Name: Küçük oligomer oluşturan Membran Protein Sedimantasyon Denge: pentameric İstikrar Histidine Protonasyon Etkisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Öğrenin, küçük hidrofobik membran proteininin pentamer oluşumunu ve pH değişimlerindeki stabilitesini sedimantasyon denge yöntemiyle nasıl belirleyeceğinizi. Bu teknik, viral protein etkileşimlerini ve ilaç geliştirme çalışmalarını destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Araştırma Vakfı hibesi NRF-CRP4-2008-02 (JT) ve Tier 1 hibesi RG 51/13 tarafından finanse edilmiştir.

Bu protokol daha fazla ayrıntı ve özel hususlar 3, 25-28 sevk edilecek olan aşağıdaki kaynaklara dayanmaktadır. 2, H2O ile deterjan miseller 1. Yoğunluk eşleştirme Not: tampon çözeltisi yoğunluklu deterjan miseller yoğunluğuna uyumlu olması gerekir. Ortak yoğunluk ayarlayıcı maddeler 2 H2O, H2 18 O, 2H 2 18 O, gliserol ve sakaroz 29 içerir. &#39;H 2 18 O 2 H2O ile aynı yoğunluğa sahiptir ve protein değiştirilebilir protonlar dötertumlanma istenmiyorsa, daha iyi bir seçim olabilir. Bu prosedürde, 50 mM Tris, pH 7.3, 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) -propanesulfonate (C14SB) deterjan yoğunluğu, 100 mM NaCI 2 H2O ile uyumlu olacak Bir ilk tahmin olarak, aşağıdaki konsantrasyonlar2 H2O kullanılacaktır: 10, 30, ve% 50 hac / hac. 1.1. Örnek hazırlanması <ol><li> Aşağıdaki stok çözeltileri ve filtre bir 0.2 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir sterilize hazırlanması: 50 ml, 500 mM Tris pH 7.3, 1 M NaCI (10 X tampon çözeltisi); 1 mi, 250 mM C14SB (50X deterjan çözeltisi). </li><li> 20 ul 10X tampon çözeltisi, 4 ul 50X deterjan çözeltisi, 20 ul 2 H2O (% 99.9) ve 156 ul karıştırılarak numune çözeltisinin 200 ul hazırlayın H 2 O deiyonize 20 ul 2 H2O (% 99.9) ve 160 ul, 20 ul 10X tampon çözeltisi karıştırılarak bir referans çözeltisi, 200 ul hazırlayın H 2 O deiyonize </li><li> Diğer 2 H2O konsantrasyonları için yineleyin 1.1.2, uygun 2 H2O ve H2O miktarlarını ayarlamaya,% 30 ve% 50, yani. </li></ol> 1.2. 6-kanal A MeclisiHücre içine UC hücreleri ve örnek yükleme. Not: Örnek yükleme yöntemine bağlı olarak EAA hücrenin iki türü vardır. Hücreler mühürlü sonra hücreler yüklenebilir dış dolgu ise dış dolgu olmadan Hücreler, hücre sızdırmazlık önce yüklenecek olan. Harici-dolgu AUC hücre Meclis, daha önce 3 tarif edilmiştir. Bu protokolde, dış dolgu olmadan 6-kanal EAA hücre montajı anlatılmıştır. Ana fark, ayrıca sıkılır her iki tarafta vida halkalar olmasıdır, ve (Şek. 1) muhafaza fişleri gerek yoktur. montaj aşamalarında fark aşağıda belirtilmiştir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig1.jpg" /> Şekil 1. Harici dolgu olmadan 6-kanal EAA hücre görünümü patladı. Bu rakam Beckman Coulter An-50 Ti modifiye ve An-60 Ti Analyti olmuşturcal Rotor, Hücreler ve karşı ağırlıklar kullanım kılavuzu. <ol><li> Safir penceresinin yerine kuvars penceresinde (Şekil. 2) Her EAA hücre için iki pencere meclisleri hazırlayın. Pencere tutucu içine pencere conta yerleştirin. Biraz pencere astarı viraj ve boşluk pencere tutucu şafta karşısında oluşturacak şekilde pencere tutucu içine yerleştirin. Pencere tutucu yivli işareti hizalayarak, pencere liner içine safir penceresini yerleştirin. . Not: Bu tür bu yoğunluk eşleştirme deneyde olduğu gibi 30000 rpm üzerinde parazit ölçümleri, Bu nedenle yüksek hızda 28, 30 daha fazla ışık kırılma üretecek ve böylece kuvars cam sıkıştırılabilir ve safir camlar kullanılmaktadır. Bir safir cam kuvars penceresinden daha ağırdır ve yüzüne kazınmış bir &quot;X&quot; vardır. </li></ol><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig2.jpg" /> Şekil 2. patlamış görünümü of pencere montajı. Bu rakam Beckman Coulter An-50 Ti ve An-60 Ti Analitik Rotor, Hücreleri ve karşı ağırlıklar kılavuzdaki modifiye edilmiş <ol><li> Parça numarası baş aşağı hücre gövdesini yerleştirin. Konut tuşu ile uyumlu kama yatakları ile, (sol, Şek. 1) aşağı bakan pencere ile bir pencere montajı ardından, öncelikle hücre konut aşağı eğimli tarafı 6-sektör merkezinde içine kaydırın. </li><li> Hafifçe kat spinkote vida halka konuları ve vida halkası yıkama. Pencere montaj üstüne bir vida halka pulu yerleştirin. Dışında bakan kelime &quot;OUT&quot; pencere gövde içine vida halkası takın. Hücre hizalama aracını kullanarak vida halkası elle sıkın. </li><li> Tork anahtarı kullanarak, sadece 60 inç-pound vida halka sıkın. </li><li> Parça numarası dik ve 12-öğle saatlerinde konumlandırılmış olan hücreyi yerleştirin. LSol satır içine OAD 120 ul referans ve sağ satır içine 110 ul örnek. Her numune ve referans doğru eşleştirilmiş emin olun. Not: Tam numune hacmi kritik öneme sahip değildir, ancak örnek menisküs farklı olacak şekilde bir referans numunesi (5-10 ul) biraz daha fazla hacme sahip olması gerekir. </li><li> Dikkatle pencere (Şekil. 1, sağ) aşağı bakacak şekilde hücre gövdesi, bir pencere montaj içine kaydırın. Aşırı hücre rahatsız ve içeriğini dökmek için değil dikkat edin. </li><li> Adımı yineleyin 1.2. 3 ve 1.2. 4, 120 inç-pound ikinci vida sıkma halkasını. Hücreyi ters çevirin ve 120 inç-pound ilk vidalı halka yeniden sıkın. </li><li> , Rotor içine hücreleri yükleyin santrifüj içine rotor yüklemek ve üreticinin talimatlarına göre 28 monokromatörü yükleyin. Not: Bu st AyrıntılarAP, bu referansta 3 bulunabilir. </li></ol> 1.3. Girişim ölçümü kurma <ol><li> Kısaca şu aşamada özetlenebilir olacak üreticinin talimatlarına göre, EAA enstrüman için kullanıcı arabirimi yazılımını başlatın ve 3000 rpm&#39;de her hücre için lazer kurulum ve radyal kalibrasyonu yapın. </li><li> Yeterli bir vakum sonra 1.3.1.1 (&lt;100 mikron), 3000 rpm&#39;de santrifüj çalıştırmak ulaşıldı. Kullanıcı arayüzü yazılımı girişim deseni önizlemesini ve yüksek kontrast elde etmek için lazer parametrelerini ayarlamak. </li><li> &quot;Denge&quot; ve &quot;Girişim&quot; ölçüm belirterek | (Yeni Dosya Dosya) Yeni kurmak dosyası oluşturun. Bir sedimantasyon denge yöntemi (&quot;Yöntem&quot; düğmesi) 20 ° C&#39;de çalışma sıcaklığı, 45000 rpm veya daha yüksek hangisi protein örnekleri için beklenen en yüksek hızında çalışacak ve 1 tarama toplamak için her 15 dakikada ayarlayın. MonitoHeteroAnalysis veri dosyaları açma ve en az 12 saat sonra &quot;Maç&quot; fonksiyonunu seçerek r denge ilerleme (yaklaşık gecede Şekil. 3). Not: Benzer bir fonksiyonu da SEDFIT (Seçenekler | Yükleme Seçenekleri | Denge Test Yaklaşımı) mevcuttur. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig3.jpg" /> Şekil HeteroAnalysis Maç işlevi 3. Sonuç. Maç işlevi ardışık tarama ve son tarama arasındaki RMSD karşılaştırarak denge ilerlemesini izlemek için kullanılabilir. X ekseni asimptotik RMSD değerleri ile gösterildiği gibi bu örneğin 8 saat sonra denge elde edilmesini gösterir. 