Name: Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Öğrenin, gübrelenmiş tavuk yumurtalarında yüksek titrelİ influenza A virüsü üretme yöntemini. Bu maliyet etkin sistem, aşı geliştirme ve viroloji araştırmaları için güvenilir virüs elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, NIH hibe HL120947 (PC), HL103868 (PC) ve Amerikan Kalp Derneği Yardım Hibesi (PC) tarafından desteklenmiştir.

Genel sözleri: NOT steril koşullar altında yumurta manipülasyonu ile ilgili tüm prosedürleri uygulayın ve steril tekniği buna göre kullanılmalıdır. % 70 etanol ile tüm ekipman kullanmadan önce ön-temiz. Genel olarak, influenza virüsü aşılama ve hasat BSL-2 laboratuvarda yapılmalıdır. Ancak, bu protokol yaymak için kullanıldığında çok daha patojenik grip virüsleri (örneğin, salgın ve pandemi öncesi suşları, kümes hayvanları ve hayvancılık, yüksek patojen kuş gribi suşları, 1918 H1N1 suşu için bir tehlike teşkil suşları), yüksek biyogüvenlik düzeyleri ve Bazı durumlarda, biyogüvenlik önlemleri ve izinler gereklidir. Yerel Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi grip virüsü ile ilgili tüm araştırmaları onaylaması gerekir. Aşılama için Yumurta 1. Hazırlık <ol><li> Uygun bir satıcıdan serum patojen içermeyen (SPF) taze döllenmiş yumurta kuş edinin. Tipik haliyle, tavuk yumurtası kullanılır. Yumurta bizi olmalıhemen girişte ed. </li><li> Otomatik yumurta turner ile nemlendirilmiş yumurta inkübatör varış yeri yumurta düzenli yumurta döndürmek için üzerine. Otomatik yumurta turner mevcut değilse, elle en az 2-3 kez bir gün (eldiven giymek ve mümkün olduğunca steril olarak her şeyi tutmak için emin olun) yumurta döndürün. </li><li> 37 ° C ve 10-11 gün boyunca% 55-60 nemde kuluçkaya. </li></ol> 2. Yumurta Mum <ol><li> Inkübasyon yaklaşık 7 veya 8 gün sonra candling ile infertilite yumurta kontrol etmek için karanlık bir odada bir parlak ışığa karşı yumurta incelemek için bir yumurta Candler kullanın. <ol><li> % 70 etanol ile yumurta Candler silin. Genellikle eldiven değiştirme ve patojenlerin kontaminasyon riskini en aza indirmek için% 70 etanol ile dezenfekte edin. </li><li> Inkübatör yumurta çıkarın ve boş yumurta kartonları koyun. </li><li> Odada ışıkları kapatın. </li><li> Candler karşı bir defada her yumurta bir büyük ucunu tutun. </li><li> Determin için yumurta uyunE o bereketli ya infertil olup olmadığını. NOT: Bir fasulye şeklinde embriyo giden İnce kan damarları açıkça görünür olmalıdır. Döllenmemiş yumurta görünür yumurta sarısı ile küçük bir kan nokta olarak görünecektir. </li></ol></li><li> Döllenmemiş yumurta olan atın ve inkübatör canlı yumurta dönün. Fazla 30 dakika inkübatör dışında yumurta bırakmayın. Bir yumurtanın durumu teyit edilememesi halinde, bunu işaretleyin ve daha sonra gözlemlemek. </li></ol> Virüs İnokulum 3. hazırlanması <ol><li> 10 mM HEPES (pH 7.4) ihtiva eden steril PBS içinde 10 4 pfu / ml - yaklaşık 10 ila 3 grip virüsü stokunu. Kritik adım: kullanımdan hemen önce virüs stokunu ve buz üzerinde her zaman seyreltilmiş virüs tutmak. </li></ol> Alantoik Rota aracılığıyla 4. Grip Virüsü Aşılama <ol><li> Virüs inokülasyonundan (gün 10 ve 11) gün, daha yumurta mum ve herhangi bir ölü embriyolar ortadan kaldırır. Canlı embriyoların ayırtyumurta içinde hareket arıyor. </li><li> Inkübatör