Name: Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Keşfedin fare retinası dilim hazırlığı ve kayıt patch kelepçe teknikleriyle nöronlarda ışık-uyarılmış postsinaptik yanıtları inceleme yöntemini. Bu teknik retinal fizyoloji araştırmaları için hassas elektrofizyolojik ölçümler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH R01 EY020533, WSU Başlangıç Fonu ve RPB hibeleri tarafından desteklenmiştir.

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürleri Wayne State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Deneysel Çözüm 1. Hazırlık <ol><li> Gerçek deneyden önce diseksiyon çözeltisini 1 gün hafta 1 hazırlayın. Çünkü düşük sıcaklıklarda 16 de güçlü tamponlama yeteneği retina diseksiyon için bir HEPES tampon solüsyonu kullanın. (MM olarak) aşağıdaki gibi kimyasalları karıştırın: 115 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl2, 1.0 MgCl2, 10 HEPES, 28 glikoz ihtiva eder. NaOH ile 7.4&#39;e pH ayarlayın. 1 hafta buzdolabı yukarı çözümü tutun. </li><li> kayıt solüsyonu retina preparasyonlar 17 için tasarlanmış yapay beyin omurilik sıvısı (CSF) &#39;dir Ames aracı. Deney günü olarak, bir tüp içinde Ames tozu (500 ml çözelti için 4.4 g) tartılır. Ayrıca, NaHCO 3 (500 ml çözelti için 0.95 g) tartmak ve A ile karıştırınMES&#39;in toz. </li><li> Deney günü ile yama kelepçe kayıtları için hücre içi pipet çözüm hazırlayın. (MM olarak) aşağıdaki gibi kimyasalları karıştırma: 111, K-glukonat, 1.0 CaCl2, 10 HEPES, 1.1 EGTA, 10 NaCl, 1.0 MgCl2, 5 ATP, Mg ve 1,0 GTP Na. KOH ile pH&#39;ı 7.2&#39;ye ayarlayın. Geleneksel şırınga filtresi ile pipet çözüm Filtre. ~ 500 ul hacimde yapın ve bir dondurucu veya derin dondurucuda saklayabilirsiniz. </li></ol> Deney Günü 2. Hazırlık <ol><li> O / N karanlık adaptasyonu için karanlık bir alanda - (erkek, 8 haftalık 4, C57BL / 6J veya benzeri bir arka plan) gece deneyden önce, bir kafes içinde bir fare koyun. </li><li> Diseksiyon için hazırlık: <ol><li> En az 10 dakika süreyle oksijen ile, bir cam beher içinde - (200 mi, 100), buz üzerine yerleştirin ve kabarcık çözeltisi kesme doldurun. </li><li> Retina hazırlık depolama için karanlık kutu oksijenasyonu başlatın. </li><li> Yeniden gres için raylar ile plastik lamelleri hazırlayınintestinal dilim preparasyonlar 35 mm plastik tabak, her biri koyun. </li><li> Bir helikopter (doku dilimleme makinesi) yeni bir jilet takın. </li><li> Iki eşit parçaya, bir filtre membranı kesin. Bu retina dilimleme içindir. </li><li> Mikroskop yakın diseksiyon araçları ve transfer pipet hizalayın. Her aracı kolayca karanlıkta erişilebilir, böylece çalışma alanı iyi organize edilmelidir. </li></ol></li><li> Yama kelepçe kayıtları için hazırlık: <ol><li> Ames tozu ve damıtılmış su içinde NaHCO 3 (Ames 4.4 g NaHCO 3 0.95 g / 500 mi GKD 2 O) içinde çözülür. Karışık oksijen ile kabarcık Ames ortamı (% 95 O2 ve% 5 CO2), en azından 30 dakika için ise bir kayıt sıcaklık seviyesine ısıtma (~ 35 ° C). Hala köpüren ise NaHCO3 ile 7.4 pH ayarlayın. </li><li> Diseksiyon sırasında iç pipet çözüm çözülme. Çözündürüldükten sonra, hücre içi boyama için,% 0.01 sülforhodamin B ekleyin. </li></ol></li></ol> 3. Retina Diseksiyon <ol><li> Karanlık bir odada, karbon dioksit ve bilateral pnömotoraks kullanarak fare euthanize. 