Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farklı floresan okumalarına dayanan çoğullanmış yüksek verimli biyolojik tahlilleri geliştirmek için memeli hücrelerini floresan olarak barkodlamaktır. Bunu yapmak için, memeli hücrelerinde floresan proteinleri kararlı bir şekilde ifade etmek ve böylece onları barkodlamak için retroviral parçacıklar kullanılır. Daha sonra, klonal barkodlu popülasyonları elde etmek için floresan aktive edilmiş hücre sıralaması yapılır.

Klonal popülasyonlar daha sonra amplifiye edilir, birleştirilir ve birbirlerinden ayırt edilebildiklerini ve bu nedenle aynı anda kullanılabileceklerini doğrulamak için akış sitometrisi ile analiz edilir. Son olarak, barkodlu hücre hatları etiketli tahlil ile dönüştürülür. Proteinler ve biyolojik aktivite, barkodlu kanallardan farklı floresan kanallar kullanılarak izlenir.

Sonuçlar, yüksek verimli bir ortamda çoğullanmış uygulamalar için memeli hücrelerinin floresan çubuk kaplamasının faydasını göstermektedir. Bu tekniğin, antikor veya boyanın dikkatli bir şekilde kalibre edilmesini gerektiren mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, genetik olarak barkodlanmış hücre hatları oluşturulduktan sonra, daha fazla manipülasyon gerektirmemeleri ve ilgilenilen proteinin uzun süreler boyunca ifade edilmesi nedeniyle, biyolojik adaptasyonlar için daha fazla kullanılırlar. Floresan genetik olarak barkodlanmış hücre hatlarının yüzey tahlilleri ile birleştirilmesi, biyolojik fonksiyonları veya etkileri hidro verim formatında bağımsız olarak araştırmamıza olanak tanır.

Örneğimizde, farklı viral substratların çoğullamasını izlemek için floresan genetik çubuk kaplama kullanıyoruz. Tahlil, bölünmeye dahil olan makineleri araştırmak ve yüksek verimli ilaç keşfi için daha fazla kullanılabilir. Transfeksiyondan bir gün önce, 2.5 çarpı 10 ile 10 santimetrelik bir plakayı% 10 FBS ile DMEM'deki altıncı Phoenix GP hücrelerine tohumlayın.

Bu paketleme hücre hattı, trans halinde retroviral partikül oluşumu için tıkaç ve kutup proteinlerini kararlı bir şekilde ifade eder. Transfeksiyon gününde, hücreleri incelemek için parlak alan mikroskobu kullanın. Hücrelerin sağlıklı olması ve transfeksiyon için kullanılacak tek tabakalı bir tabaka halinde plakaya yapışması gerekir.

Daha sonra, DNA transfeksiyon karışımını 125 mikrolitre serumsuz olarak hazırlayın. DMEM. Üç mikrogram veziküler stomatit virüsü zarf glikoprotein vektörü, P-C-I-V-S-V-G ve ilgilenilen floresan protein genini taşıyan üç mikrogram transfer vektörü ekleyin, 15 mikrolitre polieteramin transfeksiyon reaktifi ekleyin ve farklı floresan protein belirteçleri taşıyan viral partiküller elde etmek için karıştırın. Bunu yapmak için her bir transfeksiyonu tercih edilen işaretleyici ile bağımsız olarak gerçekleştirin.

Her bir karışımı, hücrelere ekleyerek inkübasyon transfect'ini takiben oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Damla damla daha sonra plakaları 37 santigrat derecede inkübe edin. İsteğe bağlı olarak, 24 saat sonra, ortamı yedi mililitre taze ortamla değiştirin.

Bu hücre sağlığını iyileştirebilse de, süpernatanttaki viral yükü azaltabilir. Transfeksiyondan 48 saat sonra, virüs parçacıklarını içeren süpernatanı 10 mililitrelik bir şırıngaya aktarmak için bir pipetleyici kullanın. Süzüntüyü iki mililitrelik mikro santrifüj tüplerine dağıtmak için pistona bastırmak için 0.20 mikromolar politetrafloroetilen filtre ile donatılmıştır.

Hemen kullanım için iki mililitrelik bir alikot ayırın. Kalan viral snat ve alikotları buzun üzerine yerleştirin ve altı oyuklu bir plaka tohumunun her bir oyuğuna transdüksiyondan 24 saat önce kullanılana kadar eksi 80 santigrat dereceye aktarın, burada 2.0 ila 3.0 çarpı 10 ila beşinci yapışkan hücreler burada 2, 9, 3 T hücreleri ertesi gün kullanılır. Yapışan hücreleri dönüştürmek için, mevcut ortamı plakadan çıkarın.

