Name: Aracı Olarak Adeno-ilişkili virüs kullanarak Hastalığında Retina Engelleri Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Öğrenin, adeno-ilişkili virüs kullanarak retina hastalıklarında kan-retina bariyeri geçirgenliğini ve iç sınırlayıcı membran bütünlüğünü hayvan modellerinde değerlendirmeyi. Bu yöntem, konfokal mikroskopi ve PCR ile transdüksiyon paternini analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Institut de la Vision'ın görüntüleme platformuna teşekkür ederiz. Fransız Musküler Distrofi Derneği'ne (AFM) O.V. ve Allergan INC.'e doktora bursu için teşekkür ederiz. LABEX LIFESENSES [referans ANR-10-LABX-65] çerçevesinde gerçekleştirilen bu çalışma, ANR tarafından yönetilen Fransız devlet fonları tarafından desteklenmiştir. Peggy Barbe ve Mélissa Desrosiers'e AAV hazırlıkları konusundaki teknik yardımları için teşekkür ederiz. Stéphane Fouquet'e konfokal mikroskopideki mükemmel teknik yardımı ve sonuçların yorumlanmasıyla ilgili uzman girdileri için minnettarız.

Bu çalışmada kullanılan tüm hayvanlar Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım ARVO Tablosuna göre bakım ve ele alınmıştır. HEK-293 hücrelerinden 17,18 süreli transfection ile Rekombinant AAV (rAAV), 1. Üretim NOT: McClure C, (2011) 19 vallahi bak. <ol><li> AAV vektörü plazmid geniş ölçekli bir plazmid hazırlama (en az 1 mg / ml) ile saflaştınlır. 3 plazmidler kullanın. AAV ters terminali olmadan çoğaltma ve kapsid genleri taşıyan AAV yardımcı plazmid ITR&#39;ler, AAV ITR transferi plazmid olarak anılacaktır taşıyan transgen ifade kaseti, adenovirüs ve yardımcı genleri E2, E4, ve VA RNA genleri tedarik plazmid sevk edilen tekrarlar pHELPER olarak. </li><li> Bu 3 plazmidler polietilenimin (ya da diğer transfeksiyon reaktifi) kullanılarak 293 hücreleri transfekte. Transfeksiyon verimi% 80 üzerinde iyi vi için gerekli olanral verimleri. </li><li> Bir iyodiksanol degrade üzerinde 293 hücre lisatlanndan rekombinant AAV arındırın. % 15,% 25,% 40,% 60 iyodiksanol gradyanı elde etmek için kullanılır. AAV parçacıkları ihtiva eden% 40 iyodiksanol fraksiyonu toplamak% 0.001 Pluronic PBS&#39;ye 1 saat karıştırıldı ve tampon değişimi (fosfat tamponlu tuzlu su) için 500,000 x g&#39;de ultrasantrifugasyon sonra fraksiyonu konsantre edilir. </li><li> Viral genomik titresi 20 belirlemek için, qPCR ardından DNAz ProteinaseK özet gerçekleştirin. ileri ve geri primerler AAV2 ITR bulunan 62 bp bölgesini yükseltmek. Plazmid standart için, prob FAM ile etiketlenmiş ve (BHQ) söndürücü bir kara delik vardır. </li><li> ITR primeri, 100 nM ileri ITR primeri, 100 nM, AAV2 ITR probu, 0.4 mM dNTP, 2 mM MgCI2, 1 x Platin Taq tampon, 1U Platin ters 340 nM kullanılarak 25 ul nihai hacim içinde qPCR (kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu) yapınız Taq ve 5 ul şablonu (standart, numune ve hiçbir şablon kontrolü). </li><li> Içinstandart seri seyreltileri ile 10 katı 7 x transfeksiyon için plazmid kullanımı (5 ul 10 Ekim-10 Nisan genomları / ml nihai bir konsantrasyonda elde edilen, 2 x 10 9 3 10 ila 2 x genomları / ml her biri). </li><li> Denatürasyon için 40 döngü, ardından 15 dakika boyunca 95 ° C&#39;de bir ilk denatürasyon adımı programı başlayın 1 dakika tavlama / uzatma için 95 ° C &#39;de 1 dakika süre ile 60 ° C&#39;de ilave edildi. Kısa süreli depolama için veya uzun depolama süreleri boyunca -20 ° C &#39;de 4 ° C&#39; de muhafaza edin. </li></ol> AAV 2. Intravitreal <ol><li> Ketamin (50 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile C57BL6J fareler anestezi ve refleks, uygun bir anesthetization gösteren çekme refleksi ve kuyruk kıskaç yanıt doğrultma kaybını kontrol edin. Neosynephrine% 5 kornea uygulama ile öğrencilerin genişletmek ve göz damlası% 0.5 mydriaticum. Anestezi altında iken kuruluğu önlemek için göze veteriner merhem kullanın. </li><li> Bir ultra ince 30 G disposab geçmekle ekvator boyunca iğne ve vitreus boşluğuna, limbusa yanındaki (Chiu K, vallahi (2007) 21). Vitröz kavitesine merkezi iğne, doğrudan gözlemiyle ShH10-GFP veya rAAV5-GFP 