Name: LC-MS / MS kullanarak Kurutulmuş Kan Spotlar Immünosupresan Tacrolimus Niceleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Öğrenin kurutulmuş kan spotlarında LC-MS/MS ile takrolimus nicelendirmesini. Bu yöntem, organ nakli hastalarında immünosupresan izlemini minimal invaziv örnekleme ile kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Amerika Birleşik Devletleri Federal İlaç Dairesi (FDA) sözleşmeli HHSF223201310224C ve Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri/FDA hibesi 1U01FD004573-01 tarafından desteklenmiştir.

Sağlıklı bireylerden de tanımlanan kan örnekleri Colorado Hastanesi University (Aurora, Colorado) satın alındı. Validasyon çalışmalarına yanı sıra kalibratör ve kalite kontrol örneklerinin hazırlanması için de tanımlanan kan bankası örneklerinin kullanılması Colorado Çok kurumsal Değerlendirme Kurulu (COMIRB, Aurora) tarafından &quot;muaf&quot; olarak kabul edildi. Kaynaklar ve Çözümleri 1. Hazırlık <ol><li> Satınalma takrolimus ve iç standart D 2, Malzeme Listesi&#39;nde belirtilen satıcılardan 13C-takrolimus. <ol><li> Takrolimus için 1 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyonda ve D 2 10 ug / ml, 13 C-takrolimusun bir konsantrasyonda saf metanol içinde stok çözelti hazırlayın. Üç bağımsız ağırlıkları dayalı referans malzemelerin stok çözümleri olun. Kısım stok çözeltileri ve mağaza -70 ° C veya altında. </li></ol></li><li> Proteinlerini çökeltmek için çözeltisi hazırlayın(: 3 h: 7 hacim) ve su içinde metanol / 0,2 M ZnSO 4 kullanılarak takrolimus ekstrakte edin. Bu çözüm aynı zamanda, iç standart D 2, 2.5 ng / ml arasında bir konsantrasyonda 13 C-takrolimus ihtiva eder ve boş numune ekstre haricinde tüm örnekler, (1.3.3 bakınız) bir çıkarma işlemi için kullanılmıştır. <ol><li> Her çıkarma gününde taze bu proteinin yağış çözüm hazırlayın ve 12 saatte çözümün bitiminden ayarlayın. </li></ol></li><li> Kalibrasyon eğrisi ve kalite kontrol (QC) numuneleri hazırlanması <ol><li> Saf metanol kullanılarak stok çözeltisinin uygun seyreltiler gerçekleştirerek takrolimusun stok çözelti hazırlayın. </li><li> , Kalibratörler ve kalite kontrol örnekleri hazırlamak EDTA tam kana uygun şekilde seyreltilmiş stok çözeltisi 20 ul başak için, 20 dakika karıştırıldı ve kısım için hücresel kan bileşenlerine takrolimusun homojen bir dağılım sağlamak için bir su banyosu içinde nazik çalkalama altında 37 ° C&#39;de inkübe 1.5 ml polip içinekonik dipli ropylene tüpler ve geçmeli kapaklar. Organik çözücünün nispi hacmi 5% aşmamaktadır emin olun. </li><li> Nokta bir pipet kullanarak filtre kartlarında her dairenin ortasına çivili tam kan 50 ul. </li><li> 3 saat boyunca oda sıcaklığında filtre kartları kan lekeleri kurutun. </li><li> 1, 2.5, 5, 10, 25 ve 50 ng / ml takrolimus konsantrasyonlarında insan EDTA tam kandaki takrolimus kalibrasyon standartları hazırlayın. Iç standart D 2, 13 C-takrolimusu (&quot;sıfır örnek&quot;) içeren protein yağış çözelti ile kalibrasyon standartları gibi çıkarılması için boş bir örneği hazırlayın. </li><li> 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml konsantrasyonlarda insan EDTA tam kandaki QC örnekleri hazırlanır. Boş bir örnek hazırlayın. İç standart D 2 ihtiva eden çökeltme ile ekstre edilmiştir QC örneklerinin aksine, 13 C-takrolimus yapar protein çökeltme çözeltisi ile boş bir numunesi alıriç standart D 2, 13 C-takrolimusu (&quot;boş örneği&quot;) içermez. </li></ol></li><li> Klinik örneklerin toplanması <ol><li> 43,44 açıklandığı gibi kurutulmuş kan lekeleri toplayın. </li></ol></li></ol> 2. Tacrolimus Ekstraksiyon Kurutulmuş Kan Noktası Örnekleri <ol><li> Görme kabul edilebilir örnek kalitesini ve hacmini 45 sağlamak için kurutulmuş kan nokta kontrol edin. </li><li> 6 mm delik yumruk ile filtre kartındaki kan spot Punch merkezi. Not: zımbaların kalitesi tartılarak izlenebilir. Bir delikli doymuş filtre diski 0.09 mg (: 4.83- 5.14 mg, n = 12 aralık) ortalama ± 5.02 mg ağırlığındadır. </li><li> Konik alt ve geçmeli kapaklı, 1.5 ml polipropilen tüpler içine yerleştirin diskler. </li><li> Her tüpe 20-30 mermi ekleyin. </li><li> Her tüpe (2.5 ng / ml dahili standart v: 0,2 M ZnSO 4, 7: 3, hac metanol) bir protein çökeltme çözeltisinin 500 ul ekle. Extr içinBoş numunelerin eylem iç standart olmadan protein yağış çözümü kullanın. </li><li> (&quot;10&quot; ayarı, maksimum hızı) 1 dakika için mermi blender Diskleri homojenize. </li><li> 10 dakika boyunca (&quot;10&quot; ayarı, maksimum hızı) çoklu tüp vorteks üzerinde oda sıcaklığında örnekleri çalkalayın. </li><li> Santrifüj örnekleri 16.000 x g&#39;de 10 dakika süreyle 4 ° C &#39;de. </li><li> 300 ul eki ile donatılmış