Aracılığıyla DEĞİŞTİR Protein-protein etkileşimleri İnhibitörlerinin Geliştirilmesi: Tasarım ve Geliştirme Olmayan ATP Rekabetçi CDK inhibitörleri Uygulama
October 26th, 2015
Protein-protein etkileşimlerini hedeflemek için REPLACE stratejisinin uygulanmasını açıklıyoruz. REPLACE , optimize edilmiş peptidik inhibitörlerin ilaç benzeri moleküllere dönüştürülmesi için sentetik ve hesaplamalı yaklaşımları içeren yinelemeli bir stratejidir.
Stratejinin genel amacı, bir protein protein etkileşiminin bir peptit inhibitörünün dönüştürülmesi yoluyla etkili bir küçük moleküllü ilaç benzeri terapötik oluşturmaktır. Bu, ikinci bir adım olarak hangi parçaların etkili bir şekilde değiştirilebileceğini anlamak için istenen peptit protein etkileşimi için bir yapı aktivite ilişkisi kurarak elde edilir. Hesaplamalı kimya, bilinen peptit belirleyicileri için uygun fragman alternatiflerini tanımlamak için kullanılır ve bu daha sonra bir fragman peptit melezleri kütüphanesini sentezlemek için kullanılabilir.
Daha sonra, daha ilaç benzeri olan ve doğal peptitin aktivitesini özetleyen molekülleri tanımlamak için in vitro bir tahlilde test edilebilecek moleküller üretmek için bu fragmanlar ve kesilmiş peptit arasında bir melez kütüphanesi sentezlenir. Sonuçlar, metodoloji kullanılarak daha fazla ilaç benzeri bileşiğin tanımlanabileceğini ve bunların, protein protein etkileşimlerinin inhibitörlerinin ilaç keşfi için etkili başlangıç noktalarını temsil ettiğini göstermektedir. Bu nedenle, bu tekniğin yüksek verimli tarama gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, protein protein traksiyonunun ilaç keşfi açısından son derece zor olması ve geleneksel yöntemlerin iyi çalışmamasıdır.
Değiştirme stratejisi, aşamalı yinelemeli yaklaşımı içerir ve bu nedenle daha uzun sürebilir veya uzun vadede etkili olma olasılığı daha yüksektir. Bugün, bazı reaksiyonları ve prosedürleri ayarlayacak olan ortağım Dr.Sandra Craig'in yardımıyla prosedürlerin çoğunu kendim göstereceğim. Bu prosedüre, yerleştirme protokolünün doğrulanması ile başlayın, ardından ligandları Cyclin bir oluğuna yerleştirmek için metin protokolünde açıklandığı gibi reseptör bağlanma bölgesinin ve ligandların hazırlanmasıyla başlayın.
İlk olarak, yazılıma ayarlanan reseptör ligand etkileşim protokolünden ligand uyum rutinini seçin, reseptörü ve hazırlanan ligandları bu protokol için girdi olarak kullanın. Bu çalıştırmalar için enerji şebekesi olarak PLP one'ı seçin. Yerleştirme programı tarafından kullanılan enerji ızgarası, ligand reseptör etkileşimleri ve potansiyel pozlar oluşturmak için kuvvet alanıdır.
Birinci Plp, özellikle hidrojen bağı etkileşimlerine öncelik veren barış açısından doğrusal potansiyeldir. Pozların enerjinin en aza indirileceğini ve oluşturulan poz sayısını 10 olarak belirtin. Diğer tüm parametreleri ilk örnekte varsayılan değerlerde bırakın.
Görselleştirici programında pozları görüntüleyin ve ardından PLP bir puanının azalan değerlerine göre sıralayın. Aday bir ligand pozuna, geometriye ve hedef reseptör yapısı ile kovalent olmayan etkileşime dayalı olarak kenetlenmiş bir ligandın bağlanma afinitesini tahmin etmek için plp gibi puanlama fonksiyonlarını kullanın. Bilinen sınırlama grubuyla süper imkansızlık için puanlanan pozların ilk %25'ini görsel olarak analiz edin.
