Elektrik Alan-kaynaklı Release ve Ölçme (EFIRM) tarafından Exosomal Biomarker Algılama

Bu prosedürün genel amacı, biyosıvılardan eksozomları verimli bir şekilde ekstrakte etmek, eksozom kargosunu dışarı atmak ve kargoyu hızla analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle eksozom belirteçlerini hedefleyen antikorlara sahip manyetik mikropartiküller kullanılarak biyosıvılardan eksozomların ekstrakte edilmesi ve ardından ekstrakte edilen eksozomların bir elektrot yüzeyine yüklenmesiyle gerçekleştirilir. Sonrasında, eksozom bir elektrik alanı kullanılarak lizize edilir ve eksozom kargosu elektrot yüzeyindeki problarla hibridize edilir.

Sisteme bir raporlayıcı molekül de hibridize edilir. Son adım, elektrot yüzeyine bir substrat çözeltisi eklemek ve ardından elektrik akımını ölçerek okumayı gerçekleştirmektir. Nihayetinde, akımın elektrokimyasal ölçümü, ekzosom örneğindeki nükleik asit veya protein içeriğinin miktarını göstermek için kullanılır.

Bu teknolojinin ultra santrifüjleme ve lizin tamponu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, eksozom içeriğini ekstrakte etmek ve test etmek için basit ve hızlı bir yöntem olmasıdır. Bu teknoloji bizi oldukça heyecanlandırıyor; çünkü bu efim teknolojisi, ilk kez, organların hastalık durumunda veya normal seyirde damar yoluyla ağız boşluğuna bıraktığı ve organın kökeninden gelen bilgileri kullanmamıza olanak tanıyor. Bu teknoloji, söz konusu bilgileri yakalamamıza ve moleküler içeriği serbest bırakarak esnek bir biçimde eş zamanlı olarak tespit etmemize imkan sağlıyor.

Bu hastalık ayırıcı bilgileri, Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kullanıcılar, dikkatli olunmadığı takdirde manyetik mikropartiküllerin kullanımı zor olabileceği için güçlük çekebilirler. Ayrıca, biyolojik örnek analizlerinde elektrokimyasal yöntemlerin kullanımı bazıları için yeni bir yaklaşım olabilir. Manyetik mikropartikül ve elektrot yüklemesinin öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir. Manyetik mikropartiküllerle çalışırken ve bunları elektrotlara yüklerken özel dikkat gösterilmelidir.

Başlamak için, mililitrede 10 µg streptadin kaplı manyetik mikropartikül içeren bir stok çözeltiyi resüspande edin ve beş µL ekleyin. Boncukları yıkamak için çözeltiyi 495 µL PBS içeren bir mikro santrifüj tüpüne ekleyin. İlk olarak, tüpü bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukları rahatsız etmeden tamponu dikkatlice uzaklaştırın.

Ardından tüpü manyetik olmayan bir rafa aktarın. Boncukları yıkamak için 500 µL PBS ve by PET ekleyin. Son yıkamadan sonra bunu toplamda üç kez tekrarlayın.

Boncukları 490 µL PBS içinde süspande edin ve ardından bir mg/mL'lik stok çözeltiden beş µL Biotinize fare anti-insan CD 63 antikoru ekleyin. Çözeltiyi pipetleme yoluyla karıştırın; bir numune rotatörünü 90 derecelik karşıt rotasyon için beş saniyeye ve beş derecelik vibrasyon için bir saniyeye programlayın. Tüpleri rotatöre yerleştirin ve programı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çalıştırın.

Ardından, tüpleri beş dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin. Boncukları üç kez 500 µL PBS ile yıkayın ve ardından Caine içeren 490 µL PBS içinde yeniden süspande edin. Bir tüpü örnek tanımlayıcısıyla etiketleyin ve ardından örneği antikor konjugatlı boncuklarla karıştırmak için 10 µL örneği birkaç kez pipetle ekleyin.

Ardından, tüpleri örnek rotatorüne aktarın ve aynı programı oda sıcaklığında iki saat boyunca çalıştırın. Sonra boncukları, 1 molar tris hidroklorür tamponunun 500 microliteri ile üç kez yıkayın. Mıknatıslı raf kullanılarak, ekstrozomlar artık elektrodu önceden kaplamak için mıknatıslı boncuklara bağlanmıştır.

Öncelikle prob, potasyum klorür ve ole monomer stok reaktiflerini distile su ile seyreltin. Beş uçlu biyotinli DNA probu, GA DH mRNA'sı için özgündür. Monomer prob çözeltisini vorteksleyerek karıştırın.

Her bir birim elektrodun çıplak altından oluşan çalışma, karşıt ve referans elektrotlardan meydana geldiği 16 sensörlü bir elektrot dizisi kullanın. Elektrotların çapraz kontaminasyonunu önlemek için elektrot dizisinin üzerine plastik bir kuyucuk yerleştirin. Çalışma, karşıt ve referans elektrotlar sıvı ile kaplanacak şekilde, 60 µL monomer prob çözeltisini bir altın elektrot yüzeyine aktarın.

