Name: Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar Escherichia coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Öğrenin, Escherichia coli'de uyumlu plazmidler kullanarak protein birlikte-ifade etme yöntemiyle çözünürlüğü düşük protein komplekslerinin biyokimyasal analizini nasıl gerçekleştirebilirsiniz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

rakamları yeniden yazdırmak için Springer ve Elsevier tarafından izin ölçüde kabul edilmektedir.

E. 1. izolasyonu E. coli Eş transformantlar <ol><li> Uygun E. elektro-yetkili hücreleri hazırlayın coli suşu transforme edilecek. LB ortamı, 1 ml (tripton, maya ekstresi, 10 NaCl, 5, ve 10 g / l&#39;lik konsantrasyonlarda kullanılır) tercih edilen soyunun tek bir koloni, ve transfer 180 rpm çalkalama koşulları altında, 37 ° C&#39;de inkübe edin. Ön-kültür 1 seyreltin: 500, taze LB ortamında 25 ml ve 37 ° C&#39;de kültür inkübe edin. </li><li> Log-faz (0.6 OD) içinde 20 dakika için 5000 xg) bir hücre süspansiyonu santrifüj ve orijinal kültür hacminin yarısı% 10, h / h buz soğukluğunda steril gliserol-su içinde pelletini. Her seferinde tabanda hacmi yarıya, bu adımı 4 kez tekrarlayın. Son olarak, gliserol / su içinde tekrar süspansiyon pelet ve 50 ul alikolar içinde hücre süspansiyonu bölün. 6 ay -80 ° C de alikotları saklayın. </li><li> 0.5 mM EDTA ile takviye edilmiş, steril su içinde arzu edilen plazmid çözülür. Ic üzerinde çözülmeE elektro-kompetan hücrelerin bir tümböleni ve vektör uygun bir miktar (2.5-5 ng) ile karıştırılır. Elektroporasyon için uygun olan bir 0.1 cm küvet içine karışımı koyun ve 1.8 kV uygulanır. </li><li> Hemen SOC ortamında 1 ml &#39;ye elektroporatlanmıştır hücreleri transferi (LB ortamı% 0.2 / h glukoz, 10 mM MgCl2, 2.5 mM KCI ile takviye edilmiş), çalkalama altında 1 saat boyunca inkübe edilir ve son olarak da içeren Petri kapları 100 ul alikotları aktarmak Uygun antibiyotik ile LB agar. 37 ° C&#39;de O / N inkübe edin. </li><li> Petri kapları tek koloniler çizgiler ile transformantlann arındırın. </li><li> Birincil Transformantların elektro-yetkili hücreleri hazırlayın ve tekrar ileri plazmidlerle dönüştürmek için 1,1-1,5 adımları. </li><li> Ko-transformantların gliserol stokları hazırlayın. Uygun antibiyotikler ile takviye edilmiş LB içinde tek bir koloni transfer, çalkalanarak 37 ° C&#39;de inkübe ve log-faz (0.6 OD) santrifüj 20 dakika boyunca 5000 x g&#39;de hücre süspansiyonu. ROrta% 15 h / h gliserol ihtiva eden LB-antibiyotikler pelet esuspend. Alikotları koyun ve en saklayın - 80 ° C. </li></ol> E. α ve ε Altbirimlerin 2. birlikte ifadesi, E. coli DNA polimeraz III <ol><li> Steril bir çerçevenin bulunduğu uygun soy gliserol stokundan bir miktar transfer LB ortamı ve antibiyotikler içeren bir Petri kutusu içine (örneğin, TOP10 / pGOOD-ε243 ve TOP10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160, Şekil 1 &#39;e bakınız). Hücreler damlacık hücreler süspansiyon Petri kabı üzerine kuru ve çizgi edelim. 37 ° CO / N inkübe edin. </li><li> Steril kürdan LB-antibiyotikler ortamı, 1 ml için tek bir koloni ile Aktarım. 37 ° C&#39;de 8 saat inkübe edin. Taze ortam içinde 500 ve 15 saat boyunca 30 ° C&#39;de inkübe: kültür öncesi 1 seyreltin. </li><li> IPTG, arabinoz veya arabinoz ve IPTG, 1 mM her ekleyin. 2.5 saat boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edilir. Hücreler toplanır ve -20 ° C &#39;de pelet saklayın. </li><li> Liziz tamponu (50 mM Tris-HCI, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA, 2.5 mM ditiyotreitol, 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF), pH 8) &#39;de buz ve tekrar süspansiyon ile çözülme peletler. Yavaşça soğuk cam çömlekçi olan hücreler süspansiyon homojenize. </li><li> 15 sn soğutma aralığı (4 kür) takip 15 sn 15 W, bir sonikasyon. </li><li> Çözünür fraksiyonu geri kazanmak için, 4 ° C&#39;de, 20 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de toplam protein ekstreleri santrifüjleyin. </li><li> SDS-PAGE (% 12.5 akrilamid) her çözünür protein ekstresi alikolar ile analiz edin. Bu amaçla, H2O 60 ul ve yükleme tamponu (250 mM Tris-HCI, pH 20 ul ihtiva eden Eppendorf tüplerine her çözünür protein ekstresi 20 ul transfer 6.8, 10 mM β-merkaptoetanol,% 10 (ağ / hac) SDS,% 50 (h / h) gliserol,% 0.25, mavi (ağ / hac) bromofenol) ve 5 dakika kaynatılır. Yük, her numune