Name: Glikosidaz Faaliyetlerinin Belirlenmesi için indoksil-glikozitler sentezi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Öğrenin, indoksil-glikozit sentezi için yeni bir sentetik yöntemle glikosidaz enzim aktivitelerini nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, karmaşık karbonhidrat yapılarında yüksek verim sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Glycom A/S, Kopenhag, Danimarka tarafından bu çalışmaya verilen destek minnetle kabul edilmektedir.

Genel açıklamalar:
Tüm reaksiyonlar çeker ocak ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm reaktifler ve çözücüler (pa.a.; kuru çözücüler için su içeriği: MeCN <50 ppm; et2O <0.01%; CH2Cl2 <% 0.003; THF <%0,005) ticari kaynaklardan satın alınmış ve alındığı gibi kullanılmıştır. TLC, Merck silika jel 60 F254 plakaları üzerinde gerçekleştirildi. Bileşikler UV ve/veya EtOH/H2S04 (9:1) ve ardından ısıtma ile muamele edilerek tespit edildi. Kolon kromatografisi Merck/Fluka silika jel 60 (230-400 mesh) ile yapıldı. Filtrasyonlar Büchner hunisi ve aspiratör pompası kullanılarak yapıldı. Solventler, döner bir buharlaştırıcı (40 °C, ~ 200 rpm) kullanılarak uzaklaştırıldı. Ürünler yüksek vakumda (döner kanatlı pompa) kurutuldu. Kuru çözücü gerektiren reaksiyonlar argon atmosferi altında gerçekleştirilmiştir.
Aşağıda, 5-bromo-4-kloro-indoksilik asit alil ester (12) kullanan X-Gal (16) sentezi açıklanmaktadır. Bu sentetik diziye göre hazırlanan metil esterlerin yanı sıra çeşitli ikame modellerine sahip diğer bileşikler için ref.17-19'a bakınız.
1. Alıcı: 5-Bromo-4-Kloro-İndoksilik Asit Alil Ester18 Sentezi (12)
<ol>
	<li>N-Asetilasyon: N- (4-bromo-3-kloro-2-metilfenil) -asetamid sentezi (6)
	<ol>
		<li>10.0 g (45.7 mmol) 4-bromo-3-kloro-2-metilanilini 30 ml diklorometan içinde çözün. 
		Dikkat! Diklorometan zararlıdır ve çözeltiyi bir buz banyosunda soğutur.</li>
		<li>6.50 ml (68.7 mmol) asetik anhidrit damla damla ekleyin ve karışımın oda sıcaklığına ısınmasına izin verin. Karışım 8 saat veya gece boyunca karıştırılabilir. Dikkat! Asetik anhidrit aşındırıcı ve yanıcıdır.</li>
		<li>Çözücüyü çıkarın ve 9: 1 etil asetat / metanolden yeniden kristalleştirin (verim:% 97 (11.6 g, 44.2 mmol), renksiz katı). 
		Dikkat! Etil asetat tahriş edici ve yanıcıdır. Dikkat! Metanol zehirli ve yanıcıdır.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oksidasyon: N-asetil-5-bromo-6-kloro-antranilik asit sentezi (7)
	<ol>
		<li>2.30 g (8.76 mmol) 6 (adım 1.1'den elde edilen ürün) ve 2.10 g (8.52 mmol) MgSO4•7H2O karışımını 40 ml su içinde 3 boyunlu yuvarlak tabanlı bir şişede geri akışlı ve damlatıcı huni ile donatılmış.</li>
		<li>3 saatlik bir süre boyunca reaksiyon karışımına damla damla 50 ml doymuş KMnO4 çözeltisi su ekleyin. Daha sonra reflü altında 2 saat daha ısıtın, yaklaşık 135 °C yağ banyosu. Dikkat! Potasyum permanganat zararlı ve oksitleyicidir.</li>
		<li>Oda sıcaklığına soğutun ve reaksiyon sırasında oluşan pirolusiti (MnO2) süzün. 
		Dikkat! Pirolusit zararlıdır.</li>
		<li>Süzüntüye pH 1'e kadar hidroklorik asit (% 37) ekleyin, ardından ürünü süzün ve vakumda kurutun, (verim:% 70 (1.80 g, 6.15 mmol), renksiz katı). 
		Dikkat! Hidroklorik asit aşındırıcıdır.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deasetilasyon: 5-bromo-6-kloro-antranilik asit sentezi (8)
	<ol>
		<li>3.90 g (13.3 mmol) 7 (aşama 1.2'den elde edilen ürün) 70 ml 1 N sulu sodyum hidroksit çözeltisi içinde çözün ve yaklaşık 100 ° C'de (yağ banyosu) 5 saat ısıtın
		Dikkat! Sodyum hidroksit aşındırıcıdır.</li>
		<li>Oda sıcaklığına soğutun ve pH 1'e kadar hidroklorik asit (% 37) ekleyin, ardından ürünü bir Büchner hunisi ile filtreleyin ve vakumda kurutun (verim:% 88 (2.93 g, 11.7 mmol), renksiz katı).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Anhidrit oluşumu: 5-bromo-6-kloro-isatoik anhidrit sentezi (9)
	<ol>
		<li>33 ml kuru asetonitrilde 8.17 g (32.6 mmol) 8 (adım 1.3'ten elde edilen ürün) süspansiyon. 
		Dikkat! Asetonitril zararlı ve yanıcıdır.</li>
		<li>Oda sıcaklığında karıştırın ve 30 dakikalık bir süre boyunca aynı anda 18.5 ml kuru diklorometan içinde 5.3 ml ve 3.22 g (10.8 mmol) trifosgen çözeltisi ekleyin. Daha sonra 50 ° C'de (yağ banyosu) 3 saat ısıtılır. Dikkat! Piridin zararlı ve yanıcıdır. 
		Dikkat! Trifosgen toksiktir ve fosgen salabilir.</li>
		<li>Çözücünün yaklaşık% 75'ini çıkarın ve 100 ml damıtılmış su ekleyerek reaksiyonu söndürün ve ürününüzü süzün. Az miktarda soğuk diklorometan ile yıkayın.</li>
		<li>Ürünü vakumda kurutun (verim:% 88 (7,53 g, 27,2 mmol), renksiz katı).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>N-Alkilasyon: 5-bromo-6-kloro-N- [(metoksikarbonil) alil]-isatoik anhidrit sentezi (10)
	<ol>
		<li>25 g (90 mmol) 9'u (adım 1.4'ten elde edilen ürün) 250 ml susuz dimetilformamid içinde çözün. ve bir buz banyosu ile soğutun. 
		Dikkat! Dimetilformamid zararlı ve yanıcıdır</li>
		<li>Porsiyon bazında 1.15 eşdeğer sodyum hidrit (parafin içinde% 60) ekleyin. 
		Dikkat! Sodyum hidrit aşındırıcı ve yanıcıdır; su/buz ile ağır reaksiyon.</li>
		<li>0 ° C'de 30 dakika karıştırdıktan sonra, oda sıcaklığına ısınmaya izin verin ve damla damla 1.2 eşdeğer alil bromoasetat ekleyin.</li>
		<li>5 saat karıştırdıktan sonra 500 ml distile su ekleyerek reaksiyonu söndürün ve ürününüzü süzün.</li>
		<li>Su ile yıkayın (3 kez, 100 ml) ve ürünü vakumda kurutun (verim:% 93 (31.5 g, 84.1 mmol), renksiz katı).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Anhidrit Açılışı: 5-bromo-6-kloro-N-(metoksikarbonilalil)-antranilik asit alil esterin sentezi (11)
	<ol>
		<li>10 g (27 mmol) 10 (adım 1.5'ten elde edilen ürün) 100 ml alil alkolde çözün. 
		Dikkat! Alil alkol çevre için zararlı ve tehlikelidir.</li>
		<li>Porsiyon olarak 350 mg (8.70 mmol) sodyum hidrit (parafin içinde% 60) ekleyin.</li>
		<li>6,5 saat veya gece boyunca karıştırdıktan sonra çözücüyü çıkarın.</li>
		<li>Ham ürünü kolon kromatografisine tabi tutun (sütun 30 x 6 cm; 240 g silika) petrol eter/etil asetat 2:1; RF = 0.66), (verim:% 80 (8.30 g, 21.3 mmol), sarı yağ). 
		Dikkat! Petrol eteri yanıcı, tahriş edici ve çevre için tehlikelidir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dieckmann Yoğunlaşması: 5-bromo-4-kloro-indoksilik asit alil esterin sentezi (12)
	<ol>
		<li>3.0 g (7.7 mmol) 11 (adım 1.6'dan elde edilen ürün) ve 1.75 g (15.6 mmol) potasyum tert-butoksiti 100 ml kuru dietil eter içinde karıştırın. 
		Dikkat! Potasyum tert-butoksit aşındırıcı ve yanıcıdır. 
		Dikkat! Dietil eter zararlıdır ve son derece yanıcıdır.</li>
		<li>Karışımı geri akış (soğutucu) altında 40-45 °C'de 2 saat ısıtın.</li>
		<li>Çözücünün yaklaşık% 75'ini çıkarın ve seyreltilmiş hidroklorik asit (100 ml, 1 M) ekleyin. 
		Dikkat! Tamamen kurumayın, ayrışma meydana gelebilir.</li>
		<li>Ürünü süzün ve vakumda kurutun (verim:% 84 (5.14 g, 15.5 mmol), renksiz ila hafif yeşil katı).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Indoxyl-Glycoside: X-Gal17'nin Sentezi
<ol>
	<li>Faz Transfer Glikozilasyonu: (5-bromo-4-kloro-indox-3-ilik asit alil ester) 2,3,4,6-tetra-O-asetil-β-ᴅ-galaktopiranosid sentezi (14)
	<ol>
		<li>400 mg (1.21 mmol) indoksilik asit alllester 12 (aşama 1.7'den elde edilen ürün), 410 mg (1.21 mmol) tetrabütilamonyum hidrojensülfat ve 500 mg (1.21 mmol) donör 2,3,4,6-tetra-O-asetil-α-ᴅ-galaktopiranosil bromür (α-asetobromogalaktoz) 10 ml diklorometan içinde karıştırın. Dikkat! Tetrabütilamonyum hidrojensülfat zararlıdır.</li>
		<li>10 ml sulu potasyum karbonat çözeltisi (1 M) ekleyin. 
		Dikkat! Potasyum karbonat aşındırıcıdır.</li>
		<li>Donörün (TLC: petrol eteri / etil asetat) tamamen tüketilmesine kadar oda sıcaklığında karıştırın.</li>
		<li>Organik fazı (ayırma hunisi) ayırın, Na2S04 üzerinde kurutun ve çözücüyü çıkarın.</li>
		<li>Ham ürünü kolon kromatografisine tabi tutun (petrol eter/etil asetat 1:1; RF = 0.33). (verim:% 86 (690 mg, 1.04 mmol), renksiz katı).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ester Bölünmesi ve Dekarboksilasyon: (N-asetil-5-bromo-4-kloro-indol-3-il) 2,3,4,6-tetra-O-asetil-β-ᴅ-galaktopiranosid sentezi (15)
	<ol>
		<li>600 mg (0.908 mmol) 14 (aşama 2.1'den elde edilen ürün) 15 ml kuru tetrahidrofuran içinde çözün. 
		Dikkat! Tetrahidrofuran zararlı ve yanıcıdır.</li>
		<li>800 μl morfolin ve 105 mg (9.09 μmol) tetrakis (trifenilfosfin) paladyum (0) ekleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında karıştırın. 
		Dikkat! Morfolin yanıcı ve aşındırıcıdır.</li>
		<li>Çözücüyü çıkarın.</li>
		<li>400 mg (2.40 mmol) gümüş asetat, 800 mg (5.79 mmol) potasyum karbonat ve 10 ml asetik anhidrit ekleyin. 
		Dikkat! Gümüş asetat tahriş edici ve çevre için tehlikelidir.</li>
		<li>90-100 °C'de 20 dakika ısıtın.</li>
		<li>Oda sıcaklığına soğuduktan sonra diklorometan ile seyreltin.</li>
		<li>Karışımı iki kez suyla ve bir kez seyreltilmiş NaHCO3 çözeltisi (% 10) ile yıkayın. 
		Dikkat! Sodyum bikarbonat aşındırıcıdır.</li>
		<li>Organik fazı Na2S04 (filtre) üzerinde kurutun ve çözücüyü çıkarın.</li>
		<li>Ham ürünü kolon kromatografisine tabi tutun (PE/EA 1:1; RF = 0.24), (verim:% 88 (495 mg, 8.00 mmol), renksiz katı).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zemplén Deasetilasyonu: (5-bromo-4-kloro-indol-3-il)-β-ᴅ-galaktopiranosid sentezi (16)
	<ol>
		<li>396 mg (0.436 mmol) 15 (adım 2.2'den elde edilen ürün) 10 ml metanol içinde çözün.</li>
		<li>Katalitik miktarda sodyum metanolat ekleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında karıştırın. 
		Dikkat! Sodyum metanolat yanıcı ve aşındırıcıdır.</li>
		<li>Amberlite IR-120 H + (filtre) ile nötralize edin ve konsantre edin. 
		Dikkat! Amberlite IR-120 H + tahriş edicidir.</li>
		<li>Ürünü vakumda kurutun (verim:% 87 (170 mg, 0.416 mmol), renksiz katı).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Model Deneyini Gösterme: X-Gal kullanan β-galaktosidazın aktivite kanıtı
<ol>
	<li>500 μl'lik tamponda (Tris-HCl 20 mM; pH 7.4; 50 mM NaCl, 0.1 mM etilendiamintetraasetik asit; veya enziminiz için başka herhangi bir uygun tampon) 0.5 mM'lik bir X-Gal çözeltisi hazırlayın</li>.
	<li>1 μl β,1-3-galaktosidaz (EC 3.2.1.23 10.000 U/ml; veya başka bir uygun β-galaktosidaz) ekleyin ve 37 ° C'de çalkalayın (600 rps).</li>
	<li>Reaksiyonu takip edin. İndigo türü boya kısa bir süre sonra oluşur.</li>
</ol>

