Name: Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Öğrenin, iPSC kaynaklı nöronların optogenetik yöntemle sinaptik bağlantı kurmasını değerlendiren ortak kültür sistemi. Bu yöntem, nöronal olgunlaşmayı hızlandırarak sinirbilim araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz iPSC nesil uzmanlık ve protokol paylaşımı için, sırasıyla ChR2 ve Synapsin1-tdTomato lentiviral yapıları C. Chai K. Deisseroth ve S. Je teşekkür, WY Leong, teknik destek için, paylaşım reaktif ve uzmanlık için Goh laboratuar üyeleri. Bu çalışma ELG onun Rekabet Araştırmaları Programı (002-082 2008 NRF-CRP UÇK) altında Ulusal Araştırma Vakfı Singapur, Abbott Beslenme ve ELG için Mükemmeliyet Merkezi Akademik (ACE) GlaxoSmithKline (GSK) araştırma ödülü tarafından desteklenen ve GJA ve Eğitim, Bilim ve Kore Teknoloji (MEST) Bakanlığı tarafından finanse Kore Ulusal Araştırma Vakfı World Class Enstitüsü (WCI) Programı (UÇK) tarafından (UÇK Hibe Numarası: BÇYÖ 2009-003) GJA için

<ol><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+mapping+of+synaptic+connectivity+using+photostimulation+in+Channelrhodopsin-2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li>
<li>Stroh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+stem+cell+differentiation+in+the+setting+of+automated+optogenetic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation.</a> Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).</li>
<li>Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+neurons+adopt+and+regulate+the+activity+of+an+established+neural+network%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).</li>
<li>Viviani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+coculture+of+neurons+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation and coculture of neurons and glial cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).</li>
<li>Braun, H., Günther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+differentiation+of+human+iPS-cells+in+a+rat+cortical+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiologiae+Experimentalis%22%5BJournal%5D)">Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture.</a> Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).</li>
<li>Shivaraj, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taurine+induces+proliferation+of+neural+stem+cells+and+synapse+development+in+the+developing+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain.</a> PLoS ONE. 7, e42935(2012).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+induction+and+long-term+self-renewal+of+primitive+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells+by+small+molecule+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).</li>
<li>Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neurons+and+photons+for+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting neurons and photons for optogenetics.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).</li>
<li>Marchetto, M. C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+Syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li>
<li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 160(2013).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Optogenetik nöronların 13 belirlenen popülasyonlarının aktivasyonu için zamansal ve uzamsal kesinlik sağlar. Deneylerde, mikroskop objektif tüm alanı ChR2 ifade fotoğraf uyarmak sadece kortikal nöronların 30 saniye aydınlattı. Bu sinaptik bağlantıları ko-kültür içindeki nöronların farklı popülasyonlar arasındaki oluşmuş olup olmadığını belirlemek bize izin verdi. Bizim sonuçlar photostimulation bu nöronlar ChR2 ifade presinaptik kortikal nöronların sinaptik girdi almak olduğunu göstermektedir ki, iPSC türetilmiş nöronlarda PSC sıklığını artırmaktadır ortaya koydu. Bu da, iPSC türetilen nöron başarılı bir şekilde kortikal nöronlar devrelerin içine dahil olduğu saptanmıştır. Bu ko-kültür sisteminin oluşturulması için pek çok kritik adım vardır. Bu kaplama ile devam etmeden önce fare NPC türetilmiş astrosit kültürleri, minimal hücre ölümü ile, sağlıklı olmasını sağlamak için önemlidirdiğer hücre türleri. Kortikal nöronlar ve insan NPC sağlıklı astrositlerde üzerine de eklemek ve elektrofizyolojik kayıtlar kültür koşulları ağır bağlıdır. Bu protokolde diğer önemli adımlar astrosit kültürleri üzerine elektroporasyon ve kortikal nöronların kaplama