Name: Aracılığıyla DEĞİŞTİR Protein-protein etkileşimleri İnhibitörlerinin Geliştirilmesi: Tasarım ve Geliştirme Olmayan ATP Rekabetçi CDK inhibitörleri Uygulama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Keşfedin, hesaplamalı kimya ve sentetik yöntemlerle peptit inhibitörlerini ilaç benzeri moleküllere dönüştürme stratejisini. Protein-protein etkileşimleri için yeni terapötik geliştirme yaklaşımlarını öğrenin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Douglas Pittman ve Michael Wyatt'a hücre kültürü konusundaki yardımları için ve Dr. Wyatt ve Bayan Erin Anderson'a bağlanma testlerinin geliştirilmesindeki yardımları için teşekkür ederiz. Güney Carolina Üniversitesi Kimya ve Biyokimya Bölümü'nden Mike Walla ve Bill Cotham'a Kütle Spektrometresi konusunda yardım için, Helga Cohen ve Dr. Perry Pellechia'ya NMR spektrometresi için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından 5R01CA131368 araştırma projesi hibesi ile finanse edilmiştir.

Potansiyel Küçük Molekül Kapak Kapatma Gruplarının 1. Hesaplamalı Tanıtımı Not: Prensip olarak, yerleştirme veya farmakofor ara çeşitli yöntemler potansiyel kapatma gruplarını tahmin etmek için de kullanılabilir. DEĞİŞTİRME hesaplama çalışmaların amacı, ikame edilmiş amino asitlerin özelliklerini ve etkileşimlerini muhafaza eden küçük moleküllerin tespit etmektir. <ol><li> LigandFit yerleştirme protokolünün 14 Doğrulama </li></ol> Not: Daha önceki çalışmalarda, yerleştirme yöntemi (LigandFit 15, moleküler modelleme programı takımında bir modül, Discovery Studio 3.0) bu algoritma bilinen Ncaps bağlayıcı modlarını çoğaltmak ve sonuçlar elde göstermek için yeterli olduğundan emin olmak için doğrulandı bilinmeyen bileşikler 14 tahmini vardır. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Aşağıdaki adımları (1,2-1,5) kullanılarak aşağıdaki gibi LigandFit için optimal parametreleri tespit: PLP1 enPoz nesil, oluşturulan pozlar azaltılması ve pozlar analizi için PLP1 puanlama fonksiyonu için ji ızgara. </li><li> Elde edilen konformasyonlar sınırlamak ve kaplanmış peptidin kovalent bağ oluşumu için uygun ligandlar konumlandırmak amacıyla, hidrojen bağları için etkileşim filtre sırasıyla Trp217 ve Gln254 indol azot ve amid nitrojen atomu ayarlayın. </li><li> Tasarım ve A reseptörü (2UUE) siklin / CDK2&#39;nin içine fragmanı alternatifleri bir kütüphane rıhtım. Sentez ve PLP1 puanlama, CBG ile etkileşim filtreleri ve tamamlayıcılık ile etkileşim dayalı ticari kaynak potansiyeli kapak kapatma gruplara öncelik. Aşağıdaki gibi LigandFit yerleştirme için gereken çeşitli adımlar vardır. </li></ol><ol start="2"><li> Reseptör bağlanma sitesi 14 Hazırlanması <ol><li> Yazılımda bir görselleştirme penceresine: CDK2 / siklin A kristal yapısı (2UUE pdb id) İthalat. Bu yapı, daha önce tanımlanmış olan FLIP ihtiva 5-metil-1-fenil-1 H-1, 2,4-triazol-3-karboksamido (3,5-DCPT) RLIF siklin yivine bağlıdır (Şekil 3). </li><li> Sil veya yerinde kalıntıları RLIF (C-terminali) tutmak. Peptit sekansı muhafaza edildiğinde, ligand için etkileşim filtresi olarak peptidin N-terminal amino grubu kullanılır. &quot;Reseptör-ligand etkileşimleri&quot; araçlardan, N-cap Göster / Gizle sitesi alandan 3,5-DCPT etrafında bir küre oluşturun. Küre ligand-reseptör etkileşimleri bağlanması esnasında oluşmasına izin verilir bağlanma yeri aktif bölgeyi tanımlamak için oluşturulur. </li><li> &quot;Seçilen ligand hacmi olarak bulabilirsiniz sitesinden&quot; dan daha bağlanma bölgesini tanımlar ve proteinden Ligandı 3,5-DCPT silin. Oluşturulan alanı içinde bağlayıcı hacmini tanımlamak için bu adımı uygulayın. </li><li> Hidrojen bağlanması için etkileşim filtreleri olarak artıkları Trp217 ve Gln254 indol azot ve amid nitrojen atomu ayarlayın. Etkileşimi filtreleri ayarlama böylece bütünleşmesini yalnızca pozlarset kalıntılarının atomları ile ract nedenle demirledi pozlar önemli etkileşimleri koruyarak yerleştirme sürecinde filtre edilecektir. </li></ol></li><li> Ligandlar 14 Hazırlanması <ol><li> Molekül ağırlığı 500&#39;den daha az ikincil cebinde kesik peptit ve van der Waals etkileşimleri için uygun hidrofobik grupların (ikame edilmiş fenil grubu) dahil edilmesi ile ligasyon için bir karboksilat grubun varlığı da dahil olmak üzere ölçütlere göre 100 potansiyel kapaklama gruba kütüphane Tasarım Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> Trp217 ve ikame edici ile peptid, hidrojen bağı etkileşimlerini almışlardır heterosiklik halkalar seçin HAKRRLIF arasında bazik yan zincirler, iyon-çiftlenmesi etkileşimlerini değiştirmek için dahil. Karbonil oksijen ile bir kaynak peptidin (Tablo 1) &#39;de peptit omurgasına benzeyen Gln254 amid azot atomu ile etkileşime girebilir, böylece ilgili aldehid moleküller olarak ligandları bağlantı istasyonu. </li><li> Önce docKral, düşük enerjili konformasyon için tasarlanmış ligandların en aza indirmek ve &quot;ligandlar hazırlayın&quot; protokolünü kullanarak uygun bir iyonizasyon devlet hazırlar. Beraberlik ve yazılım içine ithal edilen bir tablo için ChemDraw&#39;a içinde .sdf dosyası biçiminde bu potansiyel N kapaklar ihracattan önce. Not: ligandlar protokolünü hazırlayın tüm ligandlar en aza indirmek için kullanılan en düşük enerji durumlarına demirledi edilecek ve iyonizasyon ücrete atomların uygulanmıştır. Varsayılan parametreler bu aşama için kullanılır. </li></ol></li><li> Siklin A Groove 14 ligandlann Yerleştirme <ol><li> Yazılımın reseptör-ligand etkileşimleri protokolü setinden LigandFit rutin seçin. Reseptörü