Name: Elektrik Alan-kaynaklı Release ve Ölçme (EFIRM) tarafından Exosomal Biomarker Algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Keşfedin, ekzozomları biyosıvılardan manyetik mikropartiküller kullanarak çıkarma ve elektrik alanı ile lizis yaparak RNA ve protein kargo analizi yöntemini. Bu hızlı elektrokimyasal teknik, biyobelirteç keşfi için verimli bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi ve (FW) Hibe UL1TR000124 aracılığıyla Translational Sciences, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Advancing Ulusal Merkezi tarafından desteklenen; Felix &amp; Mildred Yip donatılmış Profesörlük ve (DTWW için) Barnes Aile Fonu, (MT) Ödül Numarası T90DE022734 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Diş &amp; Kranyofasiyal Research Ulusal Enstitüsü. içerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. Manyetik Boncuk-tabanlı Exosome Ekstraksiyon <ol><li> Boncuklar yeniden askıya almak için bir mikrosantrifüj tüpü içinde, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), tampon 495 ul içinde Streptavidin-kaplı manyetik mikro 5 ul iyi karıştırılmış solüsyonu pipetle. Manyetik bir raf kullanarak üç kez yıkanır ve 500 ul PBS ile yeniden süspanse boncuklar. raf örnek mikrosantrifüj tüpleri tutabilecek bir konut ünitesi tarafında mıknatıs bir dizidir. <ol><li> Her yıkamadan için, ilk tüpler 1 dakika rafa oturup, ve daha sonra dikkatlice boncuk bozmadan süpernatant tampon kaldırmak için bir pipet kullanın izin. </li><li> Tarafında mıknatıslar olmadan düzenli bir rafa tüpleri yerleştirin. Tüplerin içine PBS 500 ul ekleyin ve birlikte çözüm ve boncuk karıştırmak için pipet kullanın. Sonra tekrar solüsyon gelen boncuk ayırmak için manyetik rafa geri tüpleri koymak. </li><li> PBS a mıknatıslanma ve tabanda yoluyla tampon bu kaldırma gerçekleştirinüç kez toplam. Bu manyetik parçacıkların bir ilk yıkama yapar. </li></ol></li><li> Manyetik rafın olmayan manyetize edilmiş bölümü üzerine yerleştirilen bir tüp ile, PBS tamponu 490 ul içine boncuk yeniden süspanse edin. Pipet boncuk karışımı içine 1.0 mg / ml stok konsantrasyonunda biyotinile fare anti-insan CD63 antikoru 5 ul. Çözelti içinde, boncuk ve antikor karışımı pipet kullanın. </li><li> Örnek karıştırıcı üzerine boncuk ve biyotinile antikor karışımı ile mikrosantrifüj tüpleri yerleştirin. 90 ° 5 saniye eğerek ve 1 saniye 5 ° titreşimli de karşılıklı dönüş için örnek rotator için rotator parametrelerini ayarlayın. Oda sıcaklığında 30 dakika için bu parametrelerin numune boncuk karışımı tüpleri döndürün. </li><li> Konjugasyon sonra bağlanmamış antikor çıkarın. <ol><li> Oda sıcaklığında dönme, 30 dakika sonra, 5 dakika boyunca geri manyetik rafa tüpleri. </li><li> Bir mikropipet kullanılarak sıvı faz kaldırarak boncuk üç yıkar gerçekleştirin ve 500 μ ile yıkayın; PBS l. Üçlü yıkamadan sonra, raf manyetize kısmına 490 kazein-PBS ul ve yerine boncuk tekrar süspansiyon. </li></ol></li><li> Antikor kaplı boncuklar kullanılarak exosome çıkarma. <ol><li> Hedeflenen örnek kimliği ile her tüp etiketleyin. Mikrosantrifüj tüpe serum veya tükürük 10 ul örnek Pipet. Birkaç kez pipet kullanılarak örneğini ve manyetik boncuk karışımı pipet kullanın. </li><li> Döndürücü üzerine numune ve anti-insan CD63 antikoru boncuk tüpleri ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca döner. Aşama 1.2 &#39;de tarif edildiği gibi aynı döndürücü parametreleri kullanın. </li><li> Döner örnek 2 saat sonra, çözelti ayrı tanelerine mıknatıslanma mikropipet ile sıvı faz ayrılması ve Tris-HCI tampon maddesinin 500 ul boncuk resuspending üçlü yıkama yapar. Elde edilen boncuklar artık eksozom bağlı ve elektrik alan serbest bırakılması ve ölçüm için hazırız. </li></ol></li></ol> 2. Elektrik Alan Bağlı Çıkış birnd Exosomal İçerik Ölçümü <ol><li> GADPH Astar ile Elektrot İlk ön kaplamaya tabi tutulması <ol><li> Bir plastik de bireysel elektrotların çapraz bulaşmayı önlemek için bir elektrot dizisi uygulayın. Bu deney için, çıplak altından yapılmış bir çalışma, sayaç ve referans elektrot oluşan dizideki her birim elektrot ile 16 sensör elektrot dizisi