cam HPLC şişe içine süpernatantlar aktarın. Ön yarık teflon contaları kullanın. Not: Çıkarılan numuneler -20 ° C&#39;de ya da altında LC-MS / MS analizi kadar depolanabilir. </li></ol> 3. LC-MS / MS Analizi <ol><li> Yük 100 C8 kartuşu ekstraksiyon kolonuna ekstre numunenin süpernatant ul ve 7 ile yıkayın: su içinde% 0.1 formik asit: 3 oranında 5 ml &#39;lik bir akış hızında asetonitril / dk, 1 dakika boyunca. Sviçleme vana bağlantılar Şekil 2 de gösterilmiştir ve gradyan Tablo 1 &#39;de çekme pompası ile işletilen </st&gt; Rong. </li><li> Ahiret, analitik kolona öncesi sütundan Analitlerin geri gömme sonuçlanan anahtarlama valfi etkinleştirin. </li><li> 65 ° C kolon termostatı ayarlayın. </li><li> Tablo 1 &#39;de gösterilen akış oranları ve gradyanı kullanılarak, analitik sütundan analitlerin Zehir. </li><li> Turbo elektrosprey iyonizasyon kaynağı üzerinden tandem kütle spektrometresi analitik sütun bağlayın. Tablo 2&#39;ye göre kütle spektrometresi önemli parametreleri ayarlayın. </li><li> Birden çok reaksiyon modu (MRM) pozitif iyonları ([M + Na] +) algılar. Ölçümü için, aşağıdaki iyon geçişler kullanın: takrolimus: m / z (kütle / şarj) = 826.6 616.2 ve D2, 13 C-takrolimus →: m / z = 619.2 → 829.6. Not: Toplam çalışma süresi 4.6 dakikadır. </li></ol> 4. sayısallaştırılması <ol><li> Her bir çalışma için 1.3.5 ve hazırlanan kalibratörler göre bir kalibrasyon eğrisi oluşturmakHer analitik vadede sayılabilir. <ol><li> Kütle spektrometresi yazılımını kullanarak (Tepe Alanı [analit] / Tepe Alanı [internal standart]) analitin tepki faktörü karşısında, nominal konsantrasyonları çizilerek bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. </li><li> 1 / X ağırlığı ile bir arada bir ikinci dereceden bir montajı kullanarak kalibratörler monte edin. </li></ol></li><li> Kurumuş kan lekelerinde miktar takrolimus ayıklanır MRM Kromatogramlarda takrolimusu ve iç standart doruklarına entegre. Takrolimus için tepki faktörü (Tepe Alanı [analit] / Tepe Area [internal standart]) hesaplayın ve kütle spektrometresi yazılımını kullanarak kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırın. </li></ol> 5. Doğrulama Prosedürleri <ol><li> Algılama (LLOD) alt sınırı ve miktar (LLOQ) alt sınırı. <ol><li> Algılama (LLOD) alt limit olarak 1: 4 bir zirve-gürültü oranı ile en düşük takrolimus konsantrasyonu düşünün. Olarak kantitatif (LLOQ) alt limitini tanımlareşit ya da nominal konsantrasyon ve eşit veya daha iyi% 20 hassasiyet (varyans katsayısı) için ±% 20 sapma daha iyi bir hassasiyetle, kalibrasyon eğrisinin en düşük konsantrasyon. </li></ol></li><li> Içi ve günler arası doğruluk ve kesinliklerini. <ol><li> 2 ng / ml (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) ve 40 ng / ml (QC4) dört konsantrasyon seviyelerinde doğruluğu ve hassasiyeti test edin. </li><li> Insan EDTA tam kan, her doğrulama gününde QC örnekleri hazırlamak filtre kartları, özü kuru ve yukarıda tarif edildiği gibi analiz edin. </li><li> QC konsantrasyon seviyesi başına 6 örnekleri ile gün içi doğruluk ve hassasiyet belirleyin. </li><li> 20 gün boyunca günler arası doğruluk ve hassasiyet değerlendirin. 4 örneklerin her gün her QC düzeyini ölçün. </li><li> Her gün QC örnekleri ile birlikte iki kalibrasyon eğrileri analiz edin. </li><li> Nominal konsantrasyon (% konsantrasyon seviyesi başına altı numune, 5.2.2 bakınız) olarak gün içi doğruluğu hesaplayın. Kireçvaryans (% CV) katsayısı olarak ulate hassas. </li><li> Kabul Nominal konsantrasyon% 85 ila% 115 sınırlar içine düşerse gün içi doğruluğu kabul edilebilir düşünün. O% 15 CV (varyans katsayısı) eşit veya daha kabul edilebilir ise gün içi hassasiyet düşünün. </li><li> 20 doğrulama gün içinde analiz her QC konsantrasyon seviyesi için ortalama olarak günler arası doğruluk ve hassasiyet hesaplayın. </li><li> Kabul Nominal konsantrasyon% 85 ila% 115 sınırlar içine düşerse ortalama arası günlük doğruluğu kabul edilebilir düşünün. O% 15 CV (varyans katsayısı) eşit veya daha kabul edilebilir olmadığını arası günlük hassasiyet düşünün. </li></ol></li><li> Matris müdahalelerden dışlama. <ol><li> Matris sinyalleri neden olabilir etkileşimler dışlanması için, boş kurutulmuş kan lekeleri (8 farklı bireyler, tercihen 4 erkek ve 4 kadın) analiz. </li><li> Görme iyon kromatogramlar kontrol edin. Eğer tutma süresi olan tepe değeritakrolimus pencere LLOQ de takrolimusla çivili entegre ve boş örneklerinde takrolimus zirveleri olanlar ile eğrinin altında kalan alanlarını karşılaştırmak, tespit edilir. Boş örneklerinde piklerin alanı LLOQ de takrolimus olanların% 15&#39;ini gerekiyordu değildir. </li></ol></li><li> İyon bastırma / iyon geliştirme. <ol><li> Ko