2 Sonra - karbondioksit kullanarak 3 dakika, fare bilincini kaybeder. </li><li> Fare artık kuyruk-çimdiği yanıt zaman hızlı bir şekilde gözler enükleasyonu ve bir plastik tabak soğuk kesme çözeltisi içine yerleştirin. Hayvanın ölümü sağlamak için ikili pnömotoraks gerçekleştirin. Hızla karanlık kutuya çanak göz saklayın. Karanlıkta prosedürü yürütmek için bir kızılötesi görüntüleyicisi kullanın. Not: Alternatif olarak, izofluran, dekapitasyon veya servikal dislokasyon ötenazi için kullanılabilir. ötenazi yöntemi Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) ve / veya Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallara uymalıdır. </li><li> Karanlık bir odada, diseksiyon mikroskobu ve kızılötesi aydınlatma ayarlayın. Mikroskop altında, 10 cm plastik tabak w içine çanak göz aktarınsoğutulmuş kesme solüsyon i. Sürekli boru içinden kabarcık oksijen plastik tabak altına yerleştirdi. Çok düşük değil yani akış sesini ayarlayın, ancak diseksiyon rahatsız kadar yüksek olmadığından emin olun. </li><li> Kornea ve lens temizleme: <ol><li> Bir mikro-cerrahi bıçakla kornea üstünde bir kesi yapmak. Göz küresinin diğer ucunda optik sinir tutarak hareket gözü engeller. Cerrahi bir makas kullanarak kesim uzatın. Etrafında bazı sklera ile kornea kesin. </li><li> Ince forseps ile objektif tut ve yavaşça lensi çekin. Vitreus lens çıkarmak için çok yapışkan ise, bir makas ile vitreus kesti. </li><li> Göz-fincan yapıldıktan sonra, yavaşça küçük bir transfer pipet ile Göz yuvası içine soğuk, oksijenli kesme çözümü dökün. NOT: Bir kesi korneada yapıldıktan sonra gözün çabuk söner. Bu pro sırasında göz deforme gibi göz şeklini korumak için önemlidirketencik retinaya zarar ve retina dekolmanı neden olacaktır. </li></ol></li><li> Retinanın dorsal ve ventral tarafı belirlenmesi: Not: yeşil ve morötesi (UV) düzensiz bir dağılım özel retina alanı belirleme 18 koniler için hafif tepki kayıtlar için önemlidir. <ol><li> Optik sinir başı yakınında geçen retina göz fincan karşısına gidiyor çizgi belirleyin. Bu hat, çoğunlukla optik sinirin ventral tarafında boyunca geçer; Diğer 19 ventral ise optik sinir dahil yan, sırt tarafı. Kızılötesi izleyiciler altında açıkça bu dönüm bakın. </li><li> Deney amacına bağlı olarak, gereksiz tarafında bir kesim yapmak. Bu göz fincan retina izole sonra yararlı olacaktır. </li></ol></li><li> Camsı kaldırma: <ol><li> İsteğe bağlı olarak, 15 dakika için hiyaluronidaz (0.5 mg / ml) ile göz fincan inkübe edilir. </li><li> Ekstra ince forseps ile vitrözü çıkarın. vitreus esasalt ve göz bardağın dış kenarına eklenerek. Yavaşça dokunmadan veya retina alay etmeden çıkarın. Vitreus sıkıca Göz yuvası takılı olabilir gibi, göz fincan retina dekolmanı önlemek için yavaşça çıkarın. Hiçbir gerginlik hissedilir kadar çekmeye devam edin. Not: Bu adım fare retinasına kesme için özellikle önemlidir; Bununla birlikte, bu tür sıçan veya salamanderin gibi diğer türlerin retinalarında için bir sorun değildir. </li></ol></li><li> Göz-fincan retina izole edin. Sklera tut ve yavaşça forseps ters kullanılarak retina soyulabilir. NOT: retina hazırlıkları Tüm montaj izole retina yapılabilir. Kenarlarda 3-4 kesim yapmak ve retina düzleştirmek ya da birkaç parçaya kesilmiş retina. </li><li> Retina Trim ve retinanın gereksiz yarısını atın (3.5 adım). Aynı plastik tabak, iki parçaya kalan retina kesti. Retinanın her parça için, bir yapmak için kenarları kesilmişretina döşeme ve katlama kenarları kırpın. </li><li> Büyük bir transfer pipeti (~ 2 mL) kullanılarak bir cam plaka üzerine bir retina levha aktarın. Küçük bir pipet ile aşırı çözümü Suck slab düzleştirmek için filtre kağıt parçası kullanın ve ardından hızla doku üstünde filtre membran bir parça koyun. <ol><li> Küçük bir transfer pipet kullanarak, filtre zarı üzerinde çözüm diseksiyon bir damla yerleştirin. Çözelti zarın yayılır kadar ~ 15 saniye bekleyin. Bu süre zarfında, retina dokusu filtre zarı sopa olacak. </li><li> Altında ve filtre etrafında daha soğuk diseksiyon çözüm dökün. Filtre membran ile retina dokusu yüzer. Bir forseps ile filtre membran tut ve dilimleme odasına yerleştirin. Doku üzerinde çözüm diseksiyon