için 18 ul ila yaklaşık 1.5 saat için 140 V&#39;ta elektroforez gerçekleştirin. </li></ol> Deinococ arasında α alt birimi 3. birlikte ifadesi,cus radiodurans DNA Polimeraz III ε E. Alt Birim E. coli DNA polimeraz III <ol><li> E. ön kültür hazırlanması E. coli suşu TOP 10 / Dr pBAD-α / LB-ampisilin, tetrasiklin ortamı, 1 ml pGOOD-ε243 ve 37 ° C &#39;de 8 saat daha inkübe edilir. Taze ortam içinde, 1.000 ve 37 ° C &#39;de O / N inkübe: 1 seyreltin. </li><li> 1 seyreltin: taze ortam, 100, 200 içine mi, daha sonra arabinoz ve IPTG, 1 mM her biri 3 saat; özellikle, 3 saat süre ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. Hücreler hasat ve -20 ° C &#39;de pelet saklayın. </li><li> 50 mM Tris-HCI, pH 8, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF içinde pelletini. Homojenize ve 2.4 ve 2.5 de tarif edildiği gibi hücreler bozabilir. </li><li> Hemen hücreler 20 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de santrifüj lizata. Pelet atın. Kağıt filtre 3 kat ile donatılmış bir Buchner hunisi ile süpernatant filtre. Nazik vakum uygulayın. Aşırı köpüklenme önlemek için, filtrasyon sırasında buz üzerinde vakum Erleni tutun. </li><li> Bradford 14 göre protein konsantrasyonu belirleyin. </li></ol> 4. Jel Filtrasyon Kromatoarafisi <ol><li> 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, pH kolonuna 8. Yük çözünür protein ekstresi ile bir su ceketli 16x70 (200) jel süzme sütunu dengelenmesi. En uygun çözünürlük için, 1 ml örnek döngü kullanmak. / Dakika 0.6 ml kromatografisi yapın. Boyunca 4 ° C&#39;de kolon sıcaklığı muhafaza edin. </li><li> 0.9 ml kesirler toplayın ve SDS-PAGE ile analiz. Aktarım H2O 60 ul ve yükleme tamponu (250 mM Tris-HCI pH 6.8, 10 mM β-merkaptoetanol,% 10 (a / h) SDS, w% 50 20 ul ihtiva eden Eppendorf tüplerine ilgili her fraksiyonun 20 ul ( h / h) gliserol,% 0.25 (mavi ağırlık / hacim) bromofenol) ve 5 dakika kaynatılır. Yük, her numune için 18 ul ila yaklaşık 1.5 saat için 140 V&#39;ta elektroforez gerçekleştirin. </li><li> 3&#39;-5 &#39;ekzonükleaz ve her bir fraksiyonun DNA polimeraz aktivitesi 96 biz de belirlerll mikroplakalar. Alt-tabaka 15 olarak timidin 5&#39;-monofosfat, p-nitrofenil ester (p NP TMP) ile eksonükleaz aktivitesi deneyi. PPX (pirofosfataz, purin nükleosit fosforilaz, ksantin oksidaz) enzim-bağlı deney 16 ve DNA polimeraz aktivitesi tahmin 2- (4-İyodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-fenil-2H-tetrazolyum klorid (INT) Elektron alıcı 16 gibi. </li></ol> Popülasyonlarının E. Yabani tip ε alt biriminin birlikte ifade 5. Mutasyon Analizi E. coli DNA Polimeraz III ve mutajenik εD12A Variant <ol><li> E. tek bir koloni transfer pBAD-ε ve LB-antibiyotikler ortamın 1 ml pGOOD1-εD12A 11 vektörleri içeren E. coli TOP 10. 37 ° C&#39;de O / N inkübe edin. </li><li> (Arabinoz, IPTG veya arabinoz ve IPTG, 1 mM), uygun indükleyicileri eklemek, taze ortam (10 mi) ihtiva eden 250 3 şişeleri ve 37 ° C&#39;de inkübe: Ön-kültür 1 seyreltin8 saat karıştırıldı. Paralel olmayan kaynaklı kültürlerde hazırlayın. </li><li> 1 ml&#39;lik alikolar toplamak, daha sonra 1 sulandırmak taze ortam (10 mi) ihtiva eden yeni şişelere 500 uygun indükleyicileri ile takviye edilmiş ya da. 37 ° C&#39;de O / N inkübe edin. </li><li> Tekrar 1 ml 5.2 ve 5.3 ve toplamak alikotları adımları. </li><li> Nesillerin sayısı her kültürde meydana belirleyin. LB plakaları, inokulum ve kültür uygun seri dilüsyonları 100 ul üzerine aktarın. 37 ° C&#39;de O / N inkübe edin. LB plakaları üzerine kolonileri sayın ve büyüme (C log) sonunda aşı içinde mevcut (I log) ve kültürde hücre sayısının kaydını hesaplar. Nesillerin sayısını belirlemek için, formülü kullanın: (C log - I log) /0.301. </li><li> 20 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüj ve 50 mM Tris-HCI, pH 7.6, 50 mM NaCI, 1 ml süspansiyon hücrelerin. Hücreleri geçirgenliği, 20 saniye kloroform ve vorteks 2-3 damla ekleyin. </li><li> Β- belirleyinSubstrat olarak p-nitrofenil-β-D-glukopiranosid (PNPGluc) kullanılarak 96 çukurlu bir mikrolevhadaki her bir kısım bir glukosidaz aktivitesi. Her çukuruna geçirgen hücrelerin 100 ul ve alt-tabaka 100 ul (16 mg / H2 O ml stok çözelti) eklenir. Kuyularda hava kabarcıklarını önlemek için özen gösterin. Bir mikrolevha okuyucu ve uygun bir filtre kullanılarak, 420 nm&#39;de absorbansı okumak. </li></ol>