kullanın. </li><li> Ultra saf damıtılmış su ile bir tüp içine hazır reaktifleri pipetleyerek, 100 nM DNA probu, 0.3 M KCI ve 10 mM pirol bir stok karışım hazırlayın. Vorteks ile iyice karıştırın. NOT: Bu çalışma için seçilen DNA probu eksozom içinde mevcut olduğu bilinmektedir GAPDH referans genine karşılık gelir. kullanılan prob dizisi &#39;-Biyotin-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 5&#39;. Tüm elektrotlar üzerinde bu karışımı kullanın. </li><li> Pipet her altın elektrod yüzeyi üzerine monomer DNA probu karışımı 60 ul. Çalışma, c yeterli kapsama olmasını sağlamak için elektrotları inceleyinSıvı karışım ile Sayaç ve referans elektrotlar. </li><li> Electropolymerize monomer prob karışımı elektrot yüzeyine döngüsel bir kare dalga (CSW) elektrik alanı profili uygulayarak elektrot yüzeyinde bir iletken polimer katmanı oluşturmak için. Bu elektrik alanı 9 saniye +350 mV uygulayarak ve hemen 1 saniye için 950 mV geçiş oluşur. Uygulanan bir elektrik alanı, 100 saniye, toplam 10 çevrim için elektroda bu siklik kare dalga profil uygulanır. </li><li> Elektrotun yüzeyinden sıvının çıkması için sensör yüzeyine damıtılmış su ve azot gazı ile kuru ile 3 kez yıkayın. Bu sıvı düzgün elektrot kaldırılır emin olun. </li></ol></li><li> Exosome Kargo Boşaltma <ol><li> Yük 5 boncuk eksozom kompleks karışımı 495 ul bir detektör probu 1 mcM ul ve karıştırmak için bir pipet kullanın. Not: detektör probu 3 &#39;ucunda bir floresein molekülüne konjuge edilmiş bir DNA primer sekansıdır. Dedektör probBu çalışma için kullanılan e dizisi eksozom içinde bulunan, GAPDH mRNA karşılık gelir. floresein konjuge detektör probu sekansıdır: 5&#39;-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-Floresein-3 &#39;. </li><li> Pipet altında bir mıknatıs dizi ile bir altın elektrot yüzeyine prob ve boncuk eksozom kompleks karışımı 60 ul. Bu mıknatıs dizisi sensörünün çalışma elektrotlara karşılık hizalanmış onaltı 2.54 mm çaplı mıknatıslar oluşur. Şekil 2A mıknatıslar ve boncuk eksozom çözümün yerleşimini gösterir. </li><li> Örnek elektrot yüzeyinde yüklendikten sonra, -300 mV 9 saniye ve 200 mV (200 sn toplam) 1 saniye ile CSW elektrik alanın 20 döngüleri uygulayın. serbest exosomal yük elektrodun sathı üzerinde primerler hibridize olur. Exosome yüzey belirteçleri soruşturma konusu ise,. Deney bu bölümünü atlamak 2B bu süreci göstermektedir Şekil. </li> &lt;li&gt; Yıkama-off üçlü damıtılmış su ile elektrot yüzeyini durulayarak elektrot yüzeyinde ilişkisiz analitler. Azot gazı ile elektrot kurutun. </li></ol></li><li> Raportör Antikor ve saati <ol><li> (: 1000 seyreltme, 1 içinde HRP) kazein / PBS içinde seyreltilmiş yaban turpu peroksidazına konjüge edilmiş 150 ünite / ml anti-floresin antikor 60 ul ekle. </li><li> Prob sandviç karmaşık bir anti-floresein HRP bir elektrik alan tahrik konjugasyon kullanın. 1 saniye ve elektrot yüzeyine 5 çevrim için 1 saniye için 500 mV -200 mV uygulanır. Şekil 2A, bir protein ve nükleik asit sisteminde hem de yakalama ve dedektör sistemi kompleksleri gösterir. </li><li> Distile su ve azot gazı ile kuru kullanılarak üçlü yıkama sensör yüzeyi. </li><li> Bağlanmamış fazla bir anti-floresin antikorun yıkama ayrılmasının ardından, 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetrametilbenzidin (TMB), alt-tabakanın 60 ul ekle. Bir çok kanallı pipet kullanarak her bir sensör yüzeyine bu alt tabakayı yükleyin. </li><li> . 16 kanal eş zamanlı olarak ölçüm kapasitesine sahip bir elektrokimyasal potansiyostat kullanılarak 60 sn için -200 mV&#39;de elektrot akımının ölçülmesi ile akım amperometrik olarak okunmasını yapın 2C okuma sırasında akım profilinin bir örneği Şekil. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52439/52439fig2highres.jpg" /> EFIRM Yöntem Şekil 2. Bileşenleri. (A), anti-insan CD63 kaplı manyetik mikropartiküller kullanarak biyo-sıvı gelen eksozomlar ayıklanması ve daha sonra parçacık-eksozom kompleksi uygulanan halkalı kare dalgaları kullanarak eksozom kargo boşaltma yöntemi. Serbest eksozom RNA / DNA / protein hedefleri tespit etmek için kullanılan elektrot biyosensör (B) Şema. Daha büyük akım büyüklüğü t karşılık (C) EFIRM metodolojisi, gelen amperometik okuma Temsilcisi örneğiBir biyomolekülün yüksek seviyelerde o. Bu rakam Wei ve ark değil. 14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52439/52439fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol><li>Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+MicroRNA%3A+A+Diagnostic+Marker+for+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer.</a> Clinical Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).</li>
