Elektrik Alan-kaynaklı Release ve Ölçme (EFIRM) tarafından Exosomal Biomarker Algılama

Bu prosedürün genel amacı, eksozomları biyosıvılardan verimli bir şekilde çıkarmak, eksozom yükünü dışarı atmak ve kargoyu hızlı bir şekilde analiz etmektir. Bu, önce antikorları hedefleyen eksozom işaretleyicili manyetik mikropartiküller kullanılarak biyoakışkanlardan eksozomların çıkarılması ve ardından ekstrakte edilen eksozomların bir elektrot yüzeyine yüklenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, eksozom bir elektrik alanı kullanılarak yatırılır ve eksozom kargosu elektrotun yüzeyindeki problara hibritlenir.

Bir raportör molekül de sisteme hibritlenir. Son adım, elektrot yüzeyine bir substrat çözeltisi eklemek ve ardından elektrik akımını ölçerek okumayı elde etmektir. Sonuç olarak, akımın elektrokimyasal ölçümü, eksozom numunesindeki bir nükleik asit veya protein içeriğinin miktarını göstermek için kullanılır.

Bu teknolojinin ultra santrifüj ve lizin tamponu gibi mevcut yönteme göre ana avantajı, eksozom içeriğinin çıkarılması ve test edilmesi için basit ve hızlı bir yöntem olmasıdır. Bu teknoloji bizi çok heyecanlandırıyor çünkü ilk kez, bu efim teknolojisi, hastalıkta veya normal durumda organlar tarafından dökülen ve köken organ tarafından damar sistemi yoluyla ve ağız boşluğumuza geldiklerinde dökülen bilgileri kullanmamıza izin veriyor. Bu teknoloji, bu bilgiyi yakalamamıza ve aynı anda esnek bir şekilde tespit edebileceğimiz moleküler içeriği serbest bırakmamıza olanak tanır.

Bu hastalık ayırt edici bilgiler, genellikle bu yönteme yeni başlayan kullanıcılar zorlanabilir çünkü dikkatli olunmazsa manyetik mikropartiküllerin kullanımı zor olabilir. Ayrıca, biyolojik numune analizinde elektrokimyasal yöntemlerin kullanımı, bazıları için yeni bir paradigma olabilir, çünkü manyetik mikro parçacık ve elektro yüklemenin öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir. Manyetik mikropartikülleri tutarken ve bunları elektrotlara yüklerken özel dikkat gösterilmelidir.

Yeniden askıya almaya başlamak için, mililitre başına 10 mikrogram strept adin kaplı manyetik mikropartiküller içeren bir stok çözeltisi ve beş mikrolitre ekleyin. Boncukları yıkamak için 495 mikrolitre PBS içeren bir mikro santrifüj tüpüne çözelti. İlk olarak, tüpü bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukları rahatsız etmeden tamponu dikkatlice çıkarın.

Ardından tüpü manyetik olmayan bir rafa aktarın. Boncukları yıkamak için 500 mikrolitre PBS ve PET ekleyin. Bunu son yıkama işleminden sonra toplam üç kez yapın.

Boncukları 490 mikrolitre PBS'de askıya alın ve daha sonra mililitre stok çözeltisi başına bir miligramdan beş mikrolitre Biyotinillenmiş fare anti-insan CD 63 antikoru ekleyin. Çözeltiyi pipetleme programıyla karıştırın, beş saniye boyunca 90 derecede karşılıklı dönüş ve bir saniye boyunca beş derecede titreşim için bir numune döndürücü programlayın. Tüpleri döndürücüye yerleştirin ve programı oda sıcaklığında 30 dakika çalıştırın.

Ardından, tüpleri beş dakika boyunca manyetik rafa aktarın. Boncukları 500 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın ve ardından Caine içeren 490 mikrolitre PBS'de tekrar süspanse edin. Bir tüpü numune tanımlaması ile etiketleyin ve ardından numuneyi antikor konjuge boncuklarla karıştırmak için birkaç kez 10 mikrolitre numune pipeti ekleyin.

Daha sonra, tüpleri numune döndürücüye aktarın ve aynı programı oda sıcaklığında iki saat boyunca çalıştırın. Daha sonra boncuğu 500 mikrolitre bir molar tris hidroklorür tamponu ile üç kez yıkayın. Mıknatıslanmış rafı kullanarak, eksozomlar şimdi elektrotu prekolaştırmak için mıknatıslanmış boncukları bağlar.

Önce probun, potasyum klorürün ve ole monomerinin stok reaktiflerini damıtılmış suya seyreltin. Beş asal biyotinile DNA probu, GA DH mRNA'ya özgüdür. Monomer prob çözeltisini girdaplama ile karıştırın.

Her birim elektrotun çalışma sayacı ve çıplak altından oluşan referans elektrotlardan oluştuğu 16 sensörlü bir elektrot dizisi kullanın. Elektrotların çapraz kontaminasyonunu önlemek için elektrot dizisine plastik bir kuyu yerleştirin. Monomer prob çözeltisinin 60 mikrolitresini bir altın elektrotun yüzeyine aktarın, böylece çalışma sayacı ve referans elektrotları sıvı ile kaplanır.