salınımlı matris bileşenleri nedeniyle iyon bastırma / iyon artışının potansiyel bir girişimi değerlendirmek için 45 anlatıldığı gibi bir post-kolon infüzyon protokolü kullanın. </li><li> % 0.1 formik asit içinde çözülmüş 10 mg / ml arasında bir konsantrasyonda, takrolimusu infüze: metanol (30:70, v / v) sütun sonrası 10 ul / dk&#39;lık bir hızda doldurulur. <ol><li> Analitik kolon ve elektrosprey kütle spektrometresi kaynağı arasında T parçası ile bir şırınga pompası bağlayın. </li><li> Takrolimus için MRM geçişleri MS / MS sinyal yoğunluğu Monitör ve iç standart (m / z = 616.2 m / z = 829,6 → 619,2 → 826,6) Extrac enjeksiyonundan sonrated boş örnekleri (n = farklı bireylerden 8 örnek). Not: İyon-bastırma-sinyali ve iyon geliştirme bir zirve bir daldırma neden olurken iyon bastırılması / iyon geliştirme yokluğunda analitlerin infüzyon neden olduğu, sürekli sinyal boş matris enjeksiyonu ile etkilenmemelidir. </li></ol></li></ol></li><li> Devam etmek. <ol><li> En yüksek kalibratörlerinin sonra boş örnekleri ekstre analiz ederek olası carry-over değerlendirin (50 ng / ml, n = 6). </li><li> Görme iyon kromatogramlar kontrol edin. Takrolimusun tutulma süresi penceresi içinde doruklarına tespit edilirse, LLOQ de takrolimusla çivili entegre ve boş örneklerinde takrolimus zirveleri olanlar ile eğrinin altında alanlarını karşılaştırır. Boş örneklerinde piklerin alanı LLOQ de takrolimus olanların% 15&#39;ini gerekiyordu değildir. </li></ol></li><li> Ekstraksiyon kazanımları. <ol><li> QC sam çıkarıldığı sonra Analitlerin sinyalleri karşılaştırarak geri kazanımlar belirlemeples boş kurutulmuş kan lekeleri olanlar ile dört konsantrasyon seviyeleri (n = konsantrasyon başına 6) de ekstraksiyonu sonrası takrolimusun gelen miktarda çivili. </li><li> QCS dört set (: 2, 4, 20, 40 ng / ml konsantrasyon seviyelerini) hazırlayın. </li><li> Filtre kağıdı kartları üzerine boş olarak EDTA tam kan 50 ul tespit ve 2 saat süre ile kurutulması &quot;bir geri kazanım test örnekleri&quot; karşılık gelen bir 4 setleri hazırlayın. </li><li> Bundan sonra, QC ve boş &quot;Kurtarma test örnekleri&quot; hem makasla filtre kartında tüm kan nokta kesip konik alt ve geçmeli kapaklı bir polipropilen tüp içine sonuçlanan diskleri yerleştirin. </li><li> Tüm örnekler ayıklayın. </li><li> Cam HPLC şişe içine süpernatantlar (400 ul) aktarın. </li><li> 2, 4, 20 ve 40 ng / ml (200, 400, 2000, 4000 ng / ml stok çözeltisi, takrolimus 4 ul konsantrasyonları elde etmek için boş bir &quot;ekstre geri test örnekleri&quot; olarak takrolimus stok solüsyonu ekleyinsüpernatan 400 ul) ile utions. </li><li> LC-MS / MS analizinden sonra, QC örneklerinin ve ilgili konsantrasyon &quot;Kurtarma test örnekleri&quot; hem sinyalleri karşılaştırmak (ekstraksiyon / sinyal örnekleri çıkarma x 100 sonra çivili önce kurtarma% = sinyal örnekleri çivili). </li></ol></li><li> Sulandırma bütünlüğü. <ol><li> Kullanılarak seyreltme bütünlüğü kurmak örnekler, 500, 250 ve 100 ng / ml&#39;de analit ile çivili. </li><li> Ekstraksiyon işleminden sonra, protein, bir çökeltme çözeltisi kullanarak örnekleri seyreltik (1:10, n = 3 konsantrasyon düzeyinde başına). </li><li> Nominal konsantrasyonlarda sapmaları hesaplayın. % 85 içinde anma kabul edilebilir bir -115% düşüş sonuçları düşünün. </li></ol></li><li> Kararlılıkları. <ol><li> Dört konsantrasyon seviyelerinde (n = konsantrasyon başına 4), farklı zaman noktalarında ve farklı depolama şartları altında analiz de QC örnekleri kullanarak stabiliteleri araştırılması. </li><li> Nominal değerleri ile depolandıktan sonra sonuçları karşılaştırın. R düşünün% 85 içinde anma kabul edilebilir bir -115% düşüş sonuçları · Borçlar. </li><li> 4 ° C, -20 ° C de 1 ay ve -80 ° C de 1 ay 1 hafta çevre sıcaklığında 1 hafta Örnek stabilitesini oluşturulması. </li><li> Üç döngü üzerinde test donma-çözülme stabilitesi (-20 ° C). 4 ° C&#39;ye ayarlanır termostatlı bir otomatik numune alıcı içinde numuneler yerleştirilerek test ekstre numune ve otomatik numune stabilitesi. 72 saat sonra numune enjekte edilir. </li></ol></li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Anılan olarak, kurutulmuş kan lekeleri dayalı terapötik ilaç ve takrolimus bağlılık izlenmesi kavramı çekici rağmen, genellikle venöz EDTA tam kan örneklerinde takrolimus LC-MS / MS analizi ile ilişkili ötesinde analitik zorluklar vardır. Bunlar arasında, ancak matris Burada kullanılan filtre kart malzemeyi ve düşük kan hacmi (20 ul) pamuk linterleri malzemesi içine batırılmış kapiler tam kan olması, bunlarla sınırlı değildir. Bununla birlikte, merkezi bir laboratuarda yüksek verimlilik analizi, güçlü bir spesifik ve so...