1.4. Veri analizi <ol><li> Numunelerin her bir grubu için, 2 H2O konsantrasyonuna karşı radyal dağılım profili eğimini çizilir. Not: Dağıtım çok sığ üstel o ap olacakyaklaşımlar çok doğrusallık. X ekseni ile kesişme noktasını eşleşen 2 H2O konsantrasyonuna karşılık gelir. </li><li> Daha doğru sonuçlar için, çeşitli çoğaltır deneyi gerçekleştirmek. Seçenek olarak ise, 2 H2O konsantrasyonunun daha dar bir aralık deneyi tekrar. </li></ol> C14SB miselleri içine SH 2. çökelme dengesi 2.1. Run parametreler <ol><li> SEDNTERP kullanarak tampon yoğunluk ve viskozite, protein kısmi spesifik hacim ve santrifüj hızı hesaplayın. D 2 O konsantrasyonu da dahil olmak üzere, &quot;Tampon Veri Seç&quot; bölümündeki tampon ve yoğunluk seçin Compute hesaplamak ve buna göre tampon bileşenleri girmek için. </li><li> 2.1.1.1 &quot;V-bar&quot; bölümünde protein kısmi spesifik hacim seçin Compute hesaplamak ve protein amino asit dizisini girin. &quot;N = Bu monomer bir oligomer olun&quot; en yüksek beklenen oligomerik boyutunu belirtinalan, bu durumda N = 5. ana penceresinde RPM alanındaki değerleri girerek hızını hesaplayın kadar σ ≈ 1; Bu radyal dağılım profili 25 iyi bir üstel şekli sağlamak için başparmak bir kuraldır. Not: Bu, aşağıdaki gibi deney için hesaplanan değerler olarak: ρ = 1,03839 g / ml, η = 1,0267 cP = 0,7569 ml / g arasında, ω 1 = 16000 rpm. </li><li> Bir hız ve sonraki 25 de dağıtım profili arasında yeterli fark sağlamak için takip sonraki hızları hesaplayın. Not: Bu da işlevinden yapılabilir hesaba çözüm sütunu (dolum hacmi) alır SEDFIT içinde, &quot;denge rotor işlevi hızlandırır tahmin&quot;. </li></ol> 2.2. Numune hazırlanmasına, <ol><li> 5 mM C14SB ile 1 ml referans solüsyonu ve% 32,3 2 H 2 O hazırlayın 100 ul 10X tampon Solutio karıştırarak yoğunluk eşleştirme deney (bölüm 1), belirlenen şekilden, (aşama 1.1.1), 20 ul 50X deterjan çözeltisi (aşama 1.1.1), 323 ul 2 H2O (% 99.9) ve 527 ul H2O deiyonize </li><li> Örneğin metanol veya% 50 h / h sulu asetonitril gibi uygun bir çözücü içinde, liyofilize edilmiş, HPLC ile saflaştırılmış, SH peptidleri (daha önce tarif edilen 31 ifadesi ve saflaştırılması) çözündürülür. Her bir seyreltilmiş bir 280 vermek üzere üç numune için bir mikrolitre ölçekli UV / Vis spektrometre ve kısım içinde çözülmüş peptidlerin A280 ölçümü, 12 mm = 0.3, 0.5 ve 0.8 (A 280, 10 mm = 0.25, 0.417 ve 0.67) 130 ul. Gecede örnekleri liyofilize ve tekrar süspansiyon 130 ul referans çözeltisi (adım 2.2.1) örnek çözümleri vermek. Not: Trp, Tyr ve kalıntılarını içerdiği için, SH proteini 280 nm&#39;de UV / Vis emme tespit edilebilir. Aromatik artıkların olmayan proteinler ya da müdahale ile, uygun bir kromofor ile etiketleyerek Bir Trp ihtiva eden mutant kullanılarak tespit edilebiliryerine absorbans ım ölçümleri. </li><li> Kuvars pencereli bir 6-kanal EAA hücre montajı bölüm 1.2 adımları izleyin. En yakın rotor merkezine rotor merkezi ve en düşük konsantrasyon numunesi (A 280, 12mm = 0.3) uzak (A 280, 12mm = 0.8) kanal yüksek konsantrasyon örneği yükleyin. </li></ol> 2.3. Absorbans ölçümleri ayarlama <ol><li> &quot;Denge&quot; ve &quot;Absorbans&quot; ölçümü belirterek | (Yeni Dosya Dosya) Yeni kurmak dosyası oluşturun. Dedektör dalga boyu olarak 280 nm belirtin. </li><li> Tek Tarama Radyal adım büyüklüğü = 0.01 cm, çoğaltır = 3 (düşük çözünürlükte, hızlı) ile örneğin, düşük çözünürlükte veri toplama belirterek, Tarama Seçenekleri &quot;ilk taramadan önce Radyal kalibrasyon&quot; kontrol ve yürüterek 3000 rpm&#39;de radyal kalibrasyon yapın . Tarama tamamlandıktan sonra, seçeneğinin işaretini kaldırın. </li><li> &quot;(Metho bir sedimantasyon denge yöntemi kurmak&quot;düğmesi) d 20 ° C&#39;de, adım 2.1.3 hesaplanan ilk hızda çalışacak ve 1 Tarama her 30 dakikada bir toplamak. Her hücrelerin &quot;Detay&quot;, adım 2.3.2 gibi düşük çözünürlükte veri toplama belirtin. En az 18 saat sonra &quot;Maç&quot; fonksiyonunu HeteroAnalysis veri dosyaları açma ve seçerek denge ilerlemesini izlemek (yaklaşık gecede, Şek. 4). Not: sonraki hızları daha az zaman alacak ise denge ulaşılması, ilk hız için önemli ölçüde daha uzun sürebilir. </li></ol><img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig4.jpg" /> HeteroAnalysis Maç işlevinden Şekil 4. sonuçları. Birinci ve ikinci hızları (sol üst ve sağ) dengeye ulaşmış görünüyor, ama emin olmak için bir kaç saat daha beklemek daha iyidir. Buna karşılık, üçüncü ve dördüncü hızları (alt sol ve sağ) açıkça dengeye ulaşmıştırdaha kısa sürede. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52404/52404fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol><li> Denge ulaşıldığında, Radyal adım büyüklüğü = 0.001 cm, çoğaltır = 10 (yüksek çözünürlüklü, yavaş) ile yüksek çözünürlükte, örneğin tek bir tarama toplamak. </li><li> Tarama tamamlandıktan sonra, bir sonraki hız için adım 2.3.3 ve 2.3.4 tekrarlayın. </li><li> Zaman, her hız için denge bilinen (hesaplanan veya deneyim) ulaşması için gerekli zaman İsteğe bağlı, her biri için dengeleme süre sonra 1 tarama toplamak için adım ve 2.1.3 hesaplanan tüm hızları dahil sedimantasyon denge yöntemi tarama kurmak hız. Bu durumda, her bir hücrelerin &quot;Detay&quot; yüksek çözünürlüklü veri toplama belirtin. </li></ol> 2.4. SEDFIT ve SEDPHAT Veri analizi Not: Daha fazla bilgi ve veri analizi okuyucu olarak hususlar için t denirwww.analyticalultracentrifugation.com: Aşağıdaki web o. <ol><li> Açık yüksek çözünürlüklü SEDFIT içinde taramalar (Veri | yük sedimantasyon denge verileri) ve 3 kanallar (; | Yükleme Seçenekleri | 3 Alt Grupları 6-kanal ham veri kaydetme Seçenekler bu farklı her bir örnek için konsantrasyonlara karşılık) veri bölünmüş. </li><li> Yeniden-açık SEDFIT aynı örnek ve aynı konsantrasyonda ancak farklı hızlarda ait veri dosyaları. Menisküs (dikey kırmızı çizgi), hücre alt (dikey mavi çizgi) ve montaj sınırları (dikey yeşil çizgiler) ayarlayın ve SEDPHAT kullanılmak üzere veri ihracat (Veri | SEDPHAT İhracat Verileri). Girdi istendiği gibi rotor türü ve merkezinde türü yanı sıra, adım 2.1.1 hesaplanan parametreler. Her numune ve konsantrasyon için bu adımı tekrarlayın. </li><li> SEDPHAT aynı örnekten tüm verileri (tüm konsantrasyonlar ve hızlar) açın ve Deney Parametreleri doldurun; Bir örnek, Şekil l&#39;de gösterilmiştir. 5. Not: D 2 O tamponu Deut ilave edildiğinde<html> Değiştirilebilir protonlar birleşmeleri T ciddi ölçüde suda çözünür proteinleri, protein moleküler ağırlığı değiştirebilir. Membran-gömülü bölgeler döviz korunur, çünkü zar proteinleri, SH proteini gibi özellikle küçük olanlar, daha az etkilenir. Bunu düzeltmek için, girişi &quot;D mol fraksiyonu tampon&quot;. Not: Bu aşamada menü Veri seçerek ayrı ayrı düzenlenmiş veri kümesi kaydetmek için tavsiye edilir | Yeni Yapılandırması Olarak Kopyala Tüm Veri ve Kaydet. </li><li> Bir Model seçin ve bu model için Küresel Parametreleri doldurun. Not: Örnek olarak, &quot;monomer-n-mer kendi kendine birleşmeme özelliği&quot; modeli ve parametreleri Şekil l&#39;de gösterilmektedir. 6. </li></ol><img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52404/52404fig5.jpg" /> Şekil 5. Deneysel Parametreler doldurmak için nasıl bir örnek. dosya / ftp_upload / 52.404 / 52404fig6.jpg &quot;/&gt; Şekil 6. Monomer-n-Mer Self-Dernek modeli için Küresel Parametreleri doldurmak için nasıl bir örnek. <ol><li> Menü Fit seçerek Küresel Fit çalıştırın | Küresel Fit ve fit yakınsak kadar bekleyin. Aşağı Not (veya bir ekran görüntüsü almak) uydurma sonuçlar, özellikle küresel azaltılmış ki-kare ve K adet bir günlük değerleri. Termodinamik Bilgileri Göster | sığdırma veri ve menü Kopyala ve Display montaj artıklar gibi diğer verileri ayıklayın. </li><li> Küresel Parametreler dönün ve (1) monomer molekül ağırlığı uyacak ve adım 2.4.5 tekrarlamak için M kontrol edin. Takılan molekül ağırlığı ve küresel azaltılmış ki-kare not edin. </li><li> Adımı yineleyin 2.4.3 her model test edilecek için 2.4.6 ve düşük küresel ki-kare değerinin yanı sıra montaj artıklar karşılaştırarak, her modelin uygun kalitesini karşılaştırmak için. Not: Küçük ve rastgele uydurma artıklar genelde iyi bir uyum gösterir, ve olur en uygun modeliküçük küresel azaltılmış ki-kare var. monte monomer molekül ağırlığı ve ki-kare değeri sabit (teorik) molekül ağırlığı bundan önemli ölçüde farklılık olmamalıdır. </li><li> İlk seçme İstatistik göre değer elde günlüğüne Ka için güven aralığı hesaplayın | Kritik hata yüzey projeksiyonları için ki-kare ve istenen güven aralığı girilerek. Günlük Ka için ki-kare değerleri elde etmek için Küresel Parametreleri iletişim Ka giriş 1-boyutlu hata yüzey projeksiyon oluşturun ve seçimini kaldırabilirsiniz | Sonraki İstatistik gidin. Not: okuyucular, bu yöntemin 33 yöntemi 32 yanı sıra illüstrasyon hakkında daha fazla bilgi için aşağıdaki kaynakları (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ sedphat / statistics.htm) başvurmaları önerilir. </li></ol>

