Aracı Olarak Adeno-ilişkili virüs kullanarak Hastalığında Retina Engelleri Eğitim için

Bu prosedürün genel amacı, retinal hastalıkların hayvan modellerinde kan-retina bariyeri geçirgenliğini ve iç sınırlayıcı membran bütünlüğünü incelemektir. Bu işlem, öncelikle GFP transgeni içeren AAV partiküllerinin vitreusa veya kan dolaşımına enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, enjeksiyonlardan sonra farklı zaman noktalarında kan örneği almaktır.

Kan örneklemesi, haftalık in vivo fundus görüntüleme ile tamamlanır. Son adım, retinal düz montajlar ve retinal kriyokesitler üzerinde immünohistokimya gerçekleştirmektir. Nihayetinde, ILM bütünlüğünün göstergesi olan transdüksiyon paternini göstermek ve kan dolaşımındaki AAV partiküllerini tespit etmek için konfokal mikroskopi ve PCR kullanılarak kan-retina bariyerinin geçirgenliği kanıtlanır.

Mevcut yöntemlerimiz olan bu tekniğin temel avantajı, AAV pasta yönteminin diğer hücreler tarafından sağlanamayan kan-retina bariyeri geçirgenliği hakkında bilgi vermesidir. Bu tekniğin etkileri, kan-retina bariyerinin AAV partiküllerine karşı geçirgenliğini sağlamaya yardımcı olarak istenmeyen yan etkileri önlediği için AAV aracılı gen tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem, diyabetik sıçanlar gibi diğer retina hastalığı hayvan modellerinde iç sınırlayıcı membran bütünlüğü hakkında bilgi sağlayabilir.

Bu yöntemle ilgili fikri ilk olarak, kan-retina bariyeri bozulmasını gösteren DP 71 null-fare modelimizin retinasının, vahşi tip retinadan daha verimli bir şekilde transduse olduğunu gördüğümüzde edindik.

C-57 black-six J fareleri anestezi uygulayarak başlayın. Doğrultma refleksi, geri çekilme refleksi ve kuyruk sıkıştırma yanıtı olmak üzere üç refleksin kaybolduğunu kontrol edin.

Bu reflekslerin kaybı anesteziyi doğrular. Ardından, korneaya damlalıkla %5 neosynephrine ve %0,5 mydriaticum uygulayarak pupillaları genişletin. Daha sonra, gözlerin aşırı kurumasını önlemek için veteriner kremi ile gözleri yağlayın. Şimdi, 1 ile 4 x 10¹¹ AAV-GFP partikülü içeren stok çözeltiyi 30 gauge ultra ince tek kullanımlık bir iğneye doldurun.

Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, lens veya retinaya temas etmeden en güvenli intravitreal enjeksiyonu gerçekleştirmek zorunda oldukları için zorlanacaklardır. Ardından, ultra ince 30 gauge tek kullanımlık bir iğneyi ekvatordan ve limbusun yanından vitreus boşluğuna geçirin. İğne göze yerleştirildikten sonra, iğneyi vitreus boşluğunun merkezinde gözlemleyerek bir mikrolitre çözelti enjekte edin.

İç sınırlayıcı membran deneyleri için bir gözü kontrol olarak kullanın ve kan-retina bariyeri deneyleri için her iki göze de enjeksiyon yapın. Enjeksiyondan sonra, her bir enjekte edilen göze antiinflamatuar ve antibakteriyel topikal tedavi uygulayın. Bir hafta sonra pupillaları neosinefrin ve midriyatikum ile dilate edin ve bir fundus kamerası ile fundus incelemeleri gerçekleştirin.

Enjeksiyondan bir hafta, iki hafta, bir ay ve iki ay sonraki gözlemlerle GFP ekspresyonunu takip edin. Ötanazi uygulanmış enjekte hayvandan gözleri topladıktan sonra, lensi ve korneayı çıkarmak için gözleri diseke edin. Ardından, diseke edilmiş gözü bir saat boyunca %4 paraformaldehitte daldırma yöntemiyle sabitleyin. Bir saat sonra, gözleri oda sıcaklığında bir saat daha %10 sükrozda kriyoprotekte edin. Ardından gözleri oda sıcaklığında yirmi dakikayla bir saat arasında (bir saatin üçte biri kadar) %20 sükrozda bekletin.

Son olarak, gözleri %30 sakroz çözeltisinde dört santigrat derecede gece boyunca bekletin. Ertesi gün, göz kaplarını cryo-matrix gibi bir gömme reçinesine gömün ve dondurun. Ardından kriyostat kullanarak 10 mikron kalınlığında kesitler alın ve bunları donmuş dokular için hazırlanmış lamlara monte edin.

Şimdi, slaytlardaki kesitleri beş dakika boyunca deterjanla permeabilize edin. Bunu, PBS ile yapılan iki kısa yıkama ile takip edin. Ardından, gözleri oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edin.