<li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+DNA+in+exosomes%3A+a+novel+biomarker+in+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li>
<li>Lau, C. S., Wong, D. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+Exosome-like+Microvesicles+and+Salivary+Gland+Cells+Interplay+Alters+Salivary+Gland+Cell-Derived+Exosome-like+Microvesicles+In%5BTitle%5D)+AND+%22Vitro.+PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer Exosome-like Microvesicles and Salivary Gland Cells Interplay Alters Salivary Gland Cell-Derived Exosome-like Microvesicles In.</a> Vitro. PLoS ONE. 7 (3), e33037(2012).</li>
<li>Bala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+exosomes+indicate+hepatocyte+injury+and+inflammation+in+alcoholic%2C+drug-induced%2C+and+inflammatory+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatolog%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases.</a> Hepatolog. 56 (5), 1946-1957 (2012).</li>
<li>Dear, J. W., Street, J. M., Bailey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+exosomes%3A+A+reservoir+for+biomarker+discovery+and+potential+mediators+of+intrarenal+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Urinary exosomes: A reservoir for biomarker discovery and potential mediators of intrarenal signalling.</a> Proteomics. 13 (10-11), 1572-1580 (2013).</li>
<li>Lässer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+saliva%2C+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA%3A+uptake+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> Journal of Translational Medicine. 9 (1), 9(2011).</li>
<li>Palanisamy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5 (1), e8577(2010).</li>
<li>Camussi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%2Fmicrovesicles+as+a+mechanism+of+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.</a> Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).</li>
<li>Lau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pancreatic+cancer-derived+exosomes+in+salivary+biomarker+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of pancreatic cancer-derived exosomes in salivary biomarker development.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26888-26897 (2013).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Exosomes+from+Cell+Culture+Supernatants+and+Biological+Fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 3 (22), (2001).</li>
<li>Park, N. J., Li, Y., Yu, T., Brinkman, B. M. N., Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+RNA+in+Saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of RNA in Saliva.</a> Clinical Chemistry. 52 (6), 988-994 (2006).</li>
<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio%2FAbiotic+Interface+Constructed+from+Nanoscale+DNA+Dendrimer+and+Conducting+Polymer+for+Ultrasensitive+Biomolecular+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Bio/Abiotic Interface Constructed from Nanoscale DNA Dendrimer and Conducting Polymer for Ultrasensitive Biomolecular Diagnosis.</a> Small. 5 (15), 1784-1790 (2009).</li>
<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+Sensor+for+Multiplex+Biomarkers+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Electrochemical Sensor for Multiplex Biomarkers Detection.</a> Clinical Cancer Research. 15 (13), 4446-4452 (2009).</li>
<li>Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+exosomal+biomarker+by+electric+field-induced+release+and+measurement+%28EFIRM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM).</a> Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).</li>
</ol>

