Name: Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Metot 1615 ölçülmesi. II. Toplam kültürlenebilir virüs Deneyi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Öğrenin, Buffalo Green Monkey böbrek hücre hattı kullanarak su örneklerindeki bulaşıcı virüsleri kantitatif olarak ölçme yöntemini. Bu EPA Metot 1615 tabanlı protokol, içme ve çevresel sulardaki viral kirlilik risk değerlendirmelerini destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu çalışmada kullanılan Sabin poliovirüs serotip 3'ü sağladığı için ABD Tarım Bakanlığı, Marshfield, WI'dan Dr. Mark Borchardt'a teşekkür eder; Dynamac Corporation'dan Mary Jean See, Nancy Schable ve Jenifer Jones, BGM kültürlerinin hazırlanması için; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar ve Larry Wymer'e USEPA Metodu 1615'in genel değerlendirmesine katkıları için; Teknik yardım için Gretchen Sullivan; ve su örnekleri toplamamıza izin verdikleri için yerel özel kuyu sahipleri ve kamu hizmetleri. Bu çalışma USEPA tarafından gözden geçirilmiş ve yayınlanmak üzere onaylanmış olsa da, resmi Ajans politikasını yansıtmayabilir. Ticari isimlerin veya ticari ürünlerin belirtilmesi, kullanım için onay veya tavsiye teşkil etmez.