vardır. Hücrelerin geniş bir sayısı elektroporasyon sonra kalıp gibi, en az 6.000.000 kortikal nöronlar, 24 oyuklu plakalar içinde astrosit kültürleri üzerine kaplama için elektroporasyona sağlamak için önemlidir. Biz az 6 milyon hücre elektroporate zaman, hayatta nöronların sayısı elektrofizyolojik kayıtları etkilenen yoğun nöronal ağ oluşturmak olmadığını gözlemledik. Her ko-kültür deney farklı çalışmalar arasında karşılaştırma izin için electroporated kortikal nöronların sayısı da tutarlı olmalıdır. Enzimatik sindirim ile ilgili tüm adımlar için, çok uzun hücre ölümüne neden olabilir sindirim çözelti hücreleri bırakmamaya esastır. Buyaklaşım, diğer nöronlarla sinaptik temas oluşturmak üzere, hastaya özgü fibroblastlar türetilen nöron yeteneği taranması için kullanılabilir. Nöro bozukluğu Rett sendromu (RTT) mustarip hastaların fibroblastlardan elde edilen nöronlar sinaptik transmisyon kusurlar sergilerler: RTT nöronlar ki tahminen bu, daha az sinaptik bağlantı 14 sağlıklı nöronlara göre PSK frekans ve genlik belirgin bir azalma sergiler. Bizim co-kültür sistemi gelişim kusurları görüntüleyen nöronlar üzerinde uyuşturucu etkileri muayene izin verir. Bu hastalıklı insan NPC ekim sırasında ve aynı zamanda nöronal farklılaşma süresi boyunca bileşiklere sürekli maruz kalma sırasında söz konusu bileşikler, ilave edilerek gerçekleştirilebilir. Bu ko-kültür sistemi de uyuşturucu testi için bir model olarak kullanılabilir iken, bu yaklaşım ile bir sınırlama her aday bileşiğin etkilerini araştıran süreci uzun ve gibi sıkıcı olabilir kiBu, yüksek veri akışı tarama yöntemi değildir. Aday bileşikler ile işlemden geçirildikten sonra, iPSC türetilen nöron ayrı PSC&#39;lerin her bileşiğin etkisini belirlemek için yama gerekir. Ayrıca, şu anda hastaların pek mevcut fibroblastlar ve iPSCs vardır. Bu nedenle, daha sabırlı hücrelere sahip ve aynı zamanda yüksek verimli tarama için bu protokolü adapte yakın gelecekte ilgi olacaktır. Örneğin, bu gibi iyonları ya da zar potansiyeli genetik olarak kodlanmış sensör olarak bir etkinlik göstergesi iPSC türetilmiş nöronlar, etiketleyerek yan adım zaman alıcı elektrofizyolojik prosedür ile esas olarak akış oranını artırmak için mümkün olacaktır. Elektrofizyolojik kayıtları gerçekleştirmeden fibroblastları yeniden programlanması gelen, bu ko-kültür sistemi üreten tüm süreç olarak, en fazla 90 gün, sırasıyla yeniden programlama ve nöral indüksiyon adımlarından sonra, insan iPSCs veya NPC ya genişletilmiş olması tavsiye edilir gerektirir,ve kriyoprezerve gelecek deneyler için gerekli zamanı azaltmak için. Deneylerde, biz synapsin1 promotörün kontrolü altında kortikal nöronlarda ChR2 ifade edilmiştir. Bu promotör Pan-nöronal olduğundan, biz muhtemelen hem inhibitör ve eksitatör kortikal nöronlar photostimulating edildi. Gelecek deneylerin amacı, özellikle engelleyici veya uyarıcı ya da devre sorgulamak için ise, daha özel promoterler kullanılabilir. Alternatif olarak, kortikal nöronlar transjenik (ya da virüs enjekte edilen fareler) ChR2 sentezleme, özellikle nöron genetik tanımlanmış alt popülasyonlar hedeflenen elde edilebilir. Örneğin, Cre recombinase sahip bir fare hasat kortikal dokular ChR2 ifade sadece kortikal nöronlar PV internöron 15 olacak bir durum verecektir floxed ChR2 ile bir fare ile geçilen parvalbumin içeren internöronlar (PV internöron) olarak ifade edilmiştir. Böyle ChR2 ifade eden de internöronlardan ko-cu kullanımılture sistemi yamalı iPSC türetilmiş nöron PV internöronlar bir devrenin içine dahil etmek mümkün olup olmadığı tespitine imkan olacaktır. Bir önceki çalışmada 9 dayanarak, kortikal nöronlar in vitro 14 gün sonra dendrit örtüşen olgun. Photostimulation bir yamalı iPSC türetilmiş nöron bir tepkisi yoksa Böylece, bu nöron kortikal nöronlar ile sinaptik bağlantıları yapmak için yeteneğine sahip olmadığını belirtmelidir. Bir iPSC türetilmiş nöron diğer iPSC türetilmiş nöronlar veya kortikal nöronlar ya sinaptik girdi alabilir. Geleneksel yama kelepçe kayıtları kullanılmış olsaydı, bu sinaptik girdi nereden geldiğini ayırt etmek mümkün olmazdı. Bizim sistemin avantajı kortikal presinaptik girişten postsinaptik cevaplar seçici uyarılmış ve tespit edilebilir olmasıdır. Burada özetlenen prosedürler entegre iPSC türetilmiş nöronların yeteneğini değerlendirmek için basit bir yaklaşım sağlamaktanımlanmış bir nöronal ağa.