üç yumurta çıkarın ve hava kesesi kadar ayrı bir tutucu yumurta düzenlemek. </li><li> Kalıcı bir kalem ile yumurta hava sahasını işaretleyin. </li><li> % 70 etanol ile hava alanı üzerinde eggshell yıkayın. </li><li> Bir yumurta karton ve bir biyogüvenlik kaput (BSL-2) içine hava boşluğu yukarı yumurta koyun. </li><li> Her bir yumurta hava torbasının hemen üzerinde bir kabuk içinde küçük bir delik açmak için bir steril 18G iğne kullanın. Embriyo veya sarısı bıçaklama önlemek için çok derinden iğne eklemek için dikkatli olun. </li><li> Steril 1 ml şırınganın içine seyreltilmiş grip virüsü çizin ve bir 22G iğne takın. </li><li> Dikkatle allantoik boşluğuna 45 ° açıyla iğne ile şırınga ilerlemek. </li><li> Seyreltilmiş grip virüsünün 0.2 ml enjekte edilir. </li><li> Diğer iki yumurta enjeksiyon tekrarlayın ve sonra şırınga ve iğne atın. </li><li> Bir tutkal tabancası (ya da erimiş parafin mumu) den tutkal bir damla ile delik mühür. Be tutkal yumurta içinde sızıntı olmadığını dikkatli. </li><li> Hava alanı yukarı çekti yumurta kuvöz içine yumurta geri yerleştirin. </li><li> Tekrarlayın 4.2 adımları - 4.12 tüm yumurtaları aşılanmış kadar. </li></ol> 5. İnkübasyon Süresi <ol><li> 37 ° C&#39;de ve •% 60 nemde açmadan enfekte yumurta inkübe edin. </li><li> Grip virüsü tipine bağlı olarak optimum inkübasyon süresi seçin. 48 saat boyunca influenza A inkübe; 72 saat grip B ve C kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol> 6. Grip Virüsü Hasat <ol><li> İnkübasyon süresinden sonra, embriyo öldürmek ve kan ile enfekte alantoik akışkan kontrol etme riskini azaltmak için kan damarları, 4 saat (ya da O / N), en az 4 ° C &#39;de yumurta soğutun. Verimi azaltır virüs, emici kırmızı kan hücrelerini engellemek için bunu yapın. Seçenek olarak ise, soğuk yumurta, 30 dakika boyunca -20 ° C &#39;de; Bununla birlikte, bu, kan kirlenme riskini arttırır. </li><li> Yumurta yeterince soğutulmuş olmuştur sonra, bir biyogüvenlik kaput yumurta transferi. Hava kesesi yukarı bakacak şekilde bir firma tutucu içine yumurta yerleştirin. % 70 etanol ile yumurta yüzeyini temizleyin. </li><li> Hava kesesi üzerindeki kabuğu açmak için steril makas kullanın. Koryoalantoik zar yok etmek değil dikkat ederek hava kesesi etrafında kabuk çıkarın. </li><li> Steril künt forseps ile koryoalantoik zar açın. Yavaşça embriyo ve küçük bir spatula ya da kaşık ile yumurta sarısı kesesi kenara taşıyın. Sarısını yırtılmasına dikkat edin. </li><li> 1 ml&#39;lik bir Eppendorf pipet yardımıyla, allantoik akışkanın toplanması. Gerekirse, yan biraz kadar sıvı mümkün olduğunca toplamak için yumurta eğin. </li><li> 50 ml&#39;lik plastik konik tüp içine bütün yumurta, allantoik akışkanın birleştirin. Virüs hasat sırasında her zaman buz üzerinde tüpler tutun. Bir yumurta verimi 5 - hafif sarımsı bir sıvı 10 mi. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de virüs içeren alantoik akışkan Spin6, C yıkıntıları pelet haline getirildi. Yeni 50 ml tüp içine net sıvıyı aktarın buz tuttu. Bir BSL-2 atık kabına yumurta bertaraf edin. </li></ol> 7. Depolama <ol><li> Hemen allantoik açıklık sıvının (örneğin, 50, 100 veya 500 ul tümbölenler) bölmeyin ve ek-freeze sıvı azot içinde. Dondurulmuş virüs stokları, uzun süreli depolama için -80 ° C dondurucu transfer. </li></ol>

