Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

Bu deneyin genel amacı, karanlığa adapte olmuş retinal nöronlardan ışık tepkisi kayıtları elde etmektir. Bu, önce bir fare gözünün hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, retinayı izole etmek ve dilim hazırlıkları için kesmektir.

Daha sonra, retina preparasyonu monte edilir ve yama kelepçesi kayıtları için bir hedef hücre bulmak üzere bir mikroskopta görüntülenir. Bir tam hücre yama kelepçesi konfigürasyonu oluşturulduktan sonra, hücrenin yakınında bir ışık uyarısı uygulanır. Son olarak, edinim yazılımı aracılığıyla eşzamanlı elektrofizyolojik yanıt gözlemlenebilir.

KRC görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre bu tekniğin en büyük avantajı, kayıt hassasiyetinin yüksek olması ve kayıt hücrelerinin morfolojik olarak tanımlanabilmesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edeceklerdir çünkü zifiri karanlıkta çalışmak, alışkın olmayanlar için zor ve kafa karıştırıcı olabilir. Bir seriye başlamak için, diseksiyon aletleri ve transfer pipetleri diseksiyon mikroskobunun yakınına koyun.

Çalışma alanı, her bir alete karanlıkta kolayca erişilebilecek şekilde iyi organize edilecektir. Hazır olduğunuzda, prosedürü karanlıkta yürütmek için bir kızılötesi görüntüleyici oluşturun. Ötenaziden sonra hızlı bir şekilde gözleri çekirdeklendirin ve mikroskop altında çalışan karanlık bir kutuda tutulan soğuk diseksiyon solüsyonu kabına yerleştirin.

Bir gözü soğuk diseksiyon çözeltisi ile bir tabağa aktarın. Sürekli oksijenle köpürür. Korneayı ve lensi çıkarmak için, optik siniri hareket etmesini önlemek için göz küresinin diğer ucunda tutun ve mikrocerrahi bir bıçakla korneanın üst kısmında bir kesi yapın.

Bir çift cerrahi makas kullanarak kesiği uzatın ve korneayı çıkarın, etrafını saran bir miktar sklera bırakın. Ardından, lensi ince forseps ile tutun ve yavaşça dışarı çekin. Göz kabı yapıldıktan sonra, küçük bir transfer pipeti ile soğuk oksijenli diseksiyon solüsyonunu göz kabına nazikçe dökün.

Retinanın şeklini korumak için hızlı bir şekilde çalışın ve retinanın dorsal ve ventral taraflarını belirlemek için hafif bir baskı uygulayın. Optik sinir başının yanından geçen retinal göz kabı boyunca uzanan çizgiyi belirlemek için kızılötesi görüntüleyiciler kullanın. Bu çizgi çoğunlukla optik sinirin ventral tarafından geçer ve optik sinirin de dahil olduğu taraf dorsal taraftır.

Deneye bağlı olarak, ventral veya dorsal tarafta bir kesim yapın. Bu, gereksiz tarafı işaretler ve ilerlemek için yararlı bir işarettir. Ardından, retinaya dokunmadan vitreusu ekstra ince forseps ile nazikçe çıkarın.

Vitreus esas olarak göz kabının altına ve dış kenarına tutturulur. Vitreus göz kabına sıkıca tutturulabileceğinden, retina dekolmanı gidermek için yavaşça ilerleyin. Gerginlik hissedilmeyene kadar çekmeye devam edin.

Retina izole edildikten sonra, sklerayı tutun ve retinayı nazikçe soyun. Forsepsin arka tarafını kullanarak retinayı kesin ve gereksiz yarısını aynı plastik tabağa atın. Kalan retinayı her parça için iki parçaya kesin.

Bir retina levhası yapmak için kenarları kesin ve katlanan kenarları kesin. Ardından, bir retina levhasını bir cam plakaya aktarmak için büyük bir transfer pipeti kullanın. Fazla çözeltiyi küçük bir pipetle emdirin ve levhayı düzleştirmek için bir parça filtre kağıdı kullanın.

Filtre zarının bir parçasını küçük bir transfer pipeti kullanarak dokunun üzerine nazikçe yerleştirin. Filtre membranına bir damla diseksiyon solüsyonu yerleştirin. Solüsyon yayılırken ve retina dokusunu filtre membranına yapıştırırken yaklaşık 15 saniye bekleyin.

Birbirine yapıştıktan sonra, zar yüzene kadar filtrenin altına ve etrafına daha fazla soğuk diseksiyon solüsyonu dökün. Daha sonra, filtre membranını dilimleme haznesine yerleştirin ve diseksiyon çözeltisi ile örtün. Zarın kurumamasını sağlamak için hızlı bir şekilde çalışarak, retina dokusunu dilimler halinde kesmek için doğrayıcıyı kullanın.