<ol><li>Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplifying+protein+expression+with+ligation-free%2C+traceless+and+tag-switching+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids.</a> Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).</li>
<li>Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+landscape+of+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli.</a> Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).</li>
<li>Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+expression+systems%3A+a+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic expression systems: a comparison.</a> Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).</li>
<li>Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+expression+of+the+PBAD+promoter+in+Escherichia+coli+by+constitutive+expression+of+the+low-affinity+high-capacity+AraE+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter.</a> Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).</li>
<li>Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+and+homogeneous+regulation+of+the+Escherichia+coliaraBAD+promoter+by+use+of+a+lactose+transporter+of+relaxed+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).</li>
<li>Tabita, F. R., Small, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+assembly+of+active+cyanobacterial+ribulose-1%2C5-bisphosphate+carboxylase%2Foxygenase+in+Escherichia+coli+containing+stoichiometric+amounts+of+large+and+small+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).</li>
<li>Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+cyanobacterial+and+higher+plant+ribulose+bisphosphate+carboxylase+subunits+into+functional+homologous+and+heterologous+enzyme+molecules+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli.</a> EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).</li>
<li>Amann, E., Brosius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG+vectors+for+regulated+high-level+expression+of+cloned+genes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli.</a> Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).</li>
<li>Scheich, C., Kümmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., Büssow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectors+for+co-expression+of+an+unrestricted+number+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins.</a> Nucleic Acids Res. 35 (6), e43(2007).</li>
<li>Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pGOODs%3A+new+plasmids+for+the+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).</li>
<li>Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+regulation%2C+modulation%2C+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+PBAD+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter.</a> J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).</li>
<li>McHenry, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replicases+from+a+bacterial+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA replicases from a bacterial perspective.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Hamdan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolysis+of+the+5%E2%80%99-p-nitrophenyl+ester+of+TMP+by+the+proofreading+exonuclease+%28%CE%B5%29+subunit+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+III%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrolysis of the 5’-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (ε) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III.</a> Biochemistry. 41 (16), 5266-5275 (2002).</li>
<li>Guillén Suárez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+enzyme-coupled+assay+of+phosphate-+or+pyrophosphate-releasing+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes.</a> BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).</li>
<li>DeRose, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+the+catalytic+domain+of+the+proofreading+%CE%B5+subunit+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+III+based+on+NMR+structural+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Model for the catalytic domain of the proofreading ε subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data.</a> Biochemistry. 41 (1), 94-110 (2002).</li>
<li>Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proofreading+exonuclease+subunit+%CE%B5+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+III+is+tethered+to+the+polymerase+subunit+%CE%B1+via+a+flexible+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker.</a> Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).</li>
<li>Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+of+the+proofreading+subunit+controls+the+assembly+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+III+catalytic+core%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).</li>
<li>Schaaper, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+selection%2C+proofreading%2C+and+mismatch+repair+during+DNA+replication+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).</li>
<li>Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+novel+traits+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of novel traits in microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).</li>
<li>Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+DNA+activates+the+cryptic+bgl+operon+in+E.+coli+K12%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12.</a> Nature. 293, 625-629 (1981).</li>
<li>Schaeffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+system+for+the+utilization+of+%CE%B2-glucosides+in+Escherichia+coli.+I.+Active+transport+and+utilization+of+%CE%B2-glucosides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inducible system for the utilization of β-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of β-glucosides.</a> J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).</li>
<li>Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+selection+for+mutators+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Direct selection for mutators in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).</li>
<li>Dunker, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unfoldomics+decade%3A+an+update+of+intrinsically+disordered+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins.</a> BMC Genomics. 9, Suppl 2. (2008).</li>
<li>Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminal+domain+of+DnaQ+contains+the+polymerase+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site.</a> J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).</li>
<li>Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+functional+domains+of+the+%CE%B5+subunit+of+DNA+polymerase+III%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Two functional domains of the ε subunit of DNA polymerase III.</a> Biochemistry. 38 (48), 16001-16009 (1999).</li>
<li>Kim, D. R., McHenry, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assembly+of+overproduced+DNA+polymerase+III.+Overproduction%2C+purification%2C+and+characterization+of+the+%CE%B1%2C+%CE%B1-%CE%B5%2C+and+%CE%B1-%CE%B5-%CE%B8+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the α, α-ε, and α-ε-θ subunits.</a> J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).</li>
<li>Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+to+the+%CE%B2-sliding+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the β-sliding clamp.</a> Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).</li>
<li>Greener, A., Callahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XL1-red%3A+highly+efficient+random+mutagenesis+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Strategies%22%5BJournal%5D)">XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain.</a> Strategies. 7, 32-34 (1994).</li>
<li>Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+ligation-independent+expression+vectors+for+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).</li>
<li>Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E. Jr, McTernan, P. M., Adams, M. W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+and+maturation+of+an+NADP-dependent+%5BNiFe%5D-hydrogenase%3A+a+key+enzyme+in+biofuel+production%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production.</a> PloS One. 5 (5), (2010).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Proteinler olan üçüncül yapı uyumlarının 25 arasında, sınırlı sayıda sınırlı değildir bölgeleri içeren, doğal olarak düzensiz olabilir. Bu düzensiz proteinler toplama 25 genellikle eğilimli, ve onların izolasyon ve karakterizasyonu zor bir görev temsil edebilir. E. ε alt birimi coli DNA polimeraz III iki farklı etki yani 26,27, özellikleri: i) N-ter etki, θ alt birimini bağlama 3&#39;-5 &#39;ekzonükleaz aktivitesini taşıyan ve yetkin; ii) Cı-tert etki, α (polimeraz) alt...

overekspresyonu teknolojilerin tanıtılması düşük kopya sayısı enzimlerin biyokimyasal çalışmalar ve farmakolojik olarak aktif proteinlerin (örneğin, insülin) sanayi üretimi ya artırdı. Bu teknolojilerin gelişiyle bu yana, önemli gelişmeler rekombinant proteinlerin verim ve kaliteyi artırmak için elde edilmiştir. Buna ek olarak, prokaryotik ve ökaryotik 1,2 3 ekspresyonu sistemleri, protein biyoteknoloji, yani, Escherichia coli &quot;iş atı&quot; yararlı alternatifler sunan, yıllar içinde geliştirilmiştir. E. alternatif platformların Özellikle, kullanılabilirlik E. coli rekombinant peptitler veya post-translasyonel modifikasyonlar taşıyan proteinlerin üretimine yol açtı. Bununla birlikte, söz edilmelidir E. E. coli halen yeniden birleştirici protein üretimi için tercih edilen bir organizmayı ifade eder. Bu en alakalı olabilir aralarında çeşitli faktörler, nedeniylekabul: i) ekspresyonu sistemleri (ifade vektörleri ve suşları oldukça bir dizi kullanılabilirlik) E. için E. coli 1,2; E. ii) Kısa nesil süreleri ve yüksek biyokütle verimi, Zengin ve sentetik medya çeşitli coli; iii) biyokimyasal olarak ve bu mikroorganizmanın genetik düzeyde ya uyduruk manipülasyon; iv), toksik proteinlerin 4 üretebilen suşlarının izole edilmesi; v) nüfus düzeyinde 5,6 homojen indüksiyon sahip suşlar yapımı. Buna ek olarak, son zamanlarda, E. üretimi için uygun olan bu ifade sistemleri gördü translasyon sonrası modifiye edilmiş proteinlerin E. coli tasarlanmış ve 2 yapılabilir. Şu anda, proteini aşırı ekspresyonu esas olan hypersynthesis uygun bir plasmid içine klonlanmış tek bir gen ile yapılabilir monomerik ya da homo-oligomerik proteinler elde etmek için kullanılır. Bununla birlikte, dikkat son zamanlardaE. inşaat ödenen coli proteini birlikte ifade sistemleri, bir hetero-oligomerik kompleksleri 2, in vivo olarak, üretim zorlu. İlginç bir şekilde, protein, birlikte-ifade edilme daha önceki deneylerde, siyanobakteri ribuloz-1,5-bisfosfat karboksilazın / oksijenaz 7,8 arasında büyük ve küçük alt birimleri ve türler arası düzeneği, ve HIV-1 kesik ve tam uzunluktaki formları arasındaki ilişkiyi ele transkriptaz 9 ters. Bu öncü çalışmalar, protein ko-ifadesi in vitro yeniden geleneksel güçlü bir alternatif temsil ettiğini göstermiştir. E. koli içinde ilave olarak, protein, ko-ekspresyonu E. coli doğal olmayan amino asitler 2 ihtiva eden proteinler elde etmek için, post-translasyonel modifikasyonlar 2 taşıyan çeşitli proteinleri üretmek için ve Süreksprese membran proteinlerinin 2 verimini artırmak için kullanılmıştır. Ayrıca, bir araç olarak bir protein birlikte-ifade edilme potansiyel E. kazandırma coli rekabetProtein salgılanması nce aktif soruşturma 2 altında. E. Protein birlikte-ifade edilme iki temel strateji coli takip edilebilir: Farklı genleri barındırmak için tek bir plazmid kullanımı aşın i); ii) tek bir hücre içinde birden fazla plasmidlerin kullanımı hedef proteinlerin yardımcı şekilde ifade etmek. Tandem promotör / operatör elemanları ihtiva eden, özellikle plazmidler ko-ekspresyonu 10 oluşturulmuştur, ancak ilk durumda, plazmid seçimi için kriterler, geleneksel tek bir protein aşın deney olanlardan farklı değildir. Bu ilk yaklaşım bu nedenle oldukça basittir. Bununla birlikte, farklı proteinler yardımcı şekilde ifade etmek tek plazmidin kullanılması, sağlamanın iki büyük bir zorlukla karşı karşıya olduğu belirtilmelidir: i) eş ifade edilen proteinlerin sayısının sınırlandırılması barındırılan genlerin sayısı ile vektör artar, moleküler kütlesi; ii) birden fazla gen, tek bir promotörün kontrolü altında klonlandı zaman, polarite gerilemenin olabilirpromoterinden distal genlerin ifadesi e. Tek