dökün ve karanlık kutuya hazırlık saklayın. NOT: Burada anlatılan prosedür önemlidir. Bu sağlamak için hızlı bir şekilde bu adımları gerçekleştirmek için önemli olduğunu filtre hafızasına retina dokusu sopabran ve kurumaz. </li></ol></li><li> Bir helikopter kullanarak, dilimler halinde retina dokusu kesti. Yaklaşık 200 mikron kalınlığında yama kelepçe çalışmaları için uygundur. </li><li> Dilimleme odasında gres raylar ile bir plastik lamel yerleştirin. Plastik lamel gres rayların üstünde bir retina dilim aktarın. Enine bölüm görünür şekilde dilim 90 ° döndürün. Daha sonra, lamel üzerine aşağı filtre membranı basın yağ ile filtre kağıdı tarafı kapsamaktadır. <ol><li> Dilim plastik lamel üzerinde hareketsiz sonra, lamel kapmak ve 35 mm plastik tabak aktarmak. Retina hazırlık üzerine soğuk diseksiyon çözüm dökün ve hazırlık daldırın. Sürekli oksijenli gereken karanlık kutunun her yemeğin, saklayın. NOT: Tüm prosedür filtre membran deforme etmeyecek şekilde dikkatli yapılması gerekiyor. Aksi takdirde, retina dilim kolayca filtre zarından ayrılır. </li></ol></li></ol><ol><li> Hazırlık Kayıt: <ol><li> Ames &#39;orta ile Başbakan perfüzyon tüpleri. Boru doldururken tüm kabarcıklar geçmesine izin verin. </li><li> Bir çektirmesi ile yama kelepçe kayıt pipetler olun. Pipet backfilled kadar 1 dakika boyunca bir pipet arka pipet çözeltisi, daldırma ile bir pipet doldurmak için. Sonraki, bir mikro-pipet dolgu kullanılarak pipet ~ 1/3 &#39;doldurunuz. Nemli pipet kutusu, her pipet saklayın. </li><li> Yama kelepçe kayıtları için ekipman açın; bilgisayar, amplifikatör, CCD kamera, mikroskop ve dahil. </li></ol></li><li> Oda ışığı kapatın. Kızılötesi görüntüleyici kullanarak mikroskop sahne odasının üzerine bir retina dilim hazırlık yerleştirin. Bu hareketsiz kılındıktan sonra, sürekli perfüzyon başlar. 33-37 ° C&#39;de perfüzyon sıcaklığını ayarlayın. </li><li> CCD kamera ile dilim yüzeyini görüntüleyin. Hedef yere odaklanın nerede hedef cell türleri bulunur. Yama kelepçe kayıt için sağlıklı görünümlü hücreyi seçin (örneğin, pürüzsüz görünümlü yüzey ve iyi bir hücre şekli olmalıdır). </li><li> Bir pipet tutucu bir kayıt pipet yerleştirin. Dilim hazırlık pipet Advance. Bu dilim hazırlama (~ yukarıdaki 2 mm) yakın olduğunda, mikroskop ile pipet ucu bulabilirsiniz. Pipet ucu mikroskop altında görülebilir sonra, hedef hücreye doğru ucu aşağı hareket ettirin. </li><li> Amplifikatör ayarlayın. (Sıfırlama) 0 mV / 0 pA de pipet ayarlayın ve 10 Hz ~ En ~ 5 mV sürekli elektrik darbe başlar. Pipet direnci kontrol edin; İdeal direnç çoğu retina nöronlar için 5 ila 10 MΩ olduğunu. </li><li> Ucundan dışarı üfleme başlayın. Bir ağızlık kullanın, ya da pipet banyo çözeltisi içine dips zaman pozitif basınç uygulamak için, bir şırınga kullanın. Ucu hedef hücrenin yüzeyinde kadar sürekli iç çözüm darbe. <ol><li> Pozitif basınç th küçük bir çukur yaptığındae hücre yüzeyi, biraz ucu ilerlemek ve üfleme durdurun. Artmalıdır pipet direnci, kontrol edin. Sürekli artıyorsa, bırakın ve&gt; 1 GΩ (gigaseal) ulaşıncaya kadar direnç izlemek. Direnç kendiliğinden artmaz ise bir gigaseal olana kadar, yavaşça negatif basınç uygulayın. </li></ol></li><li> Gigaseal gerçekleştirildikten sonra mV -70 için tutma potansiyeline değişir. Sonra, aralıklı pipet içindeki membran rüptürü negatif basınç uygulayın. Tam hücre konfigürasyonu yapıldığında, pipet direnci 500 MΩ ve 1 GΩ ve kapasitif akım görülmektedir arasında olabilir. Bazen spontan postsinaptik akımlar görülebilir. </li><li> -80 Den +40 mV IV ilişkisini kaydedin. Voltaj kapılı kanallar farklı tipte hücre tipine bağlı olarak aktive edilir. </li><li> Tutanak sinaptik akımları ya da gerilimleri ışık uyarılmış. </li></ol>

