Name: Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Öğrenin Caenorhabditis elegans kullanarak yüksek verimli kimyasal analizle üreme hücresi toksisitesini değerlendirme yöntemini. Bu teknik, gelişim biyolojisi ve toksikoloji araştırmalarında bütün bir hayvan modelinde genotoksisiteyi hızla taramak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu çalışmayı mümkün kıldıkları için aşağıdaki finansman kaynaklarına, NIH ES020353'a ve Colgate-Palmolive Alternatif Araştırma Hibe ödülüne teşekkür eder.

Besleme Bakterilerin 1. Hazırlık NOT: Bu kısım besleme bakteri (E. coli OP50) hazırlanmasını anlatır. <ol><li> E. tek bir koloni yalıtmak aseptik olarak lizojeni suyu (LB) agar plakadan coli soy OP50 otoklave LB suyu 300 ml içine inoküle. </li><li> Doygunluğa ulaşıncaya kadar inoküle kültür, 200 rpm&#39;de ve 37 ° C&#39;de bir çalkalayıcı içinde gece boyunca büyümeye izin verin. </li><li> 6, steril, önceden tartılmış 50 ml konik tüp içine OP50 aktarın. 6000 rpm&#39;de (5000 x g) 5 dakika boyunca santrifüj ile bakteriler Pelet. </li><li> Süpernatantı atın ve steril M9 50 ml bakteri yıkayın. Iki kez tekrarlayın. </li><li> İkinci yıkamadan sonra hiçbir M9 tüp bırakılırsa sağlamak, kalan M9 kaldırın. </li><li> Bakteriler pellet içeren tüp tartılarak pelet ağırlığı belirlemek ve 50 ml konik tüp ağırlığı çıkarılır. </li><li> Pelet i yeniden süspansen, M9, 100 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyonda ilave edilebilir. </li><li> Solucan kültürü için kullanılana kadar 4 ° C &#39;de OP50 çözeltisi saklayın. </li></ol> Nematod Büyüme Orta (NGM) Petri Tabaklar 2. Hazırlık NOT: Bu kısım plakaları C olan NGM Petri kapları hazırlanmasını tarif etmektedir elegans solucanlar rutin laboratuvarda muhafaza edilir. <ol><li> NGM agar ortamı otoklava. </li><li> Steril prosedürler kullanılarak, bir peristaltik pompa kullanılarak 6 cm Petri kapları içine NGM agar çözeltisi 17 ml dağıtmak. NOT: plakalarda agar sabit bir miktarının bir plaka geçerken mikroskop refocusing ihtiyacını azaltır. </li><li> Ağarı katılaştırmak izin ve fazla nemin buharlaşmasını sağlamak için kullanımdan önce, 2-3 gün süre ile, oda sıcaklığında plakalar bırakın. </li><li> Steril tekniği kullanarak NGM plakaları Tohum. OP50 sıvı kültürü 1-2 damla uygulayın ve bir cam çubuk kullanarak yayılır. Emin olun değilplakaların kenarlarına bakteri çim tüm yol yaymak için. </li><li> OP50 çim solucanlar büyümeye plakaları kullanılarak önce oda sıcaklığında 1-2 gün boyunca büyümeye izin verin. </li></ol> Bir Senkron Worm Nüfus 3. Hazırlık NOT: C. yaşam döngüsü elegans embriyonik aşamada, dört larva evreleri (L1-L4) ve yetişkinlik oluşur. Bu bölüm, solucanlar yaşa senkron nüfusun hazırlanmasını tarif etmektedir. Ağartma işleminin ardından C.elegans ile temas eden bütün maddeler steril olması gerekmektedir. <ol><li> Gün 1 - Hamile Worm Nüfus hazırlanması <ol><li> Solucan nüfusunun çoğunluğu starved L1 larva oluşur hangi NGM tabak kullanın. </li><li> Steril bir solucan L1 larva almak toplayın ve taze 6 cm NGM plakalar aktarabilirsiniz OP50 ile ekildi. Solucanların çoğunluğu gebe yetişkin kadar 20 ° C&#39;de yaklaşık 65 saat süre ile inkübe edilir. Içinplaka aşırı kalabalık önlemek ve her yeni NGM plaka L1 larvaların fazla bir veya iki küme aktarmak değil, solucanlar bakteri tüketmeden büyümeye izin. </li></ol></li><li> 4. Gün - Bir Senkronize L1 Larva Nüfus kurulması <ol><li> M9 1-2 ml ile yıkayarak NGM plakaları gebe solucanları toplayın ve bir konik 15 ml tüp aktarabilirsiniz. </li><li> Gebe solucanlar yaklaşık 5-10 dakika için 15 ml konik tüp altına sediment edelim. Solucan pelet bozmadan süpernatantı. </li><li> 2-4 mikrosantrifüj tüplerine solucan pelet aktarın ve ağartma maddesi / NaOH çözeltisi 1 ml. Oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin. Tüm solucanlar öldü onaylamak için stereomicroscope altında reaksiyonun ilerlemesini izleyin. Embriyolar ölebilir gibi daha uzun 5 dakika çamaşır suyu yok. </li><li> 3000 rpm&#39;de (900 x g), 1 dakika süreyle santrifüjlenerek solucanları toplayın. Süpernatantı ve steril M9 1 ml ekleyinTepkimeyi nötrleştirmek. </li><li> 3000 rpm&#39;de (900 x g), 1 dakika için santrifüjleme ile iki kere solucanlar yıkayın. </li><li> Süpernatantı ve en fazla 100-200 ul M9 ekleyin. </li><li> Bir cam Pasteur pipeti solucanın bir damla ekleyin kullanma / M9 embriyolar yumurtadan izin 20 ° C&#39;de en az 24 saat süreyle bunları NGM plakaları temizlemek ve inkübe karıştırın. NOT: Gıda olmadan larvaları büyüme L1 aşamada durdurulur. </li></ol></li><li> Gün 5 - Senkronize L4 larvaları Nüfus kurulması <ol><li> M9 1-2 ml plakaları yıkayarak açık NGM plakaları L1 larvaları toplayın ve bir konik 15 ml tüp aktarabilirsiniz. </li><li> Yaklaşık olarak 5 dakika boyunca 15 ml konik tüp alt ölü büyütülmüştür