Takrolimus makrolid yapısına 8, bir (Şekil 1) güçlü bir immonosuppressant 1-7. 653 g / L, etanol: - cis nedeniyle CN bağların trans izomerizm de ters fazlı yüksek-performanslı sıvı kromatografisi ile ayrılabilmektedir çözelti 9 iki rotamerden oluşturur (HPLC) Takrolimus alkoller (metanol, lipofilik ve çözünür olan 355 g / L), halojenlenmiş hidrokarbonlar (kloroform: 573 g / L) ve eter. . 0.1 g / L ve su (pH 3: Bu alifatik hidrokarbonların (heksan içinde yavaş yavaş çözülür. Molekülü herhangi bir kromoforu ve UV-emme fazla içermez 9 0.0047 g / L) kalsinörinin önlenmesi ile 192 nm Takrolimus davranır . Etki mekanizması referanslar 10,11 gözden geçirilmiştir. Şu anda Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde 12 katı organ nakli hastalarının% 80&#39;inden fazlasında kullanılmaktadır. Takrolimusun terapötik indeksi olan considered 13 dar olması. Buna ek olarak, takrolimus dozu ve kan konsantrasyonları arasındaki ilişki zayıf ve farmakokinetik 14,15 değişkendir. Transplant hastalarında takrolimus dozu rehberlik Terapötik ilaç izleme, bu nedenle genel klinik pratikte 16-20 olduğunu. Hedef, bir önceden belirlenmiş terapötik aralıkta takrolimus kan konsantrasyonlarını tutmaktır. Terapötik pencere üzerindeki konsantrasyonlar aşırı bağışıklık bastırma, kanser ve nefrotoksisite, nörotoksisite, hipertansiyon ve diyabet gibi toksisite için riskini arttırdığı da terapötik aralığının altında Takrolimus kan konsantrasyonları, kronik veya akut allo-bağışıklık reaksiyonlarının aktivitesinde artış ile sonuçlanabilir. Takrolimus Yüksek farmakokinetik içi bireysel değişkenlik nakli ve organ hasta sağkalımı 21,22 hem zararlı olabilir. Takrolimus farmakokinetik bireylerarası yüksek değişkenlik esas olarak CYP3A5 polimorfizmleri, içi birey için nedenlerden kaynaklanan ikendeğişkenliği arasında, ancak, ilaç-ilaç, hastalığa ilaç ve besin ile-ilaç etkileşimleri 14,15 bunlarla sınırlı değildir. Ayrıca immünosupressif terapötik ilaç rejimine bağlılık eksikliği katkıda bulunan bir faktör ve greft kaybı 23,24 için önemli bir nedenidir. Bu düşünceler sık ​​sık ev terapötik ilaç ve takrolimus tam kan konsantrasyonlarının izlenmesi bağlılık hastalar her zaman istenen terapötik pencere içindeki takrolimus maruziyetini sahip olmasını sağlamak için yararlı olabileceğini düşündürmektedir. Ancak, şu anki klinik uygulama 15 engelleyici lojistik ve daha sık terapötik ilaç izleme maliyeti olarak. Bunun nedenlerinden biri hasta flebotomist çizilmiş gereken venöz kan örneği var görmek olmasıdır. Kurutulmuş kan lekeleri son zamanlarda cazip bir kavram 25-28 olarak ortaya çıkmıştır. Hastayı sopa basit bir parmağı sonra özel bir filtre kağıdı kartında ve kan nokta d sonra bir kan damlası toplarried, bu takrolimus analizi ve hasta şu anda çekici olabilir diğer herhangi bir immünosupresan için merkezi laboratuara gönderilecek edilebilir. Bu, kurutuldu kan lekeleri (kan, tipik olarak 20 ul) 25,29-43 olarak, çok küçük kan hacminde takrolimus ve diğer bağışıklık bastırıcı maddelerin miktar tayini için son derece hassas ve spesifik LC-MS / MS testlerin geliştirilmesi mümkün hale gelmiştir. Diğer bir avantajı gibi kurutulmuş kan lekeleri gibi minimal invaziv, düşük hacimli numune toplama stratejileri büyük ölçüde küçük çocukların 28 terapötik ilaç izleme ve farmakokinetik çalışmaları kolaylaştırmak olduğunu. Takrolimus, genellikle venöz EDTA tam kan 15 ölçülür. Nedenleri takrolimus yoğun kan hücrelerine dağıtır ve klinik çalışmalar klinik olayların 15,18 ile plazmada daha kanda takrolimus çukur konsantrasyonları arasında iyi korelasyon bildirmişlerdir vardır. Buna karşılık, ta analizikurutuldu kan lekelerinde crolimus filtre kağıdı matris ile karıştırılır ve kılcal kan dayanır. Bu LC-MS / MS analizi ile takrolimus ve potansiyel etkileşimler çözünürleştirme bakımından zorlukları sunmamaktadır. Burada yüksek akış çevrimiçi kolon numunesi temizlemek usul ve LC-MS / MS analizi ile birlikte bir mermi blender kullanılarak kurutulmuş kan spot homojenizasyon dayalı kurulu ve onaylanmış test sunuyoruz. Bugün itibariyle, bu deney başarılı klinik çalışmalarda bağlılık izlenmesi için beş binden fazla takrolimus kurutulmuş kan nokta örneklerinin ölçümü için kullanılır olmuştur.