<ol><li>Werblin, F. S., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+retina+of+the+mudpuppy%2C+Necturus+maculosus+II.+Intracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Organization of the retina of the mudpuppy, Necturus maculosus II. Intracellular recording.</a> J Neurophysiol. 32 (3), 339-355 (1969).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Lukasiewicz, P., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+slowly+inactivating+potassium+current+truncates+spike+activity+in+ganglion+cells+of+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A slowly inactivating potassium current truncates spike activity in ganglion cells of the tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 8 (12), 4470-4481 (1988).</li>
<li>Kaneko, A., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+L-glutamate+on+the+anomalous+rectifier+potassium+current+in+horizontal+cells+of+Carassius+auratus+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of L-glutamate on the anomalous rectifier potassium current in horizontal cells of Carassius auratus retina.</a> J Physiol. 358, 169-182 (1985).</li>
<li>Kamermans, M., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA-mediated+positive+autofeedback+loop+controls+horizontal+cell+kinetics+in+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA-mediated positive autofeedback loop controls horizontal cell kinetics in tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 12 (7), 2451-2463 (1992).</li>
<li>Cook, P. B., McReynolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+inhibition+in+the+inner+retina+is+important+for+spatial+tuning+of+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lateral inhibition in the inner retina is important for spatial tuning of ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 1 (8), 714-719 (1998).</li>
<li>Pang, J. J., Gao, F., Wu , J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+current+responses+in+rod+bipolar+cells%2C+cone+depolarizing+bipolar+cells+and+AII+amacrine+cells+in+dark-adapted+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol.+558+%28Pt%22%5BJournal%5D)">Light-evoked current responses in rod bipolar cells, cone depolarizing bipolar cells and AII amacrine cells in dark-adapted mouse retina.</a> J Physiol. 558 (Pt. 558 (Pt 3), 897-912 (2004).</li>
<li>Euler, T., Masland , R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+responses+of+bipolar+cells+in+a+mammalian+retina%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Light-evoked responses of bipolar cells in a mammalian retina).</a> J Neurophysiol. 83 (4), 1817-1829 (2000).</li>
<li>Berntson, A., Taylor , W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+characteristics+and+receptive+field+widths+of+on-bipolar+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol.+524+Pt%22%5BJournal%5D)">Response characteristics and receptive field widths of on-bipolar cells in the mouse retina.</a> J Physiol. 524 Pt. 524 (Pt 3), 879-889 (2000).</li>
<li>Sterling, P., Smith, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+for+a+binary+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Design for a binary synapse.</a> Neuron. 41 (3), 313-315 (2004).</li>
<li>Borghuis, B. G., Marvin, J. S., Looger, L. L., Demb, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+nonlinear+glutamate+release+dynamics+at+bipolar+cell+synapses+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of nonlinear glutamate release dynamics at bipolar cell synapses in the mouse retina.</a> J Neurosci. 33 (27), 10972-10985 (2013).</li>
<li>Dowling, J. E., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+retinal+dystrophy+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inherited retinal dystrophy in the rat.</a> J Cell Biol. 14, 73-109 (1962).</li>
<li>Eggers, E. D., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28A%29%2C+GABA%28C%29+and+glycine+receptor-mediated+inhibition+differentially+affects+light-evoked+signalling+from+mouse+retinal+rod+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">GABA(A), GABA(C) and glycine receptor-mediated inhibition differentially affects light-evoked signalling from mouse retinal rod bipolar cells.</a> J Physiol. 572 (Pt 1), 215-225 (2006).</li>
<li>Ichinose, T., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mode+of+retinal+presynaptic+inhibition+switches+with+light+intensity%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mode of retinal presynaptic inhibition switches with light intensity).</a> J Neurosci. 32 (13), 4360-4371 (2012).</li>
<li>Ichinose, T., Fyk-Kolodziej, B., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+ON+cone+bipolar+cell+subtypes+in+temporal+coding+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Roles of ON cone bipolar cell subtypes in temporal coding in the mouse retina.</a> J Neurosci. 34 (26), 8761-8771 (2014).</li>
<li>Baicu, S. C., Taylor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-base+buffering+in+organ+preservation+solutions+as+a+function+of+temperature%3A+new+parameters+for+comparing+buffer+capacity+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency.</a> Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li>
<li>Haverkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primordial%2C+blue-cone+color+system+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The primordial, blue-cone color system of the mouse retina.</a> J Neurosci. 25 (22), 5438-5445 (2005).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
<li>Farre, C. G., M Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+screening+-+automated+patch+clamp+on+the+rise%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery+today.+Technologies%22%5BJournal%5D)">Ion channel screening - automated patch clamp on the rise.</a> Drug discovery today. Technologies. 5 (1), e1-e34 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