<ol><li>Laue, T. M., Stafford, W. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 75-100 (1999).</li>
<li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science%3A+A+tutorial+review%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li>
<li>Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530(2009).</li>
<li>Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+heterologous+protein-protein+interactions+using+analytical+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods-a+Companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation.</a> Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).</li>
<li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+for+association+and+assembly+the+study+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).</li>
<li>MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+detection+for+the+XLI+analytical+ultracentrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge.</a> Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).</li>
<li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Protein+Interactions+-+Methods+for+Detection+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-Protein Interactions - Methods for Detection and Analysis.</a> Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).</li>
<li>Alexandrov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+method+for+high-throughput+co-expression+of+protein+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).</li>
<li>Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterisation+and+functional+significance+of+transient+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions.</a> J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).</li>
<li>Ebel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sedimentation+velocity+to+characterize+surfactants+and+solubilized+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins.</a> Methods. 54, 56-66 (2011).</li>
<li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+reversible+macromolecular+associations+via+sedimentation+equilibrium%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction.</a> Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).</li>
<li>Dowell, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+is+an+important+cause+of+community-acquired+lower+respiratory+infection+among+hospitalized+adults%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults.</a> J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).</li>
<li>Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+respiratory+syncytial+virus+from+which+the+entire+SH+gene+has+been+deleted+grows+efficiently+in+cell+culture+and+exhibits+site-specific+attenuation+in+the+respiratory+tract+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse.</a> J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).</li>
<li>Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+respiratory+syncytial+virus+small+hydrophobic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein.</a> J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).</li>
<li>Jin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+respiratory+syncytial+viruses+with+deletions+in+the+NS1%2C+NS2%2C+SH%2C+and+M2-2+genes+are+attenuated+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo.</a> Virology. 273, 210-218 (2000).</li>
<li>Karron, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29+SH+and+G+proteins+are+not+essential+for+viral+replication+in+vitro%3A+clinical+evaluation+and+molecular+characterization+of+a+cold-passaged%2C+attenuated+RSV+subgroup+B%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).</li>
<li>Whitehead, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+respiratory+syncytial+virus+bearing+a+deletion+of+either+the+NS2+or+SH+gene+is+attenuated+in+chimpanzees%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees.</a> J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).</li>
<li>Rixon, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+hydrophobic+%28SH%29+protein+accumulates+within+lipid-raft+structures+of+the+Golgi+complex+during+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection.</a> J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).</li>
<li>Collins, P. L., Mottet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+orientation+and+oligomerization+of+the+small+hydrophobic+protein+of+human+respiratory+syncytial+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus.</a> J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).</li>
<li>Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+hydrophobic+protein+of+human+respiratory+syncytial+virus%3A+comparison+between+antigenic+subgroups+A+and+B%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B.</a> J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).</li>
<li>Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+the+respiratory+syncytial+virus+SH+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene.</a> J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).</li>
<li>Gan, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+hydrophobic+protein+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+forms+pentameric+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels.</a> J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).</li>
<li>Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+%28hRSV%29+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein Sci. 17, 813-820 (2008).</li>
<li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Small+Hydrophobic+Protein+and+Structural+variations+in+a+bicelle+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment.</a> J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).</li>
<li>Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+membrane+protein+molecular+weights+and+association+equilibrium+constants+using+sedimentation+equilibrium+and+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity.</a> Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).</li>
<li>Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+Ultracentrifugation%3A+Sedimentation+Velocity+and+Sedimentation+Equilibrium%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium.</a> Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).</li>
<li>Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+membrane+protein+molecular+weight+using+sedimentation+equilibrium+analytical+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Prot.+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation.</a> Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22An-50+Ti+and+An-60+Ti+Analytical+Rotor%2C+Cells%2C+and+Counterbalance%22">An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance</a>. , Beckman Coulter, Inc. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/techdocs?docname=LXLA-TB-003">https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/techdocs?docname=LXLA-TB-003</a> (2005).</li>
<li>Mayer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+membrane+proteins+in+detergent+solution+by+analytical+ultracentrifugation%3A+Different+methods+for+density+matching%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Colloid+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching.</a> Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).</li>
<li>Laue, T. Ch. 20.3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLaue%2C+T+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22">Current Protocols in Protein Science</a>. 20, John Wiley & Sons, Inc. 20.23.21-20.23.13 (2001).</li>
<li>Gan, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Small+Hydrophobic+Protein+Of+The+Human+Respiratory+Syncytial+Virus+Forms+Pentameric+Ion+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels.</a> J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).</li>
<li>Bevington, P. R., Robinson, D. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBevington%2C+PR+%22Data+reduction+and+error+analysis+for+the+physical+sciences%22">Data reduction and error analysis for the physical sciences</a>. 336, McGraw-Hill. New York. (1969).</li>
<li>Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sedimentation+equilibrium+analysis+of+recombinant+mouse+FcRn+with+murine+IgG1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1.</a> Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).</li>
<li>Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cost-effective+method+for+simultaneous+homo-oligomeric+size+determination+and+monodispersity+conditions+for+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins.</a> Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).</li>
<li>Montserret, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+structure+and+ion+channel+activity+of+the+p7+protein+from+hepatitis+C+virus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus).</a> J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).</li>
<li>Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+Ultracentrifugation+Studies+of+the+Influenza+M2+Homotetramerization+Equilibrium+in+Detergent+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Progr+Colloid+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions.</a> Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).</li>
<li>Sorkin, A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+and+endocytosis%3A+Close+encounters+of+many+kinds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).</li>
<li>Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+ion+channel+activity+of+the+human+respiratory+syncytial+virus+%28hRSV%29+small+hydrophobic+protein+transmembrane+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+science+%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain.</a> Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu çalışma, numune hazırlama ve denge sedimantasyon kullanılarak deterjan küçük bir zar proteini oligomerizasyon analizi için bir deney protokolü sağlar. yoğunluk eşleme aşaması gerekli değildir olarak açıklanan protokol, aynı derecede geçerlidir -ve çözünür proteinler için simpler- olup. Gerçekten de, deterjanlar ve proteinin bir karışımından teşekkül eder. Parçacık flotasyon katkıda bulunmaz, böylece sedimantasyon çalışmalar yapmak, deterjan yerçekimi alanına görünmez olmalıdır. Böylece, deterjan yoğunluğu dikkatle ku...