1 ila 10 x 4 11 vp ihtiva eden 1 ul stok (Şekil 1) enjekte edilir. ILM deney için bir kontrol olarak, bir göz kullanın. BRB deneyler için her iki gözleri enjekte edilir. Enjekte gözleri bir anti-inflamatuar ve antibakteriyel topikal tedavi uygulayın. </li><li> Neosynephrine ile öğrencileri genişletmek ve mydriaticum göz görüntüleme için düşer. GFP (Yeşil Floresan Protein) ifadesi 1 hafta, 2 hafta, 1 ay, intravitreal enjeksiyondan sonra 2 ay (Şekil 1) takip göz fundus kamera ile fundus muayeneleri gerçekleştirin. CO 2 inhalasyon 1 ila 2 ay sonrası enjeksiyon yoluyla fareler Kurban. </li></ol> 3. İmmünohistokimya <ol><li> Retina cryosections (Şekil 1) için, l kaldırmak için enüklee gözleri teşrih1 saat süresince% 4 paraformaldehit içinde sapiens ve kornea ve daldırma düzeltme. <ol><li> Oda sıcaklığında 1 saat, oda sıcaklığında bir saat için% 20 sakroz,% 10 sukroz içinde daha önceden belirlenmiş gözleri cryoprotect. Gece boyunca 4 ° C&#39;de% 30 sukroz çözeltisi içerisinde cryoprotect. Freeze ve Cryo-matris olarak reçine gömme eyecups embed. 10 mikron cryosections olun ve özel dondurulmuş doku bölümleri için tedavi slaytlar üzerine monte ve boyama sırasında doku uyumu artırmak. </li><li> 5 dakika boyunca PBS pH 7.4 içinde% 0.1 Triton X100 ile bölümleri geçirgenliği. PBS Yıkama 2x ve blok,% 1 BSA ile PBS içinde oda sıcaklığında 1 saat,% 0.1 Tween 20. </li></ol></li><li> Retina flatmounts (Şekil 1) için, diseksiyon kolaylaştırmak için, 15 dakika süreyle% 4 paraformaldehid içinde enüklee gözleri düzeltin. <ol><li> 15-30 dakika içinde, kornea ve lens çıkarmak için gözleri teşrih. Ora serrata etrafında keserek retina pigment epiteli (RPE) ve sklera gelen retina ayırın veoptik sinir. Retina ve kalıt retina hücrelerinde floresan proteini (tespit 24 saat aşmamalıdır) sabitlemek için başka bir 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehid içinde bırakın. Steril PBS, pH 7.4 içinde 5 dakika yıkanır. </li><li> (% 1 BSA,% 2 normal keçi ya da eşek serumu PBS,% 0.5 Triton X-100), bloke edici tampon ile PBS değiştirin ve oda sıcaklığında 4 saat ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de ya da blokaj tamponunda inkübe edilir. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de ya da 4 saat süre ile blokaj tamponu içinde primer antikorlar ile dokuların inkübe edin. PBS ile yıkayın 3x. NOT: Aşağıdaki olarak kullanılan antikorlar: Anti-laminin (/ 1,000 1) etiketleme ILM anti-rodopsin klon 4D2 (1/500) etiketleme çubuklar, anti-glutamin sentetaz klonu GS-6 (1 / 1.500) etiketleme Müller hücreleri PNA lektin (1/40) etiketleme kozalakları. </li><li> Oda Tempe 1 saat (halinde kriyoseksiyonlar) ya da 2 saat (flatmounts) blokaj tamponunda Alexa Fluor konjuge sekonder antikor: 500 oranında seyreltilmiş 1 ile dokuları inküberature ve ışıktan korunan. PBS ile yıkayın 3x. </li><li> Retinaya giderici kesim yapmak ve fotoreseptör veya retina ganglion hücre (RGH) iki tarafında yukarı bakacak şekilde bir cam slayt üzerine flatmount. 4 ° C&#39;de lamel ve mağaza uygulamak, sulu mountingmedium ekleyin. </li><li> Lazer tarama konfokal mikroskop konfokal mikroskopi gerçekleştirin. Uyarma ve emisyon karışma azaltmak için, satır görüntüleri sırayla, çizgi edinin. Nyquist-Shannon örnekleme teoremine göre adım boyutunu tanımlayın. Son görüntülerde doygun piksel en aza indirmek pozlama ayarlarını kullanın. Z-proje fonksiyonu altında maksimum şiddeti kullanarak ve nihayet 8-bit RGB renk moduna dönüştürmek tek düzlemde FIJI ile Süreci 12-bit görüntüleri, proje Z-bölümleri. </li></ol> Fare Kan Örneklerinin 4. PCR Analizi <ol><li> Anestezi C57BL6J farelerin penil ven içine bir AAV-GFP 1 10 4 x 11 partikülleri içeren 100 ul stok (izofluran% 5 enjekteultra-ince 6 mm&#39;lik bir iğne ile bir insülin şırıngası kullanılarak yakın bir bölmesi içinde indüksiyon ve ameliyat sırasında bir burun konisi ile izofluran% 2,5) dir. Bu hayvan AAV tanecikleri dolaşan bir pozitif kontrol olarak görev yapacak. </li><li> Enjeksiyon ve 3 saat, 24 saat, 2 gün ve 3 gün ShH10 intravitreal enjeksiyonu sonrası veya intrapenile enjeksiyon (Şekil 1) önce sonra fare kuyruğu örnek kan. 10-20 ul heparin tüpler toplanır. Prosedürün tamamlanmasından sonra CO 2 inhalasyon fareler Kurban. </li><li> Seçtiğiniz ekstraksiyon kiti kullanılarak, kan örneklerinden genomik DNA ayıklayın. </li><li> Genomik DNA, PCR amplifikasyon yapın. Bu protokol için aşağıdaki primer çifti kullanın: GFP, 5&#39;-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 &#39;, 5&#39;-antisens CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3&#39; seziyorum. Aşağıdaki PCR programı gerçekleştirildi: 95 ° C&#39;de 2 dakika (1 döngü); 95 ° C, 45 sn, 55 ° C, 1 dakika, 72 ° C, 45 sn (30 döngü); 72 ° C&#39;de 5 dakika (1 döngü);4 ° C tutun. </li></ol> 5. İsteğe bağlı Evans Mavisi Yöntemi NOT: Evans mavisi yöntemi kullanılarak 10 retina içine kan damarlarından albümin kaçağı ölçerek damar geçirgenliği niceliğini. <ol><li> 5 um&#39;lik bir filtreden 5 ultrasonik banyoda dakika ve filtreleme için normal tuzlu su çözeltisi (6 mg / ml), sonikasyon içinde çözülerek Evans Mavisi boya hazırlanır. </li><li> (Adım 4.1, izofluran solumaktan) C57BL6J fareler anestezi refleksi, geri çekme refleksi ve uygun bir anesthetization gösteren kuyruk tutam yanıt doğrultma kaybını kontrol ve penil ven (Şekil 1) ile Evans mavisi (45 mg / kg) enjekte edilir. Farelerin pençeleri, namlu ve kulaklar, Evans mavisi enjeksiyonu takiben boya alımını ve dağılımını teyit açıkça mavi hale olmadığını kontrol edin. </li><li> Ketamin (50 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ile, boyanın enjeksiyonundan sonra C57BL6J fareler 3 saat anestezisi ve rightin kaybını doğrulamakg doğru anesthetization gösteren refleks. Örnek intrakardiyak 500 heparin tüplerde kan ul bir sitrat tampon maddesi ile sol ventrikil yoluyla 2 dakika boyunca fareler serpmek (0.05 M, pH 3.5; sitrik asit 7.8 g damıtılmış su, 1 L sodyum sitrat ve 3.8 g çöz) vazokonstriksiyon önlemek için 37 ° C sıcaklığa daha önceden ısıtılmıştır. Fareler perfüzyon yoluyla kurban edilir. </li><li> Dikkatle perfüzyon, aydınlatmak ve sonra retina toplamak için bir işletim mikroskop altında her iki gözleri teşrih (Bölüm 3.2). Santrifüjlü bir buharlaştırıcıda Kuru retina gece boyunca, tartılmakta ve (100 xg) çalkalanarak 65 ° C&#39;de 18 saat formamid 100 ul ile retina inkübe edilerek Evans mavisi ekstrakte edin. 4 ° C&#39;de 2 saat süre ile 20,798.5 xg&#39;de 30K omega filtre tüpleri Santrifüj retina örnekler ve santrifüj kan örnekleri 4 ° C sıcaklıkta 15 dakika boyunca 20,798.5 xg&#39;de. </li><li> Absorbansı ölçmek için, her iki süpernatantlar kullanın. Absorbans en fo çıkarılarak her numunenin absorbansı belirlemek740 nm&#39;de absorbans minimum 620 nm mavi r Evans. Formamid Evans mavisi, standart bir eğriden plazma ve retinada Evans mavisi konsantrasyonu hesaplanır. Saatte kuru retina (plazma / g retina kuru ağırlık / saat ul) gram Evans mavisi mikrolitre içinde BRB geçirgenliği ifade eder. </li></ol> 6. İsteğe bağlı Floresein Anjiyografi Not: farelerdeki retinal kan damarlarından Kaçak sodyum fluoresein intraperitonal enjeksiyon ile görselleştirilebilir. <ol><li> C57BL6J fareler anestezi (izofluran solumaktan, adım 4.1) ve göz (neosynephrine ve mydriaticum) düşer Öğrencileri dilate. Anestezi altında iken kuruluğu önlemek için göze veteriner merhem kullanın. </li><li> Floresein anjiografi 0.1 ml steril tuzlu su içinde% 10 sodyum fluoresein karın 0,01-0,02 ml enjekte edilir. </li><li> Bir göz fundus kamera kullanarak enjeksiyon sonrası her iki gözün görüntüleri toplayın. Yanlısı sonra CO 2 solumaktan fareler Kurbanketencik. NOT: retinal damarlar anjiyografide görünür hale gelebilmesi için 20 sn gereklidir. Görüntüler floresein enjeksiyondan sonra 3-10 dk maksimum arasındaki yakalanan gerekir. kaçak noktalar (mevcut ise) 2.5 dakika sonra gözlenebilir. Daha sonra zaman noktalarında görüntü kalitesi nedeniyle sodyum floresein kısa bir süre analiz için kullanılan sonra elde edilen camsı, böylece sadece görüntü içine difüzyon kaybolur. </li></ol>

<ol><li>Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+retinal+basal+lamina+during+early+embryonic+development+leads+to+a+retraction+of+vitreal+end+feet%2C+an+increased+number+of+ganglion+cells%2C+and+aberrant+axonal+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth.</a> J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).</li>
<li>Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporary+disruption+of+the+retinal+basal+lamina+and+its+effect+on+retinal+histogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis.</a> Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).</li>
<li>Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane-dependent+survival+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).</li>
<li>Abdelkader, E., Lois, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+limiting+membrane+peeling+in+vitreo-retinal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery.</a> Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).</li>
<li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+limiting+membrane+barriers+to+AAV-mediated+retinal+transduction+from+the+vitreous%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous.</a> Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).</li>
<li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Muller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li>
<li>Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+release+by+retinal+glia+depends+on+both+oxygen+and+glucose+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply.</a> Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).</li>
<li>Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-retinal+barrier+in+hypoxic+ischaemic+conditions%3A+basic+concepts%2C+clinical+features+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management.</a> Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).</li>
<li>Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+response+of+neurons+and+glial+cells+to+hypoxia+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).</li>
<li>Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+blood-retinal+barrier+breakdown+quantitation+using+Evans+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).</li>
<li>Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).</li>
<li>Yang, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-mediated+transduction+of+murine+retina+with+adeno-associated+virus%3A+effects+of+viral+capsid+and+genome+size%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size.</a> J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+following+subretinal+AAV5+vector+delivery+is+not+affected+by+a+previous+intravitreal+AAV5+vector+administration+in+the+partner+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye.</a> Mol Vis. 15, 267-275 (2009).</li>
<li>Koerber, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+adeno-associated+virus+for+enhanced+glial+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery.</a> Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).</li>
<li>Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+adeno-associated+viral+variant+for+efficient+and+selective+intravitreal+transduction+of+rat+Muller+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells.</a> PLoS One. 4 (10), e7467(2009).</li>
<li>Vacca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+gene+delivery+in+Dp71-null+mouse+model+with+compromised+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers.</a> Glia. , (2013).</li>
<li>Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).</li>
<li>Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+use%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use.</a> Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).</li>
<li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348(2011).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreous+injection+for+establishing+ocular+diseases+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravitreous injection for establishing ocular diseases model.</a> J Vis Exp. (8), 313(2007).</li>
<li>Kolstad, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+adeno-associated+virus-mediated+gene+delivery+in+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration.</a> Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).</li>
<li>Sene, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+implication+of+Dp71+in+osmoregulation+and+vascular+permeability+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina.</a> PLoS One. 4 (10), e7329(2009).</li>
<li>Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