<table><tbody><tr><td>Tacrolimus</td><td>ABD Farmakope Konvansiyonu</td><td>1642802</td><td></td></tr><tr><td>D2,13C-Tacrolimus</td><td>Toronto Araştırma Kimyasalları A.Ş.</td><td></td><td></td>F370002</tr><tr><td>Kırmızı kan hücreleri</td><td>Colorado Üniversitesi Hastanesi</td><td>W20091305500 V</td><td></td></tr><tr><td>Plazma</td><td>Colorado Üniversitesi Hastanesi</td><td>W2017130556300Q</td><td></td></tr><tr><td>Aseton CHROMASOLV, HPLC, & ge; %99,9</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>439126-4 L</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril Optima LC/MS, UHPLC-UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol %99,9, HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2632-4</td><td></td></tr><tr><td>Metanol Optima LC/MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Su Optima LC/MS, UHPLC-UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A118P-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Çinko sülfat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Z68-500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 & ndash; 10 &; mikro; l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008649</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf tüp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>10 &ndash; 100 & mikro; l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008651</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l filtreli pipet uçları, steril</td><td>Neptün</td><td>BT 10XLS3</td><td></td></tr><tr><td>100 & ndash; 1.000 & mikro; l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008653</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; l filtreli pipet uçları, steril</td><td>Neptune</td><td>BT 100</td><td></td></tr><tr><td>1.000 & mu; l filtreli pipet uçları, steril</td><td>Multimax</td><td>2940</td><td></td></tr><tr><td>2 &ndash; 20 & mikro; l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008650</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Eppendorf tüp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-681-258</td><td></td></tr><tr><td>20 &ndash; 200 & mikro; l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008652</td><td></td></tr><tr><td>20 & mu; l filtreli pipet uçları, steril</td><td>GeneMate</td><td>P-1237-20</td><td></td></tr><tr><td>200 & mu; l filtreli pipet uçları</td><td>Multimax</td><td>2938T</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l filtreli pipet uçları, steril</td><td>Multimax</td><td>2936J</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon tüp</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>300 & l HPLC şişeleri için ekler</td><td>Phenomenex</td><td>ARO-9973-13</td><td></td></tr><tr><td>Terazi PR2002</td><td>Mettler Toledo</td><td>1117050723</td><td></td></tr><tr><td>Terazileri AX205 Delta Aralığı</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119343379</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender Homojenizatör</td><td>Sonraki İlerleme</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Biyofüj Fresco</td><td>Heraeus</td><td>290395</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Mendil</td><td>PDI</td><td>Q55172</td><td></td></tr><tr><td>Cam şişeler, 4 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-955-334</td><td></td></tr><tr><td>Cam şişeler, 20 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B7800-20</td><td></td></tr><tr><td>Eldivenler, nitril</td><td>Titan Marka Eldivenler</td><td>44-100S</td><td></td></tr><tr><td>HPLC şişeleri, 9 mm, 2 ml, şeffaf</td><td>Phenomenex</td><td>ARO- 9921-13</td><td></td></tr><tr><td>HPLC şişeleri için kapaklar</td><td>Phenomenex</td><td>ARO- 8952-13-B</td><td></td></tr><tr><td>İğne, 18 G 1.5</td><td></td><td></td> Eppendorf tüpleri için Hassas Kayma 305196 <td></td></tr><tr><td>Rafı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-448-11</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Şişeleri için Raf</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-541-29</td><td></td></tr><tr><td>Çelik boncuklar 0,9 & ndash; 2 mm</td><td>Sonraki İlerleme</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>Dondurucular / buzdolapları için saklama kutuları</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>Standart çok tüplü vortekser</td><td>VWR Bilimsel Ürünler</td><td>658816-115</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Kağıdı, 903 Protein Koruyucu US 100 / PK</td><td>GE Whatman&nbsp;</td><td>2016-05</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Numune Alma Cihazı</td><td>CTC PAL&nbsp;</td><td>Polat. HTCABIx1</td><td></td></tr><tr><td>İkili pompa, Agilent 1260 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G1312B</td><td></td></tr><tr><td>İkili pompa, Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G4220A</td><td></td></tr><tr><td>Mikro vakumlu gaz giderici, Agilent 1260</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G13798</td><td></td></tr><tr><td>Sütunlu fırın,&nbsp; Agilent 1290 2 pozisyonlu&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1216C</td><td></td></tr><tr><td>Entegre 6 anahtarlama valfli termostatlı kolon bölmesi</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1316C</td><td></td></tr><tr><td>HPLC kolon öncesi kartuş, Zorbax XDB C8 (5 & mikro; m parçacık boyutu), 4.6 ve orta nokta; 12,5 mm</td><td>Phenomenex</td><td>820950-926</td><td></td></tr><tr><td>HPLC analitik kolon, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 & mikro; m parçacık boyutu), 4.6 ve orta nokta; 150 mm</td><td>Phenomenex</td><td>993967-906</td><td></td></tr><tr><td>Tandem Kütle Spektrometresi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>API5000 MS/MS, TurboIonspray kaynağı</td><td>ile AB Sciex</td><td>4364257</td><td></td></tr><tr><td>Kütle spektrometresi yazılımı</td><td>AB Sciex</td><td>Analyst 1.5.1</td><td></td></tr></tbody></table>