Bir monomer probunu elektro polimerize etmek için ACSWE alanı olarak bilinen döngüsel bir kare dalga elektrik alan profili uygulayın. Bu, elektrot yüzeyinde iletken bir polimer tabakası oluşturur. Sensörü damıtılmış suyla üç kez durulayın ve ardından elektrot yüzeyindeki sıvıyı çıkarmak için nitrojen gazı ile kurulayın.

Elektrodu yakalama probu ile prekomotif ettikten sonra, dedektör probunun bir mikromolar çözeltisinden beş mikrolitre 495 mikrolitre boncuk eksozom kompleksi çözeltisine ekleyin ve ardından pipetleme ile karıştırın. Burada. Prob, GA dh için spesifik olan üç asal floresein konjuge DNA primeridir. Sensörün çalışma elektrotlarına hizalanmış 16 mıknatıstan oluşan bir mıknatıs dizisinin üzerine önceden kodlanmış bir elektrot dizisi yerleştirin.

Daha sonra 60 mikrolitre boncuk eksozom solüsyonunu elektrot yüzeyine aktarın. 20 döngü boyunca A-C-S-W-E alanını uygulayın. Serbest bırakılan ekzozomal kargo, elektrot yüzeyindeki proba hibritleşecektir.

Bağlanmamış analitleri çıkarmak için elektrot yüzeyini damıtılmış su ile üç kez durulayın ve ardından elektrodu nitrojen gazı ile çizin. Daha sonra, Caine içeren PBS'de bir ila 1000 anti floresein HRP konjuge antikor seyreltmesi yapın. Daha sonra elektrot yüzeyine 60 mikrolitre antikor seyreltmesi ekleyin.

Anti floresein HRP antikorunu dedektör probuna konjuge etmek için elektrot yüzeyine ACSWE alanı uygulayın. Fazla antikoru çıkarmak için sensör yüzeyini damıtılmış suyla üç kez durulayın ve ardından elektrodu nitrojen gazı ile çizin. Ardından, elektrot akımını 60 saniye boyunca eksi 200 milivoltta ölçün ve bir elektrokimyasal potansiyel durumu kullanarak çok kanallı bir pipetle her bir sensör yüzeyine 60 mikrolitre TMB substratı yükleyin.

Trik okumayı elde etmek için, eksozomların manyetik boncuklara bağlı olup olmadığını belirlemek için transmisyon elektron mikroskobu kullanıldı. Boncuklara tutturulmuş 70 ila 100 nanometre boyutundaki granüller, elektrik alanı veya deterjan tarafından parçalandıktan sonra bilinen eksozom boyutu ile tutarlıdır. Boncukların yakınında hiçbir eksozom görünmez.

Eksozomlardaki GA DH mRNA, atrik okuma ile tespit edildi. Zamanla mevcut olan GA DH miktarı, elektrik alanı veya deterjan tarafından eksozom lizisi üzerine beklendiği gibi azalır, bu da tükürüğün ekstra veziküler ortamına maruz kaldığını gösterir. Efim, serumun ekzozomal içeriğini ve bir insan CD 63 GFP Exo Somal markörü üreten insan akciğer kanseri hücreleri enjekte edilen farelerin tükürüğünü ölçmek için kullanıldı.

20 gün sonra, kanser hücreleri enjekte edilen farelerin hem serumunda hem de tükürüğünde daha yüksek CD 63 GFP seviyeleri bulundu, ancak salin enjekte edilen farelerde bulunmadı. Bu prosedürü denerken, elektrot yüzeyini düzgün bir şekilde yıkamak için boncukları yıkarken yeterli miktarda sıvı çıkarmak için boncuklara dokunmaktan kaçınmak ve bölgeleri elektrot üzerine düzgün bir şekilde yüklemek önemlidir. Bu teknoloji, bu efim teknolojisi, sistemik bir hastalığın, distal bir organın, eksozom adı verilen bu varlıkta bilgilerini nasıl döküp hesaplayabileceğine dair karşılanmamış kritik bir yeteneği sağladı.

Tükürüklere, ağız boşluğumuza nasıl geldikleri ve eksozomları nasıl yakalayabilecekleri, bu moleküler hedefleri nasıl serbest bırakabilecekleri ve tehdit edici hastalıklar, diyabet, pankreas kanseri veya diğer yaşamı tehdit eden bozukluklar gibi aynı anda tespit edilmesine nasıl izin verdikleri. Bu videoyu izledikten sonra, bir biyoakışkandan eksozomların nasıl hızlı bir şekilde çıkarılacağını, eksozomların kargosunun nasıl boşaltılacağını ve entegre bir elektrot sistemi kullanarak eksozomların içeriğinin nasıl hızlı bir şekilde analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız.