Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme Caenorhabditis elegans

Bu prosedürün genel amacı, nematod C No Haitis elfan kullanarak germ hattı kimyasal toksisitesini kapsamlı bir şekilde değerlendirmektir. Bu, ilk olarak, C Elgan PXOL bir GFP suşunun karışık aşamalı bir solucan popülasyonuna seyreltilmiş bir ağartıcı çözeltisi eklenerek solucanların senkronize edilmesiyle gerçekleştirilir. Bu adım, yumurta kabuğu tarafından ağartıcıdan korunan çok sayıda embriyo oluşturur.

İkinci adım, embriyoların yiyecek olmadan sıvı içinde yumurtadan çıkmasına izin vererek senkronize bir L bir larva popülasyonu oluşturmaktır. Daha sonra, solucanlar dördüncü larva aşamasına veya L dörde kadar büyürler ve bu noktada 65 saat boyunca sıvıdaki ilgili kimyasallara maruz kalırlar. Son adım, solucanların uterusu içindeki embriyolarda GFP raportörlerinin ekspresyonunun floresan mikroskobu ile görselleştirilmesidir.

Sonuç olarak, DMSO kontrolüne kıyasla GFP pozitif embriyoların oranı, test edilen bileşiklerin antijenisitesini yansıtır. Bu tekniğin, Rodin modelleri veya hücre kültürü tahlilleri gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bütün bir hayvan modelindeki kimyasalların genisitesini ve germ hattı toksisitesini değerlendirebilmemiz ve aynı zamanda prosedürü gerçekleştiren yüksek verimli bir tahlil gerçekleştirebilmemizdir. Bugün doktora sonrası araştırmacı Dr.Daniella Perotti olacak.

Bu prosedür için grafik solucanlar daha önce ekteki protokol metninde açıklandığı gibi hazırlanmıştı, GR solucanlarını nematod büyüme ortamından veya NGM plakalarından bir ila iki mililitre M dokuz ile yıkayarak ve 15 mililitrelik bir konik tüpe aktararak toplayın. GR solucan tortusunu 15 mililitrelik konik borunun dibine yaklaşık beş ila 10 dakika bekletin. Sonraki, solucan peletini rahatsız etmeden süpernatanı çıkarın.

Solucan peletini iki ila dört mikro santrifüj tüpüne aktarın ve her tüpe bir mililitre seyreltilmiş ağartıcı solüsyonu ekleyin. Oda sıcaklığında iki ila üç dakika inkübe edin. Tüm solucanların öldüğünü doğrulamak için stereo mikroskop altında reaksiyonun ilerlemesini izleyin.

Embriyolar ölebileceğinden beş dakikadan daha uzun süre ağartmayın. Solucanları bir dakika boyunca santrifüj ile toplayın. 3000 RPM'de.

Supernat'ı çıkarın ve reaksiyonu nötralize etmek için bir mililitre steril M dokuz ekleyin. Çamaşır suyu işleminden sonra solucanlarla temas eden tüm malzemelerin steril olduğundan emin olun. Solucanları M nine ortamı ile iki kez yıkayın.

Süpernatanı çıkarın ve M dokuz ila 100 ila 200 mikrolitre ekleyin. Bir cam mera pipeti kullanarak, NGM plakalarını temizlemek için bir damla solucan M dokuz karışımı ekleyin ve embriyoların yiyeceksiz yumurtadan çıkmasını sağlamak için 20 santigrat derecede en az 24 saat inkübe edin. Larva büyümesi L'de durdurulacaktır bir aşama İki senkronizasyon adımı.

Ağartma ve L kelimesi açlığı kullanılmaktadır, çünkü maruziyet için kullanılacak L dört larva sayısını en üst düzeye çıkarmak için oldukça senkronize bir sıcak popülasyon elde etmek çok önemlidir. Senkronize bir L one larva popülasyonunun kurulmasından bir gün sonra, L one larvalarını berrak NGM plakalarından toplayın. Plakaları bir ila iki mililitre M dokuz ile yıkayın ve L bir larvayı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Ölü yetişkin solucanların yaklaşık beş dakika boyunca 15 mililitrelik konik tüpün dibine çökelmesine izin verin. L one solucanlarının bulunduğu süpernatanı 15 mililitrelik yeni bir konik tüpte toplayın. Solucanları 2.600 RPM'de iki dakika santrifüjle çökeltin.

Süpernatanı yaklaşık 500 mikrolitre bırakarak çıkarın. 10 mikrolitrelik damlalardaki solucan sayısını sayarak M dokuz çözeltisindeki solucan konsantrasyonunu belirleyin. Stereo mikroskop kullanarak en az beş damla sayın.

Solucanların konsantrasyonunu M dokuzda mikrolitre başına 20 ila 25 solucana ayarlayın ve ardından NGM plakalarına 50 mikrolitre solucan M dokuz karışımı ekleyin. OP 50 ile oturan, beslenen bakteriler, L bir senkronize popülasyonun L dört aşamasına ulaşana kadar büyümesine izin vermek için 15 santigrat derecede 65 saat kuluçkaya yatırılır. Bu ekran, germ hattı bozulmasını ve embriyonik anöploidi indüksiyonunu tespit etmek için bir floresan transkripsiyonel raportör içeren bir suşa karşı bir CL kullanır.