lc-ms / ms kullanarak kurutulmuş kan spotlar immünosupresan tacrolimus niceleme

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Kalsineurin inhibitörü takrolimus ABD&#39;de solid organ naklinden sonra en immunosupresif tedavi protokollerinin temel taşıdır. Takrolimus dar bir terapötik indeks ilaçtır ve gibi tedavi amaçlı ilaç izleme ve tam kan çukur konsantrasyonları dayalı doz ayarlaması gerektirir. Ev tedavi ilaç ve bağlılık izlenmesini kolaylaştırmak için, kurutulmuş kan lekeleri koleksiyonu cazip bir kavramdır. Bir parmak sopa sonra hasta evde filtre kağıdı üzerinde bir kan damlası toplar. Kan, kurutuldu sonra, takrolimus, yüksek performanslı sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi kullanılarak ölçülür analiz laboratuvarına gönderilecek (HPLC-MS / MS), basit bir el kitabı, protein çökeltme adımında online kolon ekstraksiyon ile kombinasyon halinde. Takrolimus analizi için, 6 mm&#39;lik bir disk kan nokta doymuş merkezi kesilerek çıkarılır. Kan nokta bir kurşun blender a kullanılarak homojenize edilirnd sonra proteinler metanol / 0.2 M ZnSO 4 internal standart D 2, 13 C-takrolimus içeren çöktürülür. Vorteks ve santrifüj edilmesinden sonra, yüzer 100 ul bir online ayırma kolonuna enjekte edilir ve 5 ml / 0.1 formik asit / asetonitril dakika ile yıkandı (7: 3, hacim: hacim) 1 için min. Bundan sonra, sviçleme valfi harekete analitleri analitik kolona geri temizlendi (ve% 0.1 formik asit / asetonitril gradyanı kullanılarak ayrılmıştır) vardır. Takrolimus, tandem kütle spektrometresi kullanılarak pozitif çoklu reaksiyon modu (MRM) ölçülür. Deney 1 ila 50 ng / ml ile doğrusaldır. Olarak 20 gün içinde değerlendirilen Inter-tahlil değişkenliği (% 3.6 -6.1%) ve doğruluk (% 91.7 -101,6%) kabul kriterlerini karşılayan. Ortalama çıkarma kurtarma 95.5% &#39;dir. Carry-over, matris müdahaleler ve matriks etkileri ilgili hiçbir bulunmamaktadır. Takrolimus, oda sıcaklığında ve 1 hafta boyunca 4 ° C de kurutulur, kan lekeleri stabildir. Ayıklanan örneklerotomatik numune alma cihazı, en az 72 saat süre ile 4 ° C&#39;de stabildir.

Boş numune Örnek iyon kromatogramları, örnek, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir miktar ve bir hasta numunesinin alt limitte çivili. Kalibrasyon Eğrileri En düşük algılama sınırı ml 0,5 ng / ve kantifikasyonunun alt sınırı 1,0 ng / ml olmuştur. Yüksek konsantrasyonlar normal şartlar altında klinikte ulaşılacak muhtemel olarak Elli ng / ml, en yüksek kalibratör olarak seçildi. Kalibrasyon eğrileri, taze insan EDTA tam kan,...

Burada, basit bir manuel protein çökeltme adımı ve çevrimiçi kolon ekstraksiyonu kullanarak kurutulmuş kan lekelerinde immünosupresan takrolimusun miktarını belirlemek için yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (HPLC-MS/MS) testini açıklıyoruz.

