Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Aşağıdaki deneyin genel amacı, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli nöronların, kültürlenmiş nöronların kanal RUSIN iki veya CR iki yoluyla foto stimülasyonuna dayanan bir genetik yaklaşım kullanarak fonksiyonel bağlantılar oluşturma yeteneğini değerlendirmek için bir ko-kültür sistemi kurmaktır. Bu, önce birincil fare nöral progenitör hücrelerinin veya NPC'lerin izole edilmesi ve bunların astrositlere farklılaşmasına izin verilmesiyle elde edilir. Daha sonra primer sıçan kortikal nöronları CH R iki ile transfekte edilir ve mevcut nöronal popülasyon olarak hizmet eden astrosit tabakasına kaplanır.

Daha sonra, indüklenmiş pluripotent kök hücre veya IPSC kültürlerinden türetilen insan NPC'leri, sinapsin bir 2D domates virüsü ile transdüksiyona tabi tutulur, daha sonra astrosit nöron kültürüne oturtulur ve daha sonra sinaptik bağlantılar oluşturarak farklılaşmak üzere indüklenir. Sonuçlar, IPSC'den türetilen nöronların, iki eksprese eden kortikal nöronun jenik fotostimülasyonu üzerine IPSC'den türetilmiş nöronlardaki postsinaptik akımların elektrofizyolojik kayıtlarına dayalı olarak sıçan kortikal nöronları ile sinaptik bağlantılar oluşturduğunu göstermektedir. Bu maddenin, insan IPSC'den türetilmiş nöronlarla sadece astrositlerin birlikte kültürlenmesi gibi mevcut olanlara göre en büyük avantajı, bu insan nöronlarının olgunlaşma süresinin daha kısa olmasıdır.

Bunun nedeni, birincil nöronların varlığının bu insan nöronlarının olgunlaşmasını hızlandırabilmesidir, prosedürü gösteren Uni Chin, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi ve George Augustine'in laboratuvarından Y'yi dava edecek Embriyonik sıçan beyinlerini topladıktan ve kortikal dokuyu metin protokolüne göre izole ettikten sonra, kortikal dokuları önceden ısıtılmış kortikal doku sindirim solüsyonunu içeren bir kaba aktarın. 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe etmeden önce kortikal dokuları mümkün olduğunca ince kıyın. İnkübasyondan sonra, kortikal dokuları 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın, doku parçası içermeyen homojen bir çözelti elde edilene kadar serolojik bir pipet kullanarak dokuları ayırın.

Kalan doku kümelerini filtrelemek için doku solüsyonunu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Üç mililitre çözeltiyi 15 mililitreye ayırın. Santrifüj tüpleri.

Her tüpün altına bir XPBS'de 800 mikrolitre %7.5 BSA ekleyin ve doku tabakasının altında beş dakika boyunca 200 Gs'de santrifüj edin. Ardından, iki katmanın arayüzünden aspire ederek süpernatanı çıkarın. Tüpün altındaki selp peletini rahatsız etmekten kaçının.

Her hücre paletini yeniden süspanse etmek için bir mililitre birincil nöron ortamı kullandıktan sonra, hepsini 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde birleştirin. Daha sonra hücre yoğunluğu santrifüjünü belirlemek için bir hemo sitometre kullanın. Beş dakika boyunca 200 Gs'de 6 milyon sıçan kortikal nöronu ve süpernatanı çıkarın.

Elektroporasyon için en az 6 milyon kortikal nöron gereklidir. Nöronların hayatta kalmasıyla bir nöronal ağın oluşumunu sağlamak için, hücre peletine 100 mikrolitre elektroporasyon solüsyonu ekleyin ve yavaşça yeniden süspanse edin. Daha sonra 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu altı mikrogram CR iki plazmid ile birleştirin ve sertifikalı bir veterinere aktarın.

Üreticinin talimatlarına göre elektroporasyon için uygun programı seçin ve uygulayın. Elektroporasyonun ardından veterinere 500 mikrolitre MEM ekleyin. Hücreleri 11.5 mililitre birincil nörona, ortama aktarın ve nazikçe yeniden askıya alın.

Daha sonra, fare astrositleri içeren 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre ekleyin. Plakayı 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler veya IPC'ler ürettikten sonra, hücreleri metin protokolüne göre bir insan nöral progenitör hücresi veya NPC kültürü olarak indükleyin ve koruyun.

Bu örnekte, NPC'ler, bir astrosit kültürüne birincil nöronlar eklendikten bir gün sonra bir TD domatesinde lentiviral vektör sinaps kullanılarak etiketlenmiştir. İnsan NPC'leri bir kez yıkamak için bir XPBS kullanın, ardından hücre ayırma solüsyonu ekleyin ve 30 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Tüm hücrelerin ayrıldığından emin olun.