ve bu protokol için girdi olarak hazırlanmış ligandlar kullanın. </li><li> Enerji şebekesine olarak bu çalışır seçkin PLP1 için, bu enerji minimize olacak pozlar ve 10 olarak oluşturulan pozlar sayısı varsayılan değerlerine tüm diğer parametreleri bırakın belirtin. Not: LigandFit olduğuMonte Carlo yapısal arama algoritması ile kombine bir şekil tabanlı karşılaştırma filtre kullanarak bir proteinin aktif site ile yüksek tamamlayıcılık ve potansiyel yakınlık pozlar tanımlamak ve üretebilir bir yerleştirme yöntemi. Yerleştirme programı tarafından kullanılan enerji ızgara ligand-reseptör etkileşimleri ve potansiyel pozlar üretmek için güç alanıdır. PLP1 özellikle hidrojen bağlayıcı etkileşimleri önceleyen ve parçalı lineer potansiyeli PLP atom türü her hidrojen olmayan ligand atom veya hidrojen olmayan reseptör atomu için tahsis nerede. </li></ol></li><li> Sonuçların analizi <ol><li> İlk etapta, ekran PLP1 puanı değerlerini azalan göre sıralama sonra visualizer programında pozlar ve. Aday ligand göre yerleştirilmiş bir ligandın bağlanma afinitesi, hedef reseptör yapısı ile geometrisi ve kovalent olmayan bir etkileşim teşkil tahmin etmek için örneğin PLP1 skorlama fonksiyonlarını kullanın. Not: Burada PLP1 puanlama fonksiyonu g bulunduhidrojen bağının tahmini içerdiğinden en iyi sonuçları ive. </li><li> Bilinen kapama grubuna değerini en az 2 Å (göreceli ortalama kare sapma (RMSD sahip)) ile görsel 1 için attı pozlar üst% 25 analiz) ile üst üste, 2) siklin yivli etkileşim filtreleri ve 3) görsel tamamlayıcılık yerine . O kabul edilen bir doğru (bir deneysel yapıya kıyasla) poz demirledi &lt;2 Å bir RMSD değerine sahiptir. </li><li> Bilinen yapı-aktivite ilişkileri ile tutarlı bir şekilde, bağlama cebinin etkin dolgu maddesine sahip olarak tanımlanır, görsel tamamlayıcılığı için pozlar inceleyin. Etkileşim filtreleri bağlanması ve / veya amid bağı oluşumu için uygun geometride bir potansiyel kapama grubunu yerleştirmek için gerekli olan kritik olduğu bilinen, moleküller arası temas gerektiren atomu kısıtlamaları dahil etmek için ayarlanır. Interactio ile hidrojen bağı oluşturur potansiyel N-kapatma grupları yerleştirilmiş pozlar üç örnekn adet filtre, Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. </li></ol></li></ol> 2. Sentezi ve Potansiyel N -capping Gruplar Karakterizasyonu <ol start="1"><li> N-kapatma grupların sentezi. </li><li> Elde edilen sentezi için, ticari başlangıç ​​materyalleri, solvent ve reaktifler kullanılır. Geleneksel sentetik organik kimya (bir örnek için Şekil 5, 12,13) ​​ile potansiyel N-kapatma gruplarını sentezleme. </li><li> Reaksiyonları izlemek için, silika jel üzerinde ince tabaka kromatografisi (TLC) uygulayın. <ol><li> Mobil faz olarak bir başlangıç ​​materyali reaksiyon karışımı (1 mg) çözündürün ve kılcal borular kullanılarak TLC plakası üzerinde nokta onları. </li><li> (A 35:65 oranında etil asetat ve heksan), mobil faz içeren bölmeye TLC plaka koyun. Mobil faz TLC plakası% 90 ulaştığında, kaldırmak ve hava plakasını kurulayın. </li><li> Görünür noktalar olarak başlangıç ​​malzemesi ve reaksiyon karışımları tespit etmek için UV ışığı kullanın. CalBütün noktalar R f (nokta ve mobil faz mesafenin oranı) hesaplanmalıdır. Not: başlangıç ​​malzemesinin Rf görülen hiçbir yerinde olduğu zaman, reaksiyon tamamlanmıştır. </li></ol></li><li> Reaksiyonun tamamlanmasından sonra, sulu bir asit veya baz çözeltisi ile bir ayırma hunisi ve yıkamada yerleştirerek reaksiyon karışımı kadar çalışır. Vakum altında elde edilen ham ürün, organik çözücü madde döner bir buharlaştırıcı içinde toplamak buharlaştırılmak ve kurutun. </li><li> Uygun bir çözücü, 3-5 ml ham ürün, 500 mg çözülür ve silika ya da RP 18 Samplet bir 1 g eklemek ve hava altında kurutulur. Silis / RP SNAP flaş kartuşlarında ham ürün ihtiva eden Samplet yerleştirin ve% 6 etil asetat ile başlayarak gradyanı çalışma ile SNAP 100 g kolonu kullanılarak (üreticinin protokolüne göre) otomatik yüksek performanslı flaş kromatografisi kullanılarak ham materyal saflaştırılması: 94 % 50% etil asetat heksan ve tekrar% 50 hekzan15 kolon hacmi. </li><li> Kuruyana kadar tüm çözücüyü buharlaştırarak bir döner buharlaştırıcı kullanılarak hızlı kromatografi ile ilgili çözücü içinde toplanan saflaştırılmış ürün kurutulur ve daha fazla kalan tüm çözücüleri uzaklaştırmak için vakum altında ürün kurutulur. NMR, MS ve analitik HPLC ile arıtılmış ürünün karakterizasyonu gerçekleştirin. <ol><li> 1H NMR ve 13C NMR için, saflaştınlmış numuneye yaklaşık 10 mg ağırlığında uygun bir deuteratlanmış çözücü içinde çözünmesi, ve NMR spektrumları 2,14 kayıt için kuru bir NMR tüpü içeriği aktarın. </li><li> 1 H NMR ve yüksek alan NMR Spektrometresi (en az 300 MHz) ile 13 ° C NMR spektrumları kaydedin. Bir QTOF (uçuş kütle spektrometresi Tandem dört-1 defa) kullanarak kütle spektrumları, elektrosprey iyonizasyonu (ESI) veya VG 70S Edinme (Çift odaklama manyetik sektör kütle spektrometresi, EI) 2,14. </li><li> Bir diod düzenek detektörü ile HPLC ile ürünlerin saflığını analiz ile donatılmışBir C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 um analiz sütunu. 30 dakika boyunca% 60 asetonitril (% 0.1 trifloroasetik asit)% 100 su (% 0.1 trifloroasetik asit) başlanarak gradyanı çalıştırmak kullanarak ve 4 dk için gradyanı tutun. 