David Wong RNAmeTRIX Inc., moleküler tanı şirketin kurucularından. PeriRx LLC RNAmeTRIX moleküler tanı ile ilgili fikri mülkiyet alt lisansı. David Wong PeriRx bir danışmandır.

Sonuçlar gösterdiği gibi, anti-insan CD63 kaplı manyetik nanopartikülleri, özellikle 70-100 nm arasında değişen bir boyuta sahiptir, küçük parçacıkları yakalamak mümkündür. Çekilecek parçacık eksozom daha önce gözlenen profili ile tutarlıdır. Bundan başka, parçacıklar yakalanmasından sonra düşük voltajlı CSW kullanım boncuğun yüzeyine kaldırmak ve kargo serbest bırakılması için geleneksel bir liziz tamponu göre yöntem ile benzer DNA parçalanma profilleri neden olduğu da gösterilmiştir. Bu veriler, exosomal yük verildiği...

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>. The disclosures were updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>.

Errata: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosome araştırma RNA 1, DNA 2, ve protein 3 kargo taşıyan lipit microvesicles inceleyen bir araştırma ortaya çıkan bir alandır. Eksozom biyoloji Önceki araştırmalar, kan 4, idrar 5, anne sütü 6 ve tükürük 7 gibi Biofluids içinde eksozom belirlenmesine yol açmıştır. Çalışmalar uzaktan gövdenin 8 farklı sistemler arasında iletişimi meditating, eksozomlar farklı hücresel yolların bir rol oynadığını göstermiştir. Rolü eksozomlar hücrelerarası iletişimi oynamak için, onlar hastalık durumları ile ilişkili biyomolekülün hedefleri (protein, RNA ve DNA) paket olabileceği düşünülebilir. In vitro 3 ve hayvan modeli 9 çalışmalar bu hipotezi doğrular görünmektedir. Biyomarkır keşif için exosomal içerik araştıran, bu Biofluids seçici eksozom izolasyonu için bir metodoloji geliştirmek için gerekli olan, uyarılan expulsieksozom gelen kargo ve eksozom biyomoleküllerin miktarının on. Bu çalışmanın kapsamında, eksozomlar bir yapı yaklaşık 70-100 nm arasında bir çapa sahip olan ve yüzey işaretleyici CD63 sahip olarak tarif edilecektir. Araştırmacılar genellikle ilk Ultrasantrifügasyon 10 ile eksozomlar arındırmak ve daha sonra lizis tamponu kitleri kullanımı yoluyla exosomal içeriğini işlemek. Liziz tamponu yöntemlerin kullanımı dakika saat arasında değişen bir bekleme süresi gerektirir. Bu süreç, potansiyel eksozom kargo zarar ve bozulmasını örnek yol açabilir. Örnek olarak, çevreleyen hücre dışı ortama liziz tamponu üzerinden serbest tükürük eksozom RNA exosomal RNA sonrası liziz ölçümü stabilizasyon tepkin 11 eklenmeden özellikle zor bir görev tampon hale 1 dakika altında bir yarı ömre sahip bulunmaktadır. lizis ve istikrar için çeşitli reaktifler ekleyerek bileşik etkisi komplike ajanları tanıtmak ve analı müdahale edebilirexosomal içeriğinin sis. Alternatif bir yaklaşım, hızlı bir şekilde exosomal içeriği boşaltma ve güvenli bir şekilde tanımlanması için yük korunması için yararlı olabilir. Bu çalışmada, exosomal içeriğin salınımı için bir tek biçimli olmayan elektrik alanının kullanımını önermektedir. Elektrikli alanları polarize ve hücre zarlarını oluşturan lipid çift bozma yeteneği taşımak için bilinmektedir. Bizim deneysel çalışmalar eksozomlann microvesicle yapısının bozulması ve taşınan kargo serbest bırakılması için düzgün olmayan siklik kare dalgalar (CSW) kullanımını araştırıyor. Bu yöntem en biyomoleküllerin kesintiye olmayacak anlamına birkaç yüz milivolt aralığında gerilimleri kullanır. Bir siklik kare dalga kullanımı çevreleyen akışkan ortama tükürük eksozom mRNA içeriği serbest harekete geçirmek için mümkün olduğunu göstermektedir. Exosomal içeriğin Bu sürüm, sorunsuz bir şekilde biyomarker ekspresyon seviyelerini ölçmek için kullanılabilecek bir elektrot sistemi ile entegre 12,13.. Önerilen bu yöntem, eksozom içeriğinin hızlı, hassas ve parçalama tamponu ücretsiz analiz sağlar. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52439/52439fig1highres.jpg" /> EFIRM İş Akışı 1. Genel Bakış Şekil.. EFIRM yöntemi geniş arındırıcı ve analiz eksozom için gerekli olan üç ana evreye ayrılır. Bu SSG göre exosomal içeriği serbest bırakılması ve analiz yöntemi eksozom izolasyonu için CD63 spesifik manyetik mikro ile bağlantılı olarak kullanılır. Bu CD63-afinite taneleri tükürük örnekleri (ve diğer Biofluids) için eksozom seçici izolasyonu için izin verir. İnkübasyon ve manyetize boncuklar kullanarak eksozom çıkarılması ardından, boncuk Şekil 1. Içerik salınımını ve deney analizi bölümünü tabanlı CSW için elektrokimyasal sensör sistemi göç işin bir bakış verir edilirEFIRM yöntemi akar.

<table><tbody><tr><td>Helios Çip Arayüzlü 16 Kanallı Okuyucu Sistemi&nbsp;</td><td>Genefluidics, ABD&</td><td>nbsp; RS-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>16x Sensör Çipi, Çıplak Altın, 5 çip paketi</td><td>Genefluidics, ABD</td><td>SC1000-16X-B</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinile anti-insan CD63 Antikor</td><td>Ancell, ABD</td><td>215-030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Invitrogen, ABD</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>Neodynium Manyetikler (1/10" çap x 1/32" kalınlık)</td> <td>K & J Magnetics, ABD</td><td>DH101</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Saf Damıtılmış Su</td><td>Ömrü Teknolojileri, ABD</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Mettler Toldeo 3 M KCl Çözeltisi</td><td>Fisher Scientific, ABD</td><td>1911512</td><td></td></tr><tr><td>Pyrrole</td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>W338605-100g</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Floresein-POD, Fab parçaları</td><td>Roche, Almanya</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>3,3&asal;,5,5&prime;-tetrametilbenzidin substrat (TMB / H 2 O 2 , düşük aktivite)</td> <td>Neogen, ABD</td><td>330175</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su Çözeltisi</td><td>Yaşam Teknolojileri, ABD</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Kazein / PBS</td><td>Fisher Scientific, ABD</td><td>37532</td><td></td></tr></tbody></table>

elektrik alan-kaynaklı release ve Ölçme (efirm) tarafından exosomal biomarker algılama