<ol><li>Clark, R. J. H., Cooksey, C. J., Daniels, M. A. M., Withnall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indigo%2C+Woad%2C+and+Tyrian+Purple%3A+Important+Vat+Dyes+from+Antique+to+the+Present%5BTitle%5D)+AND+%22Endeavour%22%5BJournal%5D)">Indigo, Woad, and Tyrian Purple: Important Vat Dyes from Antique to the Present.</a> Endeavour. 17, 191-199 (1993).</li>
<li>Hunger, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunger%2C+K+%22Industrial+Dyes%3A+Chemistry%2C+Properties%2C+Applications%22">Industrial Dyes: Chemistry, Properties, Applications</a>. , 1st, Weinheim. Wiley-VHC. (2003).</li>
<li>Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indigogenic+Substrates+for+Detection+and+Localization+of+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechn.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Indigogenic Substrates for Detection and Localization of Enzymes.</a> Biotechn. Histochem. 82, 73-103 (2007).</li>
<li>Barnett, R. J., Seligman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+Demonstration+of+Esterases+by+Production+of+Indigo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Histochemical Demonstration of Esterases by Production of Indigo.</a> Science. 114, 579-582 (1951).</li>
<li>Pearson, B., Andrews, M., Grose, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+Demonstration+of+Mammalian+Glucosidase+by+Means+of+3-%285-Bromoindolyl%29-%CE%B2-%E1%B4%85-glucopyranoside%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Histochemical Demonstration of Mammalian Glucosidase by Means of 3-(5-Bromoindolyl)-β-ᴅ-glucopyranoside.</a> Exp. Biol. Med. 108, 619-623 (1961).</li>
<li>Anderson, F. B., Leaback, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+for+the+Histochemical+Localization+of+some+Glycosidases%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron%22%5BJournal%5D)">Substrates for the Histochemical Localization of some Glycosidases.</a> Tetrahedron. 12, 236-239 (1961).</li>
<li>Van Dort, M. E., Lee, K. C., Hamilton, C. A., Rehemtulla, A., Ross, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosynthesis+and+Evaluation+of+5-%5B125I%5DIodoindolyl-3-yl-%CE%B2-%E1%B4%85-galactopyranoside+%28%5B125I%5DIBDG%29+as+a+%CE%B2-Galactosidase+Imaging+Radioligand%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Radiosynthesis and Evaluation of 5-[125I]Iodoindolyl-3-yl-β-ᴅ-galactopyranoside ([125I]IBDG) as a β-Galactosidase Imaging Radioligand.</a> Mol. Imaging. 7, 187-197 (2008).</li>
<li>Yoshida, K., Iino, N., Koga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntheses+of+Halogen+Substituted+%CE%B2-%E1%B4%85-Glucuronides+and+Their+Hydrolysis+by+Rabbit+Liver+%CE%B2-Glucoronidase%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Pharm.+Bull%22%5BJournal%5D)">Syntheses of Halogen Substituted β-ᴅ-Glucuronides and Their Hydrolysis by Rabbit Liver β-Glucoronidase.</a> Chem. Pharm. Bull. 32, 1759-1769 (1975).</li>
<li>Horwitz, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+for+Cytochemical+Demonstartion+of+Enzyme+Activity+I.+Some+Substituted+3-Indolyl-%CE%B2-%E1%B4%85-glycopyranosides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrates for Cytochemical Demonstartion of Enzyme Activity I. Some Substituted 3-Indolyl-β-ᴅ-glycopyranosides.</a> J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).</li>
<li>Eschenfelder, V., Brossmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Bromo-indol-3-yl+5-Acetamido-3%2C5-dideoxy-%CE%B1-%E1%B4%85-glycero-%E1%B4%85-galactononulopyranosidic+Acid%2C+a+Novel+Chromogenic+Substrate+for+the+Staining+of+Sialidase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">5-Bromo-indol-3-yl 5-Acetamido-3,5-dideoxy-α-ᴅ-glycero-ᴅ-galactononulopyranosidic Acid, a Novel Chromogenic Substrate for the Staining of Sialidase Activity.</a> Glycoconjugate J. 4, 171-178 (1987).</li>
<li>Fujii, I., Iwabuchi, Y., Teshima, T., Shiba, T., Kikuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-Neu5Ac%3A+A+Novel+Substrate+for+Chromogenic+Assay+of+Neuraminidase+Activity+in+Bacterial+Expression+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">X-Neu5Ac: A Novel Substrate for Chromogenic Assay of Neuraminidase Activity in Bacterial Expression Systems.</a> Bioorg. Med. Chem. 1, 147-149 (1993).</li>
<li>Berlin, W., Sauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+Color+Detection+of+%CE%B1-%CA%9F-Arabinofuranisodase%2C+a+%26%2334%3BNo-Background%26%2334%3B+Reporter+Gene%2C+with+5-Bromo-3-indolyl-%CE%B1-%CA%9F-arabinofuranoside%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">In situ Color Detection of α-ʟ-Arabinofuranisodase, a &#34;No-Background&#34; Reporter Gene, with 5-Bromo-3-indolyl-α-ʟ-arabinofuranoside.</a> Anal. Biochem. 243, 171-175 (1996).</li>
<li>Marmuse, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Chromogenic+Substrates+for+Feruloyl+Esterases%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">New Chromogenic Substrates for Feruloyl Esterases.</a> Org. Biomol. Chem. 6, 1208-1214 (2008).</li>
<li>Kaneko, S., Kiaoka, M., Kuno, A., Hayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntheses+of+4-Methylumbelliferyl-%CE%B2-%E1%B4%85-Xylobioside+and+5-Bromo-3-Indolyl-%CE%B2-%E1%B4%85-Xylobioside+for+Sensitive+Detection+of+Xylanase+Activity+on+Agar+Plates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Syntheses of 4-Methylumbelliferyl-β-ᴅ-Xylobioside and 5-Bromo-3-Indolyl-β-ᴅ-Xylobioside for Sensitive Detection of Xylanase Activity on Agar Plates.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 741-745 (2000).</li>
<li>Robertson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntheses+of+Glucosides.+Part+I.+The+Synthesis+of+Indican%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Syntheses of Glucosides. Part I. The Synthesis of Indican.</a> Chem. Soc. , 1937-1943 (1927).</li>
<li>Robertson, A., Waters, R. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthese+of+Glucosides.+Part+VII.+The+Synthesis+of+6-Bromoindican%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthese of Glucosides. Part VII. The Synthesis of 6-Bromoindican.</a> Chem. Soc. , 2239-2243 (1929).</li>
<li>Böttcher, S., Thiem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoxylic+Acid+Esters+as+Convenient+Intermediates+Towards+Indoxyl+Glycosides%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Indoxylic Acid Esters as Convenient Intermediates Towards Indoxyl Glycosides.</a> Eur. J. Org. Chem. , 564-574 (2014).</li>
<li>Böttcher, S., Hederos, M., Champion, E., Dékány, G., Thiem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Efficient+Routes+to+Indoxyl+Glycosides+for+Monitoring+Glycosidase+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Novel Efficient Routes to Indoxyl Glycosides for Monitoring Glycosidase Activities.</a> Org. Lett. 15, 3766-3769 (2013).</li>
<li>Böttcher, S., Thiem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+Preparation+of+Indoxyl-+and+Nitrophenyl+Glycosides+of+Lactosamine+and+Isolactosamine%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Facile Preparation of Indoxyl- and Nitrophenyl Glycosides of Lactosamine and Isolactosamine.</a> RSC Adv. 4, 10856-10861 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Özellikle glikoz tipi yapılar ve daha karmaşık sakkaritler için düşük verim ve sınırlamalar nedeniyle, indoksil glikozitlere yönelik yeni bir sentetik yaklaşım geliştirildi. İndoksilik asit esterlerinin değerli anahtar ara ürünler olduğu kanıtlandı ve modüler, ölçeklenebilir bir yolla elde edildi. Tüm adımlar yüksek verimlidir ve ucuz başlangıç malzemeleri ve kolay çalışma sayesinde çok gramlı sentezler mümkündür. Alil ester yaklaşımının avantajı, reaktif 2 pozisyonunun bloke edilmesidir. Böylece verim düşürücü yan reaks...

