Name: Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Öğrenin, memeli hücrelerini floresan proteinlerle genetik barkodlama yöntemiyle çoklu yüksek verimli biyolojik analizler için nasıl izleyeceğinizi. Retroviral parçacıklar ve akış sitometrisi kullanılarak geliştirilen bu teknik, aynı anda birden fazla hücre popülasyonunun takibini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz retroviral partiküllerin üretimi için Phoenix GP ambalaj hücre hattı sağlamak için Stanford Üniversitesi&#39;nden Dr. Garry Nolan teşekkür etmek istiyorum. Biz td Domates sağlamak için Kaliforniya San Diego Üniversitesi&#39;nden Dr. Roger Tsien teşekkür ederim. Biz de onların hizmet ve yardım için San Diego Devlet Üniversitesi Sitometrisi Çekirdek Tesisi teşekkür etmek istiyorum.

Memeli Hücre, Genetik barkodlama için Viral Üretim ve İletim 1. Hazırlık <ol><li> Bir 10 sm&#39;lik plaka içinde Plaka, 2.5 x 10 6 yapışan hücreler (veya yaklaşık% 50-60 konflüans) Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamında% 10 fetal dana serumu (FCS) (FCS) içinde, transfeksiyondan önce bir gün. Böyle Phoenix-GP (Gary Nolan, Stanford Üniversitesi bir tür hediye) olarak tercih retroviral üretim kullanımlık ambalajlar hücre hattı için. Not: Ambalajlama hücre soyu, trans-retroviral partikül oluşumu için gag ve pol proteinlerini ifade eder. Emin hücreler transfeksiyondan önce, sağlıklı ve bir tek tabaka plakaya uyulması emin olun. </li><li> 24 saat sonra, DNA, bir transfeksiyon karışımı hazırlandı. <ol><li> Serumsuz DMEM 125 ul 3 ug Veziküler Stomatit Virüsü Zarf glikoprotein vektörü (pCI-VSVg) ve ilgili floresan protein genini taşıyan transfer vektörü 3 ug ekleyin. 2 mg / ml (Mix ve polyethylimine 15 ul ekleyin). </li><li> 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı ve damla damla hücrelere ilave edin. Not: Polyethylimine polyplexes oluşumu için, transfeksiyon tepkin maddesi olarak homojen bir DNA karışımına ilave edilir. Farklı floresan protein işaretlerini taşıyan, viral parçacıklar elde etmek için, tercih edilen bir işaretleyici ile bağımsız bir şekilde her transfeksiyon gerçekleştirin. Retroviral transfer vektörü uzunluğu yaklaşık 7 kb ve eğer 10 kb üzerinde paketlenmiş olamaz unutmayın. </li></ol></li><li> 37 ° C&#39;de inkübe edin. Bunun yerine, 30 ° C ya da 32 ° C &#39;de viral üretim yeri plakaları arttırmak için. NOT: 24 saat sonra, transfeksiyon ortamı, taze ortam 7 ml ile ikame edilmiş olabilir, ve bu hücre sağlığını geliştirmek de, bu yüzer viral yükü azaltabilir. </li><li> 48 saat sonra, transfeksiyon, 0.45 uM politetrafluoroetilen filtresi ile yüzer içeren viral parçacıklar ve filtre toplar. Transdüksiyonu için yeni toplanmış virüs süpernatant kullanın. Diğhalde, -80 ° C &#39;de parçalar halinde süpernatan tutmak ve donma-çözülme kaçının. Viral titre her donma-çözülme döngüsü muhtemelen 50% azalacak unutmayın. </li><li> Önce seçim 24 saat Levha hücre hattı iletimine yapışık ise, ya da hemen iletimi yapışmaz ise önce. 2.0 x 10 5-3,0 (burada Huh 7.5.1 ve HEK 293T) x 10 5 yapışık hücre veya 5.0 x 10 5 Tohum 1 x 10 6 yapışmayan hücreler (burada SupT1) oyuk başına bir 6-yuvalı plaka. Not: hücreler transdüksiyon zamanında yaklaşık% 60 bir katışma elde böylece hücrelerin sayısı, özellikle yapışan hücreler için, bu yüzden, transdüksiyonun öncesine tohumlanır üzere kalibre emin olun. </li><li> Tohumlanır hücrelere 5 ug / ml polibren (hexadimethrene bromür) ilave edin ve daha sonra yaklaşık% 20-40, enfeksiyon (burada 2 mi) elde etmek üzere, daha önce toplanmış virüs süpernatant ekleyin. NOT: tasnif herhangi subpopulat yükseltmek için izin verecek gibi İçişleri Bakanlığı ya da