tortu olsun. </li><li> Yeni bir konik 15 ml tüp içinde L1 solucanlar süpernatant, toplamak ve 2600 rpm&#39;de (1000 x g), 2 dakika süreyle santrifüjlenerek solucanlar çökeltilmesi. </li><li> Süpernatant le kaldıryaklaşık 500 ul aving. </li><li> Bir stereomikroskop kullanılarak damla 10 ml içinde solucanlar sayısının sayılmasıyla M9 çözeltisi solucan konsantrasyonunun belirlenmesi. En az 5 damla sayın. </li><li> 20-25 solucanlar / ul solucanlar konsantrasyonu ayarlayın ve OP50 ile seribaşı NGM plakalar solucan / M9 karışımı 50 ul ekleyin. </li><li> Onlar L4 sahne ulaşana kadar L1 senkronize nüfus büyümeye izin (hafta sonuna kadar inkübasyon için) 15 ° C&#39;de 65 saat inkübe. </li></ol></li></ol> 96 oyuklu plakalar içerisinde Chemicals Worms 4. maruz NOT: Bu bölümde Pxol1 kullanımını açıklar :: C içeren GFP transkripsiyonel muhabiri C. elegans suşu anöploidinin uyarılması için taranmaktadır. <ol><li> M9 1-2 ml plakaları yıkayarak açık NGM plakaları L4 larvaları toplayın ve bir konik 15 ml tüp aktarabilirsiniz. </li><li> Altına L4 solucanlar tortu Let15 mi, yaklaşık 5-10 dakika boyunca konik boru. Solucan pelet bozmadan süpernatantı. </li><li> M9 3-5 mi ekleyin ve bir stereo mikroskop kullanarak damla 10 ml içinde solucanlar sayısının sayılmasıyla M9 çözeltisi solucan konsantrasyonunu belirler. Her bir numune için en az 5 damla sayın. </li><li> M9 1000 solucanlar / ml&#39;lik bir konsantrasyonda yeniden süspanse solucanlar. </li><li> Bölüm 1 OP50 bakteri sulandırmak M9 ile 10 kat. Alt sıcaklık solucan gelişimini etkiler, çünkü yeniden süspanse bakteriler oda sıcaklığına ulaşmasını emin olun. </li><li> İlk (aşama 4,4) sonsuz / M9 karışımı, 100 ul ve ardından 2 ml derin, yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plakanın her oyuğuna (adım 4.5 den) ile seyreltildi OP50 bakteri 400 ul, bir çok kanallı pipet kullanarak. Sonunda, her bir çukura 500 ul, 100 solucanlar olacaktır. </li><li> Önerilen son Concentr ulaşmak için, istenen kuyulara test kimyasal veya uygun denetim ya 0.5 ul ekle100 mcM tirme, bir konsantrasyon yaygın C kimyasal ekranlarında kullanılan elegans 12. % 0.1 bir son konsantrasyonda etanol ya da DMSO çözücü kontrol Açığa. NOT: Pozitif kontrol olarak nokodazolun (100 mcM) kullanılmasını tavsiye ederiz. </li><li> Yapışkan film kullanarak plaka Seal. Kuyular arasındaki çapraz bulaşmayı önlemek için plaka mühür emin olun. </li><li> Alüminyum folyo ile plaka sarın. </li><li> Zaman uygun uzunlukta (24 veya 65 saat) için uygun sıcaklıkta bir çalkalayıcı (170-180 rpm) plaka aktarın. oda sıcaklığı solucan büyümesini etkiler; yaklaşık 20 ° C sıcaklığı muhafaza. </li></ol> Bir 384-oyuklu bir plaka içerisinde Hamile Worms 5. Görüntü Alma NOT: Bu bölüm, ergin hermafrodit bireyler rahim içinde embriyo GFP tanımının görüntülenmesi için, görüntü maruz Pxol1 :: GFP solucanlar içeriği yüksek mikroskop kullanımını tarif eder. IçinHer 384 oyuklu plaka elenecek, 4 x 96-delikli plakadan solucanlar kullanır. <ol><li> Çalkalayıcı kimyasal maruz bırakıldıktan sonra, 10-15 dakika boyunca 96 gözlü plaka kalan büyütülmüştür plakasının tabanına kadar tortu izin sağlar. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, plakanın alt solucanlar rahatsız etmemek için çok dikkatli olmak, M9 350 ul kaldırın. </li><li> M9 1 ml ve tekrar adım 5.1 ile solucanlar yıkayın. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, plakanın alt solucanlar rahatsız etmemek için vey dikkat ederek, M9 1 ml çıkarın. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, geri kalan M9 solucanlar tekrar süspansiyon ve 96 oyuklu plakalar solucan / M9 karışımı 100 ul toplamak ve siyah bir duvar / şeffaf tabanlı 384-kuyucuklu plak kuyu içine yükleyin. 384-kuyulu plakanın tüm kaynaklar yüklü kadar, 4 x 96-delikli plakadan solucanlar kullanarak tekrarlayın. NOT: Bu önemlidir arttırmak için bütün bölümler aynı hacmi içingörüntü elde etme sürecinde verimlilik ve otofokus hızı. Her iyi 80 ila 100 solucanlar arasında içermelidir. </li><li> Her bir oyuğa, levamizol (100 uM), 1 ul ekle ve solucanlar yaklaşık 30 dakika boyunca inkübe edin. Not: Levamisole bir asetilkolin reseptörü agonisti olarak görev yapar ve solucan hareketsiz. </li><li> Otomatik görüntüleme sağlayabilen bir widefield içeriği yüksek mikroskop plaka aktarın. </li><li> Görüntü elde etmek için, üreticinin talimatlarına göre bir içeriği yüksek görüntü elde etme ve analiz yazılımı kullanmak. Kuyu başına 1 görüntü elde etmek 4X hedefi seçin. </li><li> Görüntü elde etme başlamadan önce, 2160 x 2,160 maruz ve görüntü çözünürlüğü 45 msn GFP görüntüleme parametrelerini ayarlamak. </li><li> Kuyudaki solucanlar toplam sayısına bölünmesiyle GFP pozitif solucanlar sayısı gibi verileri toplayın, ikinci ölçü kuyuları arasında nispeten tutarlı olmak. </li></ol>