İndigo üretimi uzun süre boyunca ekonomik açıdan çok önemli bir süreç olmuştur. Büyük ölçekli kimyasal sentezler indigoya ucuz erişim sağlamadan önce, Hristiyanlık öncesi dönemlerden itibaren öncül maddeler doğal kaynaklardan elde edilmekteydi. Hint indigo bitkisindeki indigo öncüllerinin miktarı (0,2-0,8 %) yaklaşık 30 kat daha fazla olduğu için, Avrupa'da indigo sağlayan bitkilerin yetiştiriciliği (doğal indigo) 17üncü yüzyılda kârlılığını yitirmiştir. 19. yüzyılın sonunda indigonun kimyasal sentezi, geleneksel yetiştiriciliği ortadan kaldırmıştır1,2.
Bitkilerde doğal olarak bulunan indigo öncüleri arasında Indikan (1), Insatan A (2) ve Isatan B (3) yer alır (Şekil 1). Bunların tamamı, bir glikozil kalıntısına bağlı bir indoksil motifinden oluşur. Örneğin enzimatik hidroliz yoluyla glikozidik bağın koparılması, indoksilin (4) salınmasına yol açar. İndoksilin kendisi neredeyse renksizdir, ancak hızla oksitlenerek bir indigo boyası (5) oluşturabilir. Bu hassas reaksiyon biyokimya, histokimya, bakteriyoloji ve moleküler biyolojide enzim aktivitelerini izlemek için uyarlanmıştır. Enzimlerin izolasyonu veya saflaştırılmasına gerek kalmadan in vivo aktivite taramasının yanı sıra agar plaklarında veya çözeltide hızlı testler (örneğin mavi-beyaz tarama, mikro-kuyucuklar) mümkündür. İndoksil kısmına bağlı olan kalıntıya (örneğin esterler, glikozitler, sülfatlar) bağlı olarak, farklı enzim sınıfları (örneğin esterazlar, glikozidazlar, sülfatazlar) için uygun substratlar geliştirilmiştir3. Aşağıda, indoksil glikozitlerinin oluşumuna ve uygulamasına odaklanılacaktır.
<img alt="İndol türevlerini ve indigo boya oluşumunu gösteren indikan hidroliz süreci diyagramı." src="/files/ftp_upload/52442/52442fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1: Doğal indigo öncülleri ve hidroliz yoluyla indigo boyasının oluşumu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52442/52442fig1highres.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
İndoksil kısmının sübstitüsyon paterni, ortaya çıkan indigo boyasının rengini ve fiziksel özelliklerini belirler. En yaygın sübstitüsyon paternleri 5-bromo-4-kloro (X olarak kısaltılır; grimsi mavi), 5-bromo (mavi) ve 5-bromo-6-klorodur (macenta); çünkü bunlar en küçük boya partiküllerini oluşturur, granül oluşturmazlar ve hidroliz bölgelerinden en az difüzyona sahiptirler. Son özellik, özellikle in vivo deneyler için önemlidir3.
Esteraz aktivitesinin tespiti için indigojenik yöntemin ilk raporu, indoksil asetat ve bütirat kullanan Barrnett ve Seligman tarafından 1951 yılında yayınlanmıştır4. Yaklaşık on yıl sonra, indigojenik prensip memeli glukozidazın lokalizasyonu için uyarlanmıştır5. Sentezlerinin zor olduğu kanıtlanmış olsa da, bugüne kadar birçok indoksil glikozidi geliştirilmiştir. Sentezlerin çoğu, akseptör olarak bir N-asetillenmiş indoksil ve donör olarak ilgili glikozil halür kullanımına dayanmaktadır6-14. Glikozilasyon, sodyum hidroksit ile aseton içerisinde gerçekleştirilir. Bu koşullar altında, verimi önemli ölçüde düşüren bir dizi yan reaksiyon meydana gelir. Özellikle glukoz tipi yapılar için çok düşük glikozilasyon verimleri rapor edilmiştir (örneğin, (N-asetil-5-bromo-4-kloro-indol-3-il)-2,3,4,6-tetra-O-asetil-β-ᴅ-glukopiranozid için %156 ve daha güncel bir örnekte (N-asetil-5-bromo-4-kloro-indol-3-il)-2,3,2',3',4'-penta-O-asetil-β-ᴅ-ksilobiyozid için %2614). İndoksilik asit esterlerinin kullanıldığı yeni bir yaklaşım sayesinde, önemli sayıda indoksil glikozidi yüksek verimlerle hazırlanmıştır (örneğin, (N-asetil-5-bromo-4-kloro-indol-3-il)-2,3,4,6-tetra-O-asetil-β-ᴅ-glukopiranozid %57 verim).