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Eksozomlar arası iletişimde bir aracı rolü mikroveziküler yapılardır. Onlar hastalık ayrımcı biyomarkerlar taşımak olmadığını belirlemek için eksozom iç kargo incelemek için ilgi olduğunu. Exosomal analizinin yapılması için, ayıklanması ve iç içeriği zarar vermeden hedef Biofluids gelen eksozomlar analiz etmek için bir yöntem geliştirilmesi gerekmektedir. Elektrik alan ile indüklenen salma ve ölçüm (EFIRM) özel olarak, Biofluids gelen eksozomlar açılan kendi yük boşaltma ve iç RNA / protein içeriği test etmek için bir yöntemdir. Bir anti-insan CD63 özgü antikor manyetik mikropartikül kullanarak, eksozomlar ilk Biofluids çökeltilir. Aşağıdaki çıkarma, düşük voltajlı elektrik siklik kare dalgalar (CSW) veziküler membran bozabilir ve kargo boşaltma neden uygulanır. eksozom içeriği nereye için bir elektrot yüzeyi üzerinde hareketsiz DNA primerleri veya antikorlar hibridize edilirMoleküler içeriğin ntification. EFIRM yöntemi liziz tamponu olmayan analizi için eksozom ekstre ve boşaltılması için avantajlıdır. Bu yöntem, eksozom hem RNA ve protein biyomarker hedeflerin belirli bir algılama gerçekleştirme yeteneğine sahiptir. Boyut-tabanlı teknikler aksine EFIRM özellikle yüzey belirteçleri dayalı eksozomlar ayıklar. Transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) ile tahlil eksozom yakalama ve analiz için bir yöntem işlevselliğini gösterir. EFIRM yöntem, insan akciğer kanseri H640 hücreleri enjekte 9 farelerin analizi tuzlu kontrolleri alan 11 fareden karşı eksozom profili test etmek için (eksozom işaretleyici insan CD63, GFP ifade eden transfekte edilmiş bir hücre hattı) exosomal uygulandı. Exosomal biyobelirteçlerinin Artmış düzeyleri (referans gen GAPDH ve protein yüzey işaretleyici insan CD63-GFP) H640 hem serum ve tükürük örneklerinde fareler enjekte bulunamadı. Ayrıca Saliva ve serum numuneleri doğrusallık (R, = 0.79) sahip olduğu gösterilmiştir. Bu sonuçlar uzak hastalıkların tespiti için tükürük eksozom biyobelirteçlerinin canlılığı düşündürür.

TEM kullanarak Boncuk Exosome Yakalama Doğrulama Anti-insan CD63 manyetik boncukları kullanılarak tükürük eksozomlann izole transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleri kullanarak ekstraksiyon protokolü takip edilerek doğrulanmıştır. TEM eksozom bilinen profili ile uyumlu hemen bitişik (Şekil 3A, bkz ve 3B), 70-100 nm granüller, manyetik boncuklar gösterir. Resim 70-100 nm taneler daha önceden bunların konjüge anti-insan CD63 antikorlar...

Eksozomlar, potansiyel olarak önemli hastalık ayırıcı biyobelirteçler taşıyan biyosıvılar içinde bulunan mikroveziküler yapılardır. Burada, eksozomları spesifik olarak çıkarmak ve tekdüze olmayan elektrikli döngüsel kare dalgalar kullanılarak eksozomların parçalanmasını takiben her iki RNA/protein hedefi için ekzozomal yükü hızlı bir şekilde test etmek için yeni bir yöntem kullanılmaktadır.

Elektrik Alan-kaynaklı Release ve Ölçme (EFIRM) tarafından Exosomal Biomarker Algılama

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Bu prosedürün genel amacı, biyosıvılardan eksozomları verimli bir şekilde ekstrakte etmek, eksozom kargosunu dışarı atmak ve kargoyu hızla analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle eksozom belirteçlerini hedefleyen antikorlara sahip manyetik mikropartiküller kullanılarak biyosıvılardan eksozomların ekstrakte edilmesi ve ardından ekstrakte edilen eksozomların bir elektrot yüzeyine yüklenmesiyle gerçekleştirilir. Sonrasında, eksozom bir elektrik alanı kullanılarak lizize edilir ve eksozom kargosu elektrot yüzeyindeki problarla hibridize edilir.Sisteme bir raporlayıcı molekül de hibridize edilir. Son adım, elektrot yüzeyine bir substrat çözeltisi eklemek ve ardından elektrik akımını ölçerek okumayı gerçekleştirmektir. Nihayetinde, akımın elektrokimyasal ölçümü, ekzosom örneğindeki nükleik asit veya protein içeriğinin miktarını göstermek için kullanılır.Bu teknolojinin ultra santrifüjleme ve lizin tamponu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, eksozom içeriğini ekstrakte etmek ve test etmek için basit ve hızlı bir yöntem olmasıdır. Bu teknoloji bizi oldukça heyecanlandırıyor; çünkü bu efim teknolojisi, ilk kez, organların hastalık durumunda veya normal seyirde damar yoluyla ağız boşluğuna bıraktığı ve organın kökeninden gelen bilgileri kullanmamıza olanak tanıyor. Bu teknoloji, söz konusu bilgileri yakalamamıza ve moleküler içeriği serbest bırakarak esnek bir biçimde eş zamanlı olarak tespit etmemize imkan sağlıyor.Bu hastalık ayırıcı bilgileri, Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kullanıcılar, dikkatli olunmadığı takdirde manyetik mikropartiküllerin kullanımı zor olabileceği için güçlük çekebilirler. Ayrıca, biyolojik örnek analizlerinde elektrokimyasal yöntemlerin kullanımı bazıları için yeni bir yaklaşım olabilir. Manyetik mikropartikül ve elektrot yüklemesinin öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir. Manyetik mikropartiküllerle çalışırken ve bunları elektrotlara yüklerken özel dikkat gösterilmelidir.Başlamak için, mililitrede 10 µg streptadin kaplı manyetik mikropartikül içeren bir stok çözeltiyi resüspande edin ve beş µL ekleyin. Boncukları yıkamak için çözeltiyi 495 µL PBS içeren bir mikro santrifüj tüpüne ekleyin. İlk olarak, tüpü bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukları rahatsız etmeden tamponu dikkatlice uzaklaştırın.Ardından tüpü manyetik olmayan bir rafa aktarın. Boncukları yıkamak için 500 µL PBS ve by PET ekleyin. Son yıkamadan sonra bunu toplamda üç kez tekrarlayın.Boncukları 490 µL PBS içinde süspande edin ve ardından bir mg/mL'lik stok çözeltiden beş µL Biotinize fare anti-insan CD 63 antikoru ekleyin. Çözeltiyi pipetleme yoluyla karıştırın; bir numune rotatörünü 90 derecelik karşıt rotasyon için beş saniyeye ve beş derecelik vibrasyon için bir saniyeye programlayın. Tüpleri rotatöre yerleştirin ve programı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çalıştırın.Ardından, tüpleri beş dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin. Boncukları üç kez 500 µL PBS ile yıkayın ve ardından Caine içeren 490 µL PBS içinde yeniden süspande edin. Bir tüpü örnek tanımlayıcısıyla etiketleyin ve ardından örneği antikor konjugatlı boncuklarla karıştırmak için 10 µL örneği birkaç kez pipetle ekleyin.Ardından, tüpleri örnek rotatorüne aktarın ve aynı programı oda sıcaklığında iki saat boyunca çalıştırın. Sonra boncukları, 1 molar tris hidroklorür tamponunun 500 microliteri ile üç kez yıkayın. Mıknatıslı raf kullanılarak, ekstrozomlar artık elektrodu önceden kaplamak için mıknatıslı boncuklara bağlanmıştır.