NOT: tanımların listesi için ek malzemeler bölüm S1 bakın. USEPA Yöntem 1615 ile ilişkili QA prosedürleri ek malzemeler bölümünde S2 açıklanmıştır. 1. Filtre Elüsyon Prosedürü <ol><li> Birinci akıtmada <ol><li> tamponlu% 1.5 sığır özü, pH 9.0, 500 ml yerleştirin dereceli bir silindire, oda sıcaklığına kadar ılıtıldı. Filtre kartuşu konut açın ve tamamen elektropozitif filtreyi kapsayacak şekilde sığır özü yeterli miktarda ekleyin. Filtre gövdesi kapağını değiştirin ve steril bir behere kalan sığır özü dökün. </li><li> temas süresi 1 dakika sonra, bir basınç kabı veya peristaltik pompa kullanılarak yavaş yavaş filtre ile steril bir beherde kalan birlikte gövde sığır özü solüsyonu geçirir. 2 L&#39;lik bir cam kabın içine eluat toplayın. </li></ol></li><li> İkinci elüsyon <ol><li> Tekrarlayın tamponlu% 1.5 sığır özü ilave 500 ml kullanılarak 1.1 AdımlarıAncak 15 dakika Adım 1.1.2 de temas süresini artırır. </li><li> Birinci akıtmada o ihtiva eden 2 L&#39;lik bir kap, ikinci elüsyon sığır eti ekstresi ekleyin. behere steril bir karıştırma çubuğu ilave edin. </li></ol></li></ol> 2. Organik Flokülasyonu Konsantrasyon Prosedürü <ol><li> en az 5 dakika boyunca 0,525% sodyum hipoklorit ile kombinasyonu tipi pH elektrodu sterilize edin. Steril dH 2 O ile elektrot durulayın ve sonra 0.05 M sodyum tiyosülfat ile dechlorinate. pH 4 ve 7 standartlarını kullanarak pH metre kalibre. </li><li> bir heyecan plaka üzerinde eluatın içeren behere koyun. plaka açın ve bir girdap oluşana kadar karıştırma hızını artırmak. </li><li> yavaş yavaş eluata 1.2 M HCl damla damla ilave edilerek 3.5 ± 0.1 eluat pH ayarlayın. Hızlı ekleme virüsü inaktive çünkü HCI damla damla ekleyin. Bir çökelti oluşmaya başlar Bu süre boyunca elüat parçalı hale gelir. </li><li> Karıştırma spe azaltmakDaha sonra yavaş karışmasına Ed ve 30 dakika için oda sıcaklığında 3.5 ± 0.1 de eluat pH&#39;sini izlenmesi ve bakımı ve devam eder. </li><li> 4 ° C&#39;de 2,500 x g&#39;de 15 dakika boyunca çökelen sığır özü bir veya daha fazla santrifüj şişelerine süspansiyon ve santrifüj dökün. santrifüj ve her iki aspirat şişeleri kaldırmak veya yavaş topak haline çökelti kaybını önlemek için süpernatant süzün. süpernatant atın. NOT: çökelti miktarı ve kalitesi sığır özü sürü arasında önemli farklılıklar olabilir. Diğer birçok o güçlükle erirken bazı sürü üretilen çökelti hızla eriyecektir. </li><li> çökeltiyi ihtiva eden bir santrfuj şişesine 0.15 M sodyum fosfat, 30 ml ekleyin. <ol><li> 0.15 M sodyum fosfat, 5 dakika içinde çözülür sığır özü partiden çökeltiler için pH 9.0 kullanın. Çökelti tamamen eritilir sonra 10 dakika süre ile karıştırılır ve daha sonra 2.7 aşamasından hemen gidin. </li><li> Diğer tüm çökeltiler için 0.15 M sodyum fosfat, pH 7.0-7.5 kullanın. , Ya da daha zor çökeltiler erimesi için 10-15 dakika karıştırın orbital bir karıştırıcı üzerinde 160 rpm&#39;de çalkalanarak çökelti, bir pipet ile karıştırılır sırasında tekrar tekrar yukarı ve aşağı çözeltisi çizerek, steril bir spatula ile ayırmak, veya bu prosedürlerin bir kombinasyonu ile. Not: birden fazla santrifüj şişesi kullanırken, sodyum fosfat az 30 ml kullanılarak çökeltiler birleştirmek ve daha sonra, bir şişe ya da kap içine çökeltiler birleştirildikten sonra şişe durulama 30 ml geri kalan kısmı kullanır. </li><li> Birleştirilen çökelti düz tabanlı bir santrfuj şişesine ise, şişeye bir karıştırma çubuğu ilave edin. 2.6.5 Adım gidin. </li><li> Birleştirilen Çökelti konik bir tabana sahip bir santrfuj şişesine ise, küçük bir cam beher içine aktarın ve beher bir karıştırma çubuğu ilave edin. </li><li> Bir manyetik karıştırıcı üzerine şişe veya behere koyun ve pr kadar karıştırınecipitate tamamen çözülene. </li><li> 0.525% sodyum hipoklorit ile bir kombinasyon tipi pH elektrodu yeniden sterilize ve Aşama 2.1&#39;de tarif edildiği gibi 0.05 M sodyum tiyosülfat ile dechlorinate. pH 7 ve 10 standartlar kullanılarak pH metre kalibre. Yavaş yavaş 1 M NaOH ile 9.0&#39;a tamamen çözünmüş çökelti pH oranını ayarlamak ve daha sonra 10 dakika boyunca karıştırılmıştır. </li></ol></li><li> karıştırma çubuğu çıkarın ve 4,000-10,000 x g&#39;de 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca çözülmüştür çökelti santrifüj. </li><li> Dikkatlice pelet bozmadan bir cam behere süpernatant dökün. beher bir karıştırma çubuğu ekleyin ve pelet atın. </li><li> Bir manyetik karıştırıcı üzerine behere koyun ve çözüm karıştırın. 7,0-7,5 pH ayarlamak için akıllıca 1.2 M HCI damla ekleyin. </li><li> Filtre% 1.5 sığır özü, 15 ml, 0.05 M glisin, pH 7.0-7.5 ile önceden tedavi edilmiş bir ön filtre ihtiva eden bir sterilizasyon filtresi yardımıyla geçirilerek süpernatant sterilize edin. </li><li> Deney Örnek Volume (S) hesaplamaları: <ol><li> Kullanım Denklem 1, Lab Müstahkem Boş ve Boş Lab reaktifi dışındaki tüm test numuneleri için S hesaplamak için <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq1.jpg" width="100" /> denklem 1 D (Analiz Edilmiş Orijinal Su Numune hacmi) Yeraltı 500 L olduğu, TSV (Toplam Örneklem Hacmi) laboratuvar tarafından alınan 5-inç elektropozitif kartuş filtreden geçirilir alan numune hacmi ve FCSV (Final Konsantre Örnek Hacmi) Adım 2.10 filtrasyon aşağıdaki birimdir. Bir örnek tamamlayıcı malzemeler Bölüm S4.1 gösterilmiştir. </li><li> Ve Boş Lab Reaktif (LRB; yani reaktif dereceli su kullanarak negatif kalite kontrol) 0.3 ile FCSV çarpılarak; Blank Lab Müstahkem (yani seribaşı reaktif dereceli su kullanılarak bir pozitif kalite kontrol LFB) için S hesaplayın. </li></ol></li><li> thre içine FCSV BölE alınan örnekler. <ol><li> 1.04 kat Testi Örnek Hacmi eşit bir hacmi ile alınan örnekler 1 ve 2 hazırlayın. ; Veya altında -70 ° C, toplam kültürlenebilir virüs tahlili (alt örnek 1, Adım 4) kullanılarak analiz veya 24 saat içinde (gösterilmemiştir) moleküler deneyleri için işlenemez eğer bu Alt-numûnelerin Freeze aksi halde, 4 ° C&#39;de tutun. </li><li> veya altında kalan hacmi (alt örnek 3) Freeze -70 ° C. </li></ol></li><li> 10 ile S bölerek Aşı Volume hesaplayın. </li></ol> 3. Toplam kültürlenebilir virüs Quantal Deneyi NOT: Tüm adımlar her zaman hücre tek tabaka rahatsız etmemek için dikkatli bir şekilde çözüm eklemek için. <ol><li> Durusu veya 3-6 gün sonra bölme de BGM hücrelerinin bir tek tabaka içeren test gemilerden aspirat medya ve sonra kaldırılır medyaya eşit dengeli tuz çözeltisi hacmi ekleyin. </li><li> Durusu veya hücre kültürü te gelen dengeli tuz çözeltisi aspirest gemiler kullanılan ve daha sonra hücre kültürü testi damarları aşılamak olan <ol><li> Toplam kültürlenebilir virüs quantal tahlil kontrolleri (ek malzemeler bölüm S2.4) ile birlikte Aşı Cilt eşit alt örnek 1 hacminde her test numunesi için 10 test damarları aşılamak. </li><li> (LFSM, yani, tohumlanmış sulu ortam örneği) LFB ve Lab Kuvvetlendirilmiş Örnek matris için bir seyreltici olarak alt örnek 3 ve 0.15 M sodyum fosfat, pH 7.0-7.5 kullanılarak 5-, 25- ve 125-kat seyreltiler hazırlanır. seyreltileri yapmak için bir yöntem örneği, ek malzemeler bölümü S3 verilmiştir. Aşama 3.2.1 içinde seyreltilmemiş alt örnek 1 ile aşılanmış kaplara ek olarak, her bir test kabına bir inokülüm hacimde kullanılarak her bir inceltilmiş serileri için 10 yıkanmıştır hücre kültür testi damarları inoküle. </li><li> inkübasyon 14 gün sonra 10 tekrarlı CPE vardır (Adım 3.2.2 aşılandı dışındaki) Adım 3.2.1 herhangi bir test örneği için, önceden (Adım 3.3)alt örnek 3. 5-, 25- ve 125- ve 625-kat seyreltme pare inoküle 10 toplam kültürlenebilir virüs quantal yeni bir dizi ile birlikte her bir test gemide bir Aşı Volume kullanarak her seyreltme serisi için hücre kültürü testi gemileri yıkanır tahlil kontrolleri (ek malzemeler bölüm S2.4). </li><li> ileri ve geri damarları eğerek hücre mono tabakaları yüzeyi üzerinde inokulum dağıtın. 