Son yıllarda, nöron ve nöronal devre fonksiyonu anlayışımız nöronal uyarılabilirliği denetleyen çeşitli Optogenetic araçlar tarafından devrim edilmiştir. Böyle bir alet ışık aktive katyon kanalı, channelrhodopsin-2 (ChR2): ışık uyarımı 1-3 cevaben ChR2 yangın aksiyon potansiyelleri ifade nöronlar. Nöronlar ışığa duyarlı normalde olmadığından, bu olağanüstü yetenek nöronların 4 genetik tanımlanmış nüfusun faaliyet kesin zamansal ve mekansal kontrolü için yeni yollar açılır ve büyük ölçüde beyin fonksiyonlarının çalışmaları hızlandırdı. ChR2 sinir ağları 6 faaliyetlerini düzenleyen nöronal gelişme 5 izlenmesi, farklı amaçlar için kök hücre araştırmaları için uygulanmıştır. Burada nöronal bir eş-kültür sistemine yararını artırmak ChR2 kullanılır. Ko-kültür sistemleri farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimlerin değerlendirmesini sağlar.Nöron ve glial ko-kültür, sinir sisteminin ana hücre tipi, genel olarak, bu farklı hücre tipleri arasında sinyal araştırmak ve aynı zamanda fizyolojik yanıtlar, bu sinyal önemini değerlendirmek için, hasar yayılması ve incelemek için kullanılan Potansiyel olarak, bu 7 sinyal yer alan moleküler mekanizmalar. Bir önceki çalışmada, insan iPSCs sıçan kortikal birincil kültür içeren nöronlar, astrositler, oligodendrositler ve mikroglia 8 varlığında nöronların içine çok hızlı bir şekilde ayırt ortaya koymuştur. Bu protokol, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) elde edilen fare kortikal nöronlar ve nöronlar arasındaki sinaptik bağlantıları sorgulamak için bir ko-kültür sisteminde ChR2 kullanan bir yöntemi göstermektedir. Biz astrositlere içine incelemek için adımlar ve hasat beyin dokuları 9 yanı sıra fare nöral progenitör hücreleri korumak ve ayırt etmek için (NPC) açıklamak ve insan NPC&#39;ler into nöronlar ko-kültür sistemi oluşturmak için. Bu ko-kültür sistemi kurmak için, biz Okita ve arkadaşları tarafından tarif entegrasyon-ücretsiz yeniden programlama yöntemi kullanıldı. 10 insan iPSCs oluşturmak için. Li ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi bu iPSCs sonra verimli bir şekilde küçük moleküllü inhibitörleri kullanılarak kimyasal olarak tanımlanmış ortamlarda NPC ayrışmıştır edildi. 11 Ko-kültürlerinde nöronların farklı popülasyonlar Domates (tdTomato) dimer floresan protein, tandem ile iPSC türetilen nöron kortikal nöronlarda ChR2 ekspresyonunun saptanması ve etiketleme yoluyla tespit edilebilir. Kortikal Nöronların Optogenetic photostimulation ile iPSC türetilmiş nöronlardan elektrofizyolojik kayıtları birleştirme birbirleriyle devreleri oluşturmak üzere nöronların bu iki tip yeteneğinin değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır. Spesifik olarak, kortikal nöronlar ChR2 ifade photostimulation sinaptik devreleri oluşmuş iPSC türetilen nöron sinaptik tepkiler uyandırmakphotostimulated kortikal nöron ağı ile. Bu artış postsinaptik akımlar gerçekten bu koşullar altında iPSC türetilen nöron tespit edilir olduğunu göstermektedir. Bu protokol, hastalarından fibroblastlardan elde edilen iPSCs kullanarak farklı nörolojik hastalık modelleri içinde tekrarlama da dahil olmak üzere deneysel koşullar, çeşitli altında sinaptik devre değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>Nörokült Proliferasyon Kiti (Fare)</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>5702</td>, <td>NSC Bazal Ortam ve NSC Proliferasyon Takviyesi İçerir</td></tr><tr><td>Epi5 Epizomal iPSC Yeniden Programlama Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>12719F</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>Glutamin içermeyen MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11090081</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX takviyesi</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>İnsan LIF</td><td>Canlandırıcı</td><td>PHC9484</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Miltenyi Biyoteknoloji</td><td>130103926</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td></td></tr><tr><td>Bileşik E</td><td>Merck Millipore</td><td>565790</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck Millipore 324856</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>233FB025</td><td></td></tr><tr><td>Araştırma Sınıfı FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30160.03</td><td>Astrosit farklılaşma ortamı için</td></tr><tr><td>Tanımlanmış FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>Primer nöron ortamı için</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Glukoz</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Primer nöron ortamı için</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>EMD Millipore</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>İnvitrojen</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>DNaz I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td> hasat beyinleri</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>L-Sistein</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>70 ve mikro; m hücre süzgeci</td><td>BD Biosciences&nbsp; &nbsp;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>20 ve mikro; m filtre ünitesi</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fluka</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D (+) - Glukoz</td><td>Sigma</td><td>G7520</td><td>Elektrofizyolojik çalışmalar için</td></tr><tr><td>K-glukonat</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>KANTO Chemical</td><td>3234400</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Elektrofizyolojik çalışmalar için</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal damarlar</td><td>World precision instruments, Inc</td><td>1604323</td><td></td></tr><tr><td>15 ml santrifüj tüpü</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>352096</tr><tr><td>50 ml santrifüj tüpü</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plakalar</td><td>Corning</td><td>9761146</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar</td><td>Corning</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>T25 şişeleri</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>12 mm kapak camları</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111520</td><td></td></tr><tr><td>AMAXA Sıçan Nöron Nükleofektör Kiti ve nbsp;</td><td>Lonza</td><td>VPG1003</td><td>Primer kortikal nöronların elektroporasyonu için</td></tr><tr><td>Neon Transfeksiyon Sistemi&nbsp;</td><td>İnsan fibroblastlarının elektroporasyonu için</td> <td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td></tr><tr><td>Mini Analizi&nbsp;</td><td>PSC'lerin ölçümü için</td> <td>Synaptosoft</td><td>Mini Analiz v.6</td></tr><tr><td>Normal Dermal İnsan Fibroblastları</td><td>PromoCell</td><td>C12300</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE</td><td>Addgene</td><td>20945</td><td></td></tr><tr><td>Cıva kısa ark lambası</td><td>OSRAM</td><td>HBO 103 W/2</td><td></td></tr></tbody></table>

