Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kültürlenen nöronların channel RUSIN two veya CR two aracılığıyla foto-stimülasyonuna dayalı genik bir yaklaşım kullanarak, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilen nöronların fonksiyonel bağlantılar kurma yeteneğini değerlendirmek için bir ko-kültür sistemi kurmaktır. Bu işlem, öncelikle primer fare nöral progenitor hücrelerinin veya NPC'lerin izole edilmesi ve bunların astrositlere farklılaşmasına izin verilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, primer sıçan kortikal nöronları CH R two ile transfekte edilir ve mevcut nöronal popülasyon görevini üstlenen astrosit tabakasının üzerine ekilir.

Ardından, indüklenmiş pluripotent kök hücre veya iPSC kültürlerinden türetilen insan NPC'leri, synapsin one 2D tomato virüsü ile transduse edilir, daha sonra astrosit nöron kültürüne ekilir ve farklılaşmaya teşvik edilerek sonuçta sinaptik bağlantılar oluşturması sağlanır. Sonuçlar, CHR iki eksprese eden kortikal nöronların genik foto stimülasyonu üzerine iPSC türevli nöronlardaki postsinaptik akımların elektrofizyolojik kayıtlarına dayanarak, iPSC türevli nöronların sıçan kortikal nöronları ile sinaptik bağlantılar kurduğunu göstermektedir. Bu yöntemin, yalnızca astrositlerin insan iPSC türevli nöronlarla birlikte kültüre edildiği yöntemler gibi mevcut olanlara göre temel avantajı, bu insan nöronlarının olgunlaşma süresinin daha kısa olmasıdır.

Bunun nedeni, primer nöronların varlığının bu insan nöronlarının olgunlaşmasını hızlandırabilmesidir. Prosedürü, laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Uni Chin ve George Augustine'in laboratuvarından suing Y gerçekleştirecektir. Embriyonik sıçan beyinleri toplandıktan ve kortikal dokular metot protokolüne göre izole edildikten sonra, kortikal dokuları önceden ısıtılmış kortikal doku sindirim çözeltisi içeren bir kaba aktarın. Kortikal dokuları, 37 °C'de 30 dakika inkübe etmeden önce mümkün olduğunca ince şekilde doğrayın. İnkübasyon sonrası kortikal dokuları 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve doku parçası kalmayıp homojen bir çözelti oluşana kadar serolojik bir pipet kullanarak dokuları disosiye edin.

Kalan doku kümelerini süzmek için doku çözeltisini 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Çözeltiden üç mililitreyi 15 mililitrelik santrifüj tüplerine paylaştırın.

Her tüpün dibine, doku tabakasının altına bir katman oluşturacak şekilde 800 µL %7,5 BSA içeren XPBS ekleyin ve beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. Ardından, iki tabakanın ara yüzeyinden aspirasyon yaparak süpernatantı uzaklaştırın. Tüpün dibindeki selp peletini rahatlatmamaya dikkat edin.

Her bir hücre peletini yeniden süspansiyon haline getirmek için bir mililitre primer nöron medyumu kullandıktan sonra, hepsini 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde birleştirin. Ardından, hücre yoğunluğunu belirlemek için bir hemositometre kullanın. 6 milyon sıçan kortikal nöronunu 200 Gs'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın.

Elektroporasyon için en az 6 milyon kortikal nöron gereklidir. Hayatta kalan nöronların bir nöronal ağ oluşturmasını sağlamak için, hücre peletine 100 mikrolitre elektroporasyon çözeltisi ekleyin ve nazikçe resüspande edin. Ardından, hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini altı mikrogram CR iki plazmidi ile birleştirin ve sertifikalı bir küvete aktarın.

Üretici talimatlarına uygun olarak elektroporasyon için uygun programı seçin ve uygulayın. Elektroporasyonu takiben, vet'e 500 µL MEM ekleyin. Hücreleri 11,5 mL primer nöron besiyerine aktarın ve nazikçe resüspande edin.

Ardından, fare astrositleri içeren 24 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna 500 µL ekleyin. Plakayı 37 °C ve %5 CO2'de inkübe edin. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler veya IPC'ler oluşturulduktan sonra, hücreleri metin protokolüne uygun olarak insan nöral progenitör hücre veya NPC kültürü şeklinde indükleyin ve sürdürün.

Bu örnekte, primer nöronların bir astrosit kültürüne eklenmesinden bir gün sonra, NPC'ler bir TD tomato lentiviral vektör synapse kullanılarak işaretlenir. İnsan NPC'lerini bir kez yıkamak için bir XPBS kullanın, ardından hücre ayırma solüsyonu ekleyin ve 30 °C'de beş dakika inkübe edin. Tüm hücrelerin ayrıldığından emin olun.