<ol><li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+deaths+associated+with+seasonal+influenza+---+United+States%2C+1976-2007%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR.+Morbidity+and+mortality+weekly+report%22%5BJournal%5D)">Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007.</a> MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).</li>
<li>Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+and+pandemic+potential+of+swine-origin+H1N1+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus.</a> Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).</li>
<li>Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+Influenza+Viruses+with+Genes+from+the+1918+Pandemic+Virus%3A+Functional+Roles+of+Alveolar+Macrophages+and+Neutrophils+in+Limiting+Virus+Replication+and+Mortality+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice.</a> J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).</li>
<li>Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+and+the+challenge+for+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immu%22%5BJournal%5D)">Influenza and the challenge for immunology.</a> Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).</li>
<li>Webster, R. G., Govorkova, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuing+challenges+in+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Continuing challenges in influenza.</a> Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).</li>
<li>Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSzretter%2C+KJ+%22Current+protocols+in+microbiology%22">Current protocols in microbiology</a>. , Wiley. (2006).</li>
<li>Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+influenza-induced+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome.</a> Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).</li>
<li>Ito, T., Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+sialic+acid-galactose+linkages+in+the+chicken+egg+amnion+and+allantois+influence+human+influenza+virus+receptor+specificity+and+variant+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection.</a> J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).</li>
<li>Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+amniotic+passage+in+the+egg-adaptation+of+human+influenza+virus+is+revealed+by+haemagglutinin+sequence+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).</li>
<li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells).</a> Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Grip hastalığının büyük bir küresel yük olur, ve iş akciğer hasarı 7 patogenezi anlayış içine devam ediyor. Bu ölümcül hastalık kolaylaştırdı araştırma, çeşitli yöntemler grip virüsü 6 yaymak için geliştirilmiştir. Burada, biz tavuk yumurtası influenza virüsü üretmek için bir tekniği açıklar. Bu yöntemin avantajı, yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu ve çoğu zaman, in vitro çalışmalar için gerekli olan yüksek titre grip virüsü hisse senetleri, büyük miktarlarda elde edilir. <p class=...

Grip A insan sağlığı için büyük bir tehdit olmaya devam ediyor. Büyük bir küresel yük dünya çapında yılda 1 500.000 ölüme kadar neden olan bir yıkıcı solunum hastalığıdır. Grip virüsleri ailesi Orthomyxoviridae olup genomları 1,2, 8 negatif sens, tek iplikçikli RNA taşır. Viral genomun yüksek değişebilirlik (yani, antijenik &quot;sürüklenme&quot;) uzun vadeli bağışıklık engeller. Ayrıca, grip, anti-viral ilaçlar 3 giderek dayanıklıdır. 2009 H1N1 pandemik influenza hastalığının (pandemik suşu anti-viral direnç, gecikmiş aşı üretimi) ile ilgili tüm zorlu konuları vurgulanır. Aşı formülasyonu büyük olasılıkla patojenik influenza suşları 4 (H1N1, H3N2 ve İnfluenza B için birer adet) için Dünya Sağlık Örgütü tarafından her yıl belirlenir. Bu yöntem tahmin grip suşu dayandığındans, patojen suşları bazen yanlış tespit ve aşı etkinliği önemli ölçüde düşer vardır. Ayrıca, yeni grip suşları görünümü pandemik hastalık 2 neden bu koruyucu programları aşmak olabilir. evrensel grip aşısının oluşturulması 5 zor olmuştur. Bu nedenle, araştırma akciğer hasarının patogenezinde anlamak içine devam etmelidir. Tesis laboratuar araştırmaları için, çeşitli yöntemler viral izolasyon ve yayılma 6 geliştirilmiştir. İnsan grip virüsleri, memeli hücre çeşitli substratlar olarak amplifiye edilebilir. Bununla birlikte, büyük miktarlarda üretilmesi yüksek titre virüsleri iyi embriyo haline gelmiş yumurtalardan elde edilmektedir. Aşağıdaki protokol grip için mevcut virüs stoklarından bir virüs yayılımını ve depolama tekniğini açıklar.