bir co-kültür sistemde nöronal bağlantıları oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic yaklaşım

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Burada 2 farklı nöronal popülasyondan oluşan bir ko-kültür oluşturmak için bir protokol açıklıyoruz. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler), epizomal vektörler kullanılarak insan fibroblastlarından yeniden programlanır. iPSC kolonileri, fibroblast yeniden programlamasının başlamasından 30 gün sonra gözlemlenebilir. Pluripotent koloniler, nöral progenitör hücrelere (NPC'ler) farklılaşmaya izin vermek için nöral indüksiyon ortamında manuel olarak seçilir ve büyütülür. iPSC'ler 1 hafta içinde hızla nöroepitel hücrelerine dönüşür ve yüksek kültür yoğunluğunda tutulduğunda kendi kendini yenileme yeteneğini korur. Birincil fare NPC'leri, 7 gün boyunca serum içeren bir ortama maruz bırakılarak astrositlere ayrılır ve üzerine embriyonik gün 18 (E18) sıçan kortikal nöronlarının (channelrhodopsin-2 (ChR2) ile transfekte edilmiş) eklendiği bir tek tabaka oluşturur. Floresan protein, tandem dimer Domates (tdTomato) ile etiketlenmiş insan NPC'leri daha sonra ertesi gün astrosit / kortikal nöron kültürüne ekilir ve 28 ila 35 gün boyunca farklılaşmasına izin verilir. Bu sistemin, iPSC'den türetilmiş nöronlar ve kortikal nöronlar arasında, kortikal nöronların fotostimülasyonu üzerine sinaptik akımların sıklığındaki artıştan açıkça görülen sinaptik bağlantılar oluşturduğunu gösteriyoruz. Bu ko-kültür sistemi, iPSC'den türetilen nöronların diğer nöronal popülasyonlarla sinaptik bağlantılar oluşturma yeteneğini değerlendirmek için yeni bir platform sağlar.