Aşağıdaki protokol, indoksilik asit alil esterin (5-bromo-4-kloro) basit sentezini ve buna dayanarak bir indoksil glikozidin (X-Gal) sentezini tanımlamaktadır. Basit bir model deney, X-Gal kullanılarak β-galaktosidazın enzim reaktivitesini göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Asetik anhidrit</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>10298</td><td>Aşındırıcı, yanıcı</td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608-001-00-3</td><td>Zararlı, yanıcı</td></tr><tr><td>Alil alkol</td><td>Aldrich</td><td>453021</td><td>Zararlı, çevre için tehlikeli</td></tr><tr><td>Amberlite IR-120 H+</td><td>Fluka</td><td>06428</td><td>Tahriş Edici</td></tr><tr><td>Bromoasetik asit</td><td>Merck</td><td>802260</td><td>Aşındırıcı, toksik, tehlikeli çevre için</td></tr><tr><td>4-Bromo-3-kloro-2-metilanilin</td><td>ABCR</td><td>AB 171687</td><td>Tahriş Edici</td></tr><tr><td>Diklorometan</td><td>ACROS</td><td>326850010</td><td>Zararlı</td></tr><tr><td>Dietil eter</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>10274</td><td>Zararlı, son derece yanıcı</td></tr><tr><td>Dimetilformamid</td><td>ACROS</td><td>348430010</td><td>Zararlı, yanıcı</td></tr><tr><td>Dimetilsülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>Etil asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>607-022-00-5</td><td>Tahriş edici, yanıcı</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit</td><td>AppliChem</td><td>A1103.0500</td><td>Tahriş edici</td></tr><tr><td>&beta; 1,3-Galaktosidaz, rekombinant, E. coli</td><td>Calbiochem</td><td>345795</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>VWR</td><td>20252.290</td><td>Aşındırıcı</td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat hidrat</td><td>Merck</td><td>105885</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>ACROS</td><td>326950010</td><td>Toksik, yanıcı</td></tr><tr><td>Morpholine</td><td>Janssen Chimica</td><td>15.868.57</td><td>Aşındırıcı, yanıcı</td></tr><tr><td>Peroleum eter</td><td>Azelis</td><td>111053</td><td>Yanıcı, tahriş edici, çevre için tehlikeli</td></tr><tr><td>Potasyum karbonat</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12005</td><td>Korozif</td></tr><tr><td>Potasyum permanganat</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12056</td><td>Zararlı, oksitleyici</td></tr><tr><td>Potasyum tert-butoksit</td><td>Merck</td><td>804918</td><td>Aşındırıcı, yanıcı</td></tr><tr><td>Piridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>613-002-00-7</td><td>Zararlı, yanıcı</td></tr><tr><td>Gümüş asetat</td><td>Fluka</td><td>85140</td><td>Tahriş edici, çevre için tehlikeli</td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12144</td><td>Korozif</td></tr><tr><td>Sodyum hidrit</td><td>Merck</td><td>814552</td><td>Aşındırıcı, yanıcı</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Riedel-de H&auml; en</td><td>S181200</td><td>Korozif</td></tr><tr><td>Sodyum metanolat</td><td>Merck</td><td>806538</td><td>Aşındırıcı, yanıcı</td></tr><tr><td>Sodyum sülfat</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12175</td><td></td></tr><tr><td>Tetrabütilamonyum hidrojensülfat</td><td>Lancaster</td><td>5438</td><td>Zararlı</td></tr><tr><td>Tetrahidrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87371</td><td>Zararlı, yanıcı</td></tr><tr><td>Tetrakis (trifenilfosfin)paladyum(0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216666</td><td></td></tr><tr><td>Trifosgen</td><td>Fluka</td><td>15217</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Tris (hidroksimetil)aminometan hidroklorür</td><td>Sigma</td><td>T-3253</td><td>Tahriş edici</td></tr></tbody></table>