BRB kan ve retina arasındaki moleküller değişimini kontrol eder. Bu dökümü diyabetik retinopati veya yaşa ilişkin makula dejenerasyon (AMD) gibi çeşitli hastalıklarla ilişkilidir. Son zamanlarda geçirgen BRB görüntüleyen bir distrofin nakavt fare üzere retina adeno-ilişkili viral vektörler (AAV) tarafından aracılık edilen gen aktarımı için daha geçirgen hale göstermiştir. Ancak, BRB geçirgenlik AAV parçacıklar rağmen göz içine bu modelde göz bölmeye sınırlı kalmak enjekte. Sonuçlarımız, sistemik yan etkiler ilave riskle...

Müller hücreleri retinanın büyük glial bileşenidir. Morfolojik, onlar, vitreus ile temas radyal retina ve endfeet, yayılan ILM ve ikinci gizli bileşenleri karşı karşıya. ILM on farklı hücre dışı matris proteinleri (laminin Agrin, perlekan, nidojen, kollajen ve çeşitli heparin sülfat proteoglikanlar) oluşan bir taban zarıdır. Gelişimi sırasında, kendi varlığı ganglion hücrelerinin 1-3 retina histogenezisleri, optik akson navigasyon, ve hayatta kalmak için vazgeçilmezdir. Ancak, ILM yetişkin retinada önemsiz olduğunu ve cerrahi retina hasarı 4 neden olmadan belirli patolojilerin kaldırılabilir. Gen terapisi, bu membran intravitreal enjeksiyonu 5 ile AAVS kullanarak retinanın verimli iletimi için fiziksel bir bariyer haline gelir. Süreçlerini geniş arborization sayesinde, Müller hücreleri beslenme ve düzenleyici Suppo sağlamakoda sıcaklığı, retina nöronlarının ve vasküler hücrelerin hem de. Müller hücrelerinin de BRB 6 oluşumu ve bakım, retina homeostazının düzenlenmesinde rol oynamaktadır. Sıkı bağlantılar retina kapilar endotelial hücreler arasında, Müller hücrelerin, astrositlerin ve perisitler BRB oluştururlar. BRB diyabetik retinopati, retina ven tıkanıklığı ve solunum yolu hastalıkları gibi birçok hastalığın retina.In girmesini bazı maddeler önler, retinanın hipoksi BRB 7-9 ile sızıntı neden olur. Bu yırtılma vazojenik ödem, retina dekolmanı ve retina hasarına yol açan damar geçirgenliği bir artış ile ilişkilidir. Müller hücrelerinin sıkı hem BRB ve ILM bütünlük içinde önemli bir rol oynayan, kan damarları ve bazal membran ile ilişkilidir. Sonuç olarak, Müller glial hücreler etiketleme bu retina engellerin fiziksel durumunun çalışmaya özellikle önemlidir. Klasikortağı BRB geçirgenliği plazma albümini ile kovalent olmayan bir şekilde bağlanan Evans mavi boya, sistemik enjeksiyonundan oluşan Evans mavisi analizi kullanılarak ölçülür. Bu tahlil retina içine kan damarlarının 10 (Protokoller Bölüm 5&#39;e bakınız) albumin kaçağı (orta büyüklükte protein, ~ 66 kDa) ölçer. Alternatif olarak, vasküler sızıntı floresan sızıntı doğrulayan floresan retina anjiyografi ile görüntülendi olabilir (küçük molekülü, ~ 359 Da; Protokoller Bölüm 6) 11. Bununla birlikte, her iki yöntem küçük moleküller ve proteinlere BRB geçirgenlik değerlendirilmesini sağlar ancak ILM bütünlüğü hakkında bilgi vermemektedir. Bu nedenle, BRB geçirgenliğini incelemek için, biz, daha büyük moleküller (örneğin, AAV parçacıklar 25 nm çapında) için BRB geçirgenliği ile ilgili bilgi veren bir AAV esaslı yöntemi kullanılır. Nitekim, bizim yöntem öneririz, hangi kan AAV transgen varlığını tespit edebilir ~ 25 nm çapında parçacıkları olurkana sızmak mümkün. Bu yöntem, aynı zamanda patolojik durumlarda ILM ve hücre dışı matris proteinlerinin yapısı hakkında bilgi içerir. İki AAV varyantlar, çalışma için faydalıdır: AAV5 ve ShH10. Subretinally enjekte AAV5 fotoreseptör ve retina pigment epiteli 12 için doğal bir tropizm var ama sağlam ILM 5,13 ile yabani tip retina vitreus içine verildiğinde, dış retina genelinde alınamıyor. ShH10 özellikle nöron 14,15 fazla glial hücreler hedef için işlenmiş olan bir AAV varyantıdır. ShH10 seçici tehlikeye engelleri 16 retina artan verimlilik ile sağlıklı ve hastalıklı retina hem de Müller hücreleri etiketler. Immuhistochemistry ve kan-DNA analizi ile birleştiğinde bu viral araçlar retina engellerin devlet ve hastalık onların katılımı (Şekil 1) hakkında bilgi verir.