1-5 titreşimler / dakika ya da mevcut olan herhangi bir virüs hücrelere tutunmasını sağlamak için kapların her 15-20 dakikada bir sallanan mekanik sallanan bir platform üzerinde 80-120 dakika için oda sıcaklığında test kapları inkübe edin. </li><li> önceden ısıtılmış bakım orta ekleyin ve sonra 36.5 ± 1 ° C&#39;de deney gemileri kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol></li><li> ayarlanmış bir dondurucuya ≥75% CPE gösterir herhangi bir test gemiler gün 14. Transferi kadar onları her 2-3 günde incelemek sonra ilk 3 gün günde bir mikroskop kullanılarak her test kabında CPE görünüm için bakın ve ya-70 ° C&#39;nin altında ° C. veya altında kalan tüm kültürleri ve toplam kültürlenebilir virüs quantal tahlil kontrolleri Freeze -70 ° C son gününde gemileri inceledikten sonra. </li><li> tüm kültürleri çözülme ve 0.2 mikron sterilizasyon filtresi yardımıyla her CPE-pozitif test kabından orta ≥15% filtre. Belirtilen hacim 1,500-18,000 x g&#39;de 10 dakika süre ile tıkanması, santrifüj, filtre içinden geçerek orta geçirilir ve filtrasyona 4 ° C önceden edilemezse. </li><li> Yıkanmış BGM testi gemileri kullanarak tüm 1. geçiş testi gemilerin ikinci geçişini gerçekleştirin. <ol><li> Tüm negatif test damarlardan ve olumlu damarlardan süzülmüş ortamdan çözülmüş ortamın% 10 temsil eden bir aşılama hacmi ile yeni test damarları aşılamak. </li><li> Tekrarlayın 3.2.4-3.4.3 adımları, ancak adım 3.3 tarif edildiği gibi 2 nd 1 st geçit üzerinde olumsuz ve olumlu oldu herhangi bir test gemi dondurmak. Bir 3. geçmek gerçekleştirinYalnızca negatif tahlil kontrolleri ve 2. pasajda 1. geçişi sırasında negatif ve pozitif hücre kültürleri kullanılarak 2. geçişi için tarif edildiği gibi yaşı. </li></ol></li><li> Onlar 1. ve 2. pasaj ya da her ikisi de CPE gösterdiğinizde CPE 2. pasajda kadar hem 2. ve 3. geçitleri oluşmaz durumunda, virüs pozitif olarak bireysel test damarları belirleyin. </li><li> Tüm test numunelerinin virüs titreleri hesaplamak için Tablo S2 gösterildiği gibi ayarlanan varsayılan program ayarları ile USEPA En Muhtemel Sayı Hesaplama kullanın. <ol><li> Giriş MPN / ml değeri (M mL) ve üst (CL UML) ve alt (CL lmL)% 95 güven sınırları / ml değerlerini belirlemek için hesap makinesi içine her bir test numunesi için adım 3.6 virüs pozitif çoğaltmak testi gemilerin sayısı . </li><li> ODenklem 2 kullanılarak ilgili test örneğinin EMS / L değeri (M L) btain. <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq2.jpg" width="100" /> denklem 2 M ml Adım 3.7 EMS / ml değeri, S Deneyi Numune Hacmi ve D Analiz Edilmiş Orijinal Su Numune hacmi olduğunu. </li><li> M ml değeri CL UML değerini ikame ederek üst güven sınırı / L hesaplayın. M ml değeri CL lmL değerini yerine göre alt güven sınırı / L hesaplayın. Bir örnek hesaplama ek malzemeler Bölüm S4.2 gösterilmiştir. </li><li> 0 / D 1 ≤ olarak Raporu M ml değerleri. Örneğin, yeraltı suyu örnekleri için 0.002 EMS / L (≤ 1/500 L) ≤. </li><li> Sert her Lab MPN ve% 95 güven sınır değerlerini hesaplamak Boş ve Lab Reİlk S tarafından hesap elde edilen değerler / ml çarpılması ve daha sonra 0.3 ile sonuç bölerek Boş ajan. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bradbury, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+and+transport+of+human+enteric+viruses+in+deep+municipal+water+supply+wells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Source and transport of human enteric viruses in deep municipal water supply wells.</a> Environ. Sci. Technol. 47 (9), 4096-4103 (2013).</li>
<li>Aslan, A., Xagoraraki, I., Simmons, F. J., Rose, J. B., Dorevitch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+adenovirus+and+other+enteric+viruses+in+limited-contact+freshwater+recreational+areas+and+bathing+waters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Occurrence of adenovirus and other enteric viruses in limited-contact freshwater recreational areas and bathing waters.</a> J. Appl. Microbiol. 111 (5), 1250-1261 (2011).</li>
<li>Begier, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outbreak+of+concurrent+echovirus+30+and+coxsackievirus+A1+infections+associated+with+sea+swimming+among+a+group+of+travelers+to+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">An outbreak of concurrent echovirus 30 and coxsackievirus A1 infections associated with sea swimming among a group of travelers to Mexico.</a> Clin. Infect. Dis. 47 (5), 616-623 (2008).</li>
<li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming%2C+2001%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li>
<li>Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. Norovirus gastroenteritis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGlass%2C+RI+%22N.Engl.J.+Med%22">N.Engl.J. Med</a>. 361 (18), 1776-1785 (2009).</li>
<li>Khetsuriani, N., Lamonte-Fowlkes, A., Oberst, S., Pallansch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterovirus+surveillance--United+States%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Surveill.+Summ%22%5BJournal%5D)">Enterovirus surveillance--United States.</a> MMWR Surveill. Summ. 55 (8), 1-20 (2006).</li>
<li>Sawyer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterovirus+infections%3A+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Pediatr.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Enterovirus infections: diagnosis and treatment.</a> Semin. Pediatr. Infect. Dis. 13 (1), 40-47 (2002).</li>
<li>Abzug, M. J. The enteroviruses: an emerging infectious disease? The real, the speculative and the really speculative. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbzug%2C+MJ+%22Hot+Topics+in+Infection+and+Immunity+in+Children%22">Hot Topics in Infection and Immunity in Children</a>. Finn, A., Pollard, A. J. , Springer. (2008).</li>
<li>Harris, J. P., Edmunds, W. J., Pebody, R., Brown, D. W., Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deaths+from+norovirus+among+the+elderly%2C+England+and+Wales%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Deaths from norovirus among the elderly, England and Wales.</a> Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1546-1552 (2008).</li>
<li>Ho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Epidemic+of+Enterovirus+71+Infection+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+J.+Med%22%5BJournal%5D)">An Epidemic of Enterovirus 71 Infection in Taiwan.</a> New England J. Med. 341 (13), 929-935 (1999).</li>
<li>Bae, J., Schwab, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+murine+norovirus%2C+feline+calicivirus%2C+poliovirus%2C+and+MS2+as+surrogates+for+human+norovirus+in+a+model+of+viral+persistence+in+surface+water+and+groundwater%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of murine norovirus, feline calicivirus, poliovirus, and MS2 as surrogates for human norovirus in a model of viral persistence in surface water and groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (2), 477-484 (2008).</li>
<li>Ward, R. L., Knowlton, D. R., Winston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inactivation+of+enteric+viruses+in+fresh+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inactivation of enteric viruses in fresh water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 52 (3), 450-459 (1986).</li>
<li>Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Source+Water+Quality+on+Chlorine+Inactivation+of+Adenovirus%2C+Coxsackievirus%2C+Echovirus%2C+and+Murine+Norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effects of Source Water Quality on Chlorine Inactivation of Adenovirus, Coxsackievirus, Echovirus, and Murine Norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (15), 5159-5164 (2010).</li>
<li>Dahling, D. R., Wright, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+BGM+cell+line+culture+and+viral+assay+procedures+for+monitoring+viruses+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of the BGM cell line culture and viral assay procedures for monitoring viruses in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 51 (4), 790-812 (1986).</li>
<li>Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W. 3rd, Dahling, D. R., Stetler, R. E. EPA/600/R-95/178. ICR Microbial Laboratory Manual. , U.S. Environmental Protection Agency, I. (1996).</li>
<li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li>
<li>USEPA. 40 CFR Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems Final Rule. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Federal+Register%22">Federal Register</a>. 77 (85), 26072-26101 (2012).</li>
<li>USEPA. 40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Federal+Register%22">Federal Register</a>. 61 (94), 24353-24388 (1996).</li>
<li>Shaw, S., Regli, S., Chen, J. Virus occurrence and health risks in drinking water . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+S+%22Information+Collection+Rule+Data+Analysis%22">Information Collection Rule Data Analysis</a>. McGuire, M. J., McLain, J. L., Obolensky, A. , AWWA Research Foundation and American Water Works Association. 437-462 (2002).</li>
<li>Lieberman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieberman%2C+RJ+%22Microbial+monitoring+of+vulnerable+public+groundwater+supplies%22">Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies</a>. , American Water Works Association. Denver, CO. (2002).</li>
<li>Lukasik, J., Scott, T. M., Andryshak, D., Farrah, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+salts+on+virus+adsorption+to+microporous+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of salts on virus adsorption to microporous filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66 (7), 2914-2920 (2000).</li>
<li>Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+an+enterovirus+sewage+surveillance+system+by+comparison+of+clinical+isolates+with+sewage+isolates+from+milwaukee%2C+wisconsin%2C+collected+august+1994%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (2003).</li>
<li>Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+using+a+positively+charged+microporous+filter+and+ultrafiltration+for+concentration+of+viruses+from+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (10), 3500-3506 (2011).</li>
<li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li>
<li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples%3A+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