Öncelikle prob, potasyum klorür ve ole monomer stok reaktiflerini distile su ile seyreltin. Beş uçlu biyotinli DNA probu, GA DH mRNA'sı için özgündür. Monomer prob çözeltisini vorteksleyerek karıştırın.Her bir birim elektrodun çıplak altından oluşan çalışma, karşıt ve referans elektrotlardan meydana geldiği 16 sensörlü bir elektrot dizisi kullanın. Elektrotların çapraz kontaminasyonunu önlemek için elektrot dizisinin üzerine plastik bir kuyucuk yerleştirin. Çalışma, karşıt ve referans elektrotlar sıvı ile kaplanacak şekilde, 60 µL monomer prob çözeltisini bir altın elektrot yüzeyine aktarın.Monomer probu elektropolimerize etmek için A-C-S-W-E alanı olarak bilinen döngüsel kare dalga elektrik alan profili uygulayın. Bu işlem, elektrot yüzeyinde iletken bir polimer tabakası oluşturur. Sıvıyı elektrot yüzeyinden uzaklaştırmak için sensörü üç kez distile su ile durulayın ve ardından nitrojen gazı ile kurulayın.Elektrot yakalama probu ile önceden kaplandıktan sonra, 495 µL boncuk ekzozom kompleksi çözeltisine 1 µM'lık detektör probu çözeltisinden beş µL ekleyin ve ardından pipetleyerek karıştırın. Buradaki prob, GA dh için spesifik olan, 3' ucuna floresein konjuge DNA primeridir. Önceden kodlanmış elektrot dizisini, sensörün çalışma elektrotlarıyla hizalanmış 16 mıknatıstan oluşan bir mıknatıs dizisinin üzerine yerleştirin.Ardından, elektrot yüzeyine 60 µL boncuk ekzosom çözeltisi aktarın. 20 döngü boyunca A-C-S-W-E alanı uygulayın. Serbest kalan ekzosomal kargo, elektrot yüzeyindeki prob ile hibridize olacaktır.Bağlanmamış analitleri uzaklaştırmak için elektrot yüzeyini distile su ile üç kez durulayın ve ardından elektrotu nitrojen gazı ile kurutun. Daha sonra, kazein içeren PBS içerisinde anti-florescein HRP konjuge antikorun 1/1000 oranında dilüsyonunu hazırlayın. Ardından, antikor dilüsyonundan 60 µL miktarında elektrot yüzeyine ekleyin.Anti-florescein HRP antikorunu detektör probuna konjuge etmek için elektrot yüzeyine A-C-S-W-E alanı uygulayın. Fazla antikoru uzaklaştırmak için sensör yüzeyini üç kez distile su ile durulayın ve ardından elektrodu nitrojen gazı ile kurutun. Sonraki aşamada, her bir sensör yüzeyine çok kanallı bir pipet yardımıyla 60 µL TMB substratı yükleyin; bir elektrokimyasal potansiyostat kullanarak elektrot akımını -200 mV değerinde 60 saniye boyunca ölçün.Tric okumasını elde etmek için, eksozomların manyetik boncuklara bağlanıp bağlanmadığını belirlemek amacıyla transmisyon elektron mikroskopisi kullanılmıştır. Boncuklara tutunmuş 70 ila 100 nanometre boyutundaki granüller, elektrik alanı veya deterjanla lizis sonrası eksozomların bilinen boyutlarıyla uyumludur. Boncukların yakınında görünür eksozom bulunmamaktadır.Ekzosomlardaki GA DH mRNA'sı, atrik okuma ile tespit edildi. Elektrik alanı veya deterjan ile ekzosom lizisi sonrası, zamanla mevcut GA DH miktarının beklendiği gibi azalması, tükürüğün ekzovesiküler ortamına maruz kalındığını göstermektedir. İnsan CD 63 GFP ekzosomal belirteci üreten insan akciğer kanseri hücreleri enjekte edilen farelerin serum ve tükürüğündeki ekzosomal içeriği ölçmek için Efim kullanılmıştır.20 gün sonra, kanser hücreleri enjekte edilen farelerin hem serumunda hem de salyalarında daha yüksek CD 63 GFP seviyeleri tespit edilmiş, ancak salin enjekte edilen farelerde bu durum görülmemiştir. Bu prosedür uygulanırken, elektrot yüzeyini homojen bir şekilde yıkamak için boncukları yıkarken yeterli miktarda sıvı çıkarmak adına boncuklara dokunmaktan kaçınmak ve bölgeleri elektrot üzerine uygun şekilde yüklemek gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu teknoloji, yani efim teknolojisi, sistemik bir hastalığın veya uzak bir organın, eksozom adı verilen bu yapılar aracılığıyla bilgilerini nasıl yaydığına ve hesapladığına dair kritik olan ve daha önce karşılanmamış bir kapasite sağlamıştır.Bunların tükürüğe, ağız boşluğumuza nasıl geldiği, eksozomların nasıl yakalanabildiği, bu moleküler hedeflerin nasıl serbest bırakıldığı ve diyabet, pankreas kanseri veya diğer yaşamı tehdit eden bozukluklar gibi tehlikeli hastalıkların eş zamanlı olarak tespit edilmesine nasıl olanak sağladığı üzerinde durulmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, bir biyosıvıdan eksozomların nasıl hızlıca ekstrakte edileceği, eksozom kargosunun nasıl boşaltılacağı ve entegre bir elektrot sistemi kullanılarak eksozom içeriğinin nasıl hızlıca analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