Ayrıca pozun, bağlanma için kritik olduğu bilinen moleküller arası temaslar gerektiren atom kısıtlamalarını içerecek şekilde ayarlanmış ve veya potansiyel kapatma grubunu amid bağı oluşumu için doğru geometride konumlandırması gereken etkileşim filtrelerini yerine getirip getirmediğini gözlemleyin. Son olarak, bilinen yapı aktivitesi ile tutarlı bir şekilde bağlama cebinin verimli bir şekilde doldurulması olarak tanımlanan görsel tamamlayıcılık için pozları inceleyin. Uç kapak gruplarının sentezi için ilişkiler, tüm ticari başlangıç malzemelerini, çözücüleri ve reaktifleri kullanır ve geleneksel sentetik organik kimya ile sentezler.
Reaksiyonları izlemek için önce başlangıç malzemesini ve reaksiyon karışımını mobil fazda çözerek silika jel üzerinde ince tabaka kromatografisi veya TLC gerçekleştirin. Daha sonra çözünmüş başlangıç malzemesini ve reaksiyon karışımını kılcal borular kullanarak TLC plakası üzerinde tespit edin. TLC plakasını mobil fazı içeren hazneye yerleştirin.
Mobil faz TLC plakasının %90'ına ulaştığında, plakayı çıkarın ve havayla kurutun. Başlangıç malzemesini ve reaksiyon karışımlarını görünür noktalar olarak algılamak için UV ışığı kullanın. Ardından, nokta ve mobil faz tarafından kat edilen mesafenin oranı olan her noktanın RF'sini hesaplayın.
Daha sonra, reaksiyon karışımını ayırıcı bir huniye yerleştirin ve uygun şekilde sulu asit veya baz çözeltisi ile yıkayın. Organik çözücüyü toplayın ve kurutmadan önce döner bir buharlaştırıcıda buharlaştırın. Elde edilen ham ürün, 500 miligram ham ürünü vakum altında üç ila beş mililitre uygun çözücü içinde çözer ve hava altında kurutmadan önce bir silikaya veya RP 18 numunesine eklenir, ham ürünü içeren bir numuneyi silika, ters faz geçmeli kartuşlara yerleştirir.
Otomatik yüksek performanslı flaş kromatografisi kullanarak ham malzemeyi saflaştırın. Degradeli 100 gramlık bir ek sütun kullanmak. 15 sütun biriminden fazla çalıştırın.
Çözücü içinde toplanan saflaştırılmış ürünü, çözücünün tamamını kuruyana kadar buharlaştırarak döner bir buharlaştırıcı kullanarak flaş kromatografisinden kurutun. Ardından, kalan tüm çözücüleri çıkarmak için ürünü vakum altında daha da kurutun. Saflaştırılmış ürünün, uç kapaklı fragmanı, bağlanmış inhibitör peptitleri veya flips montajını sentezlemek için metin protokolünde açıklandığı gibi NMR MS ve analitik HPLC ile karakterizasyonunu gerçekleştirin.
Standart katı faz sentez yöntemleri ile son ed peptik bileşikler. Beş dakika boyunca iki mililitre DIMETHYLFORMAMID veya DMF'de 4.4 eşdeğer HBTU'da C terminal amino asidinin beş eşdeğerini aktive edin. Karışımı, oda sıcaklığında bir saat boyunca altı eşdeğer di izopropil etil amin kullanarak pist reçinesi üzerine yükleyin.
20 dakika boyunca üç mililitre DMF'de% 10 INE kullanarak FM koruma grubunu C terminal kalıntısından çıkarın. Sonraki amino asitleri her adımda adım adım birleştirin. Bir saat boyunca iki mililitre DMF'de altı eşdeğer DI izopropil, etil amin ve 4.4 eşdeğer HBTU kullanarak bir sonraki amino asidin beş eşdeğerini birleştirin.