226 ve 254 nm 2,14 olarak kromatogramlar ayıklayın. Not: değerlendirildi bileşiklerin analitik saflık&gt;% 95 idi. </li></ol></li></ol> Döndürür 2 Üretimi için 3. Katı Faz Sentezi <ol start="1"><li> N-kapaklı çevirir sentezi <ol><li> Aşağıdaki adımları kullanılarak standart katı faz sentez yöntemleri ile N-uçlu peptidik bileşikler bir araya getirin. <ol><li> 2 ml O -Benzotriazole- N, N, N &#39;, N-tetrametil-uronyum-heksafluoro-fosfat (HBTU, 221,93 mg) 4,4 eşdeğer olarak C-terminal amino asit (Fmoc-Phe) 5 eşdeğer etkinleştirme 5 dakika boyunca, DMF. Diizopropiletil amin 6 eşdeğer kullanılarak Rink reçine üzerine Fmoc-Phe HBTU karıştırılmalıdır (DIPEA, 103,13oda sıcaklığında 1 saat için mg) eklenmiştir. </li><li> 10 dakika boyunca 3 ml DMF içinde% 20 piperidin kullanılarak C-terminal tortusu Fmoc koruma grubunun çıkarılması. Çift sonraki amino asitler (örneğin, Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-pmc) adım adım. Her bir adımda, DIPEA (103,13 mg) ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca 2 ml DMF içinde HBTU (221,93 mg) 4,4 eşdeğer 6 eşdeğer kullanarak bir sonraki amino asidin çift 5 eşd. </li><li> Yıkama döngüleri, yukarıda tarif edilen bir amino asit birleştirme ve koruma giderme adımları sonra Fmoc DMF (DCM + 5 x 10 ml 5 x 10 mi) uygulanır. Peptit montajı kurulduktan sonra, çift, oda sıcaklığında 1 saat boyunca 2 ml DMF içinde DIPEA (103,13 mg) ve HBTU (221,93 mg) 4,4 eşdeğer 6 eşdeğer kullanılarak gruplar N-kapatma. </li><li> Peptidin montajının tamamlanmasından sonra, bölme karışımı 2 ml reaksiyon karışımı tedavi (: 5: 90 5 TFA / H2O / TIPS) O / N yan zincir koruyucu gruplar çıkarmak ve ayırmak reçineden çevirir. Soğuk dietil çökeltilmesi için eter ve I &#39;ile elde edilen ürünün toz haline getirinBir döner buharlaştırıcı içinde f gerekli konsantresi. </li></ol></li></ol></li><li> N-başlıklı-C-başlıklı çevirir sentezi <ol><li> O ile birlikte (16.1 mg, 0.02 mmol) diklorometan içinde ve ek [4- (3-klorofenoksi) piridin-2-il] metanamin (Cı-kapak) tartılır ve N-terminal olarak kapatılmış ve korunan Arg-Leu peptidi eritmek - benzotriazol-, N, N, N &#39;, N&#39; -tetrametiluronyum heksaflorofosfat (HBTU; 16.7 mg, 0.02 mmol) ve N, N-diizopropiletilamin (DIPEA, 6.5 mg, 0.02 mmol) eklenmiştir. </li><li> Karıştırın ve TLC / HPLC, başlangıç ​​materyalinin tamamen tükendiğini gösterene kadar oda sıcaklığında reaksiyonu izleyin. Reaksiyonun tamamlanmasından sonra, etil asetat ve su arasında döner bir buharlaştırıcı ve daha sonra bir bölüm ile ham tepkime karışımı konsantre hale getirin. </li><li> Sulu ve organik tabaka ayrılır; 1 N NaOH, 1 N HCI ve tuzlu su ile organik tabaka yıkayın. Sodyum sülfat ile yaklaşık 1 g organik katman kurutulur ve döner bir buharlaştırıcı içinde ürün konsantre edilir. Fina(: 2.5: 2.5 trifluoroasetik asit / H 2 O / İPUÇLARI 95) korumanın kaldırılması için Lly bölünme karışımı ile ürün O / N davranın. </li><li> Soğuk dietil eter ile ve döner bir buharlaştırıcı içinde gerekli olan tüm çözücünün konsantre çıkarılması için tamamen kuruluk derecesinde şekilde elde edilen ürün toz haline getirin. Bundan başka, tüm çözücü kalıntısını uzaklaştırmak üzere, vakum altında ürün kurutulur. </li></ol></li><li> Arıtma ve döndürür karakterizasyonu <ol><li> Yarı preparatif ters-faz HPLC yöntemleri kullanılarak ham olarak döndürür arındırın. Arıtılmış döndürür liyofilize ve kütle spektrometresi 2,14 kullanarak molekül kütlesi karakterize eder. </li><li> Bir diod düzenek detektörü ile HPLC ile döndürür ve analitik saflıkta belirlemek 250 x 4.6 mm, 5 um kolonu, bir C 18 (2), 100 A ile donatılmıştır. % 95 H2O (% 0.1 trifloroasetik asit) /% 5 asetonitril (% 0.1 trifloroasetik asit)% 35 H2O (% 0.1 trifloroasetik asit) /% 65 asetonitril (% 0.1 trifluoroace başlayarak gradyanı yöntemi kullanın-asetik asit), 30 dakika boyunca, 4 dakika boyunca gradyanı tutun. Özü 226 ve 254 nm &#39;de kromatogra-. </li></ol></li></ol> Rekabetçi 2,14 Bağlama Tayini İçin Bağlanma Tahlili 4. Floresan Polarizasyon <ol start="1"><li> Siyah 384-kuyu (138 ul) aşağıdaki prosedürü kullanarak plakalarda tahlil gerçekleştirin. </li><li> Örnekleri, izleyici peptidleri (4 nM), ve kinaz kompleksleri seyreltin (CDK2 / siklin A - 18 ug / ml, CDK4 / siklin D - 37 ug / ml), deney tamponu (25 mM HEPES pH 7, 10 mM gerekli olan konsantrasyonlara NaCl,% 0.01 Nonidet P-40, 1 mM ditiotreitol (DTT). </li><li> 384 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, eklemek: CDK4D1 ya CDK2CA (0,3 ug / kuyu saflaştırılmış rekombinan insan kinaz kompleks), 5 ul bileşik çözeltisi, 30 nM izleyici peptid (fluoresceinyl-Ahx, Pro-Val 5 ul 5 ul -Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly ya fluoresceinyl-Ahx, Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly tracer peptid). Her bir DMSO (% 6), Buffe 5 ul kullanınr, radyoaktif izotop ve 5 ul DMSO (% 6), kinaz kompleksi, kontrol çukurları olarak izleyici </li><li> Tüm bileşenler ilave edildikten sonra, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca (41,16 xg) 500 rpm&#39;de plaka santrifüj ve daha sonra oda sıcaklığında 45 dakika boyunca çalkalama ile plaka kuluçkalayın. 485 nm / 535 nm eksitasyon / emisyon filtresi ve dikroik ayna ile donatılmış bir çok modlu bir plaka okuyucusu ve detektörü kullanılarak kuyulu bir levhadaki her Floresein yoğunluğu okuyun. </li><li> Aşağıda gösterilen eşitlik kullanılarak tüm test örnekleri için göreceli ortalama kutuplaşma (mp) hesaplayın. Göreceli milletvekillerini ilişkilendirilmesi ve konsantrasyonları test ederek Yatırım Ortamı logaritmik regresyon ile 50 değerleri belirlemek. </li></ol><img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/52441/52441eq1.jpg" />