enfeksiyon yüzdesi, çoğunlukla keyfihücrelerin iyon. Açıkçası, enfeksiyon daha yüksek bir oran kolaylaştırır ve büyütme sürecini hızlandırır. </li><li> 32 ° C&#39;de 120 dakika boyunca 1500 x g&#39;de asılı kepçeli rotor içinde santrifüj ile hücreleri nakletmek. Inkübasyondan önce, taze ortam ile yıkanarak yapışmayan hücreler tekrar süspansiyon. Yapışık hücreler için, taze medya 24 saat sonrası transdüksiyon ile değiştirin. NOT: Bu üzerinde dökülmesini önlemek için parafilm ile santrifüje önce plakaları mühür tavsiye edilir. Genetik Barkodlanan hücre çeşitliliğini arttırmak için, (aşama 1.4 de elde edilmiş) farklı floresan proteinleri taşıyan viral partikül hücreleri nakletmek. Floresan belirteçler seçerken, onlar enstrümantasyon ile uyumlu olduğundan emin olun ve ayırt floresan parametreler var. </li></ol> Genetik barkodlu Hücre 2. Seçme ve Amplifikasyon <ol><li> Transdüksiyon yüzdesi oranını ölçmek için akım sitometri en az 72 saat sonrası transdüksiyon transduced memeli hücrelerini analiz. Negatif kontrol olarak, kıyaslanabilir transduse hücre çizgisi kullanın. Not: sıralama, tek tek Barkodlanan hücre popülasyonları, ilk iletimi yüksek bir yüzde oranı da saflaştırmak için kullanılabilir edileceği gibi, gerekli olmasa da, amplifikasyon işlemi hızlandırmak gerekir. </li><li> İlgili proteini eksprese eden hücreler elde etmek için seçilen hücre sıralayıcı kullanmaktadır. <ol><li> Bu amaçla, kapıları düzgün sağ kanallar ayarlanır sağlamak. <ol><li> Böylece negatif kontrol ile aynı naif hücre hattını kullanmak ve negatif nüfus her floresan eksende 10 3 değerinin altında olacak şekilde parametre / Kanal voltajını ayarlamak yapmak için. Her floresan kanal için negatif kontrol yukarıda görünen olaylar gibi pozitif floresan için yolluk belirleyin. </li></ol></li><li> Her enstrüman değişebilir farkında olun ve yolluk belirlenmesi için doğru gerilim her exp zorunlu pozitif ve negatif kontroller yaparak, buna göre ayarlanmalıdırerimental kurulum. <ol><li> Bu deneysel kurulum floresan tespiti için td Domates için eGFP için FITC kanalı (502 uzun geçiş filtresi ile devam 530/30 bant geçiren filtre), PE kanalı (bir 556 uzun geçiş filtresi ile devam 585/42 bant geçiren filtre) kullanın E2 Crimson için, ve APC kanalı (660/20 bant geçiren filtre). NOT: E2 Crimson 633 nm lazer ile heyecan ise 488 nm lazer eGFP ve td Domates heyecanlandırıyor. </li></ol></li></ol></li><li> % 100 FCS 1 ml sırala içine 15 ml konik tüpler. NOT: biri doğrudan bireysel klonlar (aşağıya bakınız) sıralama ile devam edebilirsiniz gibi floresan hücre popülasyonlarının sıralama süreci zorunlu değildir. Seçilen floresan dayalı sıkı popülasyonları sıralama bireysel klonların gelecekteki seçimi için bir yedekleme nüfusu sağlar. Tek tek hücreler bazen hücrelerin büyük bir nüfus kolaylıkla dondurulmuş ve çözülmüş sonra ve bir sonraki aşamada amplifiye edilebilir ise büyümeye zor olduğunu aklınızda bulundurun. </li><li> Sp5 dakika boyunca 32 ° C&#39;de 524 g asılı kepçeli rotor santrifüj sıralanmış popülasyonlarının aşağı hücrelerini pellet haline getirmek. Taze ortam 1 ml yeniden askıya ve bu hücre birleşmesi, en az iki gün boyunca büyümesini ve bölünmesini sağlamak için% 60&#39;ın altında olduğu, böylece hücreler plaka yeniden. <ol><li> Örneğin, 6-çukurlu plaka içinde gözenek başına ortam 2 ml yaklaşık 3 x 10 5 hücre ve 6 cm plaka ortam, 2 ml, 2 x 10 6 hücre plaka yapışan hücreler. Yapışmayan hücreler için yapışkan hücreleri ve RPMI için DMEM kullanarak (veya herhangi bir belirli bir ortamda gerekirse). Büyümesine olanak sağlamak için bir kaç gün boyunca 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde kaplama