Burada, astrositler içeren bir ko-kültür üreten alan çoklu aşamalarını tarif protokol kortikal nöronlar ve insan nöron görüntülenmiştir. İnsan iPSCs yüksek yoğunluklu (Şekil 1A) muhafaza edilmiş NPC 11 yaparak, küçük molekül inhibitörlerinin bir kokteyl ile bir sinir soy içine epizomal kullanarak fibroblastlar yeniden programlama ile elde edilen 10 vektörleri ve belirlenmiştir. TdTomato (Şekil 1B) ile etiketlenmiş insan NPClerden astrositlerde içine fare NPC farklılaşmasını, ChR2 ifade sıçan kortikal nöronların kaplama ve ekim: Çeşitli adımlar ko-kültür oluşturmak için gereklidir. Farklılaşma 2 gün içinde Glial fibrilar asidik protein (GFAP) + astrositler kolaylıkla eden kültürler (Şekil 1C) &#39;de görülmektedir. Fare NPC astrosit tek katmanlı (Şekil 1D) üzerine ChR2 ifade kortikal nöronlar kaplama önce en az bir hafta için ayırt etmek için izin verilmiştir. 3 sonraİnsan NPC farklılaşma 4 hafta, tdTomato + nöronlar kültürleri (Şekil 1E) tespit edilmiştir. Bu ko-kültür sistemi ışık uyarımı (Şekil 2A) yanıt olarak tek tek iPSC türetilmiş nöronlardan postsinaptik akımlar sürekli tespit edilmesine olanak sağlar. Işık ile uyarıldığında, aksiyon potansiyeli ChR2 (Şekil 2B) ifade kortikal nöronlarda üretilmiştir. Mevcut edilen kutuplaşma giderici darbelerin genliği artmış aksiyon potansiyeli ateşlemesini gösteren nöronları da (Şekil 2C) uyarılabilir olan iPSC türetilen (Şekil 2D) yükseltilmiştir. Bu nedenle, bu hücreler olgun nöronal özellikler sergiler. Işık yokluğunda, iPSC türetilen nöron spontan sinaptik giriş (Şekil 2E) verildi. GABA reseptörleri aracılığıyla akımlar dışa olurdu çünkü bu içe postsinaptik akımlar ağırlıklı, AMPA alıcıları tarafından aracılık ve NMDA reseptörleri mevcut a taşımak yok-70 mV tutma potansiyeline t. Hafif stimülasyon ölçüde postsinaptik akımlar (Şekil 2E) sıklığını artması nedeniyle en azından bazı girdilerin, CHR2 ifade presinaptik kortikal nöronlar arası idi. sinaptik girdi bu artışın zaman ders Şekil 2F gösterilmiştir: kortikal nöronların photostimulation 30 sn uzun ışık flaş boyunca devam edildi. ChR2 ifade kortikal nöronların (Şekil 2G) photostimulated zaman PSC&#39;ler sıklığı yüksek iken, onların genlik (Şekil 2H) etkilenmemiş oldu. Özetle, bu sonuçlar iPSC türetilen nöron olgun nöronal özellikler sergiledi ve presinaptik kortikal nöronlar ile sinaptik bağlantılar oluşturabilir göstermektedir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" /> Şekil 1: ortak-kültürünün oluşturulması için şematik diyagramıiPSCs ve NCPlerle nöral indüksiyon, insan fibroblastlar yeniden programlanması için sistem. (A) Timeline. kortikal nöron ve astrosit kültürleri üzerinde olgun nöronların içine insan NPC terminal farklılaşması için (B) Timeline. (C) Fare NPC hızla GFAP içine ayırt + astrositler 2 sonra in vitro gün. (D) Bir hafta sonra, ChR2 ifade kortikal nöronlar GFAP + astrositler üzerine ekildi. (E) 4-5 hafta sonra, insan NPC ayrılmasından sonraki elektrofizyolojik tdTomato + nöronlar üzerinde gerçekleştirilmiştir. Ölçek çubukları 100 um temsil eder. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" /> Şekil 2: Fonksiyonel sinaptik bağlantı optogenetic analizi. TdTomato (kırmızı) ile etiketlenmiş, (A) iPSC türetilmiş hücreler kortikal nöronlar ifade ile birlikte kültürlenmiştir ışıkla aktiveKanal, ChR2 (yeşil). IPSC türetilmiş nöronların Kayıtlar kortikal nöronların veya diğer iPSC-türetilmiş nöronların birinden gelebilir postsinaptik akım (PSC) yanıtları, ortaya. (B) Aydınlatma (mavi çubuk) ChR2 ifade kortikal nöronlarda aksiyon potansiyelleri bir dizi uyarılmış. ( C) iPSC türetilmiş hücreler ChR2 ifade kortikal nöronlar (E) photostimulation (mavi bar) korur. iPSC türetilmiş hücre akım eğrisi vs D) Pişirim (. Mevcut enjeksiyon ile uyarılmış iPSC türetilen nöron PSC&#39;lerin sıklığı arttırılır . photostimulation tarafından üretilen PSC sıklığında bir artış (F) zaman akışı. Mavi çubuk photostimulation zaman gösterir. PSC frekans photostimulation (G) bir artış iken (G, H), PSC genlik etkilenmemiş (lH) idi. * P &lt;0.05, öğrencinin t-testi ile kontrol grubuna göre gösterir.