Analitik Ultrasantrifügasyon 1-5, fizyolojik koşullar altında makromoleküllerin etkileşimleri incelemek zayıf ve güçlü etkileşimler hem erişilebilir olmasının en önemli yöntemlerden biridir. yöntem etiketi içermez ve ışık emiliminin veya girişim kullanır ve hatta floresan optik sistemler büyüklüğü 6 birkaç düzeyleri üzerinde konsantrasyon aralıkları ulaşmak için kullanılabilir. En biyokimyasal işlemler tersine etkileşimine bağlıdır, bu yöntem özellikle faydalıdır. Bu etkileşimlerin stoikiometri ve gücü kantitatif biyolojik süreçleri anlamak için karakterize lazım, ve bir dizi yöntem, bu amaçla 7, 8 için var. Bununla birlikte, geçici etkileşimler 9 çalışma zordur. makromoleküler etkileşimleri tanımlamak için bir yöntem seçimi statik veya dinamik doğasına bağlıdır. İlk durumda, Sedim<html> yönelimi hızı (SV) radyal ulaşım oranı ölçülür ve kompleksleri yüzer kütle ve şekil farklılıkları esasında kesirleştirilmiştir yerlerde kullanılır. Buna karşılık, deney zaman ölçeği üzerinde ters çevrilebilir dinamik dernekler fiziksel ayrılamaz. Bu durumda, kendi kendine ya da kovalent olmayan etkileşimlerin neden hetero etkileşimleri toplam protein konsantrasyonuna bağlı olan bir denge içindedir. Bu dinamik etkileşimler sedimantasyon denge (SE) ve sedimantasyon hızı (SV) 10 hem ele alınabilir. Bununla birlikte, birinci yöntem gerçekleştirmek için basit ve burada tarif edilmiştir. Bir denge difüzyon ve çökelme ile ulaşılır, böylece SE olarak, santrifüj, yeterince düşük bir hızda gerçekleştirilir. Bu noktada her iki radyal mesafenin bir fonksiyonu olarak, bir optik işaret (UV-VIS) denge profili, dernekler 11 için önceden belirlenmiş bir termodinamik modeller kullanılarak analiz edilebilir. ve_content &quot;&gt; Bu yazıda, bir sedimentasyon dengeleme çalışması nedeniyle hidrofobisite. iyon kanallarını oluşturur viral zar proteininin kendi kendine birleşmeme özelliği sunulmuştur deney deterjan varlığında gerçekleştirilir, ve bu durumda yoğunluk olduğu Çözücü deterjan edilene uyumlu olması gerekir. Bununla birlikte, protokol solvent yoğunluk eşleme gerekli olacaktır, bunun dışında, suda çözünür protein halinde olur aynı tanımladı. kullanılan protein, insan solunum sinsisyal virüsü (hRSV), alt solunum yolu bebeklerde hastalığı, yaşlılar ve bağışıklık popülasyonları Dünya çapında 12 neden Paramyxoviridae ailesinden bir zarflı Pneumovirus kodlanmıştır. HRSV enfeksiyonu kadar 64 milyon bildirilen vaka ve ölüm 160,000 her yıl meydana gelir. hRSV genom üç membran proteinleri, F, G ve küçük hidrofobik (SH) dahil olmak üzere 11 proteinleri transkripsiyonunu yapar. SH proteini katılırRSV enfeksiyonu patogenezinde. SH gen (RSVΔSH) eksik RSV mümkün olduğunu sinsitiyumların oluşmasına neden ve vahşi tip (WT) virüsü 13-16 kadar büyüdü. Bununla birlikte, RSVΔSH virüsü üst solunum yolu 15, 16 WT daha az verimli bir şekilde 10-kat çoğaltılır. Ayrıca, RSVΔSH virüs in vivo fare ve şempanze modelleri 13, 17 in zayıflatılmış oldu. SH proteini 64 (RSV alt grup A) veya 65 (RSV alt grup B) amino asitler, uzun türü Golgi 18 zarlarına çoğunlukla birikir II integral membran proteinidir. SH proteini, tek bir yüksek 20,21 korunmuş bir sarmal transmembran (TM) etki 19 tahmin vardır. C- ve N-terminal extramembrane etki lumenally / hücre dışı ve sitoplazmik sırasıyla yönlendirilir. Hem sentetik TM domeni (kalıntılar 18-43) Ve tam uzunlukta SH proteini deterjanların çeşitli homopentamers oluşturmak için gösterilmiştir. homopentameric bir şekilde düzlemsel bir lipid çift tabakaları 22,23 kanal aktivitesi için sorumludur. Lipit TM monomerlerin doğru yönlendirme ilk His-22, bir lümene ilişkin olması yakın yönde arası sarmal için gösterdi alana özel kızılötesi dikroizma 23 kullanılarak belirlenmiştir. Aynı TM domeni yönü (DPC) dodesilfosfokolin olarak pentamerik proteinin tam uzunluğunun bir sarmal demeti yeniden 22 miseller NMR çalışmaları ile teyit edilmiştir. Bu &#39;misel&#39; modelinde, tek bir a-helis TM domeni bir genişletilmiş B-hairpin C-terminal a-helisin göre N-terminal olarak sınırlanan ve edilmiştir. SH proteininin iki protonize kalıntıları, His-22 ve His-51, TM domeni (lumenally yönelimli) bulunur ve extramembrane C-terminali β firketenin ucunda sırasıyla (kadar kanal gözeneğinden). Bir bicellar Çevreyinment, ancak TM α-heliks His-51 kadar uzanır ve her ikisi de His artığı kanalı 24 lümenine erişilebilir. 22 hidrofobik yan zincirler (Ile-32, Ile-36, Ile-40 ve Leu-44), ve kaplı olan kanal yapısı, bir huni benzeri bir mimari 22 dar bölümün benimser (Cys-45, Ser-29) Ile-36 kanal lümen dar noktasını tanımlar. His-51 küçük açıklığın ucunda ise His-22, bu huni büyük açıklık yer almaktadır. Bu yazıda, bir sedimantasyon denge modunda analitik santrifüj O&#39;nun protonlanma SH, protein pentamerin istikrar etkiler olmadığını belirlemek için kullanılmıştır. Bu durumda, SH protein, literatürde bu SH protein yapılarını pentamerik oligomerler 22 göstermek için daha önce kullanılmış olan C14-betain deterjan içinde çözünmüştür.