Oda sıcaklığında, amino asit bağlantısından sonra yıkama döngülerini ve peptit montajından sonra FM D koruma adımlarını uygulayın. Peptit montajının tamamlanmasının ardından oda sıcaklığında bir saat boyunca iki mililitre DMF'de altı eşdeğer DI izopropil, etil amin ve 4.4 eşdeğer HBTU kullanan çift N kapatma grupları. Reaksiyon karışımını, yan zincir koruma gruplarını çıkarmak için gece boyunca iki mililitre bölünme karışımı ile muamele edin ve reçineden Cleve çevirileri elde edilen ürünü çökeltmek için soğuk datil eter ile tritrat edin ve gerekirse, elde edilen katı ve kuru bir döner buharlaştırıcı filtrede konsantre edin, vakum altında veya bir liyofilizatör kullanarak dondurarak kurutun.
Bu noktada, rekabetçi bağlanmanın belirlenmesi için metin protokolünde açıklandığı gibi floresan polarizasyon bağlama testine geçin. Siklon bağlama oluğuna bağlı H-A-K-R-R-L-I-F'nin model yapısı gösterilmiştir. Döngü oluğu, kırmızı ile gösterilen asidik kalıntılarla köprülenen iki hidrofobik cep, daha büyük bir birincil cep ve daha küçük bir ikincil cepten oluşur.
Diğer önemli etkileşimler, peptit omurgasının hidrojen bağ temaslarını ve peptitin üç temel kalıntısının iyon eşleştirme etkileşimlerini içerir, burada üç beş D-C-P-T-R-L-I-F'nin bağlanma modu gösterilir, triptofan iki 17 ve glutamin 2 54'ün yan zincir atomları ile hidrojen bağı etkileşimleri ile gösterilir. Bu bileşiklerin her biri, triptofan iki 17 ve glutamin 2, 54'ün etkileşim filtre atomları ile hidrojen bağlarına sahip olan üç temsili ve kapak grubunun pozları gösterilmiştir. Yeşil kesikli çizgilerle gösterildiği gibi, rezene Vander duvarının ikincil hidrofobik cep ile etkileşimlerini sağlar.
Bu videoyu izledikten sonra, bilinen bir peptit inhibitörünü, bir protein proteini çekişini inhibe eden ve terapötik gelişim için bir başlangıç noktası olan daha ilaç benzeri bir moleküle dönüştürerek değiştirme stratejisinin nasıl gerçekleştirileceği ve uygulanacağı konusunda daha iyi bir anlayışa sahip olacaksınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, peptid inhibitörlerini ilaç benzeri moleküllere dönüştüren protein-protein etkileşimlerini hedef alan REPLACE stratejisini açıklar. Metodoloji, ilaç keşfini geliştirmek için sentetik ve hesaplamalı yaklaşımları birleştirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- İlaç keşfi
- Protein-protein etkileşimleri
- Hesaplamalı kimya
Arka Plan
- Protein-protein etkileşimleri, ilaç keşfi için zorlu hedeflerdir.
- Yüksek verimlilikli tarama gibi geleneksel yöntemler bu alanda genellikle başarısız olur.
- Peptid inhibitörler, küçük molekül terapötiklerinin geliştirilmesi için başlangıç noktaları olarak hizmet edebilir.
- REPLACE stratejisi, bu inhibitörlerin ilaç benzeri özelliklerini geliştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Peptid inhibitörlerden etkili küçük moleküllü ilaçlar üretmek.
- Peptid-protein etkileşimleri için yapı-etkinlik ilişkilerini kurmak.
- Bilinen peptid belirleyiciler için uygun fragman alternatiflerini belirlemek.
Kullanılan Yöntemler
- Yapı-etkinlik ilişkilerinin kurulması.
- Fragman tanımlaması için hesaplamalı kimya.
- Fragman peptid hibritlerinin bir kütüphanesinin sentezi.
- Sentezlenen moleküllerin ilaç benzeri özelliklerini test etmek için in vitro deneyler.
Ana Sonuçlar
- REPLACE metodolojisi kullanılarak daha fazla ilaç benzeri bileşik tanımlanmıştır.
- Bu bileşikler, ilaç keşfi için etkili başlangıç noktalarını temsil eder.
- Yaklaşım, geleneksel yüksek verimli tarama yöntemlerinin sınırlamalarını aşmaktadır.
Sonuçlar
- REPLACE stratejisi, protein-protein etkileşimlerinin inhibitörlerini geliştirme potansiyelini artırır.