E., ikili veya çoklu plasmidlerin kullanımı coli hücreleri, bu nedenle plazmid uygun kombinasyonlarla kısıtlamalar getiren, seçilen vektörler uyumluluğunu gerçekleştirmek zorundadır. Bununla birlikte, bu ikinci eş ifade stratejisinin vektörlerinin molekül kütlesi ihtiva eden bir avantaj sahiptir, ve polarite sınırlar. Son zamanlarda birlikte ekspresyon plazmidleri 11 arasında gen mekik kolaylaştırmak için tasarlanmış bir protein ko-ifade sistemi inşa edilmiştir. Özellikle, pGOOD vektörleri serisi inşa ilgili özellikler elde edilmiştir: i) bir replikasyon orijini p15A, ticari vektörler (ör pBAD seri 12) ColE1 orijini içeren pGOOD plazmid uyumluluğunu sağlamak; ii) bir tetrasiklin direnç kasedi; iii) lac varlığı düzenleyici unsurları, yani Yarışmayı-Operatörü (O 1) çift ve IacI -türevli </em&gt; q geni. Uygun bir pBAD-pGOOD çift kullanarak, E. katalitik çekirdeğini aşırı ifade başardık üç farklı alt üniteden oluşan coli DNA polimeraz III, yani α (5&#39;-3 &#39;polimeraz), ε (3&#39;-5&#39; eksonükleaz) ve (stabilize edici ε) 13 θ. Özellikle, αεθ kompleksinin birlikte ifadesi, E. ek sıkı sıkıya bağlı olduğunu göstermiştir IPTG ve arabinoz hem de E. coli kültür ortamı, pGOOD ve pBAD sırasıyla (Şekil 1A), tetikleyici aşırı ekspresyonu. Mevcut yazıda, proteinin birlikte ifadesi, etkin bir şekilde bir protein kompleksi alt biriminin çözünürlüğünün kötü bağlantılı zorlukların üstesinden nasıl göstermektedir. Buna ek olarak, ne kadar in vivo proteinin tamamlama testlerinde gerçekleştirilebilir göstermektedir, ve nihayet E. ayar mutasyon sıklığı protein ko-ifade edilmesi için rapor dağ geçidii. Bu amaçla, her vaka çalışması ilgili örnekler göstermek için uygun pGOOD-pBAD çiftler kullanılır.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>INT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8377</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>PNP-gluc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7006</td><td></td></tr><tr><td>pNP-TMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0251</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>Trizma tabanı&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95039</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Fluka</td><td>70161</td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid çözeltisi %30</td> <td>BioRad</td><td>161-0158</td><td>Jel elektroforezi için</td></tr><tr><td>Amonyum persolfat</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td>Jel elektroforezi için</td></tr><tr><td>Glisin</td><td>BioRad</td><td>161-0718</td><td>Jel için elektroforez</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>161-0302</td><td>Jel elektroforezi için</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BioRad</td><td>161-0800</td><td>Jel elektroforezi için</td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioRad</td><td>161-0719</td><td>Jel elektroforezi için</td></tr><tr><td>Küvetler 0.1 cm</td><td>BioRad</td><td>1652089</td><td>Elektroporasyon için</td></tr><tr><td>Santrifüj 5415R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Allegra 21R</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kromatografi cihazı GradiFrac</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II elektroporasyon</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka Okuyucu 550</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniProtean 3 hücreli</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Güç Kaynağı</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonikatör 3000</td><td>Misonix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protein birlikte-ifade edilme yönlü faydalar<em&gt; escherichia coli</em