<ol><li>Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T">http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T</a> (2009).</li>
<li>Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+abnormalities+in+the+human+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosome abnormalities in the human oocyte.</a> Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trisomy+in+humans%3A+incidence%2C+origin+and+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Trisomy in humans: incidence, origin and etiology.</a> Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).</li>
<li>Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deaths%3A+final+data+for+2006%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Vital+Stat+Rep%22%5BJournal%5D)">Deaths: final data for 2006.</a> Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).</li>
<li>Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+in+mammals%3A+recombination%2C+non-disjunction+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li>
<li>Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome-counting+mechanisms+that+determine+nematode+sex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex.</a> Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).</li>
<li>Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+msh-5+is+required+for+both+normal+and+radiation-induced+meiotic+crossing+over+but+not+for+completion+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis.</a> Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).</li>
<li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Screening+Platform+for+the+Rapid+Assessment+of+Chemical+Disruption+of+Germline+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function.</a> Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxicity+Testing+in+the+21st+Century%3A+A+Vision+and+a+Strategy%22">Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy</a>. , The National Academies Press. (2007).</li>
<li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium-+and+high-throughput+screening+of+neurotoxicants+using+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans.</a> Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Burada anlatılan yöntem germlıne Toksik maddelerin belirlenmesi için ilk büyük ölçekli stratejisini oluşturmaktadır. Bu sadakatle germ disfonksiyon için bir vekil olarak kullanılan erken embriyolar anöploidi indüksiyon raporları GFP transgenik Pxol-1 :: GFP içeren suşu kullanımını gerektirir. yöntem, bir C dikkat senkronizasyon gerektirir elegans solucan nüfus ve otomatik yüksek içerik mikroskobu ile GFP pozitif solucanlar görüntüleme ardından 96 kuyulu formatta kimyasal solucanlar maruz kalma...