Daha sonra bunları iki kat D-M-E-M-F 12 içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti tek hücrelere nazikçe yeniden süspanse etmek için nöronal farklılaşma ortamı kullanın. Hücreleri saymak için bir hemo sitometre kullanın.

Daha sonra, ortamı astrosit kortikal nöron kültürleri plakasından dikkatlice aspire edin. İnsan NPC'leri, nöronal farklılaşmada kuyu başına santimetre kare başına 5.000 hücredir. Orta. 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edin ve ortamı en az 28 gün boyunca her iki veya üç günde bir değiştirin.

İnsan IPC'lerinin olgun nöronlar gibi davranıp davranmadığını doğrulamak için, insan IPC'lerinden farklı hücreleri bulmak için 60 x suya daldırma lensi ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanın. TD domatesini görselleştirerek. Dört ila altı ohm perfüslük bir dirence kadar bir kayıt pipeti çekin.

Harici bir çözelti içinde oda sıcaklığındaki hücreler sürekli olarak %95 oksijen, %5 karbondioksit ile köpürür. Kayıt mikro pipetini doldurmak, tüm hücre modunda bir TD domates pozitif hücresini yamalamak ve akım kelepçesindeki akım enjeksiyonuna yanıt olarak aksiyon potansiyeli ateşlemesini kaydetmek için dahili bir çözüm kullanın. CHR iki eksprese eden kortikal hücrelerin aksiyon potansiyelinin ışık stimülasyonu ile güvenilir bir şekilde uyarıldığını doğrulamak için.

İlk olarak, bir cıva ark lambası ile ışık aydınlatması yoluyla GFP'yi görselleştirerek ve 40 nanometre üzerinde 480'lik bir uyarma filtresi dalga boyu kullanarak CR ikisini ifade eden kortikal hücreleri bulun. Tüm hücre modunda akım kelepçesi kaydı yoluyla bir aksiyon potansiyelinin güvenilir bir şekilde uyarıldığını kontrol edin. Genetik stimülasyonu gerçekleştirmek için, tüm hücre modunda bir TD domates pozitif hücresini yamalayın ve voltaj kelepçesini tüm alan cıva lambası ve 480 üzeri 40 uyarma filtresi ile eksi 70 milivolta ayarlayın.

Tüm alanı 30 saniye boyunca uyarın. CHR iki ekspresentik kortikal nöronun foto stimülasyonu ile indüklenen yamalı bir hücrenin postsinaptik akımlarını veya PSC'lerini kaydedin. Genlik ve akım alanı için eşiği burada beş Pico Amp olarak ayarlayın ve PICO, PSC olmayan izleri atmak için bu olayları sırasıyla manuel olarak inceleyin.

Bu videoda gösterildiği gibi, IPC'lerin birincil kortikal nöronlarından ve astrositlerinden türetilen nöronların ko-kültürünü oluşturmak için birkaç adım gereklidir. Bu görüntü, fare NPC'lerinin astrositlere farklılaşmasının ikinci gününde, glial fibriler asidik protein veya GFAP pozitif astrositlerin kolayca gözlemlenebileceğini göstermektedir. Fare NPC'lerinin, kortikal nöronları kaplamadan önce en az bir hafta boyunca farklılaşmasına izin verildi, CR ikisini astrosit tek tabakası üzerine eksprese etti ve her ikisi de bu ko-kültürde GFAP ve CHR iki'nin immünofloresan boyanması yoluyla tanımlandı.

Üç ila dört haftalık insan NPC farklılaşmasından sonra, burada gösterildiği gibi kültürlerde TD domates pozitif nöronlar tespit edildi. Işıkla uyarıldığında, kortikal nöronlarda CHR iki IPSC eksprese eden aksiyon potansiyelleri üretildi. Türetilmiş nöronlar da uyarılabilir ve artan etki gösterir.

Depolarize edici akım darbelerinin genliği arttıkça potansiyel ateşleme. Işığın yokluğunda, IPSC'den türetilmiş nöronlar spontan sinaptik girdiler aldı. Bu içe doğru post-sinaptik akımlara ağırlıklı olarak AMPA reseptörleri aracılık etti.

Kortikal nöronların foto stimülasyonu, PSC'lerin frekansı yükselirken 32. uzun ışık flaşı boyunca sürdürüldü. CHR eksprese eden iki kortikal nöron foto ile uyarıldığında, genlikleri etkilenmedi. Bu prosedürü takiben, aday ilaç bileşiklerinin ilgilenilen spesifik hastalıklar üzerindeki etkisi gibi ek soruları yanıtlamak için farklı hastaya özgü hücre tiplerine sahip diğer ko-kültür sistemlerini kullanabiliriz.