USEPA Yöntem 1615 Kontrolsüz Kirletici İzleme Yönetmelik üçüncü izleme döngüsü (UCMR3) 17 sırasında kullanılmak üzere geliştirilmiş ve öncelikle yeraltı virüs oluşumunu ölçmek için tasarlanmıştır. Bu Bilgi Toplama Kuralı (ICR) yöntemiyle, 15,18 ile ortak bir takım adımlar paylaşan ancak iki küçük farklılıklar vardır. Hem En Muhtemel Sayı (MPN) hesaplamalara dayalı olan kantitatif ile BGM hücre mono tabakaları üzerinde CPE üretmek virüs ölçmek için quantal tahliller kullanın. Yöntem 1615 çeşitli su matrisleri virüsü konsantre edilmesi için yeni bir elektropozitif filtrenin kullanımını sağlar ve hücre kültür testi kap sayısı 20 ile her iki küçük değişiklikler, genel yöntem maliyetlerini azaltmak 10. seyreltme başına replike azaltır. çoğaltır sayısındaki azalma emek azaltır, ancak biraz daha düşük bir belirleme sınırına yol açar. Yeraltı suları yüzey suları daha virüsün düşük konsantrasyonlarda olması beklenmekle birlikte, 19,20 incitahlil numunenin e miktarı farklılıkların kısmen telafi yüzey suyunun beş katıdır. Daha az çoğaltır kullanımı çoğu yüzey suları için yeterli olacaktır, ancak bazı örnek seyreltme gerektirir. Yöntem 1615 pek çok kritik adımlar ve sınırlamaları vardır. Sığır ekstreler partiden partiye değişebilir. açıklanan ek malzemeler bölümü S2.3 olduğu gibi her yeri virüs elüsyon etkinliği ve ikincil konsantrasyon adımlarda virüs konsantrasyonu için kapasite için test edilmelidir. yöntem BGM hücre kültürleri üzerine aşılamak için ve virüs titreleri belirlemek için numune miktarını hesaplamak için kesin formüller kullanır. Bu formüller titizlikle takip edilmezse hatalı sonuçlar oluşacaktır. Uygun aseptik teknik hücre kültürlerinin bakımı için kullanılmalıdır. 14 günlük kuluçka döneminde sıkıntı göstermek bulaşmamış BGM hücre kültürü kontrolleri olasılıkla hücre kültürü bakımı ile ilgili sorunlar göstermektedir. Büyük bakım da ta olmalıken aşılanması ve çapraz bulaşmayı önlemek için hücre kültürü şişeleri orta eklenmesi ile ilgili adımları pipetle sırasında. Tamamlayıcı malzemeler Bölüm S2 açıklanan kalite kontrolleri titizlikle uyulmalıdır. Bölüm S2 de kalite sorunları için sorun giderme tavsiyelerde bulunur. Filtreleri elektropozitif virüs adsorpsiyon birincil mekanizma filtre üzerinde pozitif bir yük gücü ve izoelektrik noktası ile ilgili virüsün &#39;negatif yük gücü ve 21 test edilen suyun pH&#39;sı ile ilgili bir yük etkileşimdir. filtresi elüsyon ayrıca etkileşimlerin gücündeki etkilenir. onlar virüs türleri arasında ve hatta aynı tür içinde suşları arasında farklılık olduğundan, filtreler sağım tekdüze değildir. Bu, herhangi bir sonuç çevresel sularda bulunan virüsün gerçek düzeyini hafife anlamına gelir. Tek BGM hücre çizgisinin kullanımı da virüs oluşumunu göz ardı etmektedir. Menziltemel olarak poliovirüsler ve Enterovirüs B türlerinin serotipleri gibi bazı reovirüsler 14,15,22 sınırlıdır, bu hücre hattında CPE üretebilir enterik virüs. Diğer bulaşıcı virüs türleri tespit olmayacaktır. Zemin ve reaktif dereceli sularından poliovirus kazanımları hem Performans Değerlendirme (PE için USEPA Yöntem 1615 performans kabul kriterlerini, yani, başlamadan önce analisti performansını değerlendirmek için kullanılan bir analist bilinmeyen titreleri ile ekildi reaktif dereceli su numuneleri bir çalışmada) ve LFB örneklerinde (ek malzemeler Tablo S1). Kültür prosedürü kullanılarak yeraltı suyundan% 58 geri kazanım musluk suyu 23,24 kullanarak başkaları tarafından bildirilen benzerdir. varyasyon katsayısı% 100 (CV) ile% 111 arasında LFB örneklerinden ortalama kurtarma ayrıca PE örneklerinde gözlenen daha yüksek olsa da yöntem performans kabul kriterlerini DURICR ing. ICR ortalama laboratuvarda kazanımları% 85 (; ICR PE veritabanından yayınlanmamış veriler özgeçmişler 58 131%) 36&#39;dan farklılık ise laboratuarlar arası iyileşme% 92 varyasyon (CV) katsayısı ile% 56 idi. Daha yüksek geri kazanımlar yüksek tohum örneklerinin (122% 42 karşı) için daha düşük tohum LFB numuneler için bu çalışmada gözlenmiştir. ICR planlanan edildiğini zamanda, düşük tohum değerleri alan PE örnekleri bu yüksek tohum alma, alt kurtarma olurdu bekleniyordu. LFB örnekleri burada gözlenene benzer, ICR PE örnekleri için çocuk felci virüsü geri tohum değerleri için (CV% 100),% 54 (CV% 69) ve% 44 (CV% 71)% 71 ≤300 EMS, 300- sırasıyla 1.500 MPN ve&gt; 1500 MPN. Su örnekleri 25 bulaşıcı bir virüs ölçmek için bir çok yöntem vardır. Bu yöntem, standartlaştırma derecesi diğer yöntemlere göre önemlidir. standardizasyon, kalite ve performans denetimleri içerir sadeceaynı zamanda tüm analitik laboratuvarlar aynı yöntemi gerçekleştirmek sağlamak için tanımlanmış hacimleri ve formülleri kullanır. standardizasyon olmadan, o laboratuvarlar arasında sonuçlarını karşılaştırmak zordur ve çok sayıda analitik laboratuvarlarda büyük ölçekli çalışmalar yaparken, bu nedenle standardizasyon gereklidir. Yerleşik standardizasyon ile bu yöntem ek virüs türleri ve hücre çizgilerini içerecek şekilde gelecekte genişletilmesi gerekmektedir. Araştırma yönteme adenovirüs dahil edilmesi için veri sağlamak için devam etmektedir.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.
The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:
 These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2), 
 