Amerika Birleşik Devletleri ticaret için kayıtlı yaklaşık 87,000 kimyasallar, bu potansiyel sağlık etkileri 1 için test edilmiştir henüz sadece az sayıda bulunmaktadır. Test edilmiş olanların, sadece bir kısmı özellikle kadın germ hücre gelişimi ve farklılaşması sırasında memelilerde erken üreme olayların değişiklik belirlenmesinde zorluk nedeniyle kısmen üreme sağlığı etkileri için değerlendirilmiştir. Gerçekten de, birinci öz değişmesine ait olaylar dişi memelilerde embriyonik gelişiminin erken evrelerinde yer alan ve dolayısıyla erişim ve tarama amaçları için uygun sayıda toplama zordur. germ kuşaklar arasındaki önemli bağlantıyı sağlar, ve uygun fonksiyon hücresel ve kromozomal bölünme karmaşık programın kesin yürütme mayoz olarak adlandırılan bağlıdır. Öz değişmesine ait işlemin bozulması fertilite düşüklüğü ve üretimi ile sonuçlanabilirkromozom anormal sayıda gamet ve embriyo, bir durum anöploidi olarak adlandırılan. Mayoz kromozom ayrımı hataları insan sağlığı için son derece önemlidir. Kromozom anomalileri 1 150 canlı doğumda sıklığı, Trizomi 21, 18 ve 13 gibi en yaygın türleri 2,3 olan X ve Y kromozomu hataları ile, yaygındır. Ayrıca, kromozomal kökenli olanlar dahil olmak üzere, konjenital malformasyonlar, ABD 4 çevresel etkiler kromozomal ayrımı ve davranışlarını etkileyebilir fikri bebek ölüm önde gelen nedenidir 5 yeni değil, ama yine de tam olarak anlaşılamamıştır. İnsan doğurganlık, erken gelişim ve genel üreme sağlığı engellemesini çevremiz içine kimyasalların hangi araştırmak için bu nedenle çok önemlidir. Memeli modelleri, bu sınırlamaları sebebi olarak, &lt;yuvarlak kurt üreme toksisitesini test etmek amacıyla yüksek verimli bir ekran deneyi geliştirdikem&gt; C. elegans. Biz küçük boyutu, düşük maliyet, kısa üreme döngüsü, germ hücrelerinin yüksek oranda ve manipülasyon 6 kolaylığı olarak bu yaygın olarak kullanılan genetik model sistem tarafından sunulan birçok önemli özelliği seferber ettik. Solucanlar 96-oluklu plaka ya da yüksek hacimli sıvı kültürlerde yetiştirilebilir ve bu nedenle şeffaflığının doğrudan fluoresan muhabir saptanması için plakalar üzerinde görüntülenebilir. Aşağıda tarif edilen deney, bu özelliklerin avantajının ortaya germline bozulması ve embriyonik anöploidisi uyarılmasını tespit etmek için flüoresan raportör Pxol-1 :: GFP ihtiva eden bir sonsuz soyunun yararlanır. Bu muhabir gerginlik kullanımı esas hermafroditik solucan nüfus erkeklerin genellikle nadir görülmesi dayanmaktadır. Bu erkek (&lt;% 0.2) doğal X kromozomu 7 ayrılığı içinde hatasından kaynaklanmaktadır. Ancak, germ bozulma sık otozomal ayrılığı hatalara yol açarve heterochromosomes nedeniyle, erkek fenotip (X missegregation) yanı sıra, embriyonik öldürücülüğü (autosome missegregation) olarak yükseltilmiş bir oranı ile, her iki ilişkilidir. Embriyonik öldürücülük sorunu engellemeyi kolay kolay erkeklerde uyarılmasını tespit etmek için, bir erkek-özgü promoteri (xol-1), yine de, solucanların rahim içinde bulunan erken embriyolar GFP ekspresyonunu tahrik etmek için kullanılır. Bu nedenle, GFP ifade embriyo görünümü anöploid embriyoların varlığı için bir vekil olarak kullanılmaktadır. Bu yöntem, daha önce germlin bakım ve mayoz 8,9 karışmış genleri tanımlamak için kullanılır olmuştur. Kimyasal tarama Uyarlanmış, bu suş yüksek verimli ekranına bir ortamda kullanılır. Önemlisi, gerilme sadakatle kimyasalların aneugenicity raporları ve memeli üreme uç noktalara 10 nedenle alakalı. Burada anlatılan tahlil seyir ilaç ve kimya sanayi ayarlarında toksikoloji özellikle yararlı olacaktırhızla üreme uç noktaları yönelik kimyasalların toksisite değerlendirmek için. Ayrıca, bu deney tamamen 21. yüzyıl raporunda 11 Toksik vurgulanan devlet öncelikleri ile aynı hizaya.