LC-MS / MS kullanarak Kurutulmuş Kan Spotlar Immünosupresan Tacrolimus Niceleme

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kurumuş kan lekelerinde takrolimusun miktarını belirlemektir. Bu tekniğin, IV kan alımından sonra kan örneklerinde takrolimus miktarının belirlenmesine göre ana avantajı, hastaların örnekleri kendilerinin toplayabilmesidir: minimal invaziv, kurutulmuş kan lekeleri gibi düşük hacimli örnek toplama stratejileri ayrıca küçük çocuklarda terapötik ilaç izlemeyi ve farmakokinetik çalışmaları kolaylaştırır. Basit bir parmak çubuğundan sonra, hasta özel bir filtre kağıt kartında bir kan damlası toplar ve kan lekesi kurutulduktan sonra, takrolimus ve hastanın alabileceği diğer immünosupresanların analizi için merkezi bir laboratuvara postalanabilir.Kurumuş kan lekeleri üzerindeki ilaçların miktar tayini, kurumuş kan lekeleri gibi çok küçük kan hacimlerinde takrolimus ve diğer immünosupresanların miktar tayini için oldukça hassas ve spesifik LCM SM S testlerinin geliştirilmesi sayesinde mümkün hale gelmiştir. İlk olarak, takrolimus için mililitre başına bir miligram konsantrasyonda ve mililitre başına 10 mikrogram konsantrasyonda saf metanol içinde stok çözeltileri hazırlayın. D iki 13 C alikot stok çözeltisi için ve her ekstraksiyon gününde eksi 70 santigrat derece veya altında saklayın, proteinleri çökeltmek ve takrolimi çıkarmak için suda yedi ila üç oranında metanol ve 0.2 molar çinko sülfat hazırlayın.Dahili standart stok çözeltisi, çökeltme çözeltisine çivilenir. Çözeltinin sona erme tarihini 12 saat olarak ayarlayın. Bunu takiben, kalibratörler ve kalite kontrol numuneleri hazırlamak için saf metanol kullanarak stok çözeltisinin uygun seyreltmesini gerçekleştirerek takrolimus stok çözeltilerini hazırlayın.Uygun şekilde seyreltilmiş stok çözeltisinden 20 mikrolitre EDT'ye dökün. Bir tam kan, takrolimusun hücresel kan bileşenlerine homojen bir şekilde dağılmasını sağlamak için bir su banyosunda 20 dakika boyunca hafifçe çalkalama altında 37 santigrat derecede inkübe edilir. Daha fazla miktarda kalibratör ve kalite kontrol numunesi hazırlamak için, uygun şekilde seyreltilmiş stok çözeltisinden 2000 mikrolitre EDT'ye dökün.Bir tam kan, takrolimusun hücresel kan bileşenlerine homojen bir şekilde dağılmasını sağlamak için bir su banyosunda 20 dakika boyunca hafifçe çalkalama altında 37 santigrat derecede inkübe edilir. Daha sonra numuneleri konik tabanlı ve geçmeli kapaklı 1,5 mililitrelik polipropilen tüplere ayırın. Kan lekelerini oda sıcaklığında üç saat kuruttuktan sonra bir pipet kullanarak filtre kartlarında her dairenin ortasına 50 mikrolitre çivili tam kan koyun, insan EDTA tam kanında takrolimus kalibrasyon standartlarını bir 2.5, 5, 10, 25 ve 50 nanogram mililitre başına hazırlayın.Dahili standart D iki 13 C takrolimus içermeyen, protein çökeltme çözeltisi ile kalibrasyon standartları gibi ekstraksiyon için boş bir numune hazırlayın. Daha sonra, insan EDTA tam kanında mililitre başına 0, 2, 4, 20 ve 40 nanogram konsantrasyonlarda kalite kontrol örnekleri hazırlayın. Boş bir numune de hazırlayın Kurumuş kan lekelerini topladıktan sonra, kabul edilebilir numune kalitesi ve hacmini sağlamak için her birini görsel olarak inceleyin.Ardından, filtre kartındaki kan lekesinin merkezini altı milimetrelik bir delgeç ile delin. Diskleri konik tabanlı 1,5 mililitrelik polipropilen tüplere yerleştirin ve kapakları kapatın. Her tüpe 20 ila 30 mermi ekleyin.Bunu takiben, her tüpe 500 mikrolitre protein çökeltme çözeltisi ekleyin. Diskleri bir mermi karıştırıcıda maksimum hızda bir dakika boyunca homojenize edin. Bittiğinde, numuneleri oda sıcaklığında çok tüplü bir girdap üzerinde maksimum hızda 10 dakika çalkalayın.Daha sonra numuneleri 16.000 GS ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, SNAT'ı 300 mikrolitrelik bir ek ile donatılmış cam HPLC şişelerine aktarın. Bu noktada, ekstrakte edilen numunenin 100 mikrolitrelik süpernatını, dakikada beş mililitrelik bir akışta su ve asit nitril içinde yedi ila üç oranında% 0.1 formik asit ile C sekiz kartuşlu ekstraksiyon sütunu yıkamasına yükleyin.Bundan sonra bir dakika boyunca anahtarlama valfini etkinleştirin ve bu da analitlerin ön kaldan analitik kolona geri yıkanmasına neden olur. Ardından kolon termostatını 65 santigrat dereceye ayarlayın. Burada gösterilen akış hızlarını ve gradyanı kullanarak analitleri analitik kolondan çıkarın.Analitik kolonu, turbo elektrosprey iyonizasyon kaynağı aracılığıyla bir tandem kütle spektrometresine bağlayın. Kütle spektrometresinin temel parametrelerini aşağıdaki tabloya göre ayarlayın. Ardından, çoklu reaksiyon modunda pozitif iyonları tespit edin.Kurumuş kan lekelerindeki takrolimusu ölçmek için, boş bir numunenin kütle spektrometresi yazılımı temsili iyon kromatogramlarını kullanarak kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırın. Kantifikasyonun alt sınırında çivilenmiş bir numune ve bir hasta numunesi burada gösterilmektedir. Burada tipik bir kalibrasyon eğrisi gösterilmektedir.Ortalama korelasyon katsayısı 0.9994'tür. Doğruluk ve hassasiyet sonuçları burada ayrıntılı olarak gösterilmektedir. Önemli bir iyon baskılanması veya iyon artışı belirtisi gözlenmedi ve tepe noktalarının aşılmasına neden olan ilgili bir taşınma gözlenmedi.Kantitasyonun alt sınırındaki sinyalin %15'i tespit edildi. Seyreltme bütünlüğü, en yüksek kalibratörün üzerindeki konsantrasyonlarda hazırlanan ve hedef konsantrasyonlara ulaşmak için ekstraksiyondan sonra protein çökeltme çözeltisi içinde seyreltilen numunelerin analiz edilmesiyle araştırıldı. Test edilen tüm seyreltmeler kabul kriterlerini karşıladı.Oda sıcaklığında bir haftalık depolamadan sonra, dört santigrat derecede bir haftalık depolamadan sonra ve eksi 20 santigrat derecede bir aylık depolamadan sonra herhangi bir kayıp görülmedi. Ek olarak, üç donma ve çözülme döngüsünden sonra eksi 80 santigrat derecede bir aylık depolamadan sonra ve otomatik örnekleyicide dört santigrat derecede 72 saatlik ekstrakte edilmiş numuneden sonra herhangi bir kayıp gözlenmedi. Mastering yapıldıktan sonra 20 numune bir saatten daha kısa sürede çıkarılabilir.Bu prosedürü denerken, güvenilir miktar tayininin anahtarının kurumuş kan lekesinin kalitesi olduğunu ve diskin filtre kağıdının tamamen doymuş bir bölgesinden delindiğini hatırlamak önemlidir. Bu videoda gösterilen teknikler ve tahlil, kurumuş kan lekelerinde diğer immünosupresanları ve ilaçları ölçmek için bir platform teknolojisi sağlar.

quantification-immunosuppressant-tacrolimus-on-dried-blood-spots

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Tregs bağışıklık sisteminin güçlü bastırıcılar. Bunları tanımlamak için benzersiz yüzey belirteçleri bir eksikliği vardır, dolayısıyla, Tregs tanımları öncelikle fonksiyonel. Burada bir optimize...