glikosidaz faaliyetlerinin belirlenmesi için indoksil-glikozitler sentezi

Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities

Indoxyl glikozitlerin, glikozidaz aktivitelerini izlemek için değerli ve çok yönlü araçlar olduğu kanıtlanmıştır. İndoksiller, enzimatik hidroliz ile salınır ve örneğin atmosferik oksijen ile indigo tipi boyalara hızla oksitlenir. Bu reaksiyon, enzimlerin izolasyonu veya saflaştırılması olmadan in vivo olarak hızlı ve kolay taramanın yanı sıra agar plakaları veya çözelti içinde (örneğin mavi-beyaz tarama, mikro kuyular) hızlı testler yapılmasını sağlar ve biyokimya, histokimya, bakteriyoloji ve moleküler biyolojide kullanılır. Ne yazık ki, bu tür substratların sentezi, çeşitli yan reaksiyonlar ve indoksil hidroksil fonksiyonunun düşük reaktivitesi nedeniyle zor olduğu kanıtlanmıştır. Özellikle glikoz tipi yapılar için düşük verim gözlenmiştir. Yeni yaklaşımımız, anahtar ara ürünler olarak indoksilik asit esteri kullanır. Ölçeklenebilir yollar üzerinde çeşitli ikame modellerine sahip indoksilik asit esterleri hazırlandı. Bu alıcılar ve perasetillenmiş glikosil halojenürler ile faz transfer glikozilasyonları, yüksek verimlerde yaygın koşullar altında gerçekleştirilebilir. Ester bölünmesi ve müteakip yumuşak gümüş aracılı glikozilasyon, yüksek verimlerde perasetillenmiş indoksil glikozitleri verir. Son olarak, Zemplén'e göre korumanın kaldırılması gerçekleştirilir.

Indicane ve 5-bromo-indicane'in ilk sentezleri, Robertson tarafından daha 1927 ve 1929 yıllarında yayınlanmıştı15,16. Akseptör olarak indoksilik asit metil esterinin kullanılmasıyla, reaktif 2-konumu bloke edilmiş ve böylece yan reaksiyonlar kısmen bastırılmıştır. Koruyucu grubun uzaklaştırılması ve dekarboksilasyonu (160 °C, asetik anhidrit, 1 sa) ve ardından asetonda/sodyum hidroksit ile glikozilasyon ve son olarak deasetilasyon sonucunda Indicane ve 5-bromo-indicane elde edilmiştir. Bu konsepte dayanarak, a...

Indoxyl glikozitler, enzim taraması ve enzim aktivitesinin izlenmesi için iyi bilinen ve yaygın olarak kullanılan araçlardır. Özellikle glikoz tipi yapılar için, önceki sentezlerin zorlu ve düşük verimli olduğu kanıtlanmıştır. Yeni yaklaşımımız, iyi verimlerde önemli sayıda indooksil glikozit elde etmek için değerli ara ürünler olarak indooksilik asit esterlerini kullanır.