İyi kayıtlar ancak iyi retina preparatları ve iyi tasarlanmış yama klemp kurulumları ile elde edilebilir. Yukarıda açıklanan tüm adımlar önemli olsa da, tartışma hem diseksiyon hem de kayıtlar için bazı kritik adımları vurgulamaktadır. 
Diseksiyon için iki şey özellikle önemlidir: soğutma ve oksijenasyon. Gözü enükleasyona tabi tuttuktan sonra, gözün ön kısmını oksijen kabarcıklı, soğutulmuş diseksiyon solüsyonu içeren bir diseksiyon odasında hızla çıkarın ve soğuk solüsyonu göz kabına dökün. ...

Retina, sinir sisteminin benzersiz parçalarından biridir. Beynin erişilebilir bir parçası olarak, sinaptik mimarisi iyi karakterize edilmiştir. Ek olarak, bu sinir ağının işlevleri fizyolojik bir uyaranla incelenebilir: ışık. Retina dokusu karanlık bir odada uygun işlemlerle izole edilirse, dokudaki nöronlar ışığa yanıt verecektir. Bu hazırlık, görsel sinyal işlemeyi incelemek ve çeşitli sinaptik mekanizmaları ve sinir ağı fonksiyonlarını ve ayrıca hastalık mekanizmalarını aydınlatmak için kullanılmıştır. 
Retinal nöronlardaki ışık tepkileri onlarca yıldır kaydedilmiştir. İlk çalışmalar, çamur yavrusu retinal nöronlarından hücre içi kayıtlar yapmak için keskin elektrotlar kullandı1. 1980'lerde, yama kelepçesi tekniği icat edildi2 ve kısa sürede görme araştırmacıları arasında popüler bir yöntem haline geldi3,4. Çamur yavrusu ve balık retinal nöronları da dahil olmak üzere daha düşük omurgalılardan alınan tek hücreli kayıtlar, görsel sinyal işleme mekanizmalarının aydınlatılmasına katkıda bulunan popüler yöntemlerdi5,6. 
Genetik mutasyon teknikleri geliştirildikten sonra, fare retinası görme araştırmacıları için daha popüler bir model haline geldi7-9. Memeli retinası, evrimsel olarak insan retinasına daha yakın olduğu için düşük omurgalılardan daha çekicidir ve hastalık modellerini kullanma fırsatı vardır. Bununla birlikte, fare retina hücreleri küçük ve kırılgandır10 ve karanlık bir odada retina hazırlıkları yapmak ve yama kelepçe kayıtları yapmak zordur. Teknoloji geliştikçe, görüntüleme çalışmaları11 ve elektroretinogram (ERG)12 gibi görsel sinyalleme mekanizmalarını incelemek için çeşitli yaklaşımlar mevcut hale geldi. Bununla birlikte, yama klemp yöntemi ile tek hücre kaydı, diğer yöntemlere göre zamansal ve mekansal olarak oldukça hassas olduğu için hala önemlidir. Bu nedenle, fare retinal dilim preparatlarında(13-15) görsel sinyal işlemeyi araştırmak için sürekli olarak yama kelepçesi kayıtları gerçekleştirdik ve yöntemlerimizi geliştirdik.
Bu video eğitiminde, protokoller önemli ipuçlarıyla birlikte sunulmaktadır. İyi kayıtlar ancak iyi bir hazırlık ile elde edilebilir. Hayvan diseksiyonu yapmak ve sağlam bir yama kelepçesi teçhizatı oluşturmak, çoğu araştırmacının başarılı kayıtlar elde etmesini sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>Fareler (28-60 günlük, erkek)</td><td>Jackson laboratuvarı</td><td>C57BL/6J suşu</td><td></td></tr><tr><td>Ames'in orta tozu</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td>mükemmel</td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>mükemmel</td></tr><tr><td>Diseksiyon aleti: forseps</td><td>Dumont</td> <td># 4, # 5, # 55</td><td>mükemmel</td></tr><tr><td>Diseksiyon aracı: makas</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td>mükemmel</td></tr><tr><td>Diseksiyon aleti: ameliyat bıçağı</td><td>Surgistar</td><td>7514</td><td>mükemmel</td></tr><tr><td>Tıraş bıçağı (doğrayıcı için)</td><td>EMS</td><td>71970</td><td>mükemmel</td></tr><tr><td>Doğrayıcı</td><td>el yapımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kızılötesi görüntüleyici</td><td>Gece Kuşu Optik</td><td>NOBG1</td><td>Parlak görüntü gösterir. Küçük nesnelere odaklanmak bir sorundur.</td></tr><tr><td>Çektirme</td><td>Sutter</td><td>P-1000</td><td>mükemmel; tutarlı boyutta pipetler yapar.</td></tr><tr><td>Karanlık kutu</td><td>Pelikan</td><td>karanlık kutu</td><td>mükemmel</td></tr><tr><td>Yama kelepçe sistemi</td><td>Scientifica</td><td>dilim kapsamı 2000</td><td>Mükemmel kurulum. Çoğu temel bileşen tek bir pakete dahil edilmiştir. Mikromanipülatörler mükemmeldir.</td></tr><tr><td>Amplifikatör</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>multiclamp 700B</td><td>Mükemmel ve kolay kontrol.</td></tr><tr><td>Yazılım edinme</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>pClamp yazılımı</td><td>Mükemmel ve kolay kontrol.</td></tr><tr><td>Işık kaynağı (LED)</td><td>Soğuk LED</td><td>pE-2 4 kanallı sistem</td><td>Mükemmel</td></tr><tr><td>CCD kamera</td><td>Q-görüntüleme</td><td>Retiga 2000</td><td>Mükemmel</td></tr><tr><td>Faraday kafesi</td><td>el yapımı</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kayıt patch kelepçe teknikleri kullanarak koyu adapte fare retina dilim hazırlıkları nöronlar içinde postsinaptik yanıtları işık-uyarılmış

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Retina görsel sisteme kapıdır. Görsel sinyal işleme mekanizmaları anlamak için, biz retina sinir ağı işlevlerini araştırmak. Ağda Retinal nöronlar çok sayıda alt-tiplerinin içermektedir. Bipolar hücreler, ganglion hücrelerinin ve amacrine hücrelerinin fazla 10 alt tipi morfolojik çalışmalarla tespit edilmiştir. Retina nöronlarının birden fazla alt tipleri, hareket ve renk, görsel sinyal belirgin özellikler, kodlayan ve birden çok sinir yolları oluşturmak üzere düşünülmektedir. Bununla birlikte, görsel sinyal işleme her bir nöronun fonksiyonel rolleri tam olarak anlaşılmış değildir. yama kelepçe yöntemi bu temel soruyu ele almak yararlıdır. Burada, bir protokol sağlanır koyu adapte koşullarda yama kelepçe kayıtları kullanarak fare retina nöronlar ışık uyarılmış sinaptik yanıtları kaydetmek için. Fare gözler O / N koyu adapte olup, retina dilim hazırlıkları kızılötesi aydınlatma ve izleyiciler kullanarak karanlık bir odada disseke edilir. Kızılötesi ışık yokFare fotoreseptörleri etkinleştirmek ve böylece ışık yanıt korur. Patch kelepçe retina nöronlar ışık uyarılmış yanıtları kaydetmek için kullanılır. Bir floresan boya nöronal morfolojik alt tipleri karakterize etmek kayıtları sırasında enjekte edilir. Bu prosedür, fare retinanın her nöronun fizyolojik fonksiyonlarını belirlemek için bize sağlar.