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Burada, Escherichia coli'de in vivo protein komplekslerinin ekspresyonunun in vitro olarak geleneksel sulandırma deneylerinden daha uygun olabileceğini bildiriyoruz. Özellikle, Escherichia coli DNA polimeraz III ε alt biriminin (3'-5' eksonükleaz aktivitesine sahip) zayıf çözünürlüğünün, aynı protein α ve θ alt birimleriyle (sırasıyla DNA polimeraz aktivitesi ve stabilize edici ε içeren) birlikte eksprese edildiğinde oldukça iyileştiğini gösteriyoruz. Ayrıca, E. coli'deki protein ko-ekspresyonunun, farklı bakteri türlerinden alt birimlerin fonksiyonel bir protein kompleksinde birleşme kabiliyetini verimli bir şekilde test etmek için kullanılabileceğini gösteriyoruz. Gerçekten de, Deinococcus radiodurans DNA polimeraz III'ün α alt biriminin, E. coli'nin ε alt birimi ile in vivo olarak birlikte eksprese edilebileceğini gösteriyoruz. Ek olarak, E. coli'de mutasyon frekansını modüle etmek için protein ko-ekspresyonunun kullanımını rapor ediyoruz. AraBAD promotörününün (arabinoz ile indüklenebilir) kontrolü altında vahşi tip ε alt birimini eksprese ederek ve aynı proteinin mutajenik D12A varyantını, lak promotörün kontrolü altında (izopropil-tiyo-β-D-galaktopiranosid, IPTG ile indüklenebilir) birlikte eksprese ederek, indükleyiciler arabinoz ve IPTG'nin uygun konsantrasyonlarını kullanarak E. coli mutasyon frekansını değiştirebildik. Son olarak, E. coli'de protein birlikte ekspresyonunun son gelişmelerini ve gelecekteki zorluklarını tartışıyoruz.