- Bu yöntem, ilaç keşfine sistematik bir yaklaşım sağlar.
- Gelecekteki araştırmalar, terapötik seçenekleri daha da iyileştirmek için bu bulgulara dayanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
The REPLACE strategy addresses a critical bottleneck in oncology drug discovery by enabling the conversion of peptide-based protein-protein interaction inhibitors into drug-like small molecules. This approach expands the targetable space for cyclin-dependent kinases (CDKs), which are frequently deregulated in cancer and represent high-value therapeutic targets. By improving the drug-like properties of peptide inhibitors targeting the cyclin binding groove, the method supports early-stage target validation and lead identification efforts in oncology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by validating the cyclin binding groove as a druggable site for selective CDK inhibition.
- Operational Value: Provides a systematic workflow for structure-activity relationship mapping to identify key residues amenable to replacement with fragment-like moieties.
- Predictive Value: Generates starting compounds with improved drug-likeness that recapitulate peptide inhibitor activity, supporting preclinical de-risking of CDK2/cyclin A interactions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces fragment peptide hybrid libraries suitable for in vitro fluorescence polarization binding assays to quantify competitive binding at the cyclin binding groove.
- Operational Value: Establishes a reproducible synthesis and purification protocol using standard organic chemistry techniques, enabling scalable generation of analogs.
- Assay Readiness: Delivers compounds with defined binding poses and interaction filters that can be used to establish robust, quantitative screening assays for downstream hit-to-lead campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Supports progression from biochemical inhibition to cellular context by yielding compounds that inhibit cell cycle CDK/cyclin complexes, linking target engagement to phenotypic outcomes.
- Preclinical Alignment: Focuses on non-ATP competitive inhibition, offering a mechanistic avenue to avoid kinase domain selectivity challenges associated with ATP-competitive CDK inhibitors.
- Risk Mitigation: Enables early assessment of binding mode conservation and interaction fingerprints, reducing uncertainty in target engagement prior to cellular efficacy testing.
Pipeline & Workflow Integration
The REPLACE strategy fits within the early discovery continuum, bridging peptide-based target validation and small molecule lead generation for oncology targets like CDKs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven validation of protein-protein interfaces by converting peptide inhibitors into synthetically tractable, drug-like molecules.
- Screening: Enables assay-ready compound libraries with measurable binding affinity and defined structure-activity relationships for hit identification.
- Analytics: Relies on docking scores, interaction filters, and visual complementarity assessments to prioritize compounds with favorable binding geometry and non-covalent interactions.
- Translational Research: Connects biochemical binding data to functional inhibition of CDK/cyclin complexes, supporting alignment with cell-based readouts.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular, iterative framework applicable to other protein-protein interactions beyond CDKs, promoting platform-like utilization across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence by enabling structure-guided optimization of protein-protein interaction inhibitors with defined binding modes.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized computational docking, fragment library synthesis, and purification protocols.
- Strategic Value: Increases predictive confidence in early-stage projects by reducing reliance on empirical screening for challenging targets.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of CDK inhibitors by providing early chemical matter with validated target engagement and improved drug-like properties.
Implementation Considerations
- Requires expertise in computational chemistry for docking protocol validation and pose analysis using energy minimization and scoring functions.
- Depends on access to standard synthetic organic chemistry infrastructure for peptide assembly, fragment ligation, and purification via flash chromatography.
- Necessitates cross-team alignment between modeling, synthesis, and assay teams to ensure consistency in fragment selection and hybrid library design.
- Involves adaptation considerations when applying the strategy to different protein-protein interfaces, particularly in defining interaction filters and capping group geometries.
- Practical limitations include the iterative nature of the approach, which may require multiple cycles of design, synthesis, and testing to achieve optimal drug-like properties.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:57
Computational Identification of Potential Small Molecule Capping Groups
4:03
Synthesis of Potential N-capping Groups
6:25
Solid Phase Synthesis for the Generation of FLIPs
8:45
Results: Identification of More Drug-like Inhibitors of CDK2 through the Cyclin Groove
9:59
Conclusion