 to: 
 
 These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).
 
The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:
 The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR, 
 
 to: 
 
 The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.

Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Enterik virüsler insan bağırsak sistemi bulaştırmak ve fekal-oral yolla bulaşan virüsler bir gruptur. Bu virüsler atık su arıtma tesisi ve fosseptik atıkları, yanlış tasarlanmış veya kırık septik tanklar, kırık kanalizasyon hatları, kombine kanalizasyon taşmaları ve diğer noktası ve noktasal olmayan kaynaklardan 1-4 ile yüzey ve yeraltı sularını girin. su bazlı virüslere karşı insan enfeksiyonları ve hastalık kontamine veya yetersiz dezenfekte su tüketimi yoluyla ya da eğlence su temas yoluyla meydana gelir. Hastalık belirtileri şiddetli gastroenterit hafif içerebilir; konjunktivit; ateş; Üst solunum sıkıntısı; el, ayak ve ağız hastalığı; miyokardit; aseptik menenjit; ensefalit; felç; sepsis 5-8 ve ölüm 9,10. USEPA Yöntem 1615 çevresel ve içme sularında bulaşıcı enterik virüs parçacıkları ölçmek için bir yordam sağlar. Bu sular içerebilirbulaşıcı ve bulaşıcı olmayan virionlar karışımı, ancak bulaşıcı parçacıklar potansiyel sağlık tehlikesi oluşturmaktadır. Bulaşıcı virüs parçacıkları nedeniyle 11-13 mevcut olabilecek herhangi bir dezenfektan protein kapsid bütünlüğü nedeniyle UV ışığı radyasyon ve hasara nükleik asitlere HASARDAN çevre içme sularında zaman enfeksiyon kaybeder. yöntem temin toplam kültürlenebilir virüs prosedürü Buffalo Green Monkey türü maymun böbrek (BGM) hücre hattına sitopatik etkiler (CPE) üretimine dayanır. Bu hücre hattı tespit bulaşıcı bir virüs türlerinin aralığı belli enterovirüsler 15 öncelikle kısıtlı olsa bile, çünkü çevre viroloji alanında 14,15 yılında yaygın kullanımı seçildi. Bu çalışmanın amacı, beş inçlik electropositive kartuş filtreler elüsyon, ikincil konsantrasyon ve toplam Yetiştirilebilen virüslerin ölçümü için Yöntemi 1615 prosedürlerini tarif etmektir. bir değerlendirmeGenel olarak yöntem, Cashdollar ve ark., 16 tarif edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Sığır özü, kurutulmuş toz</td><td>BD Bacto</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>Kriyojenik tüpler</td><td>Thermo Fisher</td><td>3775/945373</td><td></td></tr><tr><td>Hank' S Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Mekanik sallanan platform</td><td>Daigger</td><td>EF4907G</td><td></td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-285-729</td><td></td></tr><tr><td>Ön filtreli sterilizasyon filtresi</td><td>VWR</td><td>28143-295</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizasyon şırınga filtresi</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>pH Standartları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33643, 33646, 33648</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1018 veya M4642</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat, %7.5</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin, EDTA</td><td>İnvitrojen</td><td>25200072</td><td></td></tr></tbody></table>

enterovirus kültür ve rt-qpcr su norovirus oluşum epa metot 1615 ölçülmesi. ii. toplam kültürlenebilir virüs deneyi

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Çevre ve içme sularında virüs oluşumu ile ilgili ulusal çalışmalarda birden fazla analitik laboratuvar kullanıldığında standartlaştırılmış bir yöntem gereklidir. ABD Çevre Koruma Ajansı'nın (USEPA) Yöntem 1615, bu sulardaki Enterovirüs ve Norovirüsü ölçmek için böyle bir standart sağlamak amacıyla geliştirilmiştir. Virüs, elektropozitif bir filtre kullanılarak sudan konsantre edilir, sığır özü ile filtre yüzeyinden ayrıştırılır ve daha sonra organik flokülasyon kullanılarak daha fazla konsantre edilir. Burada, filtre elüsyonu, ikincil konsantrasyon ve toplam kültürlenebilir virüslerin ölçümü için Yöntem 1615'in protokolünü sunuyoruz. Her numuneden elde edilen konsantre elüatın bir kısmı, Buffalo Green Monkey böbrek hücrelerinin on kopya şişesine aşılanır. Sitopatik etkiler gösteren şişelerin sayısı, litre başına en olası enfeksiyöz birim sayısını (MPN) ölçmek için kullanılır. Yöntem, veri kalitesini artırmak ve laboratuvarlar arası ve laboratuvar içi varyasyonu azaltmak için bir dizi kalite kontrolü kullanır. Laboratuvarlar tanımlanmış performans standartlarını karşılamalıdır. Yöntem 1615, Sabin poliovirüsü tip 3 ile tohumlanmış reaktif dereceli ve yeraltı sularından virüs geri kazanımı incelenerek değerlendirildi. Toplam kültürlenebilir tahlil ile ortalama poliovirüs geri kazanımları, reaktif dereceli sularda %111 ve yeraltı sularında %58 idi.