E. ε alt birimi E. coli DNA polimeraz III 243 amino asitten oluşur ve kalıntılar 187-243 17 silinir sürece, zayıf çözünürlüğe 17,18 bulunmaktadır. Bununla birlikte, daha önce tam uzunlukta α, ε ve θ alt birimlerinin birlikte ifadesi, çözünür bir DNA polimeraz III katalitik çekirdek (Şekil 1) elde edilir ki 11 göstermiştir. I) α ve ε alt birimden fazla sentezlenmesi, bağımsız olarak arabinoz ve IPTG sırasıyla (Şekil 1A) ile kontrol edile...

Protein ko-ekspresyonu, protein komplekslerinin in vitro olarak yeniden yapılandırılmasına güçlü bir alternatiftir ve in vivo biyokimyasal ve genetik testlerin gerçekleştirilmesinde yardımcı olur. Burada, protein kompleksleri elde etmek ve hücrelerin mutasyon frekansını ayarlamak için Escherichia coli'de protein ko-ekspresyonunun kullanımını rapor ediyoruz.

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, Escherichia coli içerisinde farklı proteinleri birlikte eksprese etmek ve bunların in vivo montajını değerlendirmektir. Bu, E. coli TOP10'un birlikte transforme edilmesi için iki uyumlu plazmid olan P bad ve P good kullanılarak gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, birlikte transforme edilmiş suş 30 °C'de kültüre edilir ve ardından proteinlerin aşırı eksprese edilmesi için indüklenir.Ardından, aşırı eksprese edilen proteinlerin etkileşimini analiz etmek amacıyla çözünür proteinler ekstrakte edilir ve jel filtrasyonuna tabi tutulur. Sonuçlar, e coli'de ko-ekspresyonun, in vivo olarak birleştirilmiş protein komplekslerinin üretimi için etkili bir araç olduğunu ve serbest protein alt birimlerinin düşük çözünürlüğünü aşmak için uygun olduğunu göstermektedir. Ko-ekspresyon, farklı proteinlerin tek hücrelerde aşırı eksprese edilmesine olanak tanıyarak biyokimyada güçlü bir araç sunmaktadır.Tekil genlerin aşırı ekspresyonunun, Lopi sayısı proteinlerinin incelenmesi için temel olduğu kabul edilebilir. Ancak, protein komplekslerinin incelenmesi söz konusu olduğunda; tekil proteinlerin aşırı ekspresyonunun yapılması, izole edilmesi ve in vitro ortamda yenid

the-multifaceted-benefits-of-protein-co-expression-in-escherichia-coli

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen...