<table><tbody><tr><td>60 mm Havalandırmalı, keskin kenarlı Petri kapları</td><td>Tritech</td><td>T3315</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Apex</td><td>20-274</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 96 kuyulu şeffaf yuvarlak alt 2 ml polipropilen derin kuyu plakası</td><td>Corning</td><td>P-DW-20-CS</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone</td><td>Apex</td><td>20-261</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-tripton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>Çamaşır Suyu</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür (CaCl2)</td><td>VWR</td><td>AA12316-A1</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10138225</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>IC19018680</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi</td><td></td><td><a href="http://www.cbs.umn.edu/cgc" target="_blank">http://www.cbs.umn.edu/cgc</a></td></tr><tr><td>Etanol 200 geçirmez</td><td>VWR</td><td>EM-4455S</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384 kuyu plakaları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1937-32EA</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS Sistemi</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Levamizol hidroklorür</td><td>Fluka</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat susuz (MgSO4)</td><td>VWR</td><td>97061-438</td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress Yüksek İçerikli Görüntü Alımı & Analiz Yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Biyolojik kültürler için suni ipek filmler</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (NaOH)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>BDH0316</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>Bu mikroskobun toplam büyütme formu 3.35X ila 300X'tir. Benzer özelliklere sahip herhangi bir mikroskop işe yarayacaktır.</td></tr><tr><td>TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP muhabir suşu</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi</td><td></td><td><a href="http://www.cbs.umn.edu/cgc" target="_blank">http://www.cbs.umn.edu/cgc</a></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Becton Dickinson</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

nematod kullanma germline kimyasal zehirlilik kapsamlı değerlendirme<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Çevremizde bulunan kimyasalların binlerce üreme toksisitesinin belirlenmesi, çevre sağlığı alanında en kabartan zorluklardan biri olmuştur. Bu omurgalı hayvanların yüksek sayıda ihtiyaç duymadan, (1) doğru (2) yüksek verimli moda bir orta bunu yapmak üreme süreçlerinin tuşları özelliklerini özetlemek ve edebilirsiniz model sistemler azlığı kısmen kaynaklanmaktadır. Biz nematod C. burada bir tahlil açıklamak Anöploid embriyoların indüksiyon izleyerek germlıne Toksik maddelerin hızla belirlenmesini sağlar elegans. GFP muhabiri hattının kullanımı yaparak, germ bozulma kaynaklanan kromozom ayrımı hataları kolayca görülebilir ve otomatik floresan mikroskobu ile ölçülebilir. Böylece toksisitesi bileşiklerin özel bir dizi tarama birkaç gün içinde bir 96- 384-kuyucuklu bir plaka biçiminde gerçekleştirilebilir. Pozitif h ikincil analizionun kromozom anomalileri mayoz bozulma veya erken embriyonik kromozom ayrımı hataları kaynaklanan olup olmadığını belirlemek için yapılabilir. Tamamen, bu deney, kimyasal maruziyet aşağıdaki germlıne disfonksiyonu hızlı değerlendirilmesi için hızlı ilk geçiş stratejisini temsil eder.

Gibi mikrotübül zehir nokodazol gibi kimyasal ajanlara Pxol-1 :: GFP raportör soyunun maruz (Şekil 1) DMSO kontrolü ile karşılaştırıldığında açık ergin hermafrodit bireyler rahmine GFP ifade oğulcukların yüksek bir oranda, indüklenmesine yol açacaktır. GFP pozitif embriyolar diğer embriyolar hem de hayvan bağırsağında görülen bir oto-floresan gözlenen zayıf eşiğe göre belirgin parlaktır. Maruz solucanlar doğrudan 384 çukurlu tabaklarda görüntülenmiş ve en az bir GFP pozitif embriyolu kurtların ...

Germ hattı toksisitesini değerlendirmek için kullanılan nematod Caenorhabditis elegans'ta yüksek verimli bir kimyasal testin ayrıntılı adımlarını açıklıyoruz. Bu tahlilde, kimyasal maruziyeti takiben germ hattı fonksiyonunun bozulması, anöploid embriyolara özgü bir floresan raportör kullanılarak izlenir.