Retinal düz montajlar için, enükle edilen gözleri 15 ila 30 dakika boyunca %4 paraformaldehitte sabitleyerek diseksiyonu kolaylaştırın. Bu sabitleme ve diseksiyon sonrası yapılan sabitleme işlemi, GFP floresanını korumak için kritik olduğundan düzgün bir şekilde gerçekleştirilmelidir. 15 ila 30 dakikalık sabitleme süresinin ardından gözleri disseke edin, korneayı ve lensi çıkarın.

Ora serrata ve optik sinir çevresini keserek retinayı, retinal pigment epitelyumundan ve sklera'dan ayırın. Diseksiyondan sonra, dokuyu ve transduce edilmiş retinal hücrelerdeki floresan proteini sabitlemek için retinaları 30 dakika daha %4 Paraformaldehyde daldırın. Sabitleme işleminden sonra, örneği pH 7.4 değerindeki steril PBS içerisinde beş dakika boyunca yıkayın.

Ardından PBS'yi bloklama tamponu ile değiştirin ve retinaları oda sıcaklığında dört saat veya 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Numuneleri, bloklama tamponu içindeki primer antikorlarla oda sıcaklığında dört saat veya 4 °C'de gece boyunca inkübe ederek markalama adımına başlayın. Primer antikoru uyguladıktan sonra dokuları PBS ile üç kez yıkayın, ardından dokuları bloklama tamponu içindeki 1:500 dilüsyonundaki Alexa Fluor konjuge antikorlar ile inkübe edin.

Kriyokesitler için bir saat veya flat mount'lar için iki saat inkübe edin. Bu işlemi oda sıcaklığında gerçekleştirin ve ışıktan koruyun. Sekonder antikor uygulandıktan sonra, daha önce yapıldığı gibi PBS ile üç kez yıkayarak uzaklaştırın.

Şimdi, retinayı ya fotoreseptörler ya da retinal ganglion hücreleri yukarı bakacak şekilde bir lam üzerine düz bir biçimde monte edebilmek için rahatlatma kesikleri yapın. Sulu bir montaj medyumu ve lamellen uygulayın. Lamlar, konfokal mikroskopi görüntülemesi öncesinde dört derece Celsius sıcaklıkta saklanabilir.

Dolaşımdaki AAV partikülleri için pozitif bir kontrol oluşturarak başlayın. İlk olarak, AAV enjekte edilmeden önce 10 ila 20 µL kan örneği alın. Ardından, anestezi uygulandıktan sonra, stok viral solüsyondan 100 µL'yi kan dolaşımına enjekte edin.

Kan dolaşımına madde enjekte etmenin daha kolay yolu penis venidir. Bu video kaydında, enjeksiyonun görsel kontrolü olarak mavi boya enjekte ediyoruz. Sonraki üç gün boyunca periyodik olarak küçük kan örnekleri almaya devam edin ve ardından fareyi sakrifiye edin. Ticari bir kit kullanarak doku örneklerinden genomik DNA ekstre edin; elde edilen DNA ile GFP'ye özgü bir primer çifti kullanarak PCR amplifikasyonu gerçekleştirin. 45 saniyelik uzama ve 55 °C bağlanma sıcaklığı ile 30 döngü çalıştırın. SHH 10 vektörünün transduksiyon paterninin DP 71 null farelerde artması bekleniyordu. Eğer hayvan modeli iç sınırlayıcı membranın yapısında pertürbasyonlar gösterdiyse, DP 71 null fareler bozulmuş retinal bariyerlere sahiptir ve bu nedenle faydalı bir karşılaştırma sunarlar; DP 71 null farelerde SHH 10'un intravitreal enjeksiyonu Müller glia hücrelerini daha verimli bir şekilde hedefler.

Bu durum, bu transgenik fare hattında, vahşi tip kontrollerle karşılaştırıldığında iç sınırlayıcı membranın destabilize olduğunu göstermektedir. AAV5-GFP enjeksiyonu da iç sınırlayıcı membran geçirgenliğini kanıtlamıştır. AAV5, vahşi tip farelerde intravitreal enjeksiyon yoluyla etkisiz kalırken, DP 71 null farelerde olduğu gibi retinal bariyerleri bozulmuş farelerde fotoreseptörlere gen iletiminde güçlü bir şekilde etkili hale gelmiştir.

PCR analizi ile, intravitreal enjeksiyondan sonra kan örneklerinde hiçbir AAV izine rastlanmadığından, DP 71 null farelerdeki kan-retina bariyerinin AAV partikülleri için seçici kaldığı görülmüştür. Bu videoyu izledikten sonra, retinanın transdüksiyon paternini veya kan akışındaki AAV partikül varlığını analiz ederek, iç sınırlayıcı membranın bütünlüğünü veya kan-retina bariyeri geçirgenliğini test etmek için adeno ilişkili virüsün nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.