir.

Çoklu-parametre floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma İnsan lenfatik endotel hücreleri İzolasyonu

Bu protokol, fare derisinin besin açısından zengin ortamda enzimatik sindirimini ve ardından lökositleri izole etmek için gradyan ayrımını tanımlar.  Bu şekilde türetilen hücreler, çeşitli alt uygulamalar için kullanılabilir. Bu, doku ayrışma makinelerine ve daha sert tripsin ve dispas bazlı doku sindirim protokollerine etkili, ekonomik ve gelişmiş bir alternatiftir.

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

Lenfoid dendritik hücre aktivasyonu sınamak için lenfatik doku sonraki çıkarma deneysel yordamları bir immunostimulating nanomaterial tedaviden sonra açıklanmıştır.

Immunostimulatory Ajan değerlendirme: Lenfoid doku çıkarma ve Enjeksiyon rota bağımlı dendritik hücre aktivasyonu

Bu protokolde lenfositler, alt odadan gözenekli bir zarla ayrılan bir transmigration sisteminin üst odasına yerleştirilir. Keokin alt hazneye eklenir, bu da bir kemokin gradyan boyunca aktif göçe neden olur. 48 saat sonra, lenfositler transmigration quantitate için her iki odada sayılır.

Ex Vivo Transmigration Sisteminde Lenfosit Göçünün Değerlendirilmesi

Bu, uterus lenfoid hücrelerini hem hamile hem de hamile olmayan farelerden izole etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, FACS fenotipleme, hücre sıralama, işlevsel tahliller, RNA-seq ve proteomik gibi birden çok aşağı akış uygulaması için kullanılabilir. Buradaki protokol, akış sitometrisi ile kandine doğuştan gelen lenfoid hücrelerin fenotip grup 1 rahiminin nasıl olduğunu göstermektedir.

Akış Sitometrisi ile Analiz için Uterus Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin İzolasyonu

Öğrenin, enzimatik sindirim kullanmadan taze insan dokusunu hızla tek hücre süspansiyonuna dönüştürme yöntemini. Akış sitometrisiyle tümör infiltratif lenfositlerinin kalitatif ve kantitatif analizini gerçekleştirin.

İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

Daha fazla video keşfet