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Bu prosedürün genel amacı, nematode *C. elegans* kullanarak germ hattı kimyasal toksisitesini kapsamlı bir şekilde değerlendirmektir. Bu, öncelikle C Elgan PXOL one GFP suşunun karma evreli bir solucan popülasyonuna seyreltilmiş çamaşır suyu çözeltisi ekleyerek solucanların senkronize edilmesiyle gerçekleştirilir. Bu adım, yumurta kabukları sayesinde çamaşır suyundan korunan çok sayıda embriyonun elde edilmesini sağlar.İkinci adım, embriyoların besinsiz sıvı ortamda çatlamasına izin vererek senkronize bir L1 larva popülasyonu oluşturmaktır. Ardından, solucanlar dördüncü larva evresine veya L4 aşamasına kadar büyütülür ve bu noktada ilgilenilen kimyasallara sıvı ortamda 65 saat boyunca maruz bırakılırlar. Son adım, solucanların uterusu içindeki embriyolarda GFP raporlarının ekspresyonunun floresan mikroskobu aracılığıyla görselleştirilmesidir.Nihayetinde, DMSO kontrolü ile karşılaştırıldığında GFP pozitif embriyoların oranı, test edilen bileşiklerin antijenitesini yansıtır. Bu tekniğin Rodin modelleri veya hücre kültürü analizleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kimyasalların genikliğini ve germ hattı toksisitesini bütün bir hayvan modeli üzerinde değerlendirebilirken, aynı zamanda prosedürü yüksek kapasiteli bir analiz şeklinde gerçekleştirebilmemizdir. Bugün bize doktora sonrası araştırmacı Dr. Daniella Perotti eşlik edecek.Bu prosedür için kullanılan grafik solucanları, beraberindeki protokol metninde açıklandığı şekilde önceden hazırlanmıştır; GR solucanlarını, bir ila iki mililitre M9 ile yıkayarak nematod büyüme ortamından veya NGM plaklarından toplayın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. GR solucanlarının 15 mililitrelik konik tüpün dibine çökmesi için yaklaşık beş ila 10 dakika bekleyin. Ardından, solucan peletini bozmadan süpernatantı uzaklaştırın.Solucan peletini iki ila dört mikro santrifüj tüpüne aktarın ve her tüpe bir mililitre seyreltilmiş çamaşır suyu çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında iki ila üç dakika inkübe edin. Tüm solucanların öldüğünden emin olmak için reaksiyonun ilerleyişini stereo mikroskop altında izleyin.Embriyolar ölebileceği için beş dakikadan daha uzun süre ağartma yapmayın. Solucanları 3000 RPM'de bir dakika boyunca santrifüj ederek toplayın.Süpernatantı uzaklaştırın ve reaksiyonu nötralize etmek için bir mililitre steril M nine ekleyin. Çamaşır suyu işleminden sonra solucanlarla temas eden tüm malzemelerin steril olduğundan emin olun. Solucanları M nine medyumu ile iki kez yıkayın.Süpernatantı uzaklaştırın ve 100 ila 200 µL M9 ekleyin. Bir cam pastör pipeti kullanarak, solucan M9 karışımından bir damlayı temiz NGM plaklarına ekleyin ve embriyoların besinsiz ortamda çıkabilmesi için 20 °C'de en az 24 saat inkübe edin. Larvaların büyümesi L1 aşamasında durdurulacaktır. İki senkronizasyon adımı.Maruziyet için kullanılacak L4 larvalarının sayısını maksimize etmek adına, yüksek düzeyde senkronize bir solucan popülasyonu elde etmek kritik olduğundan, ağartma ve L kelimesi açlığı yöntemleri kullanılmaktadır. Senkronize bir L1 larv popülasyonu oluşturulduktan bir gün sonra, L1 larvaları şeffaf NGM plakalarından toplanır. Plakalar bir ila iki mililitre M9 ile yıkanır ve L1 larvaları 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarılır.Ölü yetişkin solucanların 15 mililitrelik konik tüpün dibine çökmesi için yaklaşık beş dakika bekleyin. L1 evresindeki solucanların bulunduğu süpernatantı yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe toplayın. Solucanları 2.600 RPM'de iki dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün.Yaklaşık 500 µL kalacak şekilde süpernatantı uzaklaştırın. 10 µL'lik damlalardaki solucan sayılarını sayarak M nine çözeltisindeki solucan konsantrasyonunu belirleyin. Bir stereo mikroskop kullanarak en az beş damlayı sayın.Solucan konsantrasyonunu M nine içerisinde mikrolitre başına 20 ila 25 solucan olacak şekilde ayarlayın ve ardından NGM plaklarına 50 mikrolitre solucan M nine karışımı ekleyin. Besleme bakterisi OP 50 ile birlikte, L1 senkronize popülasyonunun L4 evresine ulaşana kadar büyümesini sağlamak için 15 °C'de 65 saat boyunca inkübe edin. Bu tarama, germ hattı bozulmasını ve embriyonik aneuploidi indüksiyonunu tespit etmek için floresan transkripsiyonel raporlayıcı içeren bir CL karşıt suşu kullanır.