Bir temsilci dilim dilim hazırlama hazırlama düz bir yüzeye ganglion hücrelerinin fotoreseptörleri gösteren, düz konumda. Şekil 1&#39;de gösterildiği ve filtre kağıdı hiçbir dekolmanı olduğu. Bir dilim hareket ettirildiğinde ise, hazırlık sadece bir parçası zor yama sıkma için uygun bir hücreyi tanımlamak için yapar, odak olduğunu. Kayıtları için, genellikle parlak yüzeye sahip iyi bir soma, bir hatta yuvarlak şekil ve görünür hiçbir karanlık plaklar seçmek önemlidir. Bütün hücre konfigürasyonu yapılmış...

Fare gözünden retina dilimlerinin nasıl hazırlanacağını ve retina nöronlarında ışık tepkilerinin nasıl kaydedileceğini göstereceğiz. Tüm prosedür karanlığa uyarlanmış koşullarda gerçekleştirilir.

Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Bu deneyin genel amacı, karanlığa adapte edilmiş retinal nöronlardan ışık yanıtı kayıtları elde etmektir. Bu işlem, öncelikle bir fare gözünün hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise retinayı izole etmek ve dilim preparatları oluşturmak için kesmektir.Ardından, patch clamp kayıtları için hedef bir hücre bulmak amacıyla retinal preparat mikroskoba yerleştirilir ve incelenir. Tüm hücre patch clamp konfigürasyonu kurulduktan sonra, hücrenin yakın çevresine bir ışık stimülası uygulanır. Son olarak, eş zamanlı elektrofizyolojik yanıt veri toplama yazılımı aracılığıyla gözlemlenebilir.Bu tekniğin KRC görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kayıt hassasiyetinin yüksek olması ve kayıt yapılan hücrelerin morfolojik olarak tanımlanabilmesidir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, tam karanlıkta çalışmanın alışkın olmayanlar için zor ve kafa karıştırıcı olabilmesi nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Bir diziye başlamak için, diseksiyon aletlerini ve transfer pipetlerini diseksiyon mikroskobunun yanına yerleştirin.Her bir araca karanlıkta kolayca erişilebilmesi için çalışma alanı iyi organize edilmelidir. Hazır olduğunuzda, prosedürü karanlıkta gerçekleştirmek için bir kızılötesi görüntüleyici kullanın. Ötanaziden sonra gözleri hızla enükleleyin ve mikroskop altında, karanlık bir kutuda tutulan soğuk diseksiyon çözeltisi dolu bir kaba yerleştirin.Bir gözü, soğuk diseksiyon çözeltisi içeren bir kaba aktarın. Sürekli olarak oksijenle havalandırın. Kornea ve lensi çıkarmak için, göz küresinin diğer ucundaki optik siniri tutarak hareket etmesini önleyin ve mikrocerrahi bıçakla korneanın üst kısmından bir insizyon yapın.Kesiyi cerrahi makasla genişletin ve korneayı, çevresinde bir miktar sklera bırakacak şekilde çıkarın. Ardından, lensi ince uçlu bir pensle tutun ve yavaşça dışarı çekin. Göz çukuru oluşturulduğunda, küçük bir transfer pipeti yardımıyla soğuk oksijenli diseksiyon solüsyonunu göz çukuruna nazikçe boşaltın.Retinanın şeklini korumak için hızlı çalışın ve retinanın dorsal ve ventral taraflarını belirlemek için hafif basınç uygulayın. Optik sinir başına yakın bir yerden geçen ve retinal göz çanağını boydan boya kateden hattı belirlemek için kızılötesi görüntüleyiciler kullanın. Bu hat çoğunlukla optik sinirin ventral tarafı boyunca geçer; optik siniri de kapsayan taraf ise dorsal taraftır.Deneye bağlı olarak, ventral veya dorsal tarafta bir kesik oluşturun. Bu işlem, gereksiz olan tarafı işaretler ve ilerleyen aşamalarda kullanışlı bir belirteç görevi görür. Ardından, retinaya dokunmadan ekstra ince pensle vitreus humorunu nazikçe uzaklaştırın.Vitreus esas olarak göz çanağının altına ve dış kenarına yapışıktır. Vitreus göz çanağına sıkıca tutunmuş olabileceğinden, retina ayrılmasını gidermek için nazikçe ilerleyin. Hiçbir gerginlik hissedilmeyene kadar çekmeye devam edin.Retina izole edildikten sonra, sklera kısmını tutun ve retinayı nazikçe soyarak çıkarın. Pensetin arka tarafını kullanarak retinayı düzeltin ve gereksiz olan yarısını aynı plastik kaba atın. Kalan retinayı her bir parça için iki parçaya bölün.Retinal bir kesit oluşturmak için kenarları kesin ve katlanma kenarlarını düzeltin. Ardından, retinal kesiti bir cam lam üzerine aktarmak için büyük bir transfer pipeti kullanın. Fazla solüsyonu küçük bir pipetle çekin ve kesiti düzleştirmek için bir parça filtre kağıdı kullanın.Küçük bir transfer pipeti kullanarak, dokunun üzerine bir parça filtre membran nazikçe yerleştirin. Filtre membranın üzerine bir damla diseksiyon solüsyonu damlatın. Solüsyonun yayılması ve retinal dokuyu filtre membrana yapıştırması için yaklaşık 15 saniye bekleyin.Birbirine yapıştıktan sonra, membran yüzeye