hücreleri yerleştirin. </li></ol></li></ol> 3. Farklı şiddetler de Genetiği barkodlu Hücreleri ile klonal popülasyonları elde <ol><li> Başlangıçta transdüse hücrelerden klonal popülasyonları elde (1.7 adım) veya sıralı nüfustan (adım 2.3). Not: Bu, tüm hücrenin arasında floresan protein ifade eşit veya benzer seviyede sağlayacaknüfus içinde in (% 40 ortalama floresan yoğunluğunda küçük CV ile sıkı bir nüfus). <ol><li> Bu amaçla, bir otomatik hücre yerleştirme birimi (ACDU) ile 96-çukurlu plakalara tür tek hücre. Ilgi nüfusa göre sıralama için kapıları ayarlayın. Emin olun kapıları farklı floresan yoğunluklarda hücreleri seçerken ayırt popülasyonları elde etmek dışında en az bir günlük ölçekli ayarlanır. Burada gösterilen prosedür için, adım 2.2 tarif biri olarak kurmak deneysel sitometri aynı akışını kullanın. </li></ol></li><li> En az 2 hafta boyunca 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde tek tek klonlar yükseltin. Amplifikasyon işlemi ile artan nüfus birden fazla tek tek hücrelerden kaynaklanan olup sağlamak için mikroskop altında hücre analiz eder. NOT: sıralayıcı ortalama kuyu başına bir hücre yerleştirir, ve bazı kuyular hiç bir hücreyi olmayabilir iken, diğerleri birden fazla olabileceğini unutmayın. <ol><li> Bir po sağlamakpulation sadece plaka ile son derece nazik olun ve pipetleme kuyu rahatsız asla bir hücreden doğar. Mikroskop altında, iyi tarafından da, plaka gözlemleyin. NOT: tek tek hücreler bazen onlar kolayca tanınabilir olacaktır bölen başladığınızda, tespit etmek zor olsa da. </li><li> Kenarları boyunca sık sık hücrelerin yığın &#39;farkında olun. Birden klonal popülasyonları görülebilir bu kuyuları atın ve bir sıkı nüfusa sahip olanlar tutmak. Not: Bu, büyütme için büyük plakalar halinde olan transfer tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Flow sitometri ile analiz ederek varsayılan klonal popülasyonları Ekran. Deney düzeneği sitometri aynı akışını kullanan bir negatif kontrol onları karşılaştırın. <ol><li> Numunenin sadece bir yüzdesini analiz ve yedekleme gibi geri kalanı tutmak. Ortalama yoğunluğu ve nüfus gerginlik dayalı en belirgin ayrı popülasyonları seçin. Bunları gerektiği gibi yükseltmek veya hisse senetleri dondurmadaha uzun bir süre veya sıvı azot kısa bir süre için, -80 ° C&#39;de% 20 gliserol ile ortam dondurulması. NOT: Bir &#39;gerçek&#39; klonal nüfus çok sıkı bir floresan desen olması gerektiğini unutmayın. </li></ol></li></ol> 4. (HTS) Yüksek Verimli Tarama için Çoklama Yetenekler olun <ol><li> Bundan başka, bir çok katlı bir biçimde kullanılabileceği gerektiği kadar farklı klonal popülasyonları birleştirin. Ayırt absorpsiyon / emisyon spektrumları ve / veya farklı şiddetlerde ile klonlar seçin. 96 kuyucuklu plak format HTS için uygun olan, kullanılırsa, 200 ul içinde 50,000 hücre tohum ile sabitleştirilir. NOT: hücrelerin sayısı sadece bir tahmindir ve hücre tipi bağlı olarak değişebilir ve yapışık olup olmadığını unutmayın. </li><li> Bağımsız kurulan floresan hücre çizgilerinin her biri birbirinden ayırt edilebilir sağlamak için akış sitometrisi ile analiz edin. Analizden önce negatif hazırlamakve tek renk kontrolleri parametre ve tazminat değerlerini ayarlamak için. NOT: açıkça sağlayacak karışık popülasyonları ayırt etmek parametrelerinin ayarlanması ayrıca bir çoğaltılmış biçimde kullanılmak üzere. </li></ol> 5. Seçim Biyolojik Uygulama Genetiği Barkodlu Hücre Hatları Uyum <ol><li> Stolp ve diğ., 2013, 59 burada tarif edildiği gibi tercih edilen deney öğeleri içeren virüs partikülleri ile oluşturulan genetik barkodlanmaktadır hücre hatları, transdüksiyonu. Tercih edilen deney, ayrı ve ayırt floresan