Dilimleme haznesine yağ raylı plastik bir kapak fişi yerleştirin. Yağ raylarının üzerine bir retinal dilim aktarın ve enine kesit görünecek şekilde dilimi 90 derece döndürün. Filtre kağıdının kenarlarını gresle kaplamadan önce filtre membranını kapak sürgüsünün üzerine bastırın.

Dilimler plastik bir kapak kızağı üzerinde hareketsiz hale getirildikten sonra 33 milimetrelik plastik bir kaba aktarın. Hazırlığı kömür diseksiyon solüsyonu ile daldırın ve her bir tabağı sürekli oksijenli karanlık bir kutuda saklayın. Yama kelepçesi kayıtları için.

Füzyon tüplerini hedef ortamı ile doldurun ve tüm kabarcıkların tüpten geçmesine izin verin. Cam polar ile kayıt pipetleri yaptıktan sonra, ucu pipet solüsyonu ile doldurun. Ardından, pipetin yaklaşık üçte birini doldurmak için bir mikro pipet dolgusu kullanın, doldurulduktan sonra her pipeti nemli bir pipet kutusunda saklayın.

Ardından, karanlık koşullarda çalışan bilgisayar amplifikatörü, CCD kamera ve mikroskop da dahil olmak üzere, yama tesisi kayıtları için ekipmanı açın. Kızılötesi görüntüleyici yardımıyla mikroskop tablasına bir retina dilimi hazırlığı yerleştirin. İmmobilize olduktan sonra sürekli perfüzyona başlayın.

Perfüzyon sıcaklığını 33 ila 37 santigrat dereceye ayarlayın. Dilim yüzeyini bir CCD kamera ile görüntüleyin. Hedef konuma odaklanın.

Hedef hücre tipleri bulunurken, bir yama klat kaydı için sağlıklı görünen bir hücre seçin. Sağlıklı bir hücre tanımlandıktan sonra, bir pipet tutucusuna bir kayıt pipeti yerleştirin ve pipeti dilim hazırlığına ilerletin. Dilim hazırlığına yakın olduğunda, mikroskop ile pipetin ucunu bulun.

Pipet ucu mikroskop altında göründüğünde, ucu hedef hücreye doğru aşağı doğru hareket ettirin. Ardından, amplifikatörü ayarlayın ve pipeti pika amp'te ayarlayın. Nana amfisi başına beş volt.

Yaklaşık beş milivolt ve yaklaşık 10 hertz'lik sürekli bir elektrik darbesi başlatın ve pipet direncini kontrol edin. İdeal bir direnç beş ila 12 mega ohm arasındadır. Çoğu retina nöronu için.

Hazır olduğunuzda, pipetin ucu hedef hücrenin yüzeyine gelene kadar iç solüsyonu üflemek için bir ağızlık veya şırınga kullanın. Pozitif basınç hücre yüzeyinde küçük bir çukur oluşturduğunda, ucu hafifçe ilerletin ve üflemeyi durdurun. Pipet direnci sürekli artıyorsa, bırakın ve direnci bir giga ohm'dan daha büyük olana kadar izleyin.

Direnç kendiliğinden artmazsa, giga conta haline gelene kadar hafifçe negatif basınç uygulayın. Giga sızdırmazlık elde edildikten sonra, tutma potansiyelini negatif 70 milivolt olarak değiştirin ve ardından pipet ucunun içindeki zarı yırtmak için aralıklı olarak negatif basınç uygulayın. Tüm hücre konfigürasyonu yapıldığında, pipet direnci 500 mega ohm ile bir giga ohm arasında olabilir ve kapasitif akım gözlemlenebilir.

IV ilişkisini negatif 80 ila 40 milivolt arasında kaydedin. Hücre tipine bağlı olarak farklı voltaj kapılı kanal türleri etkinleştirilecektir. Son olarak, ışıkla uyarılmış sinaptik akımları veya voltajları kaydedin.

10 x'te görüntülenen bu dilim hazırlığı, filtre kağıdından ayrılmadan hem fotoreseptörleri hem de ganglion hücrelerini gösterir. Bu hazırlık 60 x objektif ile görüntülendiğinde, her hücre katmanı net bir şekilde gözlemlenir. Retinal nöronlardan gelen ışıkla uyarılmış uyarıcı postsinaptik potansiyeller, bir adım ışığına yanıt olarak uyarıldı.

Tepe genliği ve bozunma süresi, hücre tipine ve alt tipine bağlı olarak değişir. Hücre tipi ve morfolojik alt tipi, gelişiminin ardından fizyolojik kayıtlardan sonra kükürt etiketlemesi ile ortaya çıkarılmıştır. Bu teknik, retina araştırmaları alanındaki bilim adamlarının doğal görsel sinyallemenin işlevlerini ve sinaptik mekanizmaların katkılarını incelemelerinin yolunu açtı.