İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, kalitatif ve kantitatif analizler ile spesifik lenfosit alt popülasyonlarının izolasyonu için, insan doku fragmanlarını enzimatik sindirim olmadan hızla tek hücre süspansiyonuna dönüştürerek homojenize etmektir. Bu işlem, öncelikle doku fragmanlarının steril bir skalpel kullanılarak küçük parçalara ayrılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, doku bulamacı, fragmanların tek hücre süspansiyonu haline gelene kadar daha fazla homojenize edildiği mekanik bir disosiyasyon tüpüne aktarılır.

Hücreler daha sonra sonraki analizler için santrifüjle toplanır. Nihayetinde, infiltre olan lenfositleri ve alt popülasyonları analiz etmek için akış sitometrisi kullanılabilir. Laboratuvarım bu tekniği, tümör infiltre lenfositlerini doğal durumlarını ciddi şekilde etkilemeden görüntüleyebileceğimiz bir yol aradığımız için geliştirdi.

Hücreleri hızla izole edebileceğimiz ve ameliyat anındaki durumlarıyla analiz edebileceğimiz bir yöntem istedik. Bu teknik, laboratuvarımızda 300'den fazla meme tümörü ve normal doku üzerinde kullanılmış olup kullanımı kolaydır ve günlük olarak uygulanabilir. Prognostik belirteçlerin, tedaviye yanıtın ve uzun vadeli klinik sonucun incelenmesinde kullanılabilir.

Bu tekniği bugün, laboratuvarımdaki bir teknisyen olan John Nicola Loic gösterecek. Doku örneğini tartarak ve ardından dokunun uzunluğunu, genişliğini ve yüksekliğini ölçerek başlayın. Daha sonra doku parçasını, bir mililitre uygun, kimyasal olarak tanımlanmış serumsuz hematopoetik hücre ortamı içeren küçük bir Petri kabına aktarın ve örnekleri bir ila iki kare milimetrelik küçük parçalara bölmek için steril bir bistüri kullanın.

Ardından, kap içeriğini mekanik disosyasyon C tüpüne aktarın ve kabı ile bisturiyi iki mililitre besiyeri ile durulayın. Yıkama sıvısını C tüpüne ekleyin ve ardından doku parçalarını nazikçe homojenize ederek tek hücre süspansiyonu elde etmek için 0.01 mekanik disosyasyon programını art arda iki kez çalıştırın. İkinci döngüden sonra, homojenatı 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirerek 50 mililitrelik konik bir tüpe boşaltın.

Ardından, Petri kabını yıkamak için kullandığınız aynı pipeti, C tüpünde kalan sıvıyı hücre süzgecine aktarmak için kullanın. Sonra, filtrelenmiş sıvıyı 15 mL'lik konik bir tüpe aktarmak için bir mililitrelik mikropipet kullanın ve C tüpünü ek üç mL besiyeri ile durulayın. Bu yıkama sıvısını hücre süzgeci aracılığıyla 50 mL'lik tüpe aktarın.

Ardından, dokuda hapsolmuş maksimum miktardaki kalıntı sıvıyı 50 mL tüpe sıkmak için homojenize edilmemiş dokuyu temiz bir 1 mL uç yardımıyla süzgeç içinde nazikçe hareket ettirin. Şimdi, hücre süzgecini orijinal C tüpünün üzerine ters bir şekilde yerleştirin ve homojenize edilmemiş dokunun tekrar C tüpüne düşmesi için süzgeci 3 mL daha besiyeri ile durulayın. Dokuyu az önce gösterildiği gibi iki döngü daha yeniden homojenize edin ve ardından bu ikinci homojenatı hücre süzgecinden geçirin.

C tüpünü tekrar üç mililitre daha besiyeri ile durulayın. Ardından süpernatantı süzgeçten geçirin ve az önce gösterildiği gibi dokudaki kalıntı sıvıyı sıkın. Bu noktada, 15 mililitrelik tüpte yaklaşık 2,5 mililitre tek hücre süspansiyonu, 50 mililitrelik tüpte ise yaklaşık dokuz mililitre bulunmalıdır.

Doku süpernatantını hücrelerden ayırmak için, her iki homojenat tüpünü oda sıcaklığında 600 Gs'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin, 15 mililitrelik tüpteki süpernatantı 1,5 mililitrelik bir tüpe aktararak dört santigrat dereceye yerleştirin ve 50 mililitrelik tüpteki süpernatantı atın. Ardından, hücre peletlerini parçalamak için her bir tüpü sert bir yüzeye hafifçe vurun. 50 mililitrelik tüpteki gevşek hücre peletini 500 mikrolitre besiyeri ile yeniden süspande edin ve ikinci peleti yeniden süspand etmek için hücreleri 15 mililitrelik tüpe aktarın.

Ardından 50 mililitrelik tüpü başka bir 500 mikrolitre besiyeri ile durulayın ve maksimum hücre geri kazanımı için yıkama sıvısını 15 mililitrelik tüpe aktarın. Trian blue dışlama yöntemiyle canlı hücre sayısını belirledikten sonra hücre süspansiyonunu pelletleyin. Son olarak, ayrılan doku süpernatantını santrifüjleyerek çöktürün.

Ardından, pelete dokunmadan veya onu bozmadan süpernatanı dikkatlice en az bir temiz tüpe aktarın ve gelecekteki alt analizler için -80 °C'de saklayın. Bu grafiklerde, disosiye edilmiş tümör hücresi homojenatlarının ardından lökositler ve epitel hücre belirteçlerine karşı spesifik antikorlarla işaretlenmesinin temsilci akış sitometrisi nokta grafikleri gösterilmiştir. Bu protokol, CD 45 pozitif hücrelerin canlılığını önemli ölçüde değiştirmez.

Ancak, canlı EPAM pozitif hücrelerde önemli bir kayıp söz konusudur. Buna rağmen, canlı EPAM pozitif ve CD 45 pozitif alt kümeler; boyutlarına ve yapılarına göre büyük epitelial tümör hücreleri, küçük epitelial hücreler veya büyük ve küçük CD 45 pozitif hücreler şeklinde ayrıştırılabilir. Temel tümör infiltrasyon alt kümelerine ait temsilci akış sitometrisi nokta grafikleri, lenfositlerin CD 45 pozitif hücrelerin canlılığına göre kapılandığı (gated) haliyle burada gösterilmiştir.

Son olarak, meme kanseri süpernatantındaki sitokin ekspresyonu veya toplam immünoglobulinler, normal meme dokusundan elde edilen süpernatant ile karşılaştırılabilir; bu durum, bu temsili deneyde gösterildiği üzere, tümör dokusuyla ilişkili her iki protein türünde de artışlar olduğunu ortaya koymaktadır. Bu prosedür uygulanırken, uç nokta analiziniz için yeterli sayıda hücre elde etmek amacıyla hızlı ve temiz çalışmak ve prosedürün her adımında maksimum miktarda materyal geri kazanmak gerektiğini unutmamak önemlidir.