<table><tbody><tr><td>3- (N, N-dimetilmiristylamonyo) propansülfonat</td><td>Sigma</td><td>T0807</td><td></td></tr><tr><td>Döteryum oksit% 99.8</td> <td>Cambridge izotop</td><td>DLM-4-99.8</td><td></td></tr><tr><td>an-50 Ti rotor, analitik, 8'li</td><td>Beckman Coulter</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>An-60 Ti rotor, Analitik, 4'lü</td><td>Beckman Coulter</td><td>361964</td><td></td></tr><tr><td>Hücre muhafazası</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>334784</tr><tr><td>12 mm altı kanallı orta parça, epon kömür dolgulu</td><td>Beckman Coulter</td><td>331376</td><td></td></tr><tr><td>Pencere tutucu</td><td>Beckman Coulter</td><td>305037</td><td></td></tr><tr><td>Pencere contası</td><td>Beckman Coulter</td><td>327021</td><td></td></tr><tr><td>Pencere kaplaması</td><td>Beckman Coulter</td><td>362329</td><td></td></tr><tr><td>Safir pencere</td><td>Beckman Coulter</td><td>307177</td><td></td></tr><tr><td>Kuvars pencere</td><td>Beckman Coulter</td><td>301730</td><td></td></tr><tr><td>Vida halkası rondela</td><td>Beckman Coulter</td><td>362328</td><td></td></tr><tr><td>Vida halkası</td><td>Beckman Coulter</td><td>301922</td><td></td></tr><tr><td>Spinkote</td><td>Beckman Coulter</td><td>306812</td><td></td></tr><tr><td>Tork standı tertibatı</td><td>Beckman Coulter</td><td>361318</td><td></td></tr><tr><td>Karşı Ağırlık</td><td>Beckman Coulter</td><td>360219</td><td></td></tr><tr><td>Hücre hizalama aracı</td><td>Beckman Coulter</td><td>362340</td><td></td></tr><tr><td>SEDNTERP</td><td></td><td></td><td>http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</td></tr><tr><td>HeteroAnalysis&nbsp;</td><td></td><td></td><td>http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp</td></tr><tr><td>SEDFIT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm</td></tr><tr><td>SEDPHAT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm</td></tr></tbody></table>

küçük oligomer oluşturan membran protein sedimantasyon denge: pentameric İstikrar histidine protonasyon etkisi

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Analitik ultrasantrifügasyon, (EAA) etkileşim kuvvetleri geniş bir aralıkta ve fizyolojik koşullar altında, makro moleküller arasındaki tersine çevrilebilir etkileşimler üzerinde çalışmak için de kullanılabilir. Bu AUC&#39;sini nicel stoikiyometri ve homo ve biyokimyasal süreçlerde geçici ve geri dönüşümlüdür hetero-Dernek termodinamik değerlendirmek için bir seçim yöntemi yapar. Sedimantasyon denge yöntemi (SE) &#39;de, difüzyon ve çökelme arasında bir denge, belirli bir ilişki modeline bağlıdır radyal mesafenin bir fonksiyonu olarak, bir profil sağlar. Burada detaylı bir GD protokolü bir analitik ultrasantrifüj kullanarak küçük bir zar proteini oligomerin boyut ve monomer ilişki enerjisini tespit etmek üzere tarif edilmiştir. AUC-ES sadece fiziksel ilkelere dayalı, etiket-ücretsiz, ve hem suda çözünür ve membran proteinleri kullanılabilir. Bir örnek ikincisinin gösterilir, insan solunum sinsisyal virüsü küçük hidrofobik (SH) proteini (hRSV), Pentamerik iyon kanallarını oluşturan tek bir α-sarmal transmembran (TM) etki alanı ile 65-amino asit polipeptit. NMR tabanlı yapısal veriler SH proteini kanalının lümen bakan yönlendirilmiş olan zar ötesi etki protonlaştırılabilir iki His kalıntılarını sahip olduğunu göstermektedir. SE deneyleri pH dernek sabiti ve SH protein oligomerik boyutunu nasıl etkilediğini belirlemek için tasarlanmıştır. Pentamerik bir şekilde her durumda muhafaza ederken, bunun birleşme sabiti düşük pH değerinde indirgendi. Bu veriler, SH proteinde iki His tortularının bir lümene ilişkin yönlendirme ile tutarlı SH kanal aktivitesi için gözlenen benzer bir pH bağımlılığı ile uyum içindedir. ikincisi, düşük pH elektrostatik itme ve düşük oligomer istikrarı karşılaşabilirsiniz. Fizyolojik koşullarda ince, protein-protein ilişki değişiklikler hakkında niceliksel bilgi olarak ölçülmesi için her Özetle, bu yöntem uygulanabilir.

50 mM Tris, C14SB deterjan miseller radyal dağılım profili, 100 mM NaCI, pH 7.3 formları doğrusal modeli (Şekil 7A) monte edilebilir, çok sığ bir üslü. Bu dağılım eğimi ters D 2 O konsantrasyonu (Şekil 7B) ile korele edilir. eğim sıfır olduğu nokta, eşleştirme D 2 O konsantrasyonu,% 32.3 olarak bulunmuştur, yani. Aşağıda Şekil 7 Bkz. Aynı deney farklı tamponlar için tekrarl...

Sedimantasyon dengesi (SE), fizyolojik bir ortamda protein-protein etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir. Bu el yazması, insan sinsityal solunum virüsü (hRSV) tarafından kodlanan küçük hidrofobik (SH) protein tarafından oluşturulan bir homo-pentamerin stabilitesi üzerindeki pH'ın etkisini belirlemek için bu tekniğin kullanımını açıklamaktadır.

Küçük oligomer oluşturan Membran Protein Sedimantasyon Denge: pentameric İstikrar Histidine Protonasyon Etkisi

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, C 14 sulfalane deterjanı içindeki küçük bir hidrofobik polipeptit tarafından oluşturulan oligon boyutunu ve pH değiştirildiğinde bu oligon stabilitesini belirlemektir. Bu süreçte öncelikle, hangi döteryum oksit konsantrasyonunun deterjan hücrelerinin yoğunluğuyla eşleştiği ve böylece kaldırma kuvvetlerini nötrlediği belirlenir. İkinci adım olarak, çözünür hale getirilmiş küçük hidrofobik protein örnekleri için bir dizi sedimentasyon denge deneyi gerçekleştirilir.C 14 sulfalane deterjan, belirlenen deterjan konsantrasyonunda çalıştırılır. Ardından, proteinin farklı pH değerlerindeki çökelme profilini karşılaştırmak amacıyla birinci ve ikinci adımlar farklı bir pH'da tekrarlanır. Sonuçlar, hem bu deterjan içindeki küçük hidrofobik proteinin oligomerik boyutunu hem de pH'ın C 14 sulfalane deterjan içindeki bu oligomerin stabilitesi üzerindeki etkisini gösterecektir.Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır; çünkü montaj, hücrelerin yüklenmesi, yoğunluk eşleme ve denge koşullarına ulaşma gibi birçok adım söz konusudur ve bu durum, yöntemi ilk kez kullanan kişileri kolayca zorlayıp kafa karışıklığına yol açabilir. Bu adımlardaki herhangi bir küçük hata, potansiyel olarak günlerce süren deneysel zamanın boşa gitmesine neden olabilir. Prosedür, laboratuvarımdaki doktora öğrencisi Suria tarafından gösterilecektir.İlk olarak, 10 x tampon ve 50 x deterjan hazırlayın. Stok çözeltileri, 0.2 mikrometre şırınga filtresi üzerinden süzerek 1.5 mililitrelik bir epitübe aktararak filtre sterilizasyonu yapın. Hacimce %10, %30 ve %50 döteryum oksit içeren üç ayrı örnek çözeltisinden 200 mikrolitre hazırlayın.Harici dolgusu olmayan altı kanallı bir analitik ultrafiltrasyon hücresi monte etmek için, pencere contasını pencere tutucusuna yerleştirin, pencere astarını hafifçe bükün ve boşluk pencere tutucusunun karşısında oluşacak şekilde pencere tutucusuna yerleştirin. Ardından, işareti pencere tutucusuyla hizalayarak pencere astarının içine bir safir pencere yerleştirin. Parça numaralı hücre gövdesini, kama yuvaları gövde kemasıyla aynı hizada olacak şekilde ters olarak yerleştirin.pahlı yan yüzeyi aşağı gelecek şekilde altı sektörlü merkez parçayı hücre yuvasına, ardından pencere kısmı aşağı bakacak şekilde bir pencere düzeneğini yerleştirin. Daha sonra, vida halkası dişlerini ve vida halkası pulunu spin kaplama yağlayıcısı ile hafifçe kaplayın. Pencere düzeneğinin üzerine bir vida halkası pulu yerleştirin. Vida halkasını, üzerindeki "out" yazısı dışarı bakacak şekilde pencere yuvasına takın ve hücre hizalama aracını kullanarak vida halkasını el ile sıkın.Ardından, tork anahtarını kullanarak vida halkasını yalnızca 60 inch pounds değerine sıkın. Bunun ardından, ilgili parça numarasına sahip hücreyi dik bir şekilde yerleştirin ve saat 12 yönüne konumlandırın. Sol sıralara 120 µL referans çözeltisi, sağ sıralara ise 110 µL örnek çözeltisi yükleyin.Her bir örneğin ve referansın doğru şekilde eşleştiğinden emin olarak 200 µL'lik bir pipet kullanın. Pencere düzeneğini, penceresi aşağıya bakacak şekilde, hücre içeriğini dökebileceği için hücreyi aşırı derecede sarsmamaya dikkat ederek hücre yuvasına kaydırın. Önceki adımları tekrarlayın ve ikinci vida halkasını 120 inch-lbs değerine kadar sıkın.Ardından hücreyi ters çevirin ve birinci vida halkasını 120 inch pounds değerine ulaşana kadar yeniden sıkın. Hücreleri rotora yerleştirin. Rotoru santrifüje takın ve monokromatörü üretici talimatlarına göre kurun.Yeterli vakuma ulaşıldıktan sonra, santrifüjü 3000 RPM hızda çalıştırın. Kullanıcı arayüzü yazılımında girişim desenini önizleyin ve en yüksek kontrastı elde etmek için lazer parametrelerini ayarlayın. Ardından, denge ve girişim ölçümünü belirterek yeni bir kurulum dosyası oluşturun.Protein örnekleri için 45.000 devir/dakika veya öngörülen en yüksek hızda ve 20 °C çalışma sıcaklığında çalışacak bir sedimentasyon denge yöntemi kurun. Bir adet veri topladıktan sonra, en az 12 saat boyunca her 15 dakikada bir tarama yapın. Denge ilerlemesini, hetero analizdeki veri dosyalarını açıp eşleştirme fonksiyonunu (match function) seçerek izleyin. Bu noktada, kuvars pencereli altı kanallı bir analitik ultrasantrifüj hücresini daha önce olduğu şekilde monte edin.Jel yükleme uçlarını kullanarak, önceden hazırlanmış en yüksek konsantrasyonlu küçük hidrofobik protein örneğini rotor merkezine en yakın kanala, en düşük konsantrasyonlu örneği ise rotor merkezinden en uzak kanala yükleyin. Absorbans ölçümünü ayarlamak için denge ve absorbans ölçümünü belirten yeni bir kurulum dosyası oluşturun. Detektör dalga boyu olarak 280 nanometre belirleyin.Bunu takiben, ilk taramadan önce radyal kalibrasyonu kontrol et ve tarama seçenekleri kısmından 3000 RPM'de radyal kalibrasyon gerçekleştirin. Veri toplamanın düşük çözünürlükte olduğunu belirtin ve tek bir tarama yürütün. Tarama tamamlandıktan sonra seçeneğin işaretini kaldırın.Daha önce 20 °C'de hesaplanmış olan ilk hızda çalışacak şekilde bir sedimentasyon denge yöntemi kurun ve her hücrenin detay kısmında her 30 dakikada bir tarama toplayın. En az 18 saat sonra düşük çözünürlükte veri toplama belirleyin. Hetero analizde veri dosyalarını açarak ve dengeye ulaşıldığında eşleştirme fonksiyonunu seçerek denge sürecini izleyin.Tarama tamamlandıktan sonra yüksek çözünürlükte tek bir tarama gerçekleştirin. Her hız için dengeye ulaşmak için gereken süre biliniyorsa, önceki adımları bir sonraki hız için tekrarlayın. Önceden hesaplanmış tüm hızları içerecek ve her hız için dengeleme süresinden sonra bir tarama yapacak şekilde sedimentasyon denge yöntemi Taramasını ayarlayın.Bu durumda, her bir hücrenin detayında yüksek çözünürlüklü veri toplama belirleyerek C 14 sultan deterjanlı hücrelerin ve 50 molar sodyum fosfat tamponunun (pH 7.3) radyal dağılımını detaylandırın; bu durum, doğrusal bir modele uydurulabilecek çok sığ bir eksponansiyel oluşturur. Bu profilin eğimi döteryum oksit konsantrasyonuna bağlıdır ve sıfır eğimi üreten konsantrasyonun %32,3 olduğu bulunmuştur. Aynı deney, sırasıyla %30,3 ve %41'lik eşleşen döteryum oksit konsantrasyonlarını elde etmek için pH 5,5 ve pH 3 değerleri için tekrarlanmıştır.pH 7.3'te, küçük hidrofobik protein ve deterjanın, görünür afinite sabiti logaritması 21,05 olan pentamerler oluşturduğu saptanmıştır. Birleşme sabiti pH 5.5'te değişmemiş, ancak pH 3'te önemli ölçüde azalmıştır. Bu durum, yaklaşık 4,5'lik bir PK değeri ile düşük pH'da iletkenliğin azaldığını gösteren önceki raporlarla tutarlıdır.Denge hücre montajında uzmanlaşıldığında, yükleme ve deney kurulumu uygun şekilde gerçekleştirilirse bir saat içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, membran proteininizin oligomerik boyutunu belirlemek ve ayrıca stabiliteyi ile farklı deneysel koşulları karşılaştırmak amacıyla bir sedimentasyon dengesi deneyi hazırlamanın nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