<ol><li>Andrews, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REPLACE%3A+a+strategy+for+iterative+design+of+cyclin-binding+groove+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">REPLACE: a strategy for iterative design of cyclin-binding groove inhibitors.</a> Chembiochem. 7, 1909-1915 (2006).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Non-ATP+Competitive+CDK%2FCyclin+Groove+Inhibitors+through+REPLACE-Mediated+Fragment+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimization of Non-ATP Competitive CDK/Cyclin Groove Inhibitors through REPLACE-Mediated Fragment Assembly.</a> J Med Chem. 56, 1573-1582 (2013).</li>
<li>McInnes, C. Chapter 29. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcInnes%2C+C+%22Annual+Reports+in+Medicinal+Chemistry%22">Annual Reports in Medicinal Chemistry</a>. Bernstein, M., Desai, P. 47, Elsevier. 459-474 (2012).</li>
<li>Bower, J. F., Pannifer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fragment-based+technologies+to+target+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Using fragment-based technologies to target protein-protein interactions.</a> Curr Pharm Des. 18, 4685-4696 (2012).</li>
<li>Makley, L. N., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+number+of+%27druggable%27+targets%3A+non-enzymes+and+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+biology%2C+and+drug+design%22%5BJournal%5D)">Expanding the number of 'druggable' targets: non-enzymes and protein-protein interactions.</a> Chemical biology, and drug design. 81, 22-32 (2013).</li>
<li>Walensky, L. D., Bird, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrocarbon-Stapled+Peptides%3A+Principles%2C+Practice%2C+and+Progress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrocarbon-Stapled Peptides: Principles, Practice, and Progress.</a> J Med Chem. , (2014).</li>
<li>Shapiro, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin-dependent+kinase+pathways+as+targets+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment.</a> J Clin Oncol. 24, 1770-1783 (2006).</li>
<li>Thais, M., Sielecki, J. F. B., Enfield, P. A., Trainor, G. l <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+dependant+kinase+inhibitors%3A+Useful+targets+in+cell+cycle+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Cyclin dependant kinase inhibitors: Useful targets in cell cycle regulation.</a> Journal of medicinal chemistry. 43, 1-18 (2000).</li>
<li>Morphy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectively+nonselective+kinase+inhibition%3A+striking+the+right+balance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Selectively nonselective kinase inhibition: striking the right balance.</a> J Med Chem. 53, 1413-1437 (2010).</li>
<li>Chen, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+killing+of+transformed+cells+by+cyclin%2Fcyclin-dependent+kinase+2+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Selective killing of transformed cells by cyclin/cyclin-dependent kinase 2 antagonists.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4325-4329 (1999).</li>
<li>Orzaez, M., Gortat, A., Mondragon, L., Bachs, O., Perez-Paya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-noncompetitive+inhibitors+of+CDK-cyclin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">ATP-noncompetitive inhibitors of CDK-cyclin complexes.</a> ChemMedChem. 4, 19-24 (2009).</li>
<li>Kontopidis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+cyclin+groove+recognition%3A+complex+crystal+structures+and+inhibitor+design+through+ligand+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Insights into cyclin groove recognition: complex crystal structures and inhibitor design through ligand exchange.</a> Structure. 11, 1537-1546 (2003).</li>
<li>McInnes, C., Andrews, M. J., Zheleva, D. I., Lane, D. P., Fischer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidomimetic+design+of+CDK+inhibitors+targeting+the+recruitment+site+of+the+cyclin+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Current+medicinal+chemistry.+Anti-cancer+agents%22%5BJournal%5D)">Peptidomimetic design of CDK inhibitors targeting the recruitment site of the cyclin subunit.</a> Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents. 3, 57-69 (2003).</li>
<li>Premnath, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragment+based+discovery+of+arginine+isosteres+through+REPLACE%3A+towards+non-ATP+competitive+CDK+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic%2C+and+medicinal%22%5BJournal%5D)">Fragment based discovery of arginine isosteres through REPLACE: towards non-ATP competitive CDK inhibitors.</a> Bioorganic, and medicinal. 22, 616-622 (2014).</li>
<li>Venkatachalam, C. M., Jiang, X., Oldfield, T., Waldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LigandFit%3A+a+novel+method+for+the+shape-directed+rapid+docking+of+ligands+to+protein+active+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Graph+Model%22%5BJournal%5D)">LigandFit: a novel method for the shape-directed rapid docking of ligands to protein active sites.</a> J Mol Graph Model. 21, 289-307 (2003).</li>
<li>Mendoza, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cyclin-dependent+kinase+2%2Fcyclin+A+antagonists+that+differ+from+ATP+site+inhibitors+block+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Selective cyclin-dependent kinase 2/cyclin A antagonists that differ from ATP site inhibitors block tumor growth.</a> Cancer Res. 63, 1020-1024 (2003).</li>
<li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cell+growth+and+survival.+Modifications+to+the+tetrazolium+dye+procedure+giving+improved+sensitivity+and+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.</a> J Immunol Methods. 89, 271-277 (1986).</li>
<li>Zheleva, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+potent+p21%28WAF1%29-derived+peptide+inhibitors+of+CDK-mediated+pRb+phosphorylation%3A+delineation+and+structural+insight+into+their+interactions+with+cyclin+A%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+peptide+research+%3A+official+journal+of+the+American+Peptide+Society%22%5BJournal%5D)">Highly potent p21(WAF1)-derived peptide inhibitors of CDK-mediated pRb phosphorylation: delineation and structural insight into their interactions with cyclin A.</a> The journal of peptide research : official journal of the American Peptide Society. 60, 257-270 (2002).</li>
<li>Ivanov, A. A., Khuri, K. F. R., Fu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein-protein+interactions+as+an+anticancer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 34, (2013).</li>
<li>Thayer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+and+Engineering+News%22%5BJournal%5D)">Improving peptides.</a> Chemical and Engineering News. 89, 13-20 (2011).</li>
<li>Yin, H., Hamilton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+targeting+protein-protein+interactions+with+synthetic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Strategies for targeting protein-protein interactions with synthetic agents.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44, 4130-4163 (2005).</li>
<li>Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+and+drug+discovery+for+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Structural biology and drug discovery for protein-protein interactions.</a> Trends Pharmacol Sci. 33, 241-248 (2012).</li>
<li>Cannon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmaceutics+and+drug+delivery+aspects+of+heme+and+porphyrin+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy.</a> J Pharm Sci. 82, 435-446 (1993).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