Virüs üç içme suyu arıtma tesisleri ve özel kuyu kullanarak elektro filtrelerin kaynak yeraltı suyundan konsantre edildi. Bir alan numune ve LFSM kontrol oluşan iki örnek setleri, ayrı olayda arıtma tesislerinden toplanmıştır ve bir örnek seti özel kuyudan toplanmıştır. Her bir numune ile birlikte kullanıldığında tohum EMS değeri doğru bir şekilde bağlı belirlenemedi çünkü genel olarak, virüs veri hesaplama alınmadı bitkiler ve kuyu (bir bitki ve diğerinden numuneden iki numune ikisinden LFSM numuneleri kullanılarak belirlendi çoğaltmak şişeler arasında anormal CPE sonuçları) için. Yeraltı suyu örneklerinden polio kurtarma ortalama (Şekil 2) 16% 79 bir farklılaşma katsayısı ile% 58 ortalama. Hiçbir kültürlenebilir virüs yinelenen giremeyen yeraltı suyu alan örneklerinin hiçbirinde tespit edildi. Yöntem performansı da LFB s kullanılarak ölçüldüamples iki farklı tohum seviyeleri kullanılarak modifiye. poliovirus 1000 MPN de performansını test etmek için kullanılan bir poliovirus 300 MPN A &quot;düşük&quot; titre USEPA Yöntem 1615 A ​​&quot;yüksek&quot; titre kullanılan &quot;standart&quot; 500 MPN LFB seviyesinden daha az seviyelerde performansını değerlendirmek için kullanıldı LFSM kontrol seviyesi. Bu kontroller,% 111 bir ortalama iyileşme ve% 100 bir farklılaşma katsayısı (Şekil 2) benzer şekilde yapılmıştır. Tüm LRB numuneler negatif ve tüm LFB örnekleri kabul aralığı (ek malzemeler Tablo S1) içinde gerçekleştirilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig1.jpg" /> Şekil 1. Filtre elüsyon. Kartuş filtre, yıkama için bir basınç kabı kullanılması için bir şematik gösterilmiştir. Pozitif hava basıncı kartuş yuvası con boyunca basınç kabında biftek ekstresi çözeltisi itmek için kullanılırelektropozitif kartuş filtre taining. pompanın giriş sığır özü çözeltinin bulunduğu kabın içine yerleştirilmeden bir peristaltik pompa, basınç kabı için ikame edilebilir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig2.jpg" /> Ground gelen Şekil 2. Ortalama Poliovirüs Kurtarma (%) ve Reaktif-Grade su. Ortalama yüzde kurtarma yerden poliovirüs için gösterilir ( <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52437/52437fig3.jpg" /> ; n = 4) ve distile su ( <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52437/52437fig4.jpg" /> ; n = 12) örnekler. oniki reaktif dereceli su numuneleri altı poliovirus 1000 MPN ile tohumlanan 300 MPN ve altı ile seribaşı dahil. Hata çubukları standart hatasını temsil eder.

Burada, Buffalo Green Monkey böbrek hücresi hattını kullanarak toplam kültürlenebilir virüsleri ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. Prosedür, çevresel ve içme sularında bulaşıcı virüslerin oluşumunu ölçmek için standartlaştırılmış bir araç sağlar.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Metot 1615 ölçülmesi. II. Toplam kültürlenebilir virüs Deneyi