<table><tbody><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>serum patojen içermeyen (SPF) döllenmiş tavuk yumurtası&nbsp;</td><td>VALO BioMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nemlendirilmiş yumurta kuluçka makinesi&nbsp;</td><td>ÇİFTLİK yenilikçileri</td><td>Model 2100</td><td></td></tr><tr><td>otomatik yumurta çevirici</td><td>ÇİFTLİK iNNOVATORS</td><td>Model 3200</td><td></td></tr><tr><td>yumurta mumcusu</td><td>ÇİFTLİK iNNOVATORS</td><td>Model 3300&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1 ml şırınga</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>18G iğne</td><td>BD Bioscience</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>20G / 22G iğne</td><td>BD Bioscience</td><td>305176 / 305156</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Etanol>%99,5</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td> su tutkalı <td>tabancası kullanılarak %70'e kadar seyreltilmiş</td></tr><tr><td>"Ad tech Hi Temp Project Pro"</td><td>Ad tech, Yapıştırıcı Teknolojileri A.Ş.</td><td>Model 1105</td><td></td></tr><tr><td>tutkal "Reklam teknolojisi MINI SIZE, Multi Temp"</td><td>Reklam teknolojisi, Yapıştırıcı Teknolojileri, Inc.</td><td>220-34ZIP30</td><td></td></tr><tr><td>MDCK hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td></td></tr><tr><td>Yıkanmış Havuzlanmış Hindi Kırmızı Kan Hücreleri,% 10</td> <td>Lampire Biyolojik Laboratuvarları</td><td>724908</td><td></td></tr></tbody></table>

embriyone tavuk yumurta grip virüsü yayılım

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Grip enfeksiyonu yaklaşık 36.000 ölüm ve Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde 200.000 &#39;den fazla hastaneye yatış her yıl ile ilişkilidir. Mutasyon ve yeniden çeşitler nedeniyle yeni influenza virüs türlerinin sürekli ortaya çıkması virüsün kontrol komplike ve yeni ilaçların ve aşıların kalıcı geliştirilmesini gerekli kılmaktadır. Grip laboratuar tabanlı çalışma virüsün yayılması için güvenilir ve maliyet-etkin bir yöntem gerektirir. Burada, bir kapsamlı protokol sürekli olarak yüksek titre virüs stokları elde edilir verimli tavuk yumurta influenza A virüs yayılması için sağlanır. 11 gün - Kısaca, serum patojen içermeyen (SPF) döllenmiş tavuk yumurtası 37 ° C ve 10% 55-60 nemde bekletilir. Bu süre içinde, embriyo gelişimi kolaylıkla bir yumurta Candler kullanılarak izlenebilir. Virüs aşı, bir iğne ile allantoik oyuğuna virüs stokunun püskürtülmesiyle gerçekleştirilir. 37 ° C&#39;de inkübasyon 2 gün sonra yumurta4 ° C&#39;de en az 4 saat süre ile donduruldu. Hava kesesi ve chorioallantoic membran üzerinde yumurta kabuğu sonra dikkatlice açılır, ve virüs içeren allantoik sıvı hasat edilir. sıvı, santrifüj ile etrafı temizlenmiş alikotlandı ve uzun süreli depolama için -80 ° C&#39;ye kadar aktarılır. büyük miktarda, genellikle, bu protokol ile elde edilir ve yüksek virüs titresi (bir virüs içeren yumurta başına sıvının 5-10 mi) büyük miktarlarda ihtiyaç in vitro çalışmalar için, özellikle, virüs preparatı eden uygun bir yöntem için yumurta kullanımını yapmıştır virüs içinde, aynı virüs stokunun yüksek dozlar gereklidir.

Çeşitli yöntemlerle grip virüsü titre edilmesi için geliştirilmiştir. Uygun bir yöntem seçerek Bir göz bazı canlı viryonlarını değerlendirecek olan, ne olursa olsun başkalarının enfekte dayalı ise canlılığı (örneğin, hemaglutinin deneyi) toplam parçacıkları tespit olduğunu (örneğin, plak deneyi) 6. Burada, bir fare adapte influenza virüsü (A / PR / 8/34) ile aşılanır tavuk yumurtalarından elde alantoik akışkan viral titresi plak deneyi (Şekil 1) ve hemaglüsinasyon tahlilinde...