İlaç keşfinde protein-protein etkileşimlerini (PPI) hedeflemek oldukça zordur, çünkü bunlar tipik olarak çok sayıda ve yaygın temastan oluşan büyük bir sığ temas arayüzü içerir19. Ayrıca, ilaç keşfine uygun PPI'ları inhibe eden peptidik bileşikler, daha yüksek moleküler kütleleri, metabolik dengesizlikleri ve zayıf biyoyararlanımları nedeniyle sorunludur20. ÜFE inhibitörlerinin geliştirilmesi için uygulanan mevcut stratejiler, proteomimetiklerin tasarımını ve fragman tabanlı tasarımı içerir. Proteom...

Bu yazıda, daha fazla farmasötik ilgili moleküllerin içine protein-protein etkileşimleri peptidik inhibitörlerinin dönüştürmek için strateji DEĞİŞTİRİN (hesaplama zenginleştirme kullanarak kısmi ligand alternatifleri ile değiştirilmesi) uygulayarak bir vaka çalışması 1-3 tarif edilmiştir. PPİ potansiyel ilaç hedefleri zengin ama yeterince faydalanılmayan kaynağı temsil ederken, mevcut metodolojiler bu yaygın erişilebilir hale getirmek, büyük ölçüde yetersiz kalmaktadır. Fragmanı göre dizayn 4, yüksek verimli tarama 5 ve 6 ilerlemeler sağlamıştır zımbalanmış peptidler dahil olmak üzere mevcut stratejiler, ancak, bu bir çok durumda etkisizdir. Sonuç olarak, daha fazla ilerleme ve daha verimli yaklaşımlar gereklidir. Tam ilaç gibi iyileştirilmiş özelliklere ve anti-tümör terapötik maddeler olarak daha da geliştirilmesi için bir potansiyele sahip olan kinaz inhibitörlerinin geliştirilmesinde doğrulanmıştır DEĞİŞTİRME. Bu strateji, hücre dışı ATP inhibitörlerinin geliştirilmesinde örneklenmiştirdöngüsü CDK&#39;ler ve aşağıda içerir: 1) siklin oluğu bağlayıcı HAKRRLIF / RRLIF etkileşimleri ile ilgili 3 boyutlu yapısal bilgileri elde edilmesi; 2) peptid etkileşimi için önemli bir bağlama determinantları olarak belirlenmesi; Bir veya daha fazla bağlama determinantları içeren peptit N-terminal bölgesinin 3) kesme; Peptid ve hangi kesik kısmı için potansiyel küçük molekül alternatiflerinin 4) hesaplama kimlik (kısmi ligand alternatifler PLA&#39;lar) ana peptid önemli etkileşimleri korumak; 5) sentez veya PLA&#39;lerin ticari kaynak önceden silinmiş peptid kalıntı (lar) tarafından işgal alt site ile heyecanla bağlamak için öngörülen; 6) katı faz sentezi kullanılarak kesilmiş peptid için en iyi PLA&#39;lerin ligasyonu yoluyla döndürür ve sentezi; Bağlanma, bir in vitro çevirir ya da bir hücre canlılığı deneyinde daha fazla karakterizasyon ve ardından fonksiyonel deneyi (CDK / siklin bağlamında floresan polarizasyon), 7) test edilmesi. Strateg DEĞİŞTİRME şematik bir temsiliy. Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir, bu yazıda, DEĞİŞTİRME strateji iterasyon tartışılmış ve CDK2 / siklin A uygulama detaylı olarak tarif. CDK&#39;lar, doğrudan veya dolaylı tümörlerinin çoğunluğunda deregüle olduğuna inanılmaktadır ve bu nedenle uygun kanser ilaç hedefleri 7 kabul edilir. CDK&#39;lar tam aktivasyon için siklinler ile ilişki gerektiren ve daha sonra hücre döngüsü düzenlenmesinde 8 kilit rol oynayan proteinleri fosforile. CDK&#39;ların iki ana grup, hücre döngüsü kontrol noktalarına kontrol izotipleri [G1 / S (CDK4 / Siklin D, CDK6 / siklin D ve CDK4 / siklin E), S fazı (CDK2 / siklin A) ve G2 / M (CDK1 / vardır siklin B)] ve fosforilasyon ile RNA polimerazın regülatörleri (CDK7 / siklin H, CDK8 / siklin C, CDK9 / siklin T). E2F1 transkripsiyon faktörü daha sonra DNA&#39;ya bağlanır ve gen transkripsiyonunu başlatır DP proteini ile bir kompleks oluşturduğunda, S fazındaki ilerlemeden bir anahtar aşama, meydana gelir. CDK2 / siklin A E2F1 transkripsiyonel nötralize etmek için gerekli olanfosforilasyon yoluyla aktivite bu şekilde E2F1-DP kompleksi ve daha sonraki bozulma serbest yol açar. CDK2 / siklin A inhibisyonu DNA&#39;sı bağlı durum, kalıcı aktivasyonuna yol içinde E2F1 muhafaza inanılmaktadır. E2F-1 aktivitesi elde edilen seviye, bir terapötik strateji öne p53 bağımsız apoptoz indüklemek için gereken eşik aşacak. Nedeniyle E2F-1 deregüle p53 ve pRb yolları, yüksek düzeyde çoğu zaman tümörler içinde seçici apoptosise yol açacaktır kanser hücreleri ve CDK2 / siklin A inhibisyonu ortaya çıkar ve geçerli bir kanser hedef 7 olarak kabul edilebilir. Klinik olarak incelenmiştir CDK inhibitörleri, insan kinome den büyük 500 protein kinazlar arasındaki reaktivite çapraz gelen, yüksek düzeyde korunan ATP bağlama bölgeleri hedeflemek ve potansiyel etkileri ve toksisiteyi 9 yan yol açan. Alternatif bir yaklaşım CBG aracılığıyla substrat işe hedefleyerek olmayan ATP rekabetçi inhibisyonusiklin pozitif düzenleyici alt birimi mevcut ve bu nedenle farklı ve site 10,11 ATP bağlama uzak olan. CBG esas siklin A, siklin D ve siklin E içinde bulunması, bir hidrofobik oyuk olup substratlar ve tümör baskılayıcı bulunan bir konsensüs sekansı tanımak için gösterilmiştir. Izole edilmiş bir peptit olarak, siklin bağlanma motifinin (MBP) CBG bağlanır ve hücre döngüsü CDK kinaz aktivitesini inhibe ettiği gösterilmiştir. MBP İlaçla için molekül ağırlığının arasında iyi bir denge gösteren bir pentapeptid için ayrıca kesik (HAKRRLIF, CDK2 / siklin A IC 50 0,07 ± 0,02 uM, CDK4 / siklin D IC50 0,88 ± 0,34 uM) bir oktapeptit ve optimize edilmiştir benzerlik ve gücü (RRLIF, CDK2 / siklin A IC 50 1.01 ± 0.17 uM, CDK4 / siklin D, IC50 25,12 ± 2,97 uM) 12,13. CBGs bir acidi tarafından köprülü büyük bir birincil ve ikincil küçük hidrofobik cebine oluşurc bölgesi (Glu220, Glu224 ve Asp283 içerir). HAKRRLIF anahtar bağlayıcı belirleyicileri asidik bölge ve primer lipofilik site Leu6 ve Phe8 tamamlayıcılık bir yüksek derecesi ile Lys3, Arg 4 ve Arg5 ikincil hidrofobik cep, iyon eşleştirme ve hidrojen bağları ile Ala2 etkileşimini içerir. Ile7 primer cebine en uygun temas sağlayan bir ara tortu olarak hareket Buna ek olarak, çok sayıda hidrojen bağları peptit omurgasından katkıda bulunmaktadır. Bağlanma modu ve CBG ile HAKRRLIF etkileşimleri, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. MBP / CBG, protein-protein etkileşimi hedefleyen CDK2 / siklin A, CDK2 / siklin E ve CDK4 / siklin D kinaz aktivitesini inhibe eden ve normal hücreleri 7 etkilemeyen bu E2F1 kanser hücrelerinin apoptozu tetiklemesi. MBP türetilmiş peptitler hücre döngüsü CDK etkili inhibitörleri olan, ancak, bunların nedeniyle metabolik ilaç olarak faydalı olması muhtemel değildiristikrarsızlık ve hücre geçirgenliğini genel eksikliği. Bu amaçla, CDK2 / siklin üzerinden bir inhibisyon deregüle E2F1 istismar anti-tümör tedavilerin geliştirilmesi için daha fazla ilaç benzeri bileşikler içine bu güçlü peptidik inhibitörlerinin dönüştürmek için DEĞİŞTİR strateji uyguladık. Aşağıdaki protokol siklin oluğuna REPLACE uygulamasında tamamlanmıştır çalışmalarını özetlemektedir. İlk olarak, HAKRRLIF N-terminal tetrapeptid ilaç-benzeri başlık grubu değiştirmeleri tespit edilmiştir. Bundan başka, bu grupta gelişmeler DEĞİŞTİRME için ek bir doğrulama araştırıldı. Bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar Örnek sunulmaktadır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Hesaplamalı Kimya</td></tr><tr><td>Accelyrs Discovery studio 3.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dell Optiplex İş İstasyonları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Synthetic Organic Chemistry<</td></tr><tr>td colspan="4">TLC için silika jel (GF-254 plakaları), flaş kromatografisi için Biotage (Uppsala, İsveç), 2995 ile 2996 HPLC diyot dizisi dedektörü ve bir C18 (2) 100 A, 250 x 4.6&nbsp; mm, 5&nbsp; &mu; saflık tayini için m sütunu (Phenomenox Luna), 1H NMR ve 13C NMR spektrumları sırasıyla bir Varian Mercury 300 ve 400 Spektrometresi ile kaydedildi. Kütle spektrumları Mikrokütle QTOF (Tandem dörtlü-1 uçuş zamanlı kütle spektrometresi), elektrosprey iyonizasyon (ESI) ve VG 70S (Çift odaklı manyetik sektör kütle spektrometresi, EI) ile ölçüldü.</td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Floresan Polarizasyon Testi</strong</td></tr><tr><td>>384 mikro kuyu plakaları, Mikro pipetler</td><td>Grenier Bio-one</td><td>110256602</td><td></td></tr><tr><td>CDK4D1 ve CDK2CA (iyi saflaştırılmış rekombinant insan kinaz kompleksi)</td> <td>BPS Bio Sciences</td><td>40094 (CDK4 / Cyclin D), 41101 (CDK2 / Cyclin A)</td><td></td></tr> <tr><td colspan = > tahlil tamponu (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl,% 0.01 Nonidet P-40, 1&nbsp; mM ditiotretiol (DTT))</td></tr><tr><td>25 nM HEPES</td><td>CALBIOCHEM</td><td></td><td></td></tr> 375368 <tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>127838</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>ABD Biyolojik</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Aldrich-70</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>&# 176; C dondurucu</td><td>Revco (Ultima II)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DTX880 çok modlu dedektör 485&nbsp; nm/535&nbsp; nm uyarma/emisyon filtreleri ve floresein için uygun dikroik ayna</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Culture</td></tr><tr><td>96 kuyulu plakalar</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U2OS (osteosarkom) ve DU145 (prostat kanseri) hücre hatlarının dondurulmuş stokları</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU serumu, DMEM ortamı, tripsin, PEN/STRIP, MTT reaktifi</td><td>Fisher, Yaşam teknolojisi, Alfa Aesar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>VWR-70</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>& # 176; C dondurucu</td><td>Revco (Ultima II)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuluçka makinesi</td><td>Termo elektron şirketi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>Buzdolabı 4-8 & # 176; C</td><td>Isotemp Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTX880 çok modlu dedektör 595&nbsp; nm filtresi</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aracılığıyla deĞİŞtİr protein-protein etkileşimleri İnhibitörlerinin geliştirilmesi: tasarım ve geliştirme olmayan atp rekabetçi cdk inhibitörleri uygulama

