İşitsel Yolu ve optogenetic Stimülasyon için Murin Dorsal Koklear Çekirdek Doğrudan Görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, optogenetik tabanlı deneyleri mümkün kılmak için bir fare modelinde koklear çekirdeğe cerrahi olarak erişmektir. Bu, önce fareyi kraniyotomi için hazırlayarak ve kafa derisini laterale kaplayan cildi, yumuşak dokuyu ve kasları geri çekerek elde edilir. İkinci adım olarak, sol inter parietal kemikte, lambda sütür hattına yaklaşık iki milimetre uzaklıkta bir kraniyotomi yapılır.

Bu bölge koklear çekirdeğin üzerini örter. Daha sonra, beş Fransız emme borusu kullanarak, DCN'nin üzerindeki sol serebellumun en lateral kısmını aspire edin. Sonuç, DCN'nin engelsiz bir görünümünü gösterir.

Bu tekniğin stereotaktik kılavuzlama gibi yardımcı yöntemlere göre başlıca avantajları, hem koklear çekirdeğin doğrudan görüntülenmesini sağlamak hem de beyin sapı yüzeyine bir ışık kaynağı veya elektrot dizisi gibi bir nöros simülatörü yerleştirmektir. Bu yöntem, hem optogenetik hem de işitsel alanlardaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Hiçbir protez, gen transferi gibi işitsel beyin sapının ışıkla yeterli yüz ve şakak çözünürlüğü ile uyarılmasını sağlayamaz.

Bir fareyi intraperitoneal uygulama yoluyla ketamin ve ksilazin ile uyuşturduktan sonra, ayak parmağı sıkışma geri çekilme refleksini kontrol edin ve uygun anesteziyi doğrulamak için kalp atış hızını ve solunum hızını izleyin. Daha sonra kuruluğu önlemek için her iki göze de veteriner merhemi sürün. Ardından, ameliyat bölgesine engelsiz erişim sağlamak için kafa derisinin üzerindeki saçları tıraş edin.

Bundan sonra, fareyi küçük bir hayvan stereotaksik tutucusuna yerleştirin. Burun kelepçesini, yeterli solunuma izin verecek kadar gevşek, ancak farenin kafasını tamamen hareketsiz hale getirecek kadar sıkı olacak şekilde ayarlayın. Mikroskop altında, doğrudan kulak kepçesi arasındaki orta hattan başlayarak ve oksiputun coddle kısmına kadar uzanan cilt boyunca dikey bir kesi yapın.

Ardından cildi yanal olarak değiştirin. Kafatasının sol parietal, inter parietal ve oksipital kemiklerinin üzerindeki kasları bir neşter veya iris makası ile çıkarın. Bu esnada pamuk uçlu aplikatör ile 10 ila 15 saniye boyunca hafif baskı uygulayarak kanamayı en aza indirin.

Ardından, sagital ve lambda sütür çizgilerini tanımlayın. Bir çift Ron mücevheri kullanarak. Sol inter parietal kemikte bir kraniyotomi yapın, lambda sütür hattına yaklaşık iki milimetre yaklaşın.

Bu bölge, kraniyotomi sonrası DCN'yi kaplar. Beyinciğin üzerinde yer alan ince bir dura tabakası gözlenmelidir: bir neşter bıçağı kullanarak dikkatlice çıkarın. Pıhtılaşmış kanı pamuk uçlarıyla çıkarın veya kanı temizlemek için beyincik üzerine hafifçe salin damlatın.

Ardından, yardımcı olmak için DCN'nin üzerine ek olarak, sol serebellumun lateral en kısmını aspire etmek için beş Fransız emme borusu kullanın. Aspirasyonda, görselleştirmeyi iyileştirmek ve keskin bir görüntü sağlamak için mikroskobun odak düzlemini koklear çekirdeğin beklenen derinliğine ayarlayın. Sol beyinciğin yaklaşık dörtte biri ila üçte birini çıkarın.

DCN'nin bitişiğindeki ana dönüm noktası, üstün yarı dairesel kanalın'sidir. Aspirasyonu takiben, daha fazla kanama, serebral omurilik sıvısı birikmesi ve DCN'de beyincik yer değiştirmesi, kan pıhtılaşmasını önlemek için kraniyotomiye hızlı bir şekilde salin aşılayacaktır. DCN'nin doğrudan görselleştirilmesi için bir yol açmak için bir diş ucu ile nazikçe dokunma ve emme kombinasyonunu kullanın.

DCN açıkça görülebildikten ve üstteki kan ve BOS içermedikten sonra, beş mikrolitrelik gaz geçirmez bir Hamilton şırınga ile vektörün içine basınçlı bir mikro enjeksiyon yapın. Künt travmayı en aza indirmek ve enjeksiyon hacmini DCN içinde lokalize etmek için sığ eğimli 34 gauge bir iğne kullanın. Ardından, uç DCN'nin yüzeyinin altında artık görünmeyene kadar iğneyi bir mikro manipülatör ile yavaşça sokun.

1,5 mikrolitre vektör enjekte etmeye başlayın. Bu tamamlandıktan sonra, iğneyi yavaşça geri çekin, ardından cildi yeniden yaklaştırın ve farenin standart kurtarma prosedürüne göre iyileşmesine izin verin. İki ila dört haftalık iyileşme ve virüs aracılı gen transferi inkübasyonundan sonra, vektör enjekte edilen fareyi yeniden uyuşturun, ardından kraniyotomi bölgesi üzerindeki yara dokusunu çıkarın.

Bundan sonra, DCN'nin üzerinde kalan beyincik ve yara dokusunun bir kombinasyonunu tanımlayın. Üstteki beyincik ve yara dokusunu aspire etmek için beş Fransız emme kullanın. Aspirasyonun ardından.

Kraniotomiye hızlı bir şekilde salin uygulayın. Kan ulülasyonunu önlemek için, DCN'nin doğrudan görselleştirilmesi için yolu temizlemek üzere nazik diş noktası delme ve emme kombinasyonunu kullanın. DCN'ye artık optogenetik temelli fizyoloji deneyleri için erişilebilir, burada gösterilen bir lazer fiberinin doğrudan DCN'nin yüzeyine yerleştirilmesidir, bu da enfekte DCN'nin yüzeyinde opsin enfekte DCNA mavi ışık darbe serisinin optik olarak uyarılmasına izin verir, optik olarak yönlendirilen bir işitsel beyin sapı yanıtı ile sonuçlanır.

Bir mikro manipülatör kullanılarak, mavi ışık lazerine bağlı bir optik fiber doğrudan koklear çekirdeğin yüzeyine yerleştirilir ve açılır. Burada koklear çekirdeğin yüzeyindeki darbeli mavi ışığı tanımlayabiliriz. Bu prosedürü takiben, çekirdeğin elektriksel olarak simüle edilmesi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir, bu da sadece akustik olarak uyarılmış değil, aynı zamanda elektriksel olarak uyarılmış nöral tepkileri optik simülasyon tarafından uyandırılan tepkilerle doğrudan karşılaştırmamıza olanak tanır.

Bu videoyu izledikten sonra, doğrudan görselleştirme ve koklear çekirdeğe erişim nihai hedefi ile kraniyotomi ve serebellar aspirasyonun nasıl hazırlanacağı ve gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.