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

Aşağıdaki protokolün genel amacı, bir su örneğindeki enfeksiyöz virüs partikülleri seviyesini ölçmektir. Bu işlem, içme suyu veya çevre suyundan virüs konsantrasyonu yapılmış elektro-pozitif bir filtreden, negatif yüklü virüs partiküllerini elüe etmek için alkali bazlı bir ekstrakt çözeltisi kullanılarak gerçekleştirilir. Virüslerin elektro-pozitif bir kartuş filtre üzerinde toplanması, bu serinin Birinci Bölümünde ele alınmıştır.İkinci adım olarak, elüatın pH değeri yavaşça düşürülür; bu işlem, numunede bulunan bu ekstrakt proteinlerinin ve virüsün çökelerek flok oluşturmasını sağlar. Ardından flok, santrifüjle toplanır, sodyum fosfat tamponunda çözülür ve bakteri ile küfü uzaklaştırmak için filtre sterilizasyonundan geçirilir. Sonrasında, konsantre edilmiş nihai elüat Buffalo yeşil maymun böbrek hücrelerine inoküle edilir ve virüs replikasyonunu tespit etmek amacıyla hücreler 14 gün boyunca sitopatik etki (CPE) açısından gözlemlenir.Hücreyle ilişkili tüm virüs partiküllerini serbest bırakmak için, 14 günün sonunda veya herhangi bir flasktaki CPE %75 veya daha fazla olduğunda tüm hücre flaskları dondurulur. CPE'nin virüs replikasyonundan kaynaklandığını teyit etmek için yapılan ikinci ve üçüncü pasajların ardından, analiz edilen her bir örneğin litre başına en olası sayısını belirlemek için bir En Olası Sayı (Most Probable Number, MPN) hesaplama programı kullanılır. Nihayetinde, EPA Metot 1615'in toplam kültürlenebilir virüs asit bileşeni, su örneğindeki enfeksiyöz virüs partiküllerinin seviyesine dair bir ölçüm sağlar.Bu toplam virüs analizi, EPA Yöntem 1615'in yalnızca bir bileşenidir. Yöntemin tamamı, içme ve çevre sularındaki enterovirüs ve norovirüs oluşumunu ölçer. Herhangi bir virüs bulgusu, daha sonra içme ve rekreasyonel sulardaki bu virüslere maruz kalma riskini ölçmek için girdi verisi olarak kullanılabilir.Bu protokolün temel avantajı, sudaki virüslerin ölçümü için standartlaştırılmış tek bir yaklaşım sunmasıdır. Bu yaklaşım aslında 1996 yılında yayınlanan Bilgi Toplama Kuralı (Information Collection Rule) yöntemine dayanmaktadır. Yeni başlayanların bu yöntemle ilgili yaşadığı temel sorunlar, BGM hücre hattını kontaminasyondan uzak tutmak ve CPE'yi, yani sitopatik etkileri çözümlemektir.Shay Fout ve ben, hücre kültürü tekniğinin ardından, elüsyon ve organik flokülasyon prosedürlerini uygulamalı olarak göstereceğiz. İlk elüsyonu gerçekleştirmek için, dereceli silindire oda sıcaklığında 500 milliliters buffered %1.5 sığır özütü (pH 9.0) yerleştirin. Ardından, filtre kartuş haznesini açın ve elektropozitif filtreyi tamamen kaplayacak miktarda sığır özütü ekleyin.Sığır özütünün geri kalanını bir behere aktarın. Filtre gövde kapağını kapatın. Bir dakikalık temas süresinin ardından, peristaltik bir pompa ve steril hortum kullanarak, hem gövde içerisindeki hem de beherde kalan sığır özütü çözeltisini yavaşça filtreden geçirin.Elüatı steril 2 litrelik cam bir behere toplayın. Bu adımları, 15 dakikalık bir temas süresi kullanarak, ek 500 mililitre tamponlu %1,5 sığır özütü ile tekrarlayın. İkinci elüsyondan elde edilen sığır özütünü, ilk elüsyondan gelenlerin bulunduğu 2 litrelik behere ekleyin ve behere steril bir manyetik karıştırıcı çubuk yerleştirin.Elüatı içeren beheri bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin. Karıştırıcıyı açın ve bir girdap oluşana kadar karıştırma hızını artırın. 1,2 molar hidroklorik asit veya HCl'yi damla damla ekleyerek elüatın pH değerini yavaşça 3,5 ± 0,1'e ayarlayın.Asidi damla damla ekleyin, çünkü hızlı ekleme virüsü inaktive edecektir. Bu süre zarfında, çökelek oluşmaya başladığından eluat bulanıklaşacaktır. Karıştırma hızını düşük seviyeye indirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca eluatın pH değerini 3,5 ± 0,1 seviyesinde izlemeye ve korumaya devam edin.Ardından, çöktürülmüş sığır özütü süspansiyonunu bir veya daha fazla santrifüj şişesine aktarın ve 4 °C'de, 2.500 ×g hızında 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Şişeleri santrifüjden çıkarın ve peletlenmiş çökeleğin kaybını önlemek için üst fazı (süpernatantı) yavaşça dekante edin. Üst faz atılabilir.5 dakika içinde çözünen sığır özütü lotları için, çökelti içeren santrifüj şişesine 30 mililitre 0,15 molar sodyum fosfat (pH 9,0) ekleyin. Beş dakika içinde çözünmeyen çökeleklerin çözündürülmesine ilişkin talimatlar için metin protokolüne bakın. Çökelti tamamen çözündükten sonra 10 dakika boyunca karıştırın.Ardından, manyetik karıştırıcıyı çıkarın ve çözünmüş çöktürücüyü 4 °C'de, 4.000 ila 10.000 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı, peleti rahatsız etmeden dikkatlice cam bir behere aktarın. Behere bir manyetik karıştırıcı ekleyin ve peleti atın.Beheri manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin ve çözeltiyi karıştırın. pH değerini 7,0 ile 7,5 arasına ayarlamak için damla damla 1,2 molar HCL ekleyin. Süpernatantı, 15 mililitre pH 7,0 ile 7,5 arasında tamponlanmış %1,5 sığır özütü ile ön işlem görmüş bir ön filtre içeren sterilize edici bir filtreden geçirerek filtre sterilizasyonu yapın.Tüm test örnekleri için Analiz Örnek Hacmini veya S'yi hesaplamak için metin protokolüne bakın. Ardından, S değerini 10'a bölerek İnokülüm Hacmini hesaplayın. Bu hesaplamaları kullanarak, filtre sterilizasyonu sonrası elde edilen son konsantre örnek hacmini, metin protokolünde açıklandığı şekilde üç alt örneğe ayırın.Her bir test örneği için, BGM hücrelerinin tek katmanını içeren 10 adet test kabına, alt örnek birin hacmi olan İnokülasyon Hacmi kadar örnek ve toplam kültüre edilebilir virüs kantal analiz kontrollerini ekleyerek inoküle edin. Laboratuvar Güçlendirilmiş Kör ve Laboratuvar Güçlendirilmiş Örnek Matrisi için, alt örnek üç ve dilüent olarak 0,15 molar sodyum fosfat, pH 7,0 ila 7,5 kullanarak beş, 25 ve 125 katlık dilüsyonlar hazırlayın. Seyreltilmemiş alt örnek bir ile inoküle edilen kaplara ek olarak, her bir dilüsyon serisi için 10 adet yıkanmış hücre kültürü test kabını, her bir test kabında bir İnokülasyon Hacmi kullanarak inoküle edin.Kapları ileri-geri eğerek inokülümü hücre tek tabakalarının yüzeyine dağıtın. Mevcut virüslerin hücrelere absorbe olmasını sağlamak için test kaplarını oda sıcaklığında, dakika başına bir ila beş salınım yapan mekanik bir sallama platformunda veya kapları her 15 ila 20 dakikada bir sallayarak 80-120 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, test kaplarına önceden ısıtılmış idame besiyeri ekleyin ve kapları 36,5 ± 1 °C'de inkübe edin.İlk üç gün boyunca her bir test kabında sitopatik etkilerin oluşup oluşmadığını mikroskop kullanarak inceleyin ve ardından 14. güne kadar her iki veya üç günde bir kontrolleri tekrarlayın. %75'ten fazla sitopatik etki gösteren tüm test kaplarını, -70 °C veya daha düşük sıcaklığa ayarlanmış bir dondurucuya aktarın. Son günde kapları inceledikten sonra, geri kalan tüm kültürleri ve toplam kültüre edilebilir virüs miktar analizi kontrollerini -70 °C veya daha düşük sıcaklıkta dondurun.Ardından, tüm kültürleri çözdürün ve CPE-pozitif olan her test kabındaki besiyerinin %15'inden fazlasını 0,2 mikronluk sterilizasyon filtresinden süzün. Bir sonraki adım, yıkanmış BGM böbrek hücresi test kaplarını kullanarak tüm birinci pasaj test kaplarının ikinci pasajını gerçekleştirmektir. Bunun için, yeni test kaplarını tüm negatif test kaplarından çözdürülen besiyerinin yanı sıra pozitif kapların filtrelenmiş besiyerini temsil eden %10'luk bir inokülasyon hacmiyle ekimleyin.İlk pasaj için uygulanan adımları tekrarlayın; ilk pasajda negatif olup ikinci pasajda pozitif sonuç veren tüm test kaplarını dondurun. Ardından, yalnızca negatif analiz kontrollerini ve ilk pasajda negatif olup ikinci pasajda pozitifleşen hücre kültürlerini kullanarak, ikinci pasaj için tanımlanan prosedürle üçüncü bir pasaj gerçekleştirin. Sitopatik etkilerin hem birinci hem de ikinci pasajda görüldüğü veya sitopatik etkinin ikinci pasajdan önce ortaya çıkmadığı durumlarda, hem ikinci hem de üçüncü pasajda görüldüğü bireysel test kaplarını virüs pozitif olarak tanımlayın.Tüm test örneklerinin virüs titrelerini hesaplamak için, varsayılan program ayarları metin protokolünde belirtildiği şekilde ayarlanmış olan A.B. Çevre Koruma Ajansı'nın En Olası Sayı Hesaplayıcısını kullanın. Ardından, mililitre başına bulaşıcı birimlerin En Olası Sayısı için elde edilen değerleri, mililitre başına üst ve alt güven sınırlarıyla birlikte, metin protokolünde açıklandığı üzere litre başına bulaşıcı birimlerin En Olası Sayısını ve ilgili güven sınırlarını hesaplamak için kullanın. Toprak ve reaktif saflığındaki su örneklerinden elde edilen Poliovirus için ortalama geri kazanım yüzdesi gösterilmiştir.Yeraltı suyu örneklerinden ortalama Poliovirus geri kazanımı, %79'luk bir varyasyon katsayısı ile ortalama %58 olarak belirlenmiştir. Eklenmiş olmayan kopya yeraltı suyu saha örneklerinin hiçbirinde kültüre edilebilir virüs tespit edilmemiştir. Yöntem performansı ayrıca, iki farklı ekleme düzeyi kullanılarak modifiye edilmiş Laboratuvar Güçlendirilmiş Boş örnekler kullanılarak ölçülmüştür. On iki adet reaktif saflıktaki su örneği, altısı 300 MPN enfektiyöz ünite ile eklenmiş ve altısı 1.000 MPN enfektiyöz Poliovirus ünitesi ile eklenmiş örneklerden oluşmaktadır.Bu kontroller, %111 ortalama geri kazanım ve %100 varyasyon katsayısı ile benzer performans göstermiştir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, numunelerin kontaminasyonunu önlemek için aseptik tekniklerin ve iyi laboratuvar uygulamalarının kullanılması gerektiğini unutmamak önemlidir. Ayrıca, viral patojenlerle çalışırken, bu prosedürü her uyguladığınızda eldiven kullanımı gibi önlemler almanız gerektiğini unutmamalısınız. Bu videoyu izledikten sonra, virüslerin nasıl seyreltileceği, elektropozitif filtrelerin nasıl kullanılacağı, organik flokülasyonun nasıl gerçekleştirileceği ve hücre kültürü analizlerinin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.Bu prosedüre ek olarak, ek virüs tiplerini tanımlamak ve tespit etmek için moleküler analizler de gerçekleştirebilirsiniz.