Glikosidaz Faaliyetlerinin Belirlenmesi için indoksil-glikozitler sentezi

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

Bu prosedürün genel amacı, karmaşık karbonhidrat yapıdakiler de dahil olmak üzere Endo Glikozitler için iyi verimlilikle sonuçlanan yeni bir sentetik yaklaşım sunmaktır. Bu süreç, öncelikle metil len'den başlayarak bir inic asit allo Ester akseptörünün sentezlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, bu akseptörün asetillenmiş bir glikozil hali donörü ile glikozillenmesini içerir.Ardından, allel esteri bir paladyum katalizörü ile kesilir ve asetillenmiş inox glikozidi oluşturmak için ardından gümüş aracılı dekarboksilasyon uygulanır. Son adım, korunmasız inox glikozidini elde etmek için zeplan deasetilasyonudur. Nihayetinde, hazırlanan kromojenik substrat, kalitatif bir enzim aktivite testi için kullanılır.Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, karmaşık ve labil karbonhidrat yapılarına sahip glikozidlerin kolayca üretilebilmesidir. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, Inca employ inic acid methyl eta'nın ilk sentezini geliştiren Alexander Robertson'ın 1927 tarihli bir yayınını okuduğumuzda edindik. Sonraki yöntemlerde, daha kolay erişilebilir olduğu için occi inox hücre akseptörleri kullanılmış ancak düşük verim ve saflaştırma sorunları yaşanmıştır. Senteze başlamak için, metin protokolünde açıklanan halogenle sübstitüe edilmiş bir lene kullanın.Ardından, üç boyunlu yuvarlak tabanlı bir balon içerisinde, elde edilen 2,3 gram halojenli metil ol asetamidi 40 mililitre su ve 2,1 gram magnezyum sülfat heptahidrat ile üç saat boyunca reflü edin. 50 mililitre doygun potasyum permanganat sulu çözeltisini damla damla ekleyin ve ardından karışımı bir yağ banyosunda yaklaşık 135 °C'de iki saat daha reflü edin. Karışımı oda sıcaklığına soğutun ve ardından pirosit yan ürününü uzaklaştırmak için filtreleyin, çözelti pH'ını %37'lik hidroklorik asit ile bire ayarlayın.Ardından, ürünü çözücüden süzün ve vakum altında kurutun. Kurutma işleminden sonra, ürünü metin protokolünde açıklandığı şekilde izole edin ve ardından elde edilen ürünün 8,17 gramını 33 mL kuru asetonitril içinde 30 dakika boyunca süspande edin; aynı anda çözeltiye damla damla 5,3 mL piridin ve 18,5 mL kuru diklorometan içinde çözülmüş 3,22 gram tristine ekleyin. Daha sonra reaksiyonu bir yağ banyosunda 50 °C'ye ısıtın.Üç saat sonra, çözücünün yaklaşık %75'ini uzaklaştırın ve reaksiyonu durdurmak için 100 mililitre distile su ekleyin. Ürünü filtreleyin ve ardından filtreyi beş ila 10 mililitre soğuk klorometan ile yıkayın. Yıkama işleminden sonra ürünü vakum altında kurutun, bu ara ürünü alkilleştirin ve ardından metin protokolünde açıklandığı gibi ortaya çıkan anhidriti açın.Elde edilen ürün kolon kromatografisi ile izole edin. Üç gram ürünü, 100 mililitre kuru dietil eter reflü karışımı içinde 1,75 gram potasyum oksit ile 40 ila 45 derece Celsius'ta iki saat boyunca karıştırarak Dickman kondansasyonuna başlayın. Ardından, solventin yaklaşık %75'ini vakum altında uzaklaştırın ve ürünü 100 mililitre bir molar hidroklorik asit ile çöktürün.Ürünü filtreleyin ve ardından vakum altında kurutun. XG sentezine başlamak için 400 mg indoc clic acid allyl ester'i, 410 mg TBAs ve 500 mg alpha xto bromo galactose ile 10 mL klorometan içerisinde karıştırın. Ardından reaksiyona 10 mL 1 molar sulu potasyum karbonat ekleyin.Reaksiyonu oda sıcaklığında yaklaşık üç saat boyunca karıştırın ve alfa aseto bromo galaktoz tüketimini, petrol eteri ve etil asetatın bire bir çözeltisi kullanılarak ince tabaka kromatografisi ile izleyin. Alfa aseto bromo galaktoz tamamen tüketildikten sonra, çözeltinin organik fazını ayırma hunisi ile izole edin. Ardından, kalan suyu uzaklaştırmak için organik fazı sodyum sülfat üzerinde kurutun ve ardından ürünü saflaştırmak için metin protokolünde açıklanan şekilde kolon kromatografisi uygulayın. Allo esteri koparmak için 600 miligram galakto purik asidi 15 mililitre kuru tetra hidro furan içerisinde çözün.Çözücüyü vakumla uzaklaştırın; ürüne 400 mg gümüş asetat, 800 mg potasyum karbonat ve 10 mL asetik anhidrit ekleyin ve ardından reaksiyonu yaklaşık 95 °C'de 20 dakika boyunca ısıtın. Reaksiyonun oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve ardından reaksiyonu 50 mL diklorometan ile seyreltin. Bu reaksiyonu işlemek için karışımı iki kez suyla ve bir kez %10 sodyum bikarbonat çözeltisiyle yıkayın.Organik fazı sodyum sülfat üzerinde kurutun ve ardından çözeltiyi konsantre edin. Elde edilen asetillenmiş galaktopürik yan zinciri saflaştırmak için kolon kromatografisi kullanın. Daha sonra, saflaştırılmış materyalin 396 miligramını 10 mililitre metanolde çözün.Spatula ucu kadar sodyum metilat ekleyin ve ardından reaksiyonu gece boyunca karıştırın. Reaksiyonu nötralize etmek için katyon değişim reçinesi kullanın ve ardından çözeltiyi vakumda konsantre edin. Son olarak, sentetik yolun geçerliliğini test etmek amacıyla xal elde etmek için ürünü vakum altında kurutun.İlk olarak, xal'i birkaç mikrolitre dimetil sülf oksit içinde çözün. Ardından, uygun bir tampon çözelti içinde 0,5 milimolar xal stok çözeltisi hazırlayın. Sonrasında, bir mikrolitre beta galacto ekleyin ve karışımı saniyede 600 devir hızında çalkalayın.37 °C'de, canlı bir indigo boyasının oluşumu için reaksiyonu görsel olarak izleyin. Çözeltide mavi boya oluşumu, doxyl'deki enzim aktivitesini açıkça göstermektedir. Glikozitler, glikozat enzim aktivitesinin izlenmesi için önemlidir, ancak sentezlenmeleri zordur.Burada sunulan sentetik yaklaşım, nihai endo galakto purik yan ürünü %66 toplam verimle sağlamaktadır. Bu, yalnızca %28 verimle sonuçlanan önceki metodolojiye göre önemli bir iyileştirmedir. Elde edilen doksil glikozitleri, saf veya saf olmayan enzim çözeltilerinin aktivitesini test etmek için kullanılabilir.Bu örnekte, indigo rengi yalnızca beta galakto içeren kuyucuklarda gözlemlenmiş ve 0.1 millimolar XG kadar düşük bir miktar ile üretilmiştir. İndoc hücre akseptörü oluşturulduktan sonra, indoc hücre glikozidlerini elde etmeye yönelik bu sentetik yol, doğru şekilde uygulandığında iki gün içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, inial glikozidlerin sentezi ve kullanımı hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu sentetik yol, karmaşık yapılarına rağmen bu bileşikleri yüksek verimle üretir.