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Biz bir pompa ve model ilaçlar (diazepam ve takrolimus) ile uyuşturucu emme değerlendirilmesi için bir yöntem sunduk. tatbikat setlerinde ve borularda yüksek performans sıvı kromatografisi, ilaç konsantrasyonlarını ve sorpsiyon seviyelerini kullanarak ilaç analizi sonra hesaplanır.

İlaç Tutma Değerlendirilmesi PVC ve Yönetim Tüpler olmayan PVC esaslı bir Pompası kullanarak ayarlar için

Burada, yüksek çözünürlüklü (~ 30.000) MS-algılama, peptid parçacıkları Monoklonal antikor çivili peptid standartları miktar için ardından peptid öncüleri iyon hareketlilik ayrılması ile birleştiğinde bir Kromatografik tahlil açıklamak Özet.

Bir HS-MRM tahlil için Protein Biyofarmasötikler sıvı Kromatografi iyon hareketlilik QTOF kütle spektrometresi tarafından Host-hücre proteinleri miktar

Ivacaftor ve ivacaftor-lumacaftor iki yeni CF ilaç bileşimidir. Ancak, hala bir kıtlık PK/PD ve Farmakoloji anlayış yoktur. Biz ivacaftor ve onun büyük metabolitleri ve lumacaftor aynı anda analizi için en iyi duruma getirilmiş bir HPLC-MS tekniği mevcut.

Ivacaftor, büyük metabolitleri ve Lumacaftor Kistik fibrozis hastalarının biyolojik sıvı içinde klinik örnekler yüksek üretilen iş analizi için en iyi duruma getirilmiş LC-MS/MS yöntemi

Bu iletişim kuralı periferik kan ve serum/plazma tek nükleotit polimorfizmi (SNP) değerlendirme ve ELISA tahlil gibi aşağı akım analizleri için saklamak için basit ve kullanışlı bir yöntem açıklanır.

Kan ve Serum lekeler kanser biyolojik değerlendirmek örnek depolama için yararlı bir araç olarak kurutulmuş

Burada, LC/MS analizi ile birleştiğinde lazer yakalama mikrodiseksiyon dağınık şekilde ölçmek-akciğer tüberkülozu granülomlar içinde uyuşturucu dağıtımı için bir iletişim kuralı'nı açıklar. Yaklaşım ilaç konsantrasyonları yüksek uzaysal detay dokularda miktarının için geniş uygulanabilirliği vardır.

Akciğer tüberkülozu lezyonlar lazer ilaçların kayma miktar yakalamak mikrodiseksiyon sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi (LCM-LC/MS)

Burada bağışıklık fenotipik ve fonksiyonel (hücre içi sitokin indüksiyon) değerlendirmek için bir tek hücreli proteomik yaklaşım tarif değişiklikler periferik tam kan örneklerinde, kitle sitometresi ile analiz.

Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi

Hastaların kompleks ilaca dirençli tüberküloz (DR-TB) rejimlerine bağlılığını analiz etme yöntemleri yanlış ve kaynak yoğun olabilir. Yöntemimiz, 11 DR-TB ilaç konsantrasyonları için kolayca toplanan ve depolanan bir matris olan saçı analiz eder. LC-MS/MS kullanarak, uyuşturucuya bağlılığı daha iyi anlamak için kullanılabilen alt nanogram ilaç düzeylerini belirleyebiliriz.

Küçük Saç Örneklerinde 11 İlaca Dirençli TB İlaçların Ölçülmesi için Doğrulanmış LC-MS/MS Paneli

Sonsuz Horizon çarpma kullanarak servikal spinal kord yaralanması üretmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde anlatılmıştır. Yöntemi özel bir dizayn çerçeve yararlanır ve omurgayı stabilize etmek için kelepçe. Standart bir prosedür yeterli ve sürekli yaralanmalarda biyomekanik yaralanma parametreleri sonucu.

Sonsuz Horizon Darbeli kullanarak tek taraflı Servikal Spinal Kord Yaralanması bir Contusive Modeli

Prostat kanseri başlangıcı, yeni ve yenilikçi insan model sistemler ve yaklaşımlar altında yatan en erken moleküler mekanizmaları umutsuzca ihtiyaç vardır çözülmeye. Insan prostat epitel oluşturmak için pluripotent kök hücre popülasyonlarının ikna etmek için önceden prostat ürogenital sinüs mezenşimin (UGSM) potansiyel prostat araştırma güçlü deneysel bir araçtır.

Kemirgen Ürogenital Sinüs mezenşimin ve İnsan Kök Hücre Doku Rekombinasyon kullanarak İnsan Prostat epiteli oluşumu

Öğrenin kurutulmuş kan spotlarında LC-MS/MS ile takrolimus nicelendirmesini. Bu yöntem, organ nakli hastalarında immünosupresan izlemini minimal invaziv örnekleme ile kolaylaştırır.

LC-MS / MS kullanarak Kurutulmuş Kan Spotlar Immünosupresan Tacrolimus Niceleme

Daha fazla video keşfet