Bereketli tavuk yumurtaları, yüksek miktarda insan influenza A virüsü üretmek için yaygın olarak kullanılır, çünkü yüksek virüs verimini kanıtlamak için uygun ve uygun maliyetli bir sistem sağlarlar.

Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Bu prosedürün genel amacı, maliyet etkin bir sistemde yüksek titreli influenza virüsü üretmektir. Bu işlem, öncelikle serum patojeni içermeyen, taze döllemiş tavuk yumurtaları temin edilerek gerçekleştirilir. İkinci adımda, yumurtalar allantoik yol aracılığıyla influenza virüsü ile enfekte edilir.Virüsü içeren Alan Toic sıvısı 48 saat sonra toplanır ve virüs sıvı azot içerisinde şok dondurulur. Son aşamada, toplanan Alan Toic sıvısının virüs titresi etkisini belirlemek için plak ve hemaglütinasyon analizleri gerçekleştirilebilir. Toplama basamakları oldukça hassas olduğundan ve yumurtaların dikkatli bir şekilde işlenmesini ve anatomilerinin iyi bilinmesini gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik önem taşımaktadır.Prosedüre başlamadan önce, uygun bir tedarikçiden patojen içermeyen, taze döllenmiş tavuk yumurtaları temin edin. Yumurtalar ulaştığı anda, 37 °C sıcaklıkta ve %55 ila %60 nem oranında, yumurtaları düzenli olarak döndürmek için otomatik bir yumurta çeviricisi bulunan nemlendirilmiş bir yumurta inkübatörüne yerleştirin ve 10 ila 11 gün boyunca bekletin. Yedi ila sekiz günlük inkübasyonun ardından, %70 etanol ile sterilize edilmiş eldivenler giyerek.Bir yumurta ışıldağını etanolden silin ve yumurtaları inkübatörden boş yumurta kartonlarına aktarın. Ardından ışıkları söndürün ve yumurtaları tek tek, geniş uçları ışıldağa gelecek şekilde tutun. Yumurta döllendiyse, fasulye şeklindeki bir embriyoya giden ince kan damarları net bir şekilde görülmelidir.Yumurta döllenmemişse, görünür bir yumurta sarısı ile birlikte küçük bir kan lekesi gözlemlenecektir. Ardından döllenmemiş yumurtaları atın ve canlı olanı inkübatöre geri yerleştirin. Bir yumurtanın durumu teyit edilemezse, döllenmeden sonraki 10. veya 11. günde gözlemlemek üzere işaretleyin ve kullanımdan hemen önce, bir influenza A virüsü stokunu sterile PBS (hippies ile takviye edilmiş) içerisinde 1x10³ ile 10⁴ PFU/mL konsantrasyonuna seyrelterek buza yerleştirin.Ardından her bir yumurtayı tekrar ışıkla kontrol edin ve ölü, hareketsiz embriyoları ayıklayın. Sonra, inkübatörden üç yumurta çıkarın ve bunları ayrı bir tutucuya yerleştirin. Hava keseleri yukarı bakacak şekilde, yumurtaların hava boşluklarını kalıcı bir markörle işaretleyin.Ardından, hava boşluğunun üzerindeki bölgeyi %70 etanol ile yıkayın ve yumurtaları, hava boşluğu yukarı gelecek şekilde, BSL 2 biyogüvenlik kabini içinde bir yumurta kartonuna aktarın. Şimdi, her yumurtanın hava kesesinin üzerindeki kabuğa küçük bir delik açmak için steril 18 gauge bir iğne kullanın. Embriyoya veya sarısına zarar vermemek için iğneyi çok derinlemesine yerleştirmemeye dikkat edin.Ardından, seyreltilmiş influenza virüsünü steril bir bir mililitrelik şırıngaya çekin. 