synthesis-indoxyl-glycosides-for-detection-glycosidase

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

SDS-PAGE ile takip glikoproteinler şekerler kaldırmak için belirli glycosidases kullanarak protein örnekleri üzerinde glukanıdır değişiklikler tespit etmek için değerli bir yöntemdir ve ilk Glikobiyoloji çalışmaları için iyi bir seçimdir. Deglycosylation aşağıdaki değişiklikler, jel hareketlilik vardiya olarak veya glukanıdır duyarlı reaktifler boyama ile tespit edilebilir.

Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

Bu videoda, glikojen sentaz aktivitesinin tahmini için bir spektrofotometrik test açıklanmaktadır. Yöntem, zamanla NADH absorbansındaki azalmaya dayanır ve glikojen sentaz aktivitesini gösterir.

Glikojen sentaz aktivitesini belirlemek için spektrofotometrik test

Küçük ölçekte mikrobiyal ekzopolisakkaritlerin tanımlanması ve karakterizasyonu için otomatikleştirilmiş modüler yüksek verimli bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, yeni izole edilen bakteri suşlarının veya tüm suş koleksiyonlarının hızlı bir şekilde taranmasını sağlamak için salgılanan polisakkaritlerin toplam miktarını ayrıntılı bir karbonhidrat parmak izi ile analiz etmek için hızlı bir ön seçimi birleştirir.

Otomatik Modüler Yüksek Verimli Ekzopolisakkarit Tarama Platformu Oldukça hassas Karbonhidrat Parmak İzi Analizi ile birleştiğinde

Enzim taraması için yüksek verimli bir test tanımlanmıştır. Bu çoğullanmış kullanıma hazır tahlil kiti, önceden seçilmiş Chrömer, Polymer, Hydrogel (CPH) substratları ve kompleks I, çözünmez Chromojenik Biyokütle (ICB) substratlarından oluşur. Hedef enzimler polisakkarit parçalayıcı endo-enzimler ve proteazlardır.

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

İmmünoglobulin G (IgG) N-glikan hidrofilik etkileşim kromatografiu UPLC ile karakterizedir. Buna ek olarak, IgG N-glikan yapısı açıkça ayrılır. Burada sunulan yaygın araştırma ortamlarında kullanılabilir, böylece bu deneysel yönteme bir giriştir.

Ultra-Performans Sıvı Kromatografi ile İmmünoglobulin G N-Glikan Analizi

Urasil-DNA glikozilaz aktivitesini test etmek için etiketlenmemiş, radyo-izotopik olmayan bir yöntem, doğrudan apurinik / apirimidinik alan içeren ürün analizi için MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak geliştirilmiştir. Tahlil, DNA glikozilaz ölçümü için oldukça basit, spesifik, hızlı ve kullanımı kolay olduğunu kanıtladı.

Matris Yardımlı Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon ile Urasil-DNA Glikozilaz Testi Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Analizi

Bergmeyer glikoz miktar tayini, esas olarak glikoz miktarını doğru ve hassas bir şekilde ölçen klinik testler için kullanılan spektrofotometrik bir enzimatik tekniktir. Burada, mikrobiyolojik numuneler için bu yöntemin kullanılması için bir protokol sunuyoruz.

Mikrobiyolojik Numuneler için Bergmeyer Glikoz Miktar Tayini

Bu çalışma, C-glikozitleri parçalayabilen bağırsak bakterilerini verimli bir şekilde taramak ve izole etmek için bir dizi standart işletim prosedürü (SOP) oluşturur.

C-Glikozit-Parçalayan Bağırsak Bakterilerinin Taranması ve İzolasyonu

Son çalışmalar, insan bağırsak mikrobiyota enzimlerinin C-glikozitleri metabolize etmedeki rolünü vurgulamaktadır. Burada, bu C-glikozit metabolize edici enzimlerin yapısal ve enzimatik reaksiyon zincirlerini sistematik olarak karakterize etmek için analitik kimya tekniklerini (LC-MS/MS ve NMR) yapısal biyoloji yaklaşımlarıyla entegre eden kapsamlı bir metodoloji sunuyoruz.

İnsan Bağırsak Mikrobiyotasında C-Glikozit Metabolik Enzimlerinin Karakterizasyonu için Yapısal Biyoloji ve Analitik Kimya Yaklaşımları

Bu protokol, Sandell-Kolthoff reaksiyonunu kullanarak insan karaciğer mikrozomlarındaki kimyasalların Deiodinaz 1 (DIO1) aktivitesi üzerindeki etkisini güvenilir şekilde değerlendirmek için kolorimetrik bir yöntemi tanımlar. Önceden tanımlanmış kabul kriterleri ve istatistiksel performans metriklerini içerir ve OECD test rehberlerine dahil edilmesi için devam eden çabaları destekler.

Sandell-Kolthoff Reaksiyonu Kullanılarak İnsan Karaciğer Mikrozomlarında Deiodinaz 1 Aktivitesinin Kolorimetrik Değerlendirmesi

Öğrenin, indoksil-glikozit sentezi için yeni bir sentetik yöntemle glikosidaz enzim aktivitelerini nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, karmaşık karbonhidrat yapılarında yüksek verim sağlar.

Glikosidaz Faaliyetlerinin Belirlenmesi için indoksil-glikozitler sentezi

Daha fazla video keşfet