kanal yer alması gerektiği unutmayın ve bu nedenle, uygun Barkodlanan hücre hattına transfer edilmelidir. NOT: Her barkodlu hücre çizgisi farklı bir tahlil taşıyabilir. </li><li> Tahlil unsurları içeren olanlar için Sıralama genetik floresan barkodlu hücreler. Not: Deney elemanları F (bir füzyon olarak ya da dahili ribozom giriş bölgesi ile), bir etiket ya da fluoresan proteine ​​bağlanmış mühendisliği ile elde edilebilirya da basit bir tespiti, Western blot yoluyla sitometrisi veya mikroskopi akar. Bu protokolde kullanılan sistem tek başına HA epitop yüzey ifadesi dayanır, ya da ek FLAG epitop ifadesi. <ol><li> HA ve APC-floresan akuple antikorlar ile tahlil içeren klonal popülasyonları Leke. Sonra, anti-FLAG ve FITC-konjuge antikor boyama ile klonal popülasyonları analiz. </li><li> Tahlil geri izlemek için, analiz veya &#39;kod çözme&#39; farklı genetik barkodlu hücre hatları ayırt edilebilir uygun kanalda popülasyonları. Burada, td Domates tespiti için PE kanalında analiz alt tabakanın doğasını çözmek. </li></ol></li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

İşte iki köklü prosedürler kombine edilmiş; retroviral teknoloji ve flow sitometri kullanılarak floresan proteinlerin tespiti yoluyla genetik mühendisliği. Benzersiz hücre çizgilerinin üretimi için floresan protein bazlı bir genetik barkod çok katlı uygulamalar için sağlam ve basit bir yol sağlar. Retroviral teknoloji ile genetiği barkodlu hücreleri üreten, başlangıçta uzun bir süreçtir, ama bir kez, hücre malzeme güvenilir ve istikrarlı bir kaynak kurulan elde etmesini sağlar. Bu teknolojinin doğası sürekli kendi gerçe...

Böyle floresan spektroskopisi, floresan mikroskopi ve akım sitometri gibi teknolojiler, tüm floresan güveniyor, bir özellik yaygın, biyokimyasal biyomedikal ve kimya uygulamalarında kullandı. Floresan, içsel veya etiketleme yoluyla protein ekspresyonu ve profilleri, hücre kaderi, protein etkileşimleri ve biyolojik fonksiyonların 1-9 analizi için istismar ve olup olmadığını biyomolekülün etkileşimleri ve yapısal değişikliklerin tespiti için floresan / Förster rezonans enerji transferi yoluyla 10-13. Aequorea victoria yeşil flüoresan protein (GFP) 14 izolasyonu yana, diğer cnidarians, özellikle mercanlar ek doğal olarak oluşan floresan proteinlerin keşif, büyük ölçüde ayırt uyarma / emisyon spektrumları ile mevcut floresan proteinleri sayısı arttı. Bunlar, birlikte genlerinde 15-19 mutasyonların tanıtımıyla, have daha da araştırmaları için sitometri ve diğer floresan-tabanlı teknolojileri akış, mikroskopi istismar bilim adamları mevcut floresan proteinlerin gerçek bir palet elde, olanakları genişletti. Buna paralel olarak, bağımsız olsa da, retroviral teknolojinin gelişmesi büyük ölçüde memeli hücrelerinde 20-23 ektopik genetik bilginin istikrarlı ifadesini kolaylaştırmıştır. Bu teknolojinin, hücre tipi ve dokusunda 24-28 geniş bir dizi halinde ya da transgenik hayvanların 29-31 üretimi için floresan protein gen transferi için kullanılmış olması şaşırtıcı değildir. Retrovirüslerin doğası sonra, dış floresan protein genetik bilgi hücrenin 32 genomu içinde ilave edilir ve hücre ever&#39; `için floresan olur. Bu özellik, hücre kader izleme izin veya hücrelerin bir nüfus içinde tek bir hücrenin etti. Şimdi floresan hücre böylece acqui vardırkendi biosignature kırmızı ve barkodlanmaktadır olarak tanımlanabilir. Eşsiz biosignature diğer hücrelerden tanımlar, ve daha da önemlisi, genetik olarak ayırt emme / yayma spektrumlarının farklı floresan proteinleri ifade etmek için manipüle edilmiş hücrelerden ayıran. Bu tür pluripotensin 33 doğru yeniden programlama faktörleri izleme gibi