Monomer probu elektropolimerize etmek için A-C-S-W-E alanı olarak bilinen döngüsel kare dalga elektrik alan profili uygulayın. Bu işlem, elektrot yüzeyinde iletken bir polimer tabakası oluşturur. Sıvıyı elektrot yüzeyinden uzaklaştırmak için sensörü üç kez distile su ile durulayın ve ardından nitrojen gazı ile kurulayın.

Elektrot yakalama probu ile önceden kaplandıktan sonra, 495 µL boncuk ekzozom kompleksi çözeltisine 1 µM'lık detektör probu çözeltisinden beş µL ekleyin ve ardından pipetleyerek karıştırın. Buradaki prob, GA dh için spesifik olan, 3' ucuna floresein konjuge DNA primeridir. Önceden kodlanmış elektrot dizisini, sensörün çalışma elektrotlarıyla hizalanmış 16 mıknatıstan oluşan bir mıknatıs dizisinin üzerine yerleştirin.

Ardından, elektrot yüzeyine 60 µL boncuk ekzosom çözeltisi aktarın. 20 döngü boyunca A-C-S-W-E alanı uygulayın. Serbest kalan ekzosomal kargo, elektrot yüzeyindeki prob ile hibridize olacaktır.

Bağlanmamış analitleri uzaklaştırmak için elektrot yüzeyini distile su ile üç kez durulayın ve ardından elektrotu nitrojen gazı ile kurutun. Daha sonra, kazein içeren PBS içerisinde anti-florescein HRP konjuge antikorun 1/1000 oranında dilüsyonunu hazırlayın. Ardından, antikor dilüsyonundan 60 µL miktarında elektrot yüzeyine ekleyin.

Anti-florescein HRP antikorunu detektör probuna konjuge etmek için elektrot yüzeyine A-C-S-W-E alanı uygulayın. Fazla antikoru uzaklaştırmak için sensör yüzeyini üç kez distile su ile durulayın ve ardından elektrodu nitrojen gazı ile kurutun. Sonraki aşamada, her bir sensör yüzeyine çok kanallı bir pipet yardımıyla 60 µL TMB substratı yükleyin; bir elektrokimyasal potansiyostat kullanarak elektrot akımını -200 mV değerinde 60 saniye boyunca ölçün.

Tric okumasını elde etmek için, eksozomların manyetik boncuklara bağlanıp bağlanmadığını belirlemek amacıyla transmisyon elektron mikroskopisi kullanılmıştır. Boncuklara tutunmuş 70 ila 100 nanometre boyutundaki granüller, elektrik alanı veya deterjanla lizis sonrası eksozomların bilinen boyutlarıyla uyumludur. Boncukların yakınında görünür eksozom bulunmamaktadır.

Ekzosomlardaki GA DH mRNA'sı, atrik okuma ile tespit edildi. Elektrik alanı veya deterjan ile ekzosom lizisi sonrası, zamanla mevcut GA DH miktarının beklendiği gibi azalması, tükürüğün ekzovesiküler ortamına maruz kalındığını göstermektedir. İnsan CD 63 GFP ekzosomal belirteci üreten insan akciğer kanseri hücreleri enjekte edilen farelerin serum ve tükürüğündeki ekzosomal içeriği ölçmek için Efim kullanılmıştır.

20 gün sonra, kanser hücreleri enjekte edilen farelerin hem serumunda hem de salyalarında daha yüksek CD 63 GFP seviyeleri tespit edilmiş, ancak salin enjekte edilen farelerde bu durum görülmemiştir. Bu prosedür uygulanırken, elektrot yüzeyini homojen bir şekilde yıkamak için boncukları yıkarken yeterli miktarda sıvı çıkarmak adına boncuklara dokunmaktan kaçınmak ve bölgeleri elektrot üzerine uygun şekilde yüklemek gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu teknoloji, yani efim teknolojisi, sistemik bir hastalığın veya uzak bir organın, eksozom adı verilen bu yapılar aracılığıyla bilgilerini nasıl yaydığına ve hesapladığına dair kritik olan ve daha önce karşılanmamış bir kapasite sağlamıştır.

Bunların tükürüğe, ağız boşluğumuza nasıl geldiği, eksozomların nasıl yakalanabildiği, bu moleküler hedeflerin nasıl serbest bırakıldığı ve diyabet, pankreas kanseri veya diğer yaşamı tehdit eden bozukluklar gibi tehlikeli hastalıkların eş zamanlı olarak tespit edilmesine nasıl olanak sağladığı üzerinde durulmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, bir biyosıvıdan eksozomların nasıl hızlıca ekstrakte edileceği, eksozom kargosunun nasıl boşaltılacağı ve entegre bir elektrot sistemi kullanılarak eksozom içeriğinin nasıl hızlıca analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.