sedimentation-equilibrium-small-oligomer-forming-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Bu video makalede, triptofan floresan membran protein katlanması Gibbs serbest enerji elde etmek için deneysel prosedür.

Membran Protein katlanması, Termodinamik Floresans Spektroskopisi ile ölçülür.

Tek-geçişli transmembran etki oligomerization eğilimi (TMDS) değerlendirmek için etkili bir prosedür açıklanmıştır. E. coli muhabiri zorlanma ToxR için erimiş TMD oluşan Kimerik proteinleri ifade edilir. TMD-kaynaklı oligomerization ToxR, transkripsiyon ve muhabir protein üretimi,-galaktosidaz aktivasyonu dimerization neden olur.

ToxR Assay tarafından belirlenen Transmembran Domain Oligomerization Eğilimi

Enzimler su moleküllerinin taşınması için kanallar aktif bölge solvasyonu ve kataliz etkilemektedir. Bu yazıda siliko bilgisayar modellemesi ve deneylerde dayanarak bu ek katalitik motiflerin mühendislik için bir protokol mevcut. Bu enzim kataliz üzerindeki çözücü dinamiklerin etkisi anlayışımızı artıracaktır.

Membran Enzim Solvent Dynamics Bağlı çözülüyor Entropic Oranı İvme

Birçok protein, zar yüzeylerine bağlandığında işlevlerini yerine getirir. Ekstrinsik proteinlerin nanodisk membranları üzerindeki bağlanması, transmisyon elektron mikroskobu ile dolaylı olarak görüntülenebilir. Negatif leke sodyum fosfotungstat tarafından indüklenen nanodisklerin karakteristik istiflenmesinin (rouleau), ekstrinsik proteinin bağlanmasıyla önlendiğini gösteriyoruz.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Bu iletişim kuralı, düşük çözünürlüklü ab initio manken ve yapısal bir deterjan çözündürüldükten membran proteini küçük açı Nötron saçılma kontrast-eşleştirme ile deterjan kullanarak çözümde detaylarını elde etmek gösterilmiştir.

Kontrast eşleştirme deterjan küçük açı Nötron saçılma deneylerde membran proteini yapısal analiz ve Ab Initio modelleme

Bir iletişim kuralı hızla termal kayması deneyleri ve nano fluorimetry tarama fark koşulları çeşitli proteinler termal kararlılığını sınamak için sunulmaktadır. Tampon sistemleri, tuzları ve katkı maddeleri, birlikte üç benzersiz istikrar ekran, oluşan uygun işlevsel ve yapısal çalışmalar arabelleklerini tanımlamak için protein ile denetlesinler.

Protein dengelemek nasıl: istikrar ekranlar için termal kayması deneyleri ve Nano diferansiyel Fluorimetry virüs-X projede tarama

Bu protokol, yapısal düzeyde bir M42 aminopeptidaz olan TmPep1050'nin dimer-dodecamer geçişini incelemek için geliştirilmiştir. Protein arınması ile X-ışını veri işlemeye kadar basit bir boru hattıdır. Crystallogenezis, veri seti indeksasyonu ve moleküler replasman çalışma bir olgu ile vurgulanmıştır, TmPep1050H60A H307A varyantı.

X-Ray Kristalografi Thermotoga maritima M42 Aminopeptidaz TmPep1050 Oligomerik Devlet Geçiş Çalışma

Bu protokol, floresan mikroskobu kullanılarak yeniden oluşturulmuş, membrana bağlı sitoiskelet ağlarının dinamiklerini incelemek için desteklenen lipid çift katmanlarının oluşumunu ve hücre iskeleti filamentlerinin ve motor proteinlerin eklenmesini açıklar.

Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması

Doğası gereği düzensiz birçok proteinin, çok sayıda hücresel süreç için önemli bir davranış olan oldukça dinamik biyomoleküler kondensatların oluşumuna katıldığı gösterilmiştir. Burada, canlı hücrelerdeki biyomoleküler kondensatlarda proteinlerin birbirleriyle etkileşime girdiği dinamikleri ölçmek için tek moleküllü görüntüleme tabanlı bir yöntem sunuyoruz.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Sağlam tespit reaktifleri, yeni sıtma teşhis araçları geliştirmek için giderek artan bir gereklilik göstermektedir. Histidin açısından zengin bir sıtma proteini biyobelirteç varlığında uzun süreli ışıldayan sinyal yayan bir iridyum (III) probu tasarlanmıştır. Proteinin çözelti içinde veya manyetik bir parçacık üzerinde hareketsiz hale getirilerek tespit edilmesi, uygulamada esneklik sağlar.

Malarya Protein Biyomarker Histidin Zengin Protein-II Tespiti için İridyum (III) Lüminesans Probe

Öğrenin, küçük hidrofobik membran proteininin pentamer oluşumunu ve pH değişimlerindeki stabilitesini sedimantasyon denge yöntemiyle nasıl belirleyeceğinizi. Bu teknik, viral protein etkileşimlerini ve ilaç geliştirme çalışmalarını destekler.

Küçük oligomer oluşturan Membran Protein Sedimantasyon Denge: pentameric İstikrar Histidine Protonasyon Etkisi

Daha fazla video keşfet