detection-exosomal-biomarker-electric-field-induced-release

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu videoda, manyetik mikro boncuklar kullanarak eksozomları hedef biyoakışkanlardan izole etmek için bir prosedür gösteriyoruz. Prosedür, aşağı akış analizi için kullanılabilen eksozomların hızlı bir şekilde yakalanmasını sağlar.

Manyetik Boncuk Bazlı Eksozom Ekstraksiyonu: Biyoakışkanlardan Belirli Eksozomları İzole Etme Tekniği

Bu makalede eksozomların tam kandan izolasyonu ve yarı otomatik bir alet kullanılarak nanopartikül izleme ile daha fazla analiz için bir yöntem sunulmaktadır. Sunulan teknoloji, sıvı süspansiyondaki partikülleri görselleştirmek ve analiz etmek için son derece hassas bir yöntem sağlar.

Exosome Kantifikasyon ve Boyut Ölçüm Yenilikçi Yöntem

Hücre dışı veziküller koagülasyon, bağışıklık karşılıklarının ve kanser ilaç uygulaması veya rejeneratif tıpta potansiyel terapötik maddeler dahil olmak üzere, fizyolojik ve patalojik sürece, önemli bir rol oynamaktadır. Bu protokol ayarlanabilir direnç darbe algılama kullanarak çeşitli sıvıların izole ve izole olmayan hücre dışı veziküllerin miktar ve boyut karakterizasyonu için yöntemler sunar.

Sayımı ve Ayarlanabilir Dirençli Darbe Algılama Yöntemi Ekstrasellüler Veziküller boyutu-profil

Bu protokol için hızlı izole edilmesi insan tam kan üzerinden ekstraselüler veziküller ve belirli işaretleri karakterizasyonu için tam iş akışı floresans tabanlı nanopartikül izleme analizi ile açıklanmaktadır. Sunulan sonuçlar tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde göstermek ve hücre kültür supernatants için ayarlanabilir.

İnsan kanı nanopartikül izleme analizi ile tek hücre dışı veziküller floresans tabanlı hızlı karakterizasyonu

Hastalıklı ve malign hücreler için dış türev biomarkerlerin klinik çevirisi, hızlı ve doğru ölçme yöntemlerinin olmaması ile engellenmiştir. Bu raporda, küçük hacimli serum veya plazma örneklerindeki belirli dış alt türleri ölçmek için düşük büyütme koyu alan mikroskop görüntülerinin kullanımı açıklanmaktadır.

Tümör türevi Exosomes ölçmek için Nanoplasmon-gelişmiş saçılma ve düşük büyütme mikroskop görüntüleme kullanma

Fare perigonadal yağ dokusundan ve insan plazmasından izole edilmiş hücre dışı veznelerin boyut dağılımını ve toplam partikül konsantrasyonu tahmin etmek için yeni bir nanopartikül izleme analiz aracının nasıl kullanılacağını gösteriyoruz.

Hücre Dışı Veziklinlerin Nicelleştirilmesi ve Boyut Tayini için Nanopartikül Takip Analizi

Bu makale, hücre dışı vezikül alt kümelerinin karakterizasyonu için artan verime sahip yeni nesil multiparametrik analitik platformlar önermektedir. Yöntem, bir mikroarray biyoçipinde sıkışmış veziküler hedefleri nitelemek için Raman spektroskopisi ile birleştiğinde, atomik kuvvet mikroskobu ile metrolojik ve morfomekanik analizlerle çoklanmış biyosensing yöntemlerinin bir kombinasyonuna dayanmaktadır.

Hücre Dışı Vezikül Alt Kümelerinin Analizi için Çok Katlı Yüzey Plazmon Rezonans Görüntüleme Çipi Üzerinde Multimodal Analitik Platform

Burada, mikroRNA paketlemesinin dinamiklerini incelemek ve hücre dışı veziküllere (EV'ler) aktarmak için floresan etiketli mikroRNA'ların bolluğunun in vitro değerlendirmesini sağlayan basit bir protokolü açıklıyoruz.

Akış Sitometrisi Kullanarak Hücre Dışı Veziküllere miRNA Salınımının İzlenmesi

Burada, insan deneklerin gözyaşı ve tükürük gibi biyolojik sıvılarından toplanan hücre dışı veziküller (EV'ler) için karakterizasyon yöntemini gösteriyoruz. Bu yöntemde kullanılan tarayıcı, numunenin 1 μL'sinden EV'lerin fenotipini, boyutunu ve toplam partikül sayısını tespit etme yeteneğine sahiptir.

Biyolojik Sıvılardan Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu

Burada, etiketsiz yüzey takviyeli Raman spektroskopisi (SERS) kullanılarak bireysel küçük ekstrasellüler veziküllerini (sEV) analiz etmek için bir protokol sunuyoruz; bu protokol, minimal invaziv hastalık teşhisi ve sEV'lerin terapötik teslimat araçları olarak değerlendirilmesini mümkün kılmaktadır.

Hastalık Tanısı ve Tedavilerde Bireysel SEV'lerin Yüzeye Güçlendirilmiş Raman Saçılmasına Dayalı Biyosensörleme'nin Uygulanmasını Araştırmak

Keşfedin, ekzozomları biyosıvılardan manyetik mikropartiküller kullanarak çıkarma ve elektrik alanı ile lizis yaparak RNA ve protein kargo analizi yöntemini. Bu hızlı elektrokimyasal teknik, biyobelirteç keşfi için verimli bir yaklaşım sunar.

Elektrik Alan-kaynaklı Release ve Ölçme (EFIRM) tarafından Exosomal Biomarker Algılama

Daha fazla video keşfet