<table><tbody><tr><td>C57BL6J fare suşu</td><td>JANVIER LABS</td><td></td><td>fareler</td></tr><tr><td>Ketamin 500</td><td>Virbac Fransa</td><td></td><td>anestezik</td></tr><tr><td>Ksilazin Rompun %2</td>%<td>Bayer Sağlık</td><td></td><td>hizmetleri anestezik</td></tr><tr><td>Neosinefrin %5 Faure</td><td>Europhta</td><td></td><td>dilatant</td></tr><tr><td>Mydriaticum %0.5</td> <td>Thea</td><td></td><td>dilatant</td></tr><tr><td>Sterdex</td><td>Novartis</td><td></td><td>anti-enflamatuar</td></tr><tr><td>Kriyomatris gömme reçine</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Yapışma Slaytları</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143352</td><td>slaytları</td></tr><tr><td>anti-laminin</td><td>Sigma</td><td>L9393</td><td>antikor</td></tr><tr><td>anti-rodopsin klonu 4D2</td><td>Millipore</td><td>MABN15</td><td>antikor</td></tr><tr><td>anti-glutamin sentetaz klonu GS-6</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td>antikoru</td></tr><tr><td>Anti-Glial Fibriler Asidik Protein</td><td>Dako</td><td>334</td><td>antikoru</td></tr><tr><td>PNA Lektin</td><td>Invitrogen</td><td>L32459</td><td>probu</td></tr><tr><td>Alexa flor konjuge ikincil antikorlar</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>antikoru</td></tr><tr><td>Fluorsave reaktifi</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td>montaj ortamı</td></tr><tr><td>QIAmp DNA Mikro Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq DNA polimeraz</td><td>Promega</td><td>M3001</td><td></td></tr><tr><td>Evans Mavi boya</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td>boya</td></tr><tr><td>5 & mikro; m filtre</td><td>Millipor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sitrat</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik asit</td><td>Sigma</td><td>C1909-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Formamid spektrofotometrik</td><td>Sigma</td><td>295876-2L</td><td></td></tr><tr><td>Floresein</td><td>Sigma</td><td>F2456</td><td>boya</td></tr><tr><td>Micron III</td><td>Phoenix Araştırma Laboratuvarları</td><td></td><td>3-CCD renkli kamera, çerçeve yakalayıcı ve kullanıma hazır yazılıma dayalı mikroskopi sistemi, araştırmacıların fare retinalarını görüntülemesini sağlar.</td></tr><tr><td>İnsülin Şırıngaları</td><td>Terumo</td><td>SS30M3109</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga 10 ve mikro; l Hamilton</td><td>Dutscher</td><td>74487</td><td>Beze 1701</td></tr><tr><td>İğne RN G33, 25 mm, PST 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>11530332</td><td>İntravitreal Enjeksiyon</td></tr><tr><td>UltraMicroPump UMP3</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td>Çok yönlü enjektör, pikolitre hacimleri sağlamak için mikroşırıngalar kullanır</td></tr><tr><td>SYS-Micro4 Kontrol Cihazı ile UltraMicroPump (UMP3) (bir)</td><td>UMP3-1</td><td>Dijital kontrolör</td><td></td></tr><tr><td>Binoküler büyüteç SZ76</td><td>ADVILAB</td><td>ADV-76B2</td><td>Yakınlaştırma 0,66 x 5 x LED, standlı epi ve çap / Retina diseksiyonu</td></tr><tr><td>Yaylı makas düz - 8,5 cm</td><td>Biyonik Fransa S.a.r.l</td><td>15003-08</td><td>Retina diseksiyonu</td></tr><tr><td>kavisli Vanna makas</td><td>15004-08</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont 5</td><td>11254-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96 Kuyulu Termal Döngüleyici</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>4375786</td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>Ultrasonik temizleyici</td><td>Laboratuvar Malzemeleri</td><td>G1125P1T</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 30k omega tüpleri</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedvac Fisher</td><td>Scientific</td><td>SC 110 A Spektroflorometre</td><td></td></tr><tr><td></td><td>TECAN</td><td>sonsuz M1000</td><td></td></tr></tbody></table>

aracı olarak adeno-ilişkili virüs kullanarak hastalığında retina engelleri eğitim için