Daha önce toplanan viral sinüsün iki mililitresine mililitre poli beyin başına beş mikrogram ekleyin ve karışımı dikkatlice hücrelere ekleyin. Plakaları parfüm ile kapatın. Ardından plakaları asılı bir kovaya yerleştirin.

32 santigrat derecede 120 dakika boyunca 1500 kez G'de santrifüj santrifüjü. Döndürmeden sonra, hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. 24 saat sonra, hücreleri en az 72 saat içinde değiştirin.

İletim sonrası. Transdüksiyon yüzdesini ölçmek için transdüksiyon hücrelerini akış sitometrisi ile analiz etmeye hazırlanın. İlk olarak, negatif kontrol olarak karşılaştırılabilir bir nont transdüksiyonlu hücre hattı kullanarak, kapıların doğru kanallara düzgün şekilde ayarlandığından emin olun.

Kanal voltajı parametresini, negatif popülasyon ilgilenilen her floresan ekseninde 10 ila üçüncü değerinin altında olacak şekilde ayarlayın. Ardından, pozitif floresan kapılarını, negatif kontrolün ötesinde görünen olaylar olarak ayarlayın. Daha sonra dönüştürülmüş hücreleri kullanarak, spesifik floresan kanalı için pozitif yüzdeyi belirleyin.

Hücreleri, bir mililitre% 100 FBS içeren 15 mililitrelik konik tüplere sıralayın. Daha sonra sıralanmış popülasyonları asılı bir kovada döndürün. Rotor santrifüjü: 524 kez G, beş dakika boyunca 32 santigrat derecede G.

Döndürme işleminden sonra, hücreleri bir mililitre taze ortamda yeniden süspanse edin, daha sonra altı santimetrelik bir plaka üzerinde iki mililitre DMEM'de altı hücreye 10 kez tohumlayın. Bu konsantrasyonda, birleşme% 60'ın altındadır ve en az iki gün boyunca büyüme ve bölünmeye izin verecektir. Amplifikasyon için zaman tanımak için hücreleri birkaç gün boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin.

Klonal popülasyonlar, orijinal olarak dönüştürülen veya sıralanan hücrelerden üretilebilir. Bu aşamada sıkı popülasyonları tek tek klonlar yerine seçilen floresansa göre sıralamak, gelecekteki seçim için yedek bir popülasyon sağlar. Gerekirse, ilgilenilen popülasyonlara göre sıralama için kapıları ayarlayın, kapıların en az bir kütük ölçeği aralıklı olduğundan emin olun Otomatik bir hücre biriktirme birimi kullanarak ayırt edilebilir popülasyonlar elde etmek için, tek hücreleri 96 kuyu plakasına sıralayın, kuyucuk başına ortalama bir hücre olacağını unutmayın.

Bazı kuyularda hiç hücre olmayabilir ve diğerlerinde birden fazla Takip Etme olabilir. Sıralama, hücreleri en az iki hafta boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin Tek tek klonları çoğaltmak için. Büyüyen popülasyonların birden fazla hücreden değil, tek tek hücrelerden kaynaklandığından emin olmak için hücreleri mikroskop altında düzenli olarak inceleyin.

Ayrıca, iki hafta geçtikten sonra hücrelerin aşırı büyümediğinden emin olun. Varsayılan klonal popülasyonları akış sitometrisi ile tarayın ve bunları negatif bir kontrol popülasyonu ile karşılaştırın. Gerçek klonal popülasyonlar çok sıkı floresan modellerine sahip olmalıdır.

Popülasyonun ortalama yoğunluğuna ve sıkılığına göre en belirgin şekilde ayrı popülasyonları seçin. Bunları gerektiği gibi yükseltin veya stokları kısa süreler için eksi 80 santigrat derecede %10 DMSO ile donma ortamında veya daha uzun süre sıvı nitrojende saklayın. Daha sonra, klonal popülasyonların çok katlı yüksek verimli bir tarama sisteminde başarılı bir şekilde kullanılıp kullanılamayacağını test etmek.

Ayırt edilebilir absorpsiyon, emisyon spektrumları ve/veya farklı yoğunluklara sahip bir dizi klon seçin ve bunları tek bir tüp tohumunda birleştirin. 50.000 kombine hücre, ayrı tüplerde 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda 200 mikrolitre takviye edilmiş DMEM'de. Akış sitometresinde parametrelerin ve kompanzasyon değerlerinin ayarlanmasında kullanılmak üzere negatif ve tek renkli kontroller hazırlayın.