Ardından bunları, iki kat miktarında D-M-E-M-F 12 içeren 15 milliliter'lik bir tüpe aktarın ve 200 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı uzaklaştırın ve peleti tekil hücreler halinde nazikçe yeniden süspande etmek için nöronal diferansiyasyon medyumu kullanın. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın.

Ardından, astrosit kortikal nöron kültür plakasındaki besiyerini dikkatlice aspire edin. İnsani NPC'leri, nöronal diferansiyasyon besiyerinde kuyu başına santimetrekareye 5,000 hücre düşecek şekilde ekleyin. 37 °C ve %5 CO2'de inkübe edin ve besiyerini en az 28 gün boyunca her iki veya üç günde bir yenileyin.

İnsan IPC'lerinin olgun nöronlar gibi davranıp davranmadığını doğrulamak için, 60 x su daldırma lensi ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak insan IPC'lerinden farklılaşmış hücreleri bulun. TD tomato ile görselleştirme yapın. Bir kayıt pipetini dört ila altı ohm direnç değerine kadar çekerek perfüze edin.

Hücreler, oda sıcaklığında, sürekli olarak %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile havalandırılan harici bir solüsyon içerisinde tutuldu. Kayıt mikro pipetini doldurmak için dahili bir solüsyon kullanın, bir TD domates pozitif hücresini tüm hücre modunda yakalayın ve akım klempinde akım enjeksiyonuna yanıt olarak aksiyon potansiyeli ateşlemesini kaydedin. CHR2 eksprese eden kortikal hücrelerin aksiyon potansiyelinin ışık stimülasyonu ile güvenilir bir şekilde tetiklendiğini doğrulamak için.

İlk olarak, cıva ark lambası ile ışıklandırma yaparak ve 480/40 nanometre dalga boyuna sahip bir eksitasyon filtresi kullanarak GFP görselleştirmesi yoluyla CR ifade eden kortikal hücreleri bulun. Tüm hücre modunda akım kenetleme (current clamp) kaydı ile bir aksiyon potansiyelinin güvenilir bir şekilde uyarıldığını kontrol edin. Genik stimülasyon gerçekleştirmek için, tüm hücre modunda TD tomato pozitif bir hücreyi patch yapın ve tüm alan cıva lambası ile 480/40 eksitasyon filtresi altında voltaj kenetlemeyi (voltage clamp) -70 milivolt değerine ayarlayın.

Tüm alanı 30 saniye boyunca stimüle edin. CHR2 eksprese eden presinaptik kortikal nöronların foto stimülasyonu ile tetiklenen, patch yapılmış bir hücrenin postsinaptik akımlarını veya PSC'lerini kaydedin. Genlik ve akım alanı eşiğini sırasıyla 5 pA ve 5 pA olarak ayarlayın; PSC olmayan tüm izleri ayıklamak için bu olayları manuel olarak inceleyin.

Bu videoda gösterildiği üzere, IPC'lerden türetilen nöronların, primer kortikal nöronların ve astrositlerin ko-kültürünü oluşturmak için birkaç adım gereklidir. Bu görüntü, fare NPC'lerinin astrositlere diferansiyasyonunun ikinci gününde, glial fibrillary acidic protein veya GFAP pozitif astrositlerin kolayca gözlemlenebildiğini göstermektedir. Kortikal nöronların, CR iki eksprese ederek astrosit monokatmanına ekilmesinden önce fare NPC'lerinin en az bir hafta diferansiyasyona bırakılmasına izin verilmiş olup; her ikisi de bu ko-kültürde GFAP ve CHR iki'nin immunofloresan boyaması ile tanımlanmıştır.

Üç ila dört haftalık insan NPC diferansiyasyonunun ardından, burada gösterildiği gibi kültürlerde TD tomato pozitif nöronlar tespit edildi. Işıkla stimüle edildiklerinde, CHR iki IPSC eksprese eden kortikal nöronlarda aksiyon potansiyelleri oluştu. Türetilen nöronlar ayrıca eksitabl olup artan aksiyon göstermektedir.

Depolarizan akım darbelerinin genliği artırıldığında potansiyel ateşleme gözlendi. Işığın yokluğunda, IPSC türevli nöronlar spontan sinaptik girdiler aldı. Bu içeri doğru post-sinaptik akımlar ağırlıklı olarak AMPA reseptörleri aracılığıyla gerçekleşti.

PSC'lerin frekansı yükselirken, kortikal nöronların foto-stimülasyonu 32. uzun ışık flaşı boyunca sürdürüldü. ChR2 eksprese eden kortikal nöronlar foto-stimüle edildiğinde, amplitüdleri etkilenmedi. Bu prosedürü takiben, aday ilaç bileşiklerinin ilgilenilen spesifik hastalıklar üzerindeki etkisi gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, farklı hastaya özgü hücre tiplerini içeren diğer ko-kültür sistemlerini kullanabiliriz.