Şeffaf NGM plakalarını bir ila iki mililitre M9 ile yıkayarak L4 larvalarını toplayın ve bunları 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. L4 solucanlarının 15 mililitrelik konik tüpün dibine çökelmesi için yaklaşık beş ila 10 dakika bekleyin. Ardından, solucan peletini bozmadan süpernatantı uzaklaştırın.Üç ila beş mililitre M9 ekleyin ve 10 µL'lik damlalardaki solucan sayısını sayarak M9 çözeltisindeki solucan konsantrasyonunu belirleyin. Bir stereo mikroskop kullanarak her örnek için en az beş damlayı sayın. Solucanları M9 içerisinde mililitre başına bir solucan konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.Önceden hazırlanmış OP 50 bakterilerini M nine ile on kat seyreltin. Düşük sıcaklıkların solucan gelişimini etkilediğini göz önünde bulundurarak, resüspande edilen bakterilerin oda sıcaklığına ulaştığından emin olun; önce, çok kanallı bir pipet kullanarak iki mililitrelik derin yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa 100 mikrolitre solucan M nine karışımı ekleyin. Ardından, her kuyucuğun sonuna 400 mikrolitre seyreltilmiş OP 50 bakterisi ekleyin.Her kuyucukta 500 microliter içerisinde 100 solucan bulunacaktır. 100 micromolar final konsantrasyona ulaşmak için istenen kuyucuklara 0,5 microliter test kimyasalı ekleyin. CL elgan kimyasal taramalarda yaygın olarak kullanılan bir konsantrasyondur; pozitif kontrol olarak final konsantrasyonu %0,1 olacak şekilde etanol veya DMSO çözücü kontrollerini maruz bırakın.100 µM kosol içermeyen çözelti kullanın. Plakayı yapışkan film ile kapatın. Kuyucuklar arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için plağın iyice kapatıldığından emin olun.Plakayı alüminyum folyo ile sarın. Plakayı uygun sıcaklıktaki bir çalkalayıcıya uygun bir süre için aktarın. Oda sıcaklığını 20 °C civarında tutun; çünkü sıcaklık, çalkalayıcıdaki kimyasal maruziyet tamamlandıktan sonra solucanların büyümesini etkiler.Yetişkin solucanların bir çok kanallı pipet yardımıyla plağın tabanına çökmesine izin vermek için 96 kuyucuklu plakları 10 ila 15 dakika boyunca bekletin. Plağın tabanındaki solucanları rahatsız etmemeye dikkat ederek her kuyucuktan 350 µL M9 çözeltisini uzaklaştırın. Solucanları 1 mL M9 ile yıkayın ve yetişkin solucanların tabana çökmesi için plağı tekrar 10 ila 15 dakika bekletin.Plakların altındaki solucanları rahatsız etmemeye çok dikkat ederek, her kuyucuktan bir mililitre M9'u uzaklaştırın. Solucanları kalan M9 içinde yeniden süspande edin. 96 kuyucuklu plaktan 100 mikrolitre solucanlı M9 karışımı toplayın ve bunu siyah duvarlı, şeffaf tabanlı 384 kuyucuklu bir plaktaki kuyucuklara yükleyin.384 kuyucuklu plakanın tüm kuyucukları doldurulana kadar, 4 adet 96 kuyucuklu plakadaki solkanatları kullanarak işlemi tekrarlayın. Görüntüleme işlemi sırasında otofokusun verimliliğini ve hızını artırmak için tüm kuyucukların aynı hacme sahip olması önemlidir. Ardından, her kuyucuğa bir mikrolitre lale ekleyin ve solkanatları yaklaşık 30 dakika inkübe edin.Lale, bir asetilkolin reseptör agonisti olarak görev yapar ve solucanları immobilize eder; plakayı, otomatik görüntüleme sağlayabilen geniş alanlı bir yüksek içerikli mikroskoba aktarın. Üretici kılavuzuna uygun olarak yüksek içerikli görüntüleme ve analiz yazılımını kullanın. Her biri için bir görüntü elde etmek üzere 4x objektifini seçin.GFP görüntüleme parametrelerini 45 milisaniye pozlamaya ve görüntü çözünürlüğünü 2160 x 2160'a ayarlayın. Görüntü alma işlemine başlayın; pozlanan solucanlar doğrudan 384 kuyucuklu plakalar üzerinde görüntülenir. Burada gösterildiği gibi, her kuyucuk için en az bir GFP pozitif embriyo içeren solucan sayısı sayılır ve o kuyucuktaki toplam solucan sayısına göre normalize edilir.Mikrotübül zehiri no-code AOL gibi kimyasal ajanlara maruz kalma, DMSO kontrolüne kıyasla yüksek oranda GFP eksprese eden embriyoların indüklenmesine yol açar. GFP pozitif embriyolar, diğer embriyolarda gözlemlenen zayıf arka plan floresanına ve hayvanların bağırsaklarında gözlemlenen otoflorese göre önemli ölçüde daha parlaktır. Kırmızı ok, no-code AOL uygulanmış bir solucanın uterusu içinde açıkça görülebilen GFP pozitif embriyoları göstermektedir.Bu prosedürü takiben, kimyasalların germ hattı üzerindeki etkisine daha ayrıntılı bir bakış sağlamak amacıyla solucanların DNA boyaması gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, toksikoloji alanındaki araştırmacıların kimyasalların reprodüktif toksisitesini ve germ hattı toksisitesini hızla değerlendirmelerine olanak tanır.