Plakaları bir ila iki mililitre M dokuz ile yıkayarak ve bunları 15 mililitrelik konik bir tüpe aktararak L dört larvalarını şeffaf NGM plakalarından toplayın. L dört solucan tortusunu 15 mililitrelik konik borunun dibine yaklaşık beş ila 10 dakika bırakın. Ardından solucan peletini rahatsız etmeden süpernatanı çıkarın.

Üç ila beş mililitre M dokuz ekleyin ve 10 mikrolitrelik damlalardaki solucan sayısını sayarak M dokuz çözeltisindeki solucan konsantrasyonunu belirleyin. Stereo mikroskop kullanarak her numune için en az beş damla sayın. Solucanları, M dokuzda mililitre başına bir solucan konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.

Önceden hazırlanmış OP 50 bakterisini M dokuz ile on kat seyreltin. Yeniden süspanse edilen bakterilerin oda sıcaklığına ulaştığından emin olun, çünkü daha düşük sıcaklıklar solucan gelişimini etkiler Çok kanallı bir pipet kullanarak, önce iki mililitre derinliğinde yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre solucan M dokuz karışımı ekleyin. Daha sonra, sonunda her bir oyuğa 400 mikrolitre seyreltilmiş OP 50 bakteri ekleyin.

Her kuyuda 500 mikrolitrede 100 solucan bulunacaktır. 100 mikromolar nihai konsantrasyon elde etmek için istenen kuyucuklara 0,5 mikrolitre test kimyasalı ekleyin. CL elgan'daki kimyasal eleklerde yaygın olarak kullanılan bir konsantrasyon, etanol veya DMSO çözücü kontrollerini pozitif kontrol olarak %0.1'lik bir nihai konsantrasyonda maruz bırakır.

100 mikromolar kosol kullanmayın. Yapışkan film kullanarak plakayı kapatın. Kuyular arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için plakayı iyice kapattığınızdan emin olun.

Plakayı alüminyum folyo ile sarın. Plakayı uygun bir süre boyunca uygun sıcaklıktaki bir çalkalayıcıya aktarın. Odanın sıcaklığını 20 santigrat derece civarında tutun, çünkü sıcaklık, çalkalayıcıdaki kimyasal maruziyetin tamamlanmasının ardından solucanların büyümesini etkiler.

Yetişkin solucanların çok kanallı bir pipet kullanarak plakanın dibine çökelmesine izin vermek için 96 kuyulu plakayı 10 ila 15 dakika dinlendirin. Plakanın altındaki solucanları rahatsız etmemeye dikkat ederek her bir kuyucuktan 350 mikrolitre M dokuzunu çıkarın. Solucanları bir mililitre M dokuz ile yıkayın ve yetişkin solucanların dibe çökmesini sağlamak için plakayı tekrar 10 ila 15 dakika dinlendirin.

Plakanın altındaki solucanları rahatsız etmemeye çok dikkat ederek her kuyucuktan bir mililitre M dokuzunu çıkarın. Resus, kalan M dokuzda solucanları askıya alın. 96 oyuklu plakadan 100 mikrolitre solucan M dokuz karışımı toplayın ve siyah duvar şeffaf Alt 384 kuyulu plakanın kuyularına yükleyin.

384 kuyulu plakanın tüm kuyucukları yüklenene kadar 4 96 oyuklu plakadan solucanlar kullanarak işlemi tekrarlayın. Görüntü elde etme işlemi sırasında otofokusun verimliliğini ve hızını artırmak için tüm kuyuların aynı hacme sahip olması önemlidir. Daha sonra, her bir oyuğa bir mikrolitre lale ekleyin ve solucanların yaklaşık 30 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin.

Lale, bir asetilkolin reseptör agonisti olarak işlev görür ve solucanları hareketsiz hale getirir, plakayı otomatik görüntüleme sağlayabilen geniş alanlı, yüksek içerikli bir mikroskoba aktarır. Üreticinin yönergelerine göre yüksek içerikli bir görüntü edinme ve analiz yazılımı kullanın. Her görüntü için bir görüntü elde etmek için dört x reklam verme amacını seçin.

GFP görüntüleme parametrelerini 45 milisaniye pozlamaya ve görüntü çözünürlüğünü 2160 x 2160'a ayarlayın. Görüntü alımına başlayın, açıkta kalan solucanlar doğrudan 384 kuyulu plaka üzerinde görüntülenir. En az bir GFP pozitif embriyo içeren solucanların sayısı her kuyucuk için sayılır ve burada gösterildiği gibi o kuyudaki toplam solucan sayısı ile normalleştirilir.

Mikrotübül zehiri kodsuz AOL gibi kimyasal ajanlara maruz kalma, DMSO kontrolüne kıyasla yüksek oranda GFP eksprese eden embriyoların indüksiyonuna yol açar. GFP pozitif embriyolar, diğer embriyolarda gözlenen zayıf arka plan floresansından ve hayvanların bağırsaklarında gözlenen otofloresanstan önemli ölçüde daha parlaktır. Kırmızı ok, kodsuz AOL ile tedavi edilmiş bir solucanın rahmi içinde açıkça görülebilen GFP pozitif embriyoları gösterir.

Bu prosedürü takiben, kimyasalların germ hattı üzerindeki etkisine daha ayrıntılı bir bakış elde etmek için solucanların DNA boyaması gibi başka yöntemler de uygulanabilir. Bu teknik, toksikoloji alanındaki araştırmacıların, kimyasalların üreme toksisitesini ve germ hattı toksisitesini hızlı bir şekilde değerlendirmelerini sağlar.