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

Daha etkili protein-protein etkileşimleri (PPİ) hedef alınarak geliştirilmiş benzersiz bir strateji DEĞİŞTİRİN olduğunu. Bu potansiyel ilaç hedefleri çoğunluğunu temsil eden bu tür bağlayıcı siteler için inhibitörlerinin belirlenmesi ve hangi gelişmiş metodoloji sağlayarak mevcut ilaç hedef alanını genişletmeyi hedeflemektedir. Bu çalışmanın temel amacı, hesaplamalı ve sentetik kimya yaklaşımlarını içeren REPLACE strateji kullanımı ve uygulama metodolojik bakış sağlamaktır. Olmayan ATP rekabetçi sikline bağlı kinazlar (CDK) anti-tümör terapötik olarak inhibitörlerinin geliştirilmesi için uygulanması ile tarif edilmektedir değiştirin. CDKler sıklıkla kanser deregüle ve dolayısıyla ilaç gelişimi için önemli bir hedef olarak kabul edilir. S fazında CDK2 / siklin A inhibisyonu E2F1 yolu boyunca p53, bağımsız bir şekilde, kanser hücrelerinin seçici apoptosisi teşvik ettiği rapor edilmiştir. Siklin-bağlanma protein-protein etkileşimi hedefleyeng yiv (CBG) transkripsiyonel CDK&#39;lar fazla hücre döngüsünün spesifik önlenmesini sağlayacak bir yaklaşımdır. CBG CDK alt tabakalar ve tümör baskılayıcı proteinlerin türetilen bir uyuşum sekansı tarafından tanınan motifi (MBP) bağlanma siklin olarak adlandırılan. MBP önce ayrıca yeterli aktiviteyi (RRLIF) koruyarak bir pentapeptid kesiliyor sonra p21Waf (HAKRRIF) ve bir oktapeptidin için optimize edilmiştir. Geçirgen hücre değil, genel olarak peptitler, metabolik kararsız ve dolayısıyla strateji DEĞİŞTİR (Hesaplamalı Zenginleştirme aracılığıyla Kısmi Ligand Alternatifleri ile yedek) Daha fazla ilaç gibi inhibitörleri üretmek amacıyla uygulanmaktadır vardır. Strateji seçici hücre döngüsü CDK / siklin kompleksleri inhibe Fragment bağlandı inhibitör peptidler (çevirme) tasarımıyla başlar. Döndürür, tekrarlı N-ucuna (Ncaps) başlanarak küçük moleküller (başlık oluşturma grupları ile) gibi fragmanı ile HAKRRLIF / RRLIF kalıntılarını değiştirerek oluşturulan ilgili değiştirilmesi yoluyla elde edildiC-terminali. Bu bileşikler, anti-tümör terapötik olmayan ATP rekabetçi CDK inhibitörleri üretimi için başlangıç ​​noktası vardır.

Siklin yivli HAKRRLIF etkileşimleri, Şekil 2 de gösterilmiştir. Temel bağlama determinantları olarak temsil peptit tortuları başka kalıntılar küçük katkılar 12,13,18 sağlayan Ala2, ARG4, Leu6 ve Phe8 bulunmaktadır. Bu vaka çalışmasında DEĞİŞTİRİN strateji öncelikle Ala2 ve ARG4 etkileşimlerini taklit HAKRRLIF N-terminal tetrapeptidde kalıntılar için fragman alternatifler bulmak amacıyla kullanılmıştır. Potansiyel UKEP parçalarının (Tablo 1) ihtiva eden bir kütüphane ölçütleri...

Protein-protein etkileşimlerini hedeflemek için REPLACE stratejisinin uygulanmasını açıklıyoruz. REPLACE , optimize edilmiş peptidik inhibitörlerin ilaç benzeri moleküllere dönüştürülmesi için sentetik ve hesaplamalı yaklaşımları içeren yinelemeli bir stratejidir.