çıkana kadar filtrenin altına ve çevresine daha fazla soğuk diseksiyon solüsyonu dökün. Ardından, filtre membranını dilimleme haznesine yerleştirin ve diseksiyon solüsyonu ile kaplayın. Membranın kurumasını önlemek için hızlıca hareket ederek, retinal dokuyu dilimler halinde kesmek için doku kıyıcıyı kullanın.Gres rayları bulunan plastik bir lamın üzerindeki örtü camını dilimleme haznesine yerleştirin. Bir retinal dilimi gres raylarının üzerine aktarın ve enine kesit görünür olacak şekilde dilimi 90 derece döndürün. Filtre kağıdının kenarlarını gresle kapatmadan önce filtre membranını örtü camının üzerine bastırın.Plastik bir lam üzerine sabitlenen kesitleri 33 milimetrelik plastik bir kaba aktarın. Hazırlığı kömürdiseksiyon çözeltisine batırın ve her bir kabı sürekli olarak oksijenlenen karanlık bir kutuda saklayın. Patch clamp kayıtları için.Profüzyon tüplerini aims medyumu ile doldurun ve borulardaki tüm hava kabarcıklarının geçmesini bekleyin. Cam polar kullanarak kayıt pipetlerini hazırladıktan sonra, ucu pipet solüsyonu ile geri doldurun. Ardından, bir mikro pipet doldurucu kullanarak pipetin yaklaşık üçte birini doldurun; doldurulan her pipeti nemli bir pipet kutusunda saklayın.Ardından, bilgisayar, amplifikatör, CCD kamera ve karanlık koşullarda çalışan mikroskop dahil olmak üzere patch plant kayıtları için kullanılan ekipmanları açın. Kızılötesi görüntüleyici yardımıyla bir retinal kesit preparatını mikroskop tablasına yerleştirin. Preparat sabitlendikten sonra sürekli perfüzyona başlayın.Perfüzyon sıcaklığını 33 ile 37 °C arasına ayarlayın. Kesit yüzeyini bir CCD kamera ile görüntüleyin. Hedef konuma odaklanın.Hedef hücre tipleri belirlendiğinde, patch clamp kaydı için sağlıklı görünümlü bir hücre seçin. Sağlıklı bir hücre tanımlandıktan sonra, bir kayıt pipetini pipet tutucuya yerleştirin ve pipeti kesit preparatına doğru ilerletin. Pipet, kesit preparatına yaklaştığında, mikroskop yardımıyla pipetin ucunu bulun.Pipet ucu mikroskop altında görünür olduğunda, ucu hedef hücreye doğru aşağı hareket ettirin. Ardından, amplifikatörü ayarlayın ve pipeti pika amp. Nana amp başına beş volt olarak düzenleyin.Yaklaşık beş milivolt ve yaklaşık 10 hertz değerinde sürekli bir elektrik darbesi başlatın ve pipet direncini kontrol edin. İdeal direnç, çoğu retinal nöron için beş ile 12 mega ohm arasındadır.Hazır olduğunuzda, pipet ucunu hedef hücrenin yüzeyine getirene kadar dahili solüsyonu dışarı üflemek için bir ağızlık veya şırınga kullanın. Pozitif basınç hücre yüzeyinde küçük bir çöküntü oluşturduğunda, ucu hafifçe ilerletin ve üflemeyi durdurun. Pipet direnci sürekli olarak artıyorsa, olduğu gibi bırakın ve direnç bir giga ohm'un üzerine çıkana kadar izleyin.Direnç kendiliğinden artmazsa, giga sızdırmazlık (giga seal) oluşana kadar nazikçe negatif basınç uygulayın. Giga sızdırmazlık sağlandıktan sonra, tutma potansiyelini negatif 70 millivolt olarak değiştirin ve ardından pipet ucu içindeki membranı yırtmak için aralıklı olarak negatif basınç uygulayın. Tüm hücre konfigürasyonu oluşturulduğunda, pipet direnci 500 mega ohms ile bir giga ohm arasında olabilir ve kapasitif akım gözlemlenebilir.IV ilişkisini -80 ile 40 milivolt arasında kaydedin. Hücre tipine bağlı olarak farklı voltaj kapılı kanal türleri aktive olacaktır. Son olarak, ışıkla uyarılan sinaptik akımları veya voltajları kaydedin.10 x büyütmede incelenen bu kesit hazırlığı, filtre kağıdından herhangi bir ayrılma olmaksızın hem fotoreseptörleri hem de ganglion hücrelerini göstermektedir. Bu hazırlık 60 x objektif ile incelendiğinde, her bir hücre tabakası net bir şekilde gözlemlenmektedir. Basamaklı ışık uyarısına yanıt olarak retinal nöronlardan ışıkla tetiklenen eksitatör postsinaptik potansiyeller indüklenmiştir.Pik genliği ve sönümlenme süresi, hücre tipine ve alt tipine göre değişiklik gösterir. Hücre tipi ve morfolojik alt tipi, fizyolojik kayıtların geliştirilmesinin ardından kükürt işaretlemesi ile belirlenmiştir. Bu teknik, retina araştırmaları alanındaki bilim insanlarının doğal görsel sinyalleşmenin fonksiyonlarının yanı sıra sinaptik mekanizmaların katkılarını incelemelerinin yolunu açmıştır.

recording-light-evoked-postsynaptic-responses-neurons-dark-adapted

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video su kaplan semender retina dilim tam hücreli gerilim kelepçe kayıtları süreci gösterir. Biz yanı sıra retinanın görsel uyarılma sırasında yama kelepçe kayıtları gerçekleştirmek için nasıl dilim hazırlık göstermektedir.