Ücret değerlerini ayarlayın. Ardından, bağımsız olarak kurulan floresan hücre hatlarının her birinin ayırt edilebildiğinden emin olmak için numuneyi analiz edin. Barkodlu hücre hatlarını biyolojik bir uygulamaya uyarlamak için, önce bir füzyon olarak veya dahili bir ribozom giriş bölgesi aracılığıyla bir etikete veya floresan proteine bağlanacak şekilde tasarlanmış tahlil elemanlarını seçin.

Western blotting akış sitometrisi veya bir mikroskopi ile basit algılama sağlayan Ires. Burada kullanılan sistem, bir HIV zarf proteininin hücrenin yüzeyinde eksprese edildiği, HA ve bayrak etiketlerini açığa çıkaran biyolojik bir testten oluşur. Test proteini, TD domatesini ifade eden barkodlu bir hücrede eksprese edilir.

Proteinin bölünmesi, FSE etiketli bir Anti-Flag antikoru ile boyanarak izlenebilir. Protein parçalanmadığında lekelenme görülür, ancak protein parçalandığında yeşil floresan etiketlemesi artık belirgin değildir. Barkodlu hücrelerde biyolojik tahlili oluşturmak için, bunları tercih edilen tahlil elemanlarını içeren viral partiküllerle transdüksiyon yapın.

Tercih edilen hücrelere viral SUP natin ekleyin ve santrifüjleme ile döndürün. Daha sonra, hücreleri floresan etiketli anti HA antikorları ile inkübe edin. Ardından, ha için pozitif olan tahlil elementleri içerenleri izole etmek için barkodlu hücreleri sıralayın.

Son olarak, farklı barkodlu hücre hatları birleştirildi. Her biri farklı bir substrat taşıyan bir tahlil içerir. Hücrelerin karışımını Anti-Flag ve ZI konjuge antikor ile inkübe edin ve testi geri izlemek için proteinin bölünmesinin meydana gelip gelmediğini belirlemek için akış sitometrisi ile analiz edin, farklı genetik olarak barkodlanmış hücre hatlarının burada ayırt edilebildiği uygun kanaldaki popülasyonları analiz edin veya kodunu çözün.

TD domates için PE kanalı daha sonra, salgı yolunda yüzeyde eksprese edilen proteinlerin bölünmesi için test edilecek pozitif popülasyonu ortaya çıkarmak için fite kanalında analiz ederek substratın doğasını çözer. TD domatesini eksprese etmek için floresan olarak barkodlanmış ve farklı yoğunluklarda üç popülasyona ayrılmış alt T bir hücre. Popülasyonların her biri daha sonra vahşi tip HIV zarf proteini, mutant HIV zarf proteini veya dang virüsünün ekspresyonunu indüklemek için farklı bir retrovirüs ile transdüksiyona tabi tutuldu.

PRM sınır proteini, her biri bayrak ve HA etiketleri ile çevrilidir. Transdüksiyon yapılan hücreler anti HA ve Anti-Flag antikorları ile inkübe edildi. Tasarlanmış tahlil proteininin varlığını doğrulamak için Anti HA boyama yapılırken, parçalanıp ayrılmadığını belirlemek için Anti-Flag boyama yapıldı.

Boyanmamış kombine popülasyonlar akış sitometrisi ile analiz edildiğinde, klonal popülasyonlar TD domates barkoduna göre ayırt edilebilirdi, ancak fite kanalından ayırt edilemedi. Buna karşılık, aynı popülasyonlar flag fite antikoru ile boyandığında, bir popülasyon flagg için pozitifti. Barkodlamaya dayanarak, bu popülasyon, mutant HIV zarfını substratlayan popülasyon olarak kolayca tanımlanabilir.

Şimdi, retro valf teknolojisinin akış sitometrisi ile birlikte nasıl kullanılacağı konusunda çok iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Floresan genetik olarak barkodlu hücre hatları oluşturmak için, multipleks formatta dört biyolojik uygulama, Floresan genetik olarak barkodlu hücreleri multipleks formatta hücre bazlı tahlillerle birleştirme yeteneği, yüksek verim yeteneklerini önemli ölçüde artırır. Hücre hatları oluşturulduktan sonra, onları dondurmak önemlidir.

Sonra onları periyodik olarak çözdürün, yeniden analiz edin ve tekrar serbest bırakın. Floresan genetik olarak barkodlu hücre hatları oluşturmak ilk başta zaman alıcı olsa da, bir kez kurulduktan sonra, gelecekteki uygulamaların tekrarlanabilirliğini ve sağlamlığını önemli ölçüde artırır.