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler), birincil kortikal nöronlardan ve astrositlerden türetilen nöronlardan oluşan bir ko-kültür sistemi oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Bu ko-kültür sistemi, yeni, iPSC'den türetilmiş nöronlar ve channelrhodopsin-2'yi eksprese eden önceden var olan kortikal nöronlar arasında sinaptik kontakların ve devrelerin oluşumunun tespit edilmesini sağlar.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kültürlenen nöronların channel RUSIN two veya CR two aracılığıyla foto-stimülasyonuna dayalı genik bir yaklaşım kullanarak, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilen nöronların fonksiyonel bağlantılar kurma yeteneğini değerlendirmek için bir ko-kültür sistemi kurmaktır. Bu işlem, öncelikle primer fare nöral progenitor hücrelerinin veya NPC'lerin izole edilmesi ve bunların astrositlere farklılaşmasına izin verilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, primer sıçan kortikal nöronları CH R two ile transfekte edilir ve mevcut nöronal popülasyon görevini üstlenen astrosit tabakasının üzerine ekilir.Ardından, indüklenmiş pluripotent kök hücre veya iPSC kültürlerinden türetilen insan NPC'leri, synapsin one 2D tomato virüsü ile transduse edilir, daha sonra astrosit nöron kültürüne ekilir ve farklılaşmaya teşvik edilerek sonuçta sinaptik bağlantılar oluşturması sağlanır. Sonuçlar, CHR iki eksprese eden kortikal nöronların genik foto stimülasyonu üzerine iPSC türevli nöronlardaki postsinaptik akımların elektrofizyolojik kayıtlarına dayanarak, iPSC türevli nöronların sıçan kortikal nöronları ile sinaptik bağlantılar kurduğunu göstermektedir. Bu yöntemin, yalnızca astrositlerin insan iPSC türevli nöronlarla birlikte kültüre edildiği yöntemler gibi mevcut olanlara göre temel avantajı, bu insan nöronlarının olgunlaşma süresinin daha kısa olmasıdır.Bunun nedeni, primer nöronların varlığının bu insan nöronlarının olgunlaşmasını hızlandırabilmesidir. Prosedürü, laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Uni Chin ve George Augustine'in laboratuvarından suing Y gerçekleştirecektir. Embriyonik sıçan beyinleri toplandıktan ve kortikal dokular metot protokolüne göre izole edildikten sonra, kortikal dokuları önceden ısıtılmış kortikal doku sindirim çözeltisi içeren bir kaba aktarın. Kortikal dokuları, 37 °C'de 30 dakika inkübe etmeden önce mümkün olduğunca ince şekilde doğrayın. İnkübasyon sonrası kortikal dokuları 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve doku parçası kalmayıp homojen bir çözelti oluşana kadar serolojik bir pipet kullanarak dokuları disosiye edin.Kalan doku kümelerini süzmek için doku çözeltisini 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Çözeltiden üç mililitreyi 15 mililitrelik santrifüj tüplerine paylaştırın.Her tüpün dibine, doku tabakasının altına bir katman oluşturacak şekilde 800 µL %7,5 BSA içeren XPBS ekleyin ve beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. Ardından, iki tabakanın ara yüzeyinden aspirasyon yaparak süpernatantı uzaklaştırın. Tüpün dibindeki selp peletini rahatlatmamaya dikkat edin.Her bir hücre peletini yeniden süspansiyon haline getirmek için bir mililitre primer nöron medyumu kullandıktan sonra, hepsini 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde birleştirin. Ardından, hücre yoğunluğunu belirlemek için bir hemositometre kullanın. 6 milyon sıçan kortikal nöronunu 200 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın.Elektroporasyon için en az 6 milyon kortikal nöron gereklidir. Hayatta kalan nöronların bir nöronal ağ oluşturmasını sağlamak için, hücre peletine 100 mikrolitre elektroporasyon çözeltisi ekleyin ve nazikçe resüspande edin. Ardından, hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini altı mikrogram CR iki plazmidi ile birleştirin ve sertifikalı bir küvete aktarın.Üretici talimatlarına uygun olarak elektroporasyon için uygun programı seçin ve uygulayın. Elektroporasyonu takiben, vet'e 500 µL MEM ekleyin. Hücreleri 11,5 mL primer nöron besiyerine aktarın ve nazikçe resüspande edin.Ardından, fare astrositleri içeren 24 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna 500 µL ekleyin. Plakayı 37 °C ve %5 CO2'de inkübe edin. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler veya IPC'ler oluşturulduktan sonra, hücreleri metin protokolüne uygun olarak insan nöral progenitör hücre veya NPC kültürü şeklinde indükleyin ve sürdürün.Bu örnekte, primer nöronların bir astrosit kültürüne eklenmesinden bir gün sonra, NPC'ler bir TD tomato lentiviral vektör synapse kullanılarak işaretlenir. İnsan NPC'lerini bir kez yıkamak için bir XPBS kullanın, ardından hücre ayırma solüsyonu ekleyin ve 30 °C'de beş dakika inkübe edin. Tüm hücrelerin ayrıldığından emin olun.Ardından bunları, iki kat miktarında D-M-E-M-F 12 içeren 15 milliliter'lik bir tüpe aktarın ve 200 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı uzaklaştırın ve peleti tekil hücreler halinde nazikçe yeniden süspande etmek için nöronal diferansiyasyon medyumu kullanın. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın.Ardından, astrosit kortikal nöron kültür plakasındaki besiyerini dikkatlice aspire edin. İnsani NPC'leri, nöronal diferansiyasyon besiyerinde kuyu başına santimetrekareye 5,000 hücre düşecek şekilde ekleyin. 37 °C ve %5 CO2'de inkübe edin ve besiyerini en az 28 gün boyunca her iki veya üç günde bir yenileyin.İnsan IPC'lerinin olgun nöronlar gibi davranıp davranmadığını doğrulamak için, 60 x su daldırma lensi ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak insan IPC'lerinden farklılaşmış hücreleri bulun. TD tomato ile görselleştirme yapın. Bir kayıt pipetini dört ila altı ohm direnç değerine kadar çekerek perfüze edin.Hücreler, oda sıcaklığında, sürekli olarak %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile havalandırılan harici bir solüsyon içerisinde tutuldu. Kayıt mikro pipetini doldurmak için dahili bir solüsyon kullanın, bir TD domates pozitif hücresini tüm hücre modunda yakalayın ve akım klempinde akım enjeksiyonuna yanıt olarak aksiyon potansiyeli ateşlemesini kaydedin. CHR2 eksprese eden kortikal hücrelerin aksiyon potansiyelinin ışık stimülasyonu ile güvenilir bir şekilde tetiklendiğini doğrulamak için.İlk olarak, cıva ark lambası ile ışıklandırma yaparak ve 480/40 nanometre dalga boyuna sahip bir eksitasyon filtresi kullanarak GFP görselleştirmesi yoluyla CR ifade eden kortikal hücreleri bulun. Tüm hücre modunda akım kenetleme (current clamp) kaydı ile bir aksiyon potansiyelinin güvenilir bir şekilde uyarıldığını kontrol edin. Genik stimülasyon gerçekleştirmek için, tüm hücre modunda TD tomato pozitif bir hücreyi patch yapın ve tüm alan cıva lambası ile 480/40 eksitasyon filtresi altında voltaj kenetlemeyi (voltage clamp) -70 milivolt değerine ayarlayın.Tüm alanı 30 saniye boyunca stimüle edin. CHR2 eksprese eden presinaptik kortikal nöronların foto stimülasyonu ile tetiklenen, patch yapılmış bir hücrenin postsinaptik akımlarını veya PSC'lerini kaydedin. Genlik ve akım alanı eşiğini sırasıyla 5 pA ve 5 pA olarak ayarlayın; PSC olmayan tüm izleri ayıklamak için bu olayları manuel olarak inceleyin.Bu videoda gösterildiği üzere, IPC'lerden türetilen nöronların, primer kortikal nöronların ve astrositlerin ko-kültürünü oluşturmak için birkaç adım gereklidir. Bu görüntü, fare NPC'lerinin astrositlere diferansiyasyonunun ikinci gününde, glial fibrillary acidic protein veya GFAP pozitif astrositlerin kolayca gözlemlenebildiğini göstermektedir. Kortikal nöronların, CR iki eksprese ederek astrosit monokatmanına ekilmesinden önce fare NPC'lerinin en az bir hafta diferansiyasyona bırakılmasına izin verilmiş olup; her ikisi de bu ko-kültürde GFAP ve CHR iki'nin immunofloresan boyaması ile tanımlanmıştır.Üç ila dört haftalık insan NPC diferansiyasyonunun ardından, burada gösterildiği gibi kültürlerde TD tomato pozitif nöronlar tespit edildi. Işıkla stimüle edildiklerinde, CHR iki IPSC eksprese eden kortikal nöronlarda aksiyon potansiyelleri oluştu. Türetilen nöronlar ayrıca eksitabl olup artan aksiyon göstermektedir.Depolarizan akım darbelerinin genliği artırıldığında potansiyel ateşleme gözlendi. Işığın yokluğunda, IPSC türevli nöronlar spontan sinaptik girdiler aldı. Bu içeri doğru post-sinaptik akımlar ağırlıklı olarak AMPA reseptörleri aracılığıyla gerçekleşti.PSC'lerin frekansı yükselirken, kortikal nöronların foto-stimülasyonu 32. uzun ışık flaşı boyunca sürdürüldü. ChR2 eksprese eden kortikal nöronlar foto-stimüle edildiğinde, amplitüdleri etkilenmedi. Bu prosedürü takiben, aday ilaç bileşiklerinin ilgilenilen spesifik hastalıklar üzerindeki etkisi gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, farklı hastaya özgü hücre tiplerini içeren diğer ko-kültür sistemlerini kullanabiliriz.