22 gauge'lik bir iğne takın ve iğneyi ilk yumurtanın Alan Toic boşluğuna 45 derecelik bir açıyla dikkatlice ilerletin. Seyreltilmiş virüsün 0,2 mililitresini yumurtaya enjekte edin ve diğer iki yumurtaya da enjeksiyonu yaptıktan sonra şırıngayı ve iğneyi atıp her bir deliği sıcak silikon tabancasından bir damla yapıştırıcı ile kapatın.Yapıştırıcının yumurtanın içine sızmadığından emin olun ve ardından yumurtaları inkübatöre geri yerleştirin. Tüm yumurtalar inoküle edildikten sonra, enfekte yumurtaları influenza virüs tipine bağlı olarak optimal inkübasyon süresi boyunca, çevirmeden 37 °C ve %60 nemde inkübe edin.İnkübasyon süresinin sonunda, embriyoyu öldürmek ve kan damarlarını daraltmak için yumurtaları dört santigrat derecede en az dört saat boyunca soğutun. Yumurtalar yeterince soğutulduğunda, onları bir biyogüvenlik kabinine ve sabit bir tutucuya aktarın ve yumurta yüzeylerini %70 etanol ile temizleyin.Ardından, ilk yumurtanın hava kesesinin üzerindeki yumurta kabuğunu açmak için steril makas kullanın. Hava kesesi etrafındaki kabuğu çıkarın. Koriyon membranına zarar vermemeye özen gösterin.Ardından, koriyoallantoik membranı açmak için steril küt uçlu pensler kullanın ve vitellusu yırtmamaya dikkat ederek embriyoyu ve vitellusu küçük bir spatula veya kaşıkla nazikçe kenara çekin. Daha sonra, bir mililitrelik bir pipet kullanarak koriyoallantoik sıvıyı dikkatlice toplayın; mümkün olduğunca fazla sıvı toplamak için gerekirse yumurtayı yana eğin. Her yumurta hasat edildiğinde, 5 ila 10 mililitre arasında hafif sarımsı sıvı elde edilmelidir.Alan Toic sıvısını buz üzerinde 50 mililitrelik plastik konik tüplerde toplayın. Tüm sıvı toplandıktan sonra, virüsü çöktürmek için santrifüjleyin ve berrak sıvıyı buz üzerinde yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın. Son olarak, yumurtaları BSL iki atık konteynerine atın ve hemen berraklaştırılmış LAN toic sıvısına geçin.Ardından, virüsü sıvı azotta hızla dondurun ve dondurulmuş stokları -80 °C dondurucuya yerleştirin. Uzun süreli saklama için; influenza virüsü enfeksiyonu, hücre monokatmanında dantelsi hücrelerden oluşan dairesel bölgelere veya plaklara yol açan sitopatik bir etki yaratır. Bu deneyde plaklar, hücrelerin kristal viyole ile boyanmasıyla görselleştirilmiş ve 500 µL seyreltilmiş viral stok hücreler üzerinde kültüre edildiği için, 1 × 10⁻¹² seyreltimindeki virüsün bulunduğu kuyukta 65 plak sayılmıştır.Bu deneyde, nihai titre mililitre başına 1,3 x 10¹⁴ PFU idi. Hemaglütinasyon testi, influenza virüsünün kırmızı kan hücrelerinin yüzeyine tutunma yeteneğine dayanan bir influenza virüsü titreleme yöntemidir. Görüldüğü üzere, viral süspansiyon kırmızı kan hücrelerini aglutine ederek bu hücrelerin süspansiyondan çökmesini engellemektedir.50 µL'deki virüsün 2⁻¹⁰ seyreltmesinde net bir negatif sonuç gözlemlenmiştir. Bu nedenle, nihai titre ml başına 2,1 × 10⁴ HAU'dur. Bu videoyu izledikten sonra, tavuk yumurtaları inoküle edilerek influenza virüsünün nasıl çoğaltılacağı ve virüsü içeren allantoik sıvının nasıl hasat edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