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Müller hücrelerinin retina ana glial hücreler bulunmaktadır. Bunların son ayak, dış ve iç sınır membran (ILM) retinanın sınırlarını oluştururlar ve astrositler, perisitlere ve endotelyal hücreler ile bağlantılı olarak, kan-retina bariyerini (BRB) oluşturmaktadır. ILM retina ve vitreus boşluğuna arasında histolojik sınırı tanımlayan bir bazal membran gibi davranır ise BRB kan ve retina arasındaki malzeme taşıma sınırlar. Müller hücrelerinin etiketlenmesi bu hücreler BRB ve ILM ayrılmaz bir parçası olarak, retina bariyerinin fiziksel durumunu incelemek için özellikle önemlidir. BRB ve ILM Hem sık retina hastalığında değişmiş ve hastalık belirtileri sorumludur vardır. Böyle Evans mavisi deney veya floresein anjiyografi gibi brb bütünlüğünü incelemek için birkaç köklü yöntemler vardır. Ancak bu yöntemler BRB geçirgenlik t ölçüde bilgi vermemektedirnanometre aralığı içinde daha büyük moleküller, o. Ayrıca, böyle ILM gibi diğer retina engellerin durumuna ilişkin bilgi vermemektedir. Retina ILM ile birlikte BRB geçirgenliğini incelemek için, hastalık durumlarında ILM ve hücre dışı matris proteinlerinin durumunu gösteren ancak daha büyük moleküllere BRB geçirgenliği ile ilgili bilgi sağlayan bir AAV esaslı yöntemi kullanılır. İki AAV varyantlar, çalışma için faydalıdır: AAV5 ve ShH10. AAV5 Fotoreseptörlerin için doğal bir tropizm vardır ama ILM sağlam olduğunda (vahşi tip retina yani) vitreus içine verildiğinde, dış retina genelinde alınamıyor. ShH10 glial hücrelerine karşı güçlü bir tropizm vardır ve seçici sağlıklı ve hastalıklı retina hem de Müller glia etiketleyecektir. ShH10 ILM tehlikeye retina daha verimli gen teslim sağlar. Immunohistokimyası ve kan-DNA analizi ile birleştiğinde bu viral hastalığın araçlar retina engellerin durumuna da ışık tutacaktır.

Hayvan modeli ILM (- B Şekil 2A) yapısındaki düzensizlikler gösterir eğer biz ShH10 kullanarak Müller glial hücrelerin retina iletimini artış bekliyoruz. Örneğin, Dp71 yokluğunda göstermiştir, ShH10 hedefler özel olarak, fakat daha etkili Müller yabani tip farelere 16 (Şekil 2C - F) ile kıyaslandığında, bu fare çizgisinde ILM artan bir geçirgenlik gösteren intravitreal enjeksiyon ile glial hücreleri. RAAV5 da ILM geçirgenlik bir g...

Retina hastalığının hayvan modellerinde kan-retina bariyeri geçirgenliğini ve iç sınırlayıcı membran bütünlüğünü araştırmak için, retinal nöronları ve gliaları etiketlemek için araç olarak birkaç adeno-ilişkili virüs (AAV) varyantı kullandık. Virüs aracılı raportör gen ekspresyonu daha sonra retinal bariyer geçirgenliğinin bir göstergesi olarak kullanılır.

Aracı Olarak Adeno-ilişkili virüs kullanarak Hastalığında Retina Engelleri Eğitim için

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Bu prosedürün genel amacı, retinal hastalıkların hayvan modellerinde kan-retina bariyeri geçirgenliğini ve iç sınırlayıcı membran bütünlüğünü incelemektir. Bu işlem, öncelikle GFP transgeni içeren AAV partiküllerinin vitreusa veya kan dolaşımına enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, enjeksiyonlardan sonra farklı zaman noktalarında kan örneği almaktır.Kan örneklemesi, haftalık in vivo fundus görüntüleme ile tamamlanır. Son adım, retinal düz montajlar ve retinal kriyokesitler üzerinde immünohistokimya gerçekleştirmektir. Nihayetinde, ILM bütünlüğünün göstergesi olan transdüksiyon paternini göstermek ve kan dolaşımındaki AAV partiküllerini tespit etmek için konfokal mikroskopi ve PCR kullanılarak kan-retina bariyerinin geçirgenliği kanıtlanır.Mevcut yöntemlerimiz olan bu tekniğin temel avantajı, AAV pasta yönteminin diğer hücreler tarafından sağlanamayan kan-retina bariyeri geçirgenliği hakkında bilgi vermesidir. Bu tekniğin etkileri, kan-retina bariyerinin AAV partiküllerine karşı geçirgenliğini sağlamaya yardımcı olarak istenmeyen yan etkileri önlediği için AAV aracılı gen tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem, diyabetik sıçanlar gibi diğer retina hastalığı hayvan mo

using-adeno-associated-virus-as-tool-to-study-retinal-barriers

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video floxed Rac1 allel taşıyan birincil fare embriyonik fibroblastlar bulaştırmak için Cre recombinase gen taşıyan bir adenovirüs kullanın.

Kültür İlköğretim Fare Embriyonik Fibroblastlar Sinyal Molekülleri Adenovirüs aracılı Genetik Kaldırma

Kaynak: Vacca, O., et al. Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease. J. Vis. Exp. (2015)Bu video, bozulmuş retinal bariyerler boyunca adeno-ilişkili virüs geçirgenliğini görselleştirmek için fare retinal kriyokesitlerinin hazırlanmasına yönelik adım adım prosedürü göstermektedir.

Adeno-ilişkili Virüsün Retinal Geçirgenliğinin Değerlendirilmesi için Fare Retinal Kriyokesitlerinin Hazırlanması

Kaynak: Vacca, O., et al. Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease. J. Vis. Exp. (2015).Bu video, transgenik bir fare retinasında AAV aracılı gen aktarımı yöntemini ve ardından iç sınırlayıcı membran bütünlüğünü değerlendirmek için yapılan doku diseksiyonu ve boyama işlemlerini göstermektedir.