Aracılığıyla DEĞİŞTİR Protein-protein etkileşimleri İnhibitörlerinin Geliştirilmesi: Tasarım ve Geliştirme Olmayan ATP Rekabetçi CDK inhibitörleri Uygulama

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

Stratejinin genel amacı, bir protein protein etkileşiminin bir peptit inhibitörünün dönüştürülmesi yoluyla etkili bir küçük moleküllü ilaç benzeri terapötik oluşturmaktır. Bu, ikinci bir adım olarak hangi parçaların etkili bir şekilde değiştirilebileceğini anlamak için istenen peptit protein etkileşimi için bir yapı aktivite ilişkisi kurarak elde edilir. Hesaplamalı kimya, bilinen peptit belirleyicileri için uygun fragman alternatiflerini tanımlamak için kullanılır ve bu daha sonra bir fragman peptit melezleri kütüphanesini sentezlemek için kullanılabilir.Daha sonra, daha ilaç benzeri olan ve doğal peptitin aktivitesini özetleyen molekülleri tanımlamak için in vitro bir tahlilde test edilebilecek moleküller üretmek için bu fragmanlar ve kesilmiş peptit arasında bir melez kütüphanesi sentezlenir. Sonuçlar, metodoloji kullanılarak daha fazla ilaç benzeri bileşiğin tanımlanabileceğini ve bunların, protein protein etkileşimlerinin inhibitörlerinin ilaç keşfi için etkili başlangıç noktalarını temsil ettiğini göstermektedir. Bu nedenle, bu tekniğin yüksek verimli tarama gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, protein protein traksiyonunun ilaç keşfi açısından son derece zor olması ve geleneksel yöntemlerin iyi çalışmamasıdır.Değiştirme stratejisi, aşamalı yinelemeli yaklaşımı içerir ve bu nedenle daha uzun sürebilir veya uzun vadede etkili olma olasılığı daha yüksektir. Bugün, bazı reaksiyonları ve prosedürleri ayarlayacak olan ortağım Dr.Sandra Craig'in yardımıyla prosedürlerin çoğunu kendim göstereceğim. Bu prosedüre, yerleştirme protokolünün doğrulanması ile başlayın, ardından ligandları Cyclin bir oluğuna yerleştirmek için metin protokolünde açıklandığı gibi reseptör bağlanma bölgesinin ve ligandların hazırlanmasıyla başlayın.İlk olarak, yazılıma ayarlanan reseptör ligand etkileşim protokolünden ligand uyum rutinini seçin, reseptörü ve hazırlanan ligandları bu protokol için girdi olarak kullanın. Bu çalıştırmalar için enerji şebekesi olarak PLP one'ı seçin. Yerleştirme programı tarafından kullanılan enerji ızgarası, ligand reseptör etkileşimleri ve potansiyel pozlar oluşturmak için kuvvet alanıdır.Birinci Plp, özellikle hidrojen bağı etkileşimlerine öncelik veren barış açısından doğrusal potansiyeldir. Pozların enerjinin en aza indirileceğini ve oluşturulan poz sayısını 10 olarak belirtin. Diğer tüm parametreleri ilk örnekte varsayılan değerlerde bırakın.Görselleştirici programında pozları görüntüleyin ve ardından PLP bir puanının azalan değerlerine göre sıralayın. Aday bir ligand pozuna, geometriye ve hedef reseptör yapısı ile kovalent olmayan etkileşime dayalı olarak kenetlenmiş bir ligandın bağlanma afinitesini tahmin etmek için plp gibi puanlama fonksiyonlarını kullanın. Bilinen sınırlama grubuyla süper imkansızlık için puanlanan pozların ilk %25'ini görsel olarak analiz edin.Ayrıca pozun, bağlanma için kritik olduğu bilinen moleküller arası temaslar gerektiren atom kısıtlamalarını içerecek şekilde ayarlanmış ve veya potansiyel kapatma grubunu amid bağı oluşumu için doğru geometride konumlandırması gereken etkileşim filtrelerini yerine getirip getirmediğini gözlemleyin. Son olarak, bilinen yapı aktivitesi ile tutarlı bir şekilde bağlama cebinin verimli bir şekilde doldurulması olarak tanımlanan görsel tamamlayıcılık için pozları inceleyin. Uç kapak gruplarının sentezi için ilişkiler, tüm ticari başlangıç malzemelerini, çözücüleri ve reaktifleri kullanır ve geleneksel sentetik organik kimya ile sentezler.Reaksiyonları izlemek için önce başlangıç malzemesini ve reaksiyon karışımını mobil fazda çözerek silika jel üzerinde ince tabaka kromatografisi veya TLC gerçekleştirin. Daha sonra çözünmüş başlangıç malzemesini ve reaksiyon karışımını kılcal borular kullanarak TLC plakası üzerinde tespit edin. TLC plakasını mobil fazı içeren hazneye yerleştirin.Mobil faz TLC plakasının %90'ına ulaştığında, plakayı çıkarın ve havayla kurutun. Başlangıç malzemesini ve reaksiyon karışımlarını görünür noktalar olarak algılamak için UV ışığı kullanın. Ardından, nokta ve mobil faz tarafından kat edilen mesafenin oranı olan her noktanın RF'sini hesaplayın.Daha sonra, reaksiyon karışımını ayırıcı bir huniye yerleştirin ve uygun şekilde sulu asit veya baz çözeltisi ile yıkayın. Organik çözücüyü toplayın ve kurutmadan önce döner bir buharlaştırıcıda buharlaştırın. Elde edilen ham ürün, 500 miligram ham ürünü vakum altında üç ila beş mililitre uygun çözücü içinde çözer ve hava altında kurutmadan önce bir silikaya veya RP 18 numunesine eklenir, ham ürünü içeren bir numuneyi silika, ters faz geçmeli kartuşlara yerleştirir.Otomatik yüksek performanslı flaş kromatografisi kullanarak ham malzemeyi saflaştırın. Degradeli 100 gramlık bir ek sütun kullanmak. 15 sütun biriminden fazla çalıştırın.Çözücü içinde toplanan saflaştırılmış ürünü, çözücünün tamamını kuruyana kadar buharlaştırarak döner bir buharlaştırıcı kullanarak flaş kromatografisinden kurutun. Ardından, kalan tüm çözücüleri çıkarmak için ürünü vakum altında daha da kurutun. Saflaştırılmış ürünün, uç kapaklı fragmanı, bağlanmış inhibitör peptitleri veya flips montajını sentezlemek için metin protokolünde açıklandığı gibi NMR MS ve analitik HPLC ile karakterizasyonunu gerçekleştirin.Standart katı faz sentez yöntemleri ile son ed peptik bileşikler. Beş dakika boyunca iki mililitre DIMETHYLFORMAMID veya DMF'de 4.4 eşdeğer HBTU'da C terminal amino asidinin beş eşdeğerini aktive edin. Karışımı, oda sıcaklığında bir saat boyunca altı eşdeğer di izopropil etil amin kullanarak pist reçinesi üzerine yükleyin.20 dakika boyunca üç mililitre DMF'de% 10 INE kullanarak FM koruma grubunu C terminal kalıntısından çıkarın. Sonraki amino asitleri her adımda adım adım birleştirin. Bir saat boyunca iki mililitre DMF'de altı eşdeğer DI izopropil, etil amin ve 4.4 eşdeğer HBTU kullanarak bir sonraki amino asidin beş eşdeğerini birleştirin.Oda sıcaklığında, amino asit bağlantısından sonra yıkama döngülerini ve peptit montajından sonra FM D koruma adımlarını uygulayın. Peptit montajının tamamlanmasının ardından oda sıcaklığında bir saat boyunca iki mililitre DMF'de altı eşdeğer DI izopropil, etil amin ve 4.4 eşdeğer HBTU kullanan çift N kapatma grupları. Reaksiyon karışımını, yan zincir koruma gruplarını çıkarmak için gece boyunca iki mililitre bölünme karışımı ile muamele edin ve reçineden Cleve çevirileri elde edilen ürünü çökeltmek için soğuk datil eter ile tritrat edin ve gerekirse, elde edilen katı ve kuru bir döner buharlaştırıcı filtrede konsantre edin, vakum altında veya bir liyofilizatör kullanarak dondurarak kurutun.Bu noktada, rekabetçi bağlanmanın belirlenmesi için metin protokolünde açıklandığı gibi floresan polarizasyon bağlama testine geçin. Siklon bağlama oluğuna bağlı H-A-K-R-R-L-I-F'nin model yapısı gösterilmiştir. Döngü oluğu, kırmızı ile gösterilen asidik kalıntılarla köprülenen iki hidrofobik cep, daha büyük bir birincil cep ve daha küçük bir ikincil cepten oluşur.Diğer önemli etkileşimler, peptit omurgasının hidrojen bağ temaslarını ve peptitin üç temel kalıntısının iyon eşleştirme etkileşimlerini içerir, burada üç beş D-C-P-T-R-L-I-F'nin bağlanma modu gösterilir, triptofan iki 17 ve glutamin 2 54'ün yan zincir atomları ile hidrojen bağı etkileşimleri ile gösterilir. Bu bileşiklerin her biri, triptofan iki 17 ve glutamin 2, 54'ün etkileşim filtre atomları ile hidrojen bağlarına sahip olan üç temsili ve kapak grubunun pozları gösterilmiştir. Yeşil kesikli çizgilerle gösterildiği gibi, rezene Vander duvarının ikincil hidrofobik cep ile etkileşimlerini sağlar.Bu videoyu izledikten sonra, bilinen bir peptit inhibitörünü, bir protein proteini çekişini inhibe eden ve terapötik gelişim için bir başlangıç noktası olan daha ilaç benzeri bir moleküle dönüştürerek değiştirme stratejisinin nasıl gerçekleştirileceği ve uygulanacağı konusunda daha iyi bir anlayışa sahip olacaksınız.