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

EPA Metod 1615, çevre ve içme sularındaki enterovirüsleri ve norovirüsleri konsantre etmek için elektropozitif bir filtre kullanır. Bu el yazması, Yöntem 1615 analizleri için numune toplama prosedürünü açıklamaktadır.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirüs Oluşum EPA Metot 1615 Ölçüm. Virüs Örneklerinin I. Koleksiyonu

Burada, ters transkripsiyon-kantitatif PCR kullanarak çevresel ve içme sularında enterovirüs ve norovirüsü ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. EPA Metodu 1615'ten alınan bu standardize prosedürle yeraltı sularından ortalama virüs geri kazanımı, poliovirüs için %20 ve murin norovirüsü için %30 idi.

Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama

Çevresel sert yüzeylerde norovirüsün tespiti ve miktarının belirlenmesi için makro köpük tabanlı bir örnekleme metodolojisi geliştirilmiş ve değerlendirilmiştir.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

İnsan adenovirüsünün sivri uçları kullanılarak küçük hacimli su örnekleri için optimal viral konsantrasyon koşullarını belirlemek için bir yaklaşım geliştirilmiştir. Burada açıklanan teknikler, diğer viral hedefler için konsantrasyon parametrelerini tanımlamak için kullanılır ve büyük ölçekli viral konsantrasyon deneylerine uygulanır.

Sudan Viral Konsantrasyon için Küçük Bir Ses Prosedürü

Bu yazıda, aynı anda Enterococcus spp ölçmek için kullanılabilecek bir çift yönlü dijital PCR deneyi. Ve eğlence sularda genel olarak insan ilişkili dışkı kirlenme göstergeleri olarak HF183 genetik işaretleyiciler açıklanmaktadır.

Eşzamanlı Niceleme için Dubleks Dijital PCR Testi<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Ve Waters İnsan Fekal ilişkili HF183 Marker

Suyun temiz ve doğru noktadan örneklenmesi için basit, müdahaleci olmayan ve güvenilir bir yöntem olan VacuSIP'i tanıtıyoruz. Sistem, partikül ve çözünmüş bileşiklerin uzaklaştırılmasını ve atılımını temiz bir şekilde ölçmek için bentik süspansiyon besleyiciler tarafından solunan ve solunan suyun yerinde eşzamanlı olarak toplanması için geliştirilmiş ve değerlendirilmiştir.

VacuSIP, bir Geliştirilmiş INEX Yöntemi için<em&gt; In Situ</em&gt; Partikül Ölçümü ve Çözünmüş bileşikler Aktif Süspansiyon besleme üniteleri İşlenmiş

Bu kağıt için döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (lamba) teknolojisini temel alan Bemisia tabaci hızlı kimlik tahlil için protokol bildirir. En az laboratuvar eğitim gerektirir ve bu nedenle, Tesis içi giriş bitki ithalat liman ve Havaalanı gibi noktalarda uygulanabilir iletişim kuralı.

Bir döngü-aracılı izotermal amplifikasyon (lamba) tahlil hızlı teşhis edilmesi için kullanılan Bemisia tabaci

Bu iletişim kuralı Tilapia Gölü virüs (TiLV) RT-PCR yöntemlerini kullanarak tilapia dokularda tanılar. Tüm yöntemi doku diseksiyon toplam RNA emme, ardından cDNA sentezi ve TiLV geleneksel PCR veya kantitatif PCR dsDNA bir floresan bağlama boya bağlama kullanarak tarafından algılanması için tanımlanır.

Tilapia Gölü virüs kullanarak geleneksel RT-PCR ve SYBR yeşil RT-qPCR

15N izleyici araştırması için bir mikroplot tasarımı, mevsiminde birden fazla bitki ve toprak örnekleme olayını barındıracak şekilde tanımlanmıştır. Öğütme ve tartım protokolleri de dahil olmak üzere toprak ve bitki numune toplama ve işleme prosedürleri 15N analiz için konur.

15Azot Analizi için Mikroplot Tasarımı ve Bitki ve Toprak Numune Hazırlama

Öğrenin, Buffalo Green Monkey böbrek hücre hattı kullanarak su örneklerindeki bulaşıcı virüsleri kantitatif olarak ölçme yöntemini. Bu EPA Metot 1615 tabanlı protokol, içme ve çevresel sulardaki viral kirlilik risk değerlendirmelerini destekler.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Metot 1615 ölçülmesi. II. Toplam kültürlenebilir virüs Deneyi

Daha fazla video keşfet