Bozulmuş Retinal Membran Bütünlüğünün Görselleştirilmesi için AAV Aracılı Gen Aktarımı

Bu video, floresan kalsiyum indikatörü taşıyan Adeno-İlişkili Virüsler ile birincil fare orta beyin nöronlarının enfekte edilmesini gösterir. İndikatörün floresansı, başarılı enfeksiyonu doğrular ve nöronal enfeksiyonun gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Birincil Fare Orta Beyin Nöronlarını Tasarlanmış Adeno İlişkili Virüslerle Enfekte Etmek

Subretinal enjeksiyon, fare gözündeki retina pigment epiteline etkili gen iletimi için kullanılan cerrahi bir tekniktir.  Burada, deneysel farelerde viral vektörlerin retina pigment epiteline subretinal enjeksiyonu için kolay ve tekrarlanabilir bir yöntem açıklanmaktadır.

Fareler Retina Pigment Epitel Gen Tedavisi için Viral Vektörler Limbal Yaklaşım-Subretinal Enjeksiyon

Fareyi bir geniş ölçekli merkezi sinir sistemi gen teslimi için yöntemleri kaplıdır. Bu örnekte, amacı tüm omurilik etkileyen bir hastalık taklit etmektir. Yaygın iletim bir terapötik protein MSS için bir kerelik, Çevre Yönetimi'nden teslim etmek için kullanılabilir.

Yöntemleri ve merkezi sinir sistemi iletim değerlendirilmesi ve Adeno ilişkili virüs fareler için intravenöz Yönetim için ipuçları

Burada, postnatal fare retinal eksplantlarında nörit morfogenezini hızlandırılmış konfokal mikroskopi ile araştırmak için bir yöntem sunuyoruz. Membran hedefli floresan proteinlerini Cre'e bağımlı bir şekilde eksprese eden rekombinant adeno ilişkili virüs vektörlerini kullanarak retina hücre tiplerinin ve ince süreçlerinin seyrek etiketlenmesi ve edinilmesi için bir yaklaşım tanımladık.

Genetik Olarak Hedeflenmiş Retinal Hücre Popülasyonlarının Seyrek Adeno İlişkili Virüs Etiketlemesi Kullanılarak Nöronal Arborizasyonun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Bu yazıda, subkonjonktival enjeksiyon, mikroenjeksiyon iğneleri ile birlikte infüzyon/geri çekilme şırınga pompası ve gaz geçirmez çıkarılabilir şırıngadan oluşan bir enjeksiyon sistemi kullanılarak farelerde oküler dokular için geçerli bir vektör dağıtım yöntemi olarak gösterilmiştir. Bu enjeksiyon sistemi diğer göz içi uygulama yolları için de uyarlanabilir.

Küçük Hayvan Modellerinde Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin Subkonjonktival Uygulaması

Adeno ilişkili virüs, süspansiyon hücre kültüründe üretilir ve çift iyodiksanol yoğunluk gradyan santrifüjlemesi ile saflaştırılır. Toplam virüs verimini artırmak, virüs çökelme riskini azaltmak ve nihai virüs ürününü daha da konsantre etmek için adımlar dahil edilmiştir. Beklenen nihai titreler 1012 viral partikül/mL'ye ulaşır ve klinik öncesi in vivo kullanım için uygundur.

İn Vivo Uygulamalar için İodiksanol Yoğunluk Gradyan Santrifüjü ile Adeno İlişkili Virüsün Süspansiyon Kültürü Üretimi ve Saflaştırılması

Bu el yazması, optimize edilmiş bir heparin bazlı afinite kromatografisi yöntemi kullanılarak adeno ile ilişkili viral vektörlerin üretilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Ultrasantrifüjleme ihtiyacını ortadan kaldıran basit, ölçeklenebilir ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunar. Elde edilen vektörler, klinik öncesi çalışmalarda değerlerini kanıtlayan yüksek saflık ve biyolojik aktivite sergiler.

Adeno ile İlişkili Viral Vektörlerin Tek Adımlı ve Yarı Otomatik Heparin Afinite Kromatografisi Protokolü ile İzolasyonu

Öğrenin, adeno-ilişkili virüs kullanarak retina hastalıklarında kan-retina bariyeri geçirgenliğini ve iç sınırlayıcı membran bütünlüğünü hayvan modellerinde değerlendirmeyi. Bu yöntem, konfokal mikroskopi ve PCR ile transdüksiyon paternini analiz eder.

Aracı Olarak Adeno-ilişkili virüs kullanarak Hastalığında Retina Engelleri Eğitim için

Daha fazla video keşfet