development-inhibitors-protein-protein-interactions-through-replace

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Protein tasarımının birkaç önemli alanını ele alabilen hesaplamalı de novo protein tasarım yöntemleri geliştirdik. Bu yöntemleri yaymak için, protein tasarımı için çevrimiçi bir araç olan Protein WISDOM'ı sunuyoruz (http://www.proteinwisdom.org). Yapısal bir şablondan başlayarak, artan stabilite için monomerik proteinlerin ve artan bağlanma afinitesi için komplekslerin tasarımı gerçekleştirilebilir.

Protein AKIL: A Tezgahı<em&gt; Siliko olarak</em&gt;<em&gt; De novo</emBiyomoleküllerin&gt; Tasarım

Kinaz inhibitörü tedavisi karşı genetik direnç ortaya çıkması etkili kanser tedavisi için önemli bir sorun teşkil etmektedir. Yeni geliştirilen ilacın karşı tanımlanması ve dirençli mutasyonların karakterizasyonu daha iyi klinik yönetim ve yeni nesil ilaç tasarımında yardımcı olur. Burada, in vitro tarama ve dirençli mutasyonların doğrulama için bizim protokol açıklar.

Kinaz İnhibitörleri Karşı Dayanıklı Mutasyonlarının Tarama ve Doğrulama için Bir Yöntem

Protein fosforilasyonu, hücrelerin hücre dışı ortamlarındaki bilgileri nasıl yorumladığının ve ona nasıl yanıt verdiğinin merkezi bir özelliğidir. Burada, ilgilenilen bir substratı (substratları) fosforile eden kinazları hızlı bir şekilde tanımlamak için memeli hücrelerinden saflaştırılmış kinazları kullanan yüksek verimli bir tarama protokolü sunuyoruz.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik

Siklin bağımlı kinaz 1 (Cdk1) hücre döngüsünün G2 aşamasında aktif ve birçok hücresel yolları düzenler. Burada, bir vitro kinaz tahlil için bir protokol ile bu önemli kinaz hücresel hedefleri oluşturmak üzere Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlaması sağlar Cdk1 mevcut.

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Bu kağıt akış sitometresi-tabanlı bir tahlil kimyasal inhibitörleri ekran kitaplıklarına inhibitörleri ve T hücre reseptör sinyal etkileyen hedefleri tanımlaması için kullanır. Yöntem tanımlamak burada da yüksek üretilen iş gösterimleri için genişletilebilir.

T-hücre reseptör üzerinden tarama kimyasal inhibitörü kütüphanelerin sinyal arabulucu tanımlaması

Etiket, zenginleştirmek ve protein kinaz CK2 hücre lysate veya doku homogenate gibi karmaşık bir biyolojik örnekten yüzeylerde belirlemek için bu iletişim kuralını hedefidir. Bu yöntem CK2 Biyoloji benzersiz özelliklerini bu amaç için kaldıraç görevi yapar.

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

Kiaz inhibitörlerinin taranması için kendi kendine biraraya getirilen insan proteinmikrodizilerinin üretimi için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur.

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

Burada, yeni ilaçların keşfinde hayati öneme sahip olan Sanglifehrin A ile Cyclophilin A/Ganoderiol-F arasındaki protein-ligand bağlanma etkileşiminin yapısal rehberli tasarımına yönelik bir protokol sunuyoruz. Ligand-reseptör kompleksinin kararlılığı moleküler dinamik simülasyonu kullanılarak değerlendirildi.

Yeni Siklofilin A Inhibitörleri ve Ganoderiol-F Türevlerinin Yapı Yönlendirmeli Tasarımı ve Geliştirilmesi: Bir Silico İçeri Yaklaşım

Bu protokol, sağlıklı, farklılaşmamış insan embriyonik kök (ES) hücreleri korumak için nasıl kullanılacağını gösterir.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürü ve Bakım

Ras-GAP ve ERK1 çift inhibisyonu yoluyla SC1 fonksiyonları. Biz LIF yokluğunda fare ES hücre kendini yenileme destekleyen SC1 fonksiyonu test edilmiş ve SC1 fare ES hücre kültürleri kendini yenileme korumak mümkün olduğunu göstermiştir.

Kendini yenileme LIF Yokluğunda Mesc Destek SC1 (Pluripotin) kullanımı

Keşfedin, hesaplamalı kimya ve sentetik yöntemlerle peptit inhibitörlerini ilaç benzeri moleküllere dönüştürme stratejisini. Protein-protein etkileşimleri için yeni terapötik geliştirme yaklaşımlarını öğrenin.

Aracılığıyla DEĞİŞTİR Protein-protein etkileşimleri İnhibitörlerinin Geliştirilmesi: Tasarım ve Geliştirme Olmayan ATP Rekabetçi CDK inhibitörleri Uygulama (Video) | JoVE Journal

Aracılığıyla DEĞİŞTİR Protein-protein etkileşimleri İnhibitörlerinin Geliştirilmesi: Tasarım ve Geliştirme Olmayan ATP Rekabetçi CDK inhibitörleri Uygulama

Daha fazla video keşfet