comprehensive-assessment-germline-chemical-toxicity-using-nematode

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video, akut toksisite tedavisini test eden veya genetik bir suşu toksik bir duruma direnç açısından test eden kısa süreli bir sağkalım testini tanıtmaktadır. Örnek protokol, solucanların paraquat (PQ) tarafından indüklenen oksidatif strese direnme yetenekleri açısından test edildiği örnek bir hayatta kalma testini göstermektedir.

C. elegans Hayatta Kalma Testi: Kısa Süreli Bir Toksisite Testi

Burada, organizmanın iyi beslenmiş bir beslenme durumundan aç kalmış beslenme durumuna geçmesiyle bakırdan kaçınma davranışındaki ve ortak bir besin kaynağını bulma yeteneğini değerlendirmek için tasarlanmış Caenorhabditis elegans spesifik bir analiz sunuyoruz.

bir<emCaenorhabditis elegans</emBeslenme Durumuna Dayalı Bakır Kaçınma Deneyi

Nematodun, Caenorhabditis elegans'ın , nüfusa dayalı bir deneyde çözünür bileşikler için tercihinin otomatik analizini sağlayan bir davranış kayıt kurulumu ve protokolü sunuyoruz. Bu makale bir davranış odasının inşasını, davranışsal analiz protokolünü ve video analiz yazılımının kullanımını anlatıyor.

Nematod Popülasyona Dayalı Kemoterapi Tercihi Testinin Otomatik Analizi

Bir modeli hayvan, Caenorhabditis elegans, kimyasal toksisitesi değerlendirmek için temel bir protokol açıklanmıştır. Uygun ve risk değerlendirmesi çeşitli çevresel kirleticilerin gelince de eczacılık gelişimi için yararlı yöntemdir.

Büyüme ve üreme Caenorhabditis elegans kimyasallar etkisi ölçme

Çevre toxicants maruz akut geliştirme uzun vadeli etkileri ile etkileyebilir. Detaylı iletişim kuralları Bisfenol A. için erken embriyonik pozlama etkisini incelemek için bir etkili lab modelini kullanarak bir strateji göstermek için sağlanan Sağladığımız verimlilik ve bizim yaydıkları pozlama biyo-deneyleri etkinliğini izlemek için davranışsal deneyleri.

Embriyonik maruz kalma düşük doz Toxicants uzun vadeli davranış ve üreme sonuçları

Nicel bir yöntem tanımlamak ve fenotipik Caenorhabditis elegansprofil oluşturma otomatik olarak analiz ederek kimyasal maddeler akut toksisite tahmin etmek için geliştirilmiştir. Bu iletişim kuralı, bir 384-şey tabak içinde solucanlar kimyasallar ile tedavi, video esir alma ve toksikolojik ilgili fenotipleri ölçmek açıklar.

Bir yüksek-den geçerek tahlil tarafından otomatik fenotipik profil oluşturma Caenorhabditis elegans ve kimyasal toksisitesi tahmin için

Sürekli kimyasalların Trans-ve çok jenerasyonel etkileri, çevre ve insan sağlığı üzerinde uzun vadeli sonuçlarını yargılamak için esastır. Ücretsiz yaşam nematod Caenorhabditis eleganskullanarak Trans-ve çok jenerasyonel etkileri incelemek için yeni ayrıntılı Yöntemler sağlıyoruz.

Toxicants Trans ve çok jenerasyonel etkileri okumak için Caenorhabditis elegans kullanma

Burada, Caenorhabditis elegans'taki test bileşiklerinin poliglutamin agregasyonu, nöronal ölüm ve kemoavoidans davranışı dahil olmak üzere nöroprotektif aktivitelerini ve çoklu fenotiplerin örnek bir entegrasyonunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz.

Poliglutamin aracılı nörotoksisiteye karşı biyoaktif bileşiklerin keşfedilmesi için bir model sistem olarak Caenorhabditis elegans

Genç yetişkin Caenorhabditis elegans nematodları, 2-24 saat boyunca farklı konsantrasyonlarda ticari pestisitlere veya diğer toksik maddelere maruz kalır. Daha sonra, floresan eksprese eden suşlar kullanılarak farklı nöronlar görselleştirilebilir. Bu makale, nematodların pestisitlere nasıl maruz bırakılacağını ve nöron hasarının nasıl değerlendirileceğini göstermektedir.

Pestisitlerin Caenorhabditis elegans Nöronları Üzerindeki Etkisinin İncelenmesi

protokoller, insan embriyonik kök hücreleri ve transcriptome çalışmalarına dayalı iki in vitro gelişimsel toksisite test sistemleri (UKK ve UKN1) açıklar. test sistemleri, insan gelişimsel toksisite tehlike tahmin ve hayvan çalışmaları, maliyet ve kimyasal güvenlik testi için gerekli süreyi azaltmak için katkıda bulunabilir.

Kimyasal Güvenlik Tarama ve Sistem Biyolojisi Veri Üretimi Gelişim Toksisite Tahliller Tabanlı İnsan Pluripotent Kök Hücre

Öğrenin Caenorhabditis elegans kullanarak yüksek verimli kimyasal analizle üreme hücresi toksisitesini değerlendirme yöntemini. Bu teknik, gelişim biyolojisi ve toksikoloji araştırmalarında bütün bir hayvan modelinde genotoksisiteyi hızla taramak için kullanılır.

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme

Daha fazla video keşfet