Işık tam hücreli Kayıtlar Retina Dilim Uyarıcı Synaptic Akımlar Uyarılmış

İşte biz elektrofizyolojik kayıtlar için fare retina karanlık adapte dilim üretmek için bir prosedür açıklanmaktadır.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Bu makale, fare izole retinal hazırlanması incelemek ve kaydetmek için nasıl bir açıklama sağlar. Özellikle, floresan etiketli ganglion hücre popülasyonu ışık yanıtlarını kaydetmek ve daha sonra belirlemek ve morfolojisi analiz nasıl açıklar.

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

Biz sağlam fare retinadan çubuk ve koni photoresponses elde etmek için transretinal elektroretinogram (ERG) kayıtları nispeten basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşım ışığında cevaplar ayırmak ve izole düz monte retina arasında yer alan elektrotlar kullanarak bunları kaydetmek için fotoreseptör gelen sinaptik iletim bloğu yararlanır.

Fare Retina gelen Transretinal ERG Kayıtlar: Rod ve Koni Photoresponses

Bu video, düz montajlı bir fare retinasından elektrofizyolojik kayıt için tam hücre yama kelepçesi tekniğini göstermektedir. Retina içindeki yıldız patlaması amakrin hücrelerine (SAC'ler) yaklaşmak için elektrotlu ince bir cam pipet kullanılır. Bir conta oluşturduktan sonra, zarı yırtmak ve tüm hücre yama-kelepçe konfigürasyonunu oluşturmak için emme uygulanır. Son olarak, iyonların SAC sinaptik reseptörlerinden akışı konfigürasyon kullanılarak ölçülür.

Düz Montajlı Bir Fare Retinasından Elektrofizyolojik Kayıt için Tam Hücre Yama Kelepçesi Oluşturma

Video, transfekte edilmiş bir fare hipokampal beyin dilimindeki sinaptik etkileşimleri ve nöronal tepkileri incelemek için bir protokol göstermektedir. Aksiyon potansiyellerini tetiklemek için uzun menzilli duyusal nöronların aydınlatılmasını ve elde edilen uyarıcı post-sinaptik potansiyellerin tüm hücre yama-kelepçe tekniği kullanılarak kaydedilen nöronda kaydedilmesini içerir.

Fare hipokampal dilimlerindeki nöronların fotostimülasyon ve tam hücre yama kelepçesi kayıtları

Bu video, karanlığa uyarlanmış bir fare retina dokusu dilimi hazırlığında ışıkla uyarılan post-sinaptik yanıtların kaydını göstermektedir. Retina dilimi bir kayıt odasına yerleştirilir ve bir retinal ganglion hücresi ile elektriksel süreklilik sağlamak için bir kayıt pipeti kullanılır. Pipet tarafından kaydedilen ganglion hücrelerinde uyarıcı post-sinaptik potansiyeller oluşturmak için ışık darbeleri uygulanır.

Fare Retina Dilimlerinin Nöronlarında Işık Uyarılmış Postsinaptik Yanıtlar

Biz su kaplan semender (gelen ince retina dilim hazırlanması...

Bir Amfibi Retina Dilim hazırlanması Fotoreseptörler ve İkinci dereceden nöronlar eş zamanlı tam hücreli Kayıtlar

Bu protokol, düz monte hazırlık retina nöronlar üzerinde tüm hücre yama kelepçe kayıt yapmak gösterilmiştir.

Deafferentated Fare Retina bir düz montaj Hazırlık patlaması amacrine hücreleri Yama Kelepçe Kaydı

Biz retina yüzeyine paralel kesit düzlemi ile erişkin memeli retina yatay dilim hazırlık geliştirdi. nonradially odaklı retinal nöronların dendritik alanları patch-kelepçe ve görüntüleme teknikleri ile sinyal işleme çalışma izin kesilmiş değil.

Elektrofizyolojik Çalışmalar Yetişkin Fare Retina Yatay Dilimleri hazırlanması

Bu yazıda, Xenopus laevis Kurbağa yavrularını retinotectal devre eğitim için tüm cep telefonu yama kelepçe kaydetmek için kullanılan üç beyin hazırlıkları görüşmek. Kendi belirli avantajları ile her hazırlık Xenopus iribaş deneysel tractability nöral devre işlevi incelemek için bir model olarak katkıda bulunmaktadır.

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

Keşfedin fare retinası dilim hazırlığı ve kayıt patch kelepçe teknikleriyle nöronlarda ışık-uyarılmış postsinaptik yanıtları inceleme yöntemini. Bu teknik retinal fizyoloji araştırmaları için hassas elektrofizyolojik ölçümler sağlar.

Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış (Video) | JoVE Journal

Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

Daha fazla video keşfet