influenza-virus-propagation-in-embryonated-chicken-eggs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Plazmid DNA influenza A virüsleri Kurtarma grip araştırmacılar grip virüsünün biyoloji çeşitli yönlerini incelemek amacıyla rekombinant virüsler üretmek için, ve potansiyel vektörler veya aşı olarak kullanılmak üzere izin veren bir temel ve temel deneysel bir tekniktir.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Influenza A virusu ile aynı anda enfeksiyon asemptomatik sırasında invazif pnömokok hastalığına indüksiyonu karıştığı faktörlerden...

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

Bu video, influenza virüsü monoklonal antikorlarını nötralize etmek için kaçış varyantları oluşturmak için bir tekniği göstermektedir. Antikor ile nötralize edilmiş virüs süspansiyonu, kaçış varyantlarını seçici olarak çoğaltmak için embriyonlu tavuk yumurtalarına enjekte edilir. Bu, bir Hemaglutinasyon testi ile doğrulanan, ağırlıklı olarak kaçış varyantlarından oluşan bir virüs popülasyonu ile sonuçlanır.

Nötralize Edici Antikorlara Karşı İnfluenza Virüsü Kaçış Varyantlarının Üretilmesi

Video, soğuğa uyarlanmış rekombinant influenza virüsleri oluşturmak için bir yöntem gösteriyor. İnsan hücrelerinin çift yönlü plazmitlerle transfekte edilmesini, ardından daha sıcak koşullarda azaltılmış replikasyon ile karakterize edilen aşı üretimine uygun virüsler elde etmek için daha düşük sıcaklıkta inkübasyonun inkübasyonunu içerir.

Aşılar için Rekombinant Canlı Zayıflatılmış İnfluenza Virüslerinin Üretilmesi

Newcastle hastalığı virüsü (NDV) yaygın olarak, diğerleri arasında, aşı ve tedavi için yeni vektörler geliştirmek için, son birkaç yıl içinde incelenmiştir. Bu çalışmalar nedeniyle bu tür burada açıklandığı gibi rekombinant virüs cDNA'sından kurtarmak için teknikler, mümkün olmuştur.

CDNA&#39;dan rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Rescue

İnsan influenza A virüsü için sistemik ve lokalize zebra balığı enfeksiyon modelleri gösterilmiştir. Sistemik bir enfeksiyon modeli kullanarak, zebra balığı antiviral ilaçları taramak için kullanılabilir. Lokalize bir enfeksiyon modeli kullanarak, zebra balığı konakçı bağışıklık hücresi tepkilerini karakterize etmek için kullanılabilir.

İnsan İnfluenza A Virüs Enfeksiyonları Zebra balığı Modeller Kullanılarak Antiviral İlaçlar Ekran ve Host Bağışıklık Hücre Yanıtları karakterize etmek

Burada, sporozoitler veya ikinci nesil merozoitler nükleofekting tavuk Eimeria parazitlerin kararlı transfeksiyon elde etmek için bir yöntem sağladı. Heterolog antijenik genleri ifade eden genetiği değiştirilmiş eimerian parazitler aşı dağıtım aracı olarak kullanılabilir.

Tavuk Eimeria Parazitlerinin Nükleofeksiyon uyup In Vivo Propagation

Bu makalenin genel amacı, tavuk embriyolarına eksojen materyallerin hücre içi enjeksiyonunda nasıl gerçekleştirileceğini tanımlamaktır. Bu yaklaşım, tavuk embriyolarının gelişimsel biyolojisini incelemek için çok yararlıdır.

Burada: Ovo Tavuk Embriyolarında İntravasküler Enjeksiyon

Burada, yüksek titreli rekombinant Newcastle hastalığı virüsünün üretimi, saflaştırılması ve miktarının belirlenmesi için ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz. Bu protokol sürekli olarak &gt; 6 × 109 plak oluşturan birim / mL verir ve in vivo hayvan çalışmaları için uygun virüs miktarlarını sağlar. İn vivo güvenliği sağlamak için ek kalite kontrol testleri açıklanmaktadır.

Allantoik Sıvıdan Yüksek Titerli Rekombinant Newcastle Hastalığı Virüsü Üretimi

Bu yöntem, tavuk embriyosunu, bakteriyel patojen L. monocytogenes'i yaşayabilir ancak kültürlenemeyen (VBNC) bir durumdan canlandırmak ve bakteri uyku hali mekanizmalarının anlaşılmasında potansiyel olarak daha fazla kullanım sağlamak için basit ve uygun maliyetli bir in vivo model olarak göstermektedir.

Canlı Ancak Kültürlenemeyen Patojenleri Canlandırmak için İn Vivo Model Olarak Tavuk Embriyosu

Öğrenin, gübrelenmiş tavuk yumurtalarında yüksek titrelİ influenza A virüsü üretme yöntemini. Bu maliyet etkin sistem, aşı geliştirme ve viroloji araştırmaları için güvenilir virüs elde edilmesini sağlar.

Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım

Daha fazla video keşfet