an-optogenetic-approach-for-assessing-formation-neuronal-connections

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

In vitro MSS akson glia etkileşim araştırmaları için bir roman çok bölmesi nöron ko-kültür mikrosistem platformu geliştirdi. Platform altı paralel olarak bağımsız deneyler yapma yeteneğine sahiptir ve yeni geliştirilmiş bir makro / mikro hibrid imalat yöntemi kullanılarak imal edildi.

Çok bölmesi MSS Nöron glia Co-kültür mikroakışkan Platformu

Bu çalışma, bir roman nöronal akson ve (astro) glia ko-kültür platformu kurma prosedürleri açıklar. Bu ko-kültür sisteminde, bir tek akson (ve tek bir glial hücre) arasındaki doğrudan etkileşim manipülasyon glial sinyalleşme karşılıklı nöronların mekanik analiz izin veren, uygun olur.

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Bu video, insan nöral progenitör hücrelerini (NPC'ler) nöronlara ayırmak için bir yöntem göstermektedir. NPC'ler, yerleşik bir fare astrosit-sıçan kortikal nöron ko-kültürüne tanıtılır ve NPC'nin nöronlara farklılaşmasını teşvik eder. Farklılaşma, hücrelerin konfokal bir mikroskop altında görüntülenmesiyle doğrulanır.

İnsan Nöral Progenitör Hücrelerini Nöronlara Ayırmak İçin Bir Ko-Kültür Tekniği

Bu video, insan kaynaklı nöronların (iN'ler) ve indüklenmiş oligodendrosit öncü hücrelerinin (iOPC'ler) bir ko-kültürünün kurulmasını göstermektedir. iN'ler bir ko-kültürde iOPC'lerle karıştırılır ve daha sonra her iki iN'nin nöronlara ve iOPC'lerin oligodendrositlere olgunlaşmasını desteklemek için inkübe edilir. Nöronlar, diğer nöronlar ve oligodendrositlerle sinaptik bağlantılar oluştururken, oligodendrositler, nöronların aksonlarının etrafında miyelin kılıfları geliştirir.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Bir Ko-Kültür Yöntemi

Video, iPSC'den türetilen ve sıçan kortikal nöronları arasındaki nöral bağlantıları değerlendirmek için elektrofizyolojik kaydı gösterir, ışığa duyarlı iyon kanallarını aktive ederek ve postsinaptik akımları tespit ederek ko-kültürdeki sinaptik temasları doğrular.

Bir Ko-Kültürde Nöral Bağlantı Oluşumunun Elektrofizyolojik Kayıtlar Kullanılarak Değerlendirilmesi

Nöronal popülasyonları in vitro olarak fotostimül etmek için optogenetik bir yaklaşım kullanarak ön beyin devrelerinin fonksiyonel topografyasını ve sinaptik özelliklerini karakterize etmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Optogenetically Hedeflenen Önbeyin Devreler Lazer tarama photostimulation

Tek bir nöron mikroakışkan arraying ve biyomalzeme kaplamaların içinde-çip plazma desenlendirme için su maskeleme için protokoller anlatılmıştır. Yüksek birbirine eş hücre kültürleri en az girişler kullanılarak hazırlanabilir.

Tek Hücre Hassas Nevronik Co-kültürler hazırlanması

Ontojenliği sırasında inhibitör GABA'erjik sinaps oluşumunu koordine moleküler mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Bu işlemleri incelemek için, fonksiyonel GABA A reseptörleri eksprese eden stabil olarak transfekte edilmiş insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücreleri ile birlikte kültürlendi embriyonik orta spinal GABAerjik nöronlar içeren bir ko-kültürü modeli sistemini geliştirdik.

Co-kültür Model Birleşmeyle GABA'erjik Orta Spiny Nöronlar ve HEK293 Hücreler inhibitör Synapse Oluşumu istikrarlı bir şekilde GABA ifade A Reseptörler

Bu protokol nöron glia etkileşimlerinin bölümlere analizi için dolaylı nöron astrosit kokültürü açıklar.

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Bu iletişim kuralı thalamocortical akson dallanma ve synapse oluşumu organotypic cocultures, talamus ve serebral korteks eşzamanlı görüntüleme için bir yöntemi açıklar. Bireysel thalamocortical akson ve presynaptic onların terminalleri bir tek hücre çoğalmasıyla tekniği ile DsRed ve synaptophysin GFP öğesini tarafından görüntülenmiştir.

Görselleştirme Thalamocortical Axon dallanma ve sinaps oluşumunda Organotypic Cocultures

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Öğrenin, iPSC kaynaklı nöronların optogenetik yöntemle sinaptik bağlantı kurmasını değerlendiren ortak kültür sistemi. Bu yöntem, nöronal olgunlaşmayı hızlandırarak sinirbilim araştırmalarına katkı sağlar.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Daha fazla video keşfet