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Protein kompleksleri önemli hücre fonksiyonlarını katalize eder. Birçok temel komplekslerinin detaylı fonksiyonel ve yapısal karakterizasyonu rekombinant üretimi gerektirir. MultiBac özellikle ökaryotik protein ve kompleksleri ifade etmek için özel bir bakülovirüs / böcek hücre sistemidir. MultiBac açık erişim platformu ve faydayı maksimize için geliştirilmiş standart çalışma prosedürleri olarak uygulanmıştır.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Bu beş günlük protokolü bütün adımlar, ekipman, ve esaslı etkili endojen Escherichia coli sıfırdan TX-TL hücre serbest ifade sistemi oluşturmak ve çalıştırmak için gerekli ek yazılım özetliyor. Reaktif ile protokol 8 kurulumu için saat veya daha az bir tepki toplamak ve işlem verileri alır.

Bir uygulama için Protokoller Escherichia coli Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Yeşil floresan proteini füzyon göre, Escherichia coli içinde rekombinant zar proteinlerinin ifadesi için tarama için bir aerodinamik bir yaklaşım sunulmuştur.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

Bu çalışma, pMGX plazmid sistemini kullanarak Escherichia coli'de tek bir plasmidden çoklu genlerin T7 aracılı co-ekspresyonu için yöntemleri açıklamaktadır.

İndüklenebilir T7 RNA Polimeraz aracılı Çok Boylu İfade Sistemi, pMGX

Sentetik Biyoloji Mühendisliği proteinlerin kanonik olmayan amino asitlerin co-translational ekleme kullanarak benzersiz özellikleri ile sağlar. Burada, GFP türü fluorophore "altın" floresan protein (GdFP) olarak adlandırdığı roman Floresans spektroskopik özellikleri ile hayalice kırmızı kaymıştır bir türevi E. coli seçici basınç birleşme (SPI) yolu ile nasıl üretilir sundu.

Mühendislik kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından 'Altın' floresan ve kütle spektrometresi ve floresan göre Protein analizi

Birden çok chimeric floresan füzyon protein geleneksel yöntemlerle zorlukları aşmak tesislerinde ortak ifade etmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Kaset protein ortak ifade ulaşmak için ifade birden çok fonksiyonel olarak bağımsız protein içeren bir tek ifade plazmid kullanarak yararlanır.

Bitkilerde etkin bir şekilde birden fazla Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade

Bu iletişim kuralı adımları, maliyetleri ve ekipman E. colioluşturmak için gerekli ayrıntıları-hücre özleri dayalı ve 4 gün içinde veya daha az vitro protein sentez reaksiyonları uygulamak. Bu platformun geniş uygulamalar için esnek yapısı kullanabilmeniz için biz uyarlanmış ve en iyi duruma getirilmiş reaksiyon koşulları tartışıyorlar.

Escherichia coli-boş hücre Protein sentezi dayalı: sağlam, esnek ve erişilebilir platform teknolojisi için iletişim kuralları

E. coli'de heterolog ekspresyon ve fransız presi kullanılarak hücrelerin lysis'inde üretilen membran vezikül preparatlarında proton-tahrikli membran taşıyıcılarının karakterizasyonu için bir yöntem tanımladık.

E. coli'de Heterolog Ekspresyon ile Membran Taşıyıcılarının Karakterizasyonu ve Membran Veziküllerinin Üretimi

Burada, bir dizi uyumlu vektör kullanarak diferansiyel olarak etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonu için bir yöntem açıklıyoruz, ardından in vitro olarak bir araya gelemeyen protein komplekslerini incelemek için geleneksel pulldown teknikleri izleniyor.

Pulldown Testi, Zorlu Protein-Protein Etkileşimlerini Test Etmek İçin Zaman Verimli Bir Araç Olarak Bakteri Hücrelerinde Ko-Ekspresyon ile Birleştiğinde

Öğrenin, Escherichia coli'de uyumlu plazmidler kullanarak protein birlikte-ifade etme yöntemiyle çözünürlüğü düşük protein komplekslerinin biyokimyasal analizini nasıl gerçekleştirebilirsiniz.

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar

Daha fazla video keşfet