biyolojik uygulamaları çekirdekçik lokalizasyonu 34 açıklanması için çekirdek içi faktörlerin analizi, transkripsiyonel çalışmaları 35 veya nöronal ağ mimarisi 36 çalışma için nöronların genetik etiketlemesi için flüoresan raportör plasmidlerin yapımı Aynı deney düzeneği için farklı floresan protein genleri istismar var birçok sadece dört örnekleridir. Sitometrisi geniş olarak gen ekspresyonu, hücre döngüsü, apoptoz gibi tek hücre düzeyinde biyolojik süreçlerin analizi için kullanılmıştır ve fosforil yoluyla sinyal edilmiş debiMemeli hücrelerinde floresan protein genlerinin tirme 37-43 .The stabil ekspresyon ayrıca hücre analizi 38,44 ve ligand-reseptör etkileşimleri 45 için akış sitometrisi kullanımını artırmıştır. Gelişmiş yetenekleri sitometri yüksek verimli ve yüksek içeriği 46 taranması için yaygın kullanılan metodoloji haline akışını sağladı. Çift plaka okuyucu sistemleri, görüntüleme ve sitometri akabilir Fluorometreler ve robotik teknolojileri artık genişletilmiş sayısına rağmen, istismar ve bu gelişmiş teknolojik yetenekleri sığabilecek deney tasarımında bir eksiklik var gibi görünüyor. Hızlı, güvenilir, basit ve sağlam hücre bazlı yöntemler büyük ölçüde daha yüksek verimli kapasitesini artırmak çoğaltılmış çok katlı uygulamalarda ihtiyaç vardır. Çoklanmış biçimde mühendislik hücre bazlı deneyler, yüksek verimli tarama 39,47-50 gücünü artırabilir burada ilaç keşfi alanında özellikle doğrudur </sup&gt;. O bir örnekte eş zamanlı analizler veriyor gibi Çoklama, daha yüksek verimli yetenekleri 51-54 artırır. Floresan genetik barkodlama zarif çoğullamanın sağlar, fakat aynı zamanda, bir kere mühendislik, zaman alıcı protokollerin gereğini circumvents, antikorlar, boncuk ve lekeleri 39,52,55 eşliğinde maliyetlerini azaltır, ve yüksek için gerekli ekranların sayısını azaltabilir sadece hacimli uygulamalar. Son zamanlarda biyolojik uygulamalarda, daha önce farklı klinik yaygın varyantları 58 ile HIV-1 proteaz aktivitesi 56,57 izlemek için geliştirilen bir analiz ile ifade floresan genetik barkod ile çoğullama geliştirmek nasıl retroviral teknoloji tarif etmişlerdir. metodoloji seçmek ve genetik floresan barkodlu hücreleri yükseltmek ve farklı floresan proteinleri ve / veya farklı floresan intensit ifade klonal popülasyonlarının panelleri üretmek için nasıl nasıl odaklanan bir daha açıklayıcı bir şekilde izah edilirler. Fluoresan özelliklerine göre ayırt hücre popülasyonlarının paneller ayrıca farklı biyolojik soruları ele hücre bazlı tahlillerde ile kombinasyon halinde yararlanılabilir multiplekslenmiş yetenekleri geliştirmek. protokolü de, örneğin 59 gibi, daha önce laboratuar içinde geliştirilen hücre bazlı tahlillerde birini taşıyan Barkodlanan hücrelerin bir panelini mühendislik açıklamaktadır. Bu protokol, böylece genetik transferi için köklü retroviral / lentiviral teknoloji, floresan proteinlerin değeri veya 60,48 flow sitometri uygulamaları göstermek için tasarlanmamıştır değil çoğaltılmış uygulamalar için üç birleştirerek artırıcı gücünü göstermek için.

<table><tbody><tr><td>10 ml şırınga</td><td>BD</td><td>309604</td><td>virüsü 0.45 ve mikro filtrelemek için kullanılır</td></tr><tr><td>; Virüsü filtrelemek için kullanılan m ploytetrafloroetilen filtre</td><td>Pall Corporation</td><td>4219</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı)</td> <td>HEK 293T hücreleri için</td> <td>Corning</td><td>45000-304</td> hücre büyüme ortamı</tr><tr><td>PEI (Polietilamin)</td> <td>poli bilimler</td><td>23966-2</td><td>2 mg / ml konsantrasyon kullanılır</td></tr><tr><td>Asılı kova santrifüjü (soğutulmuş)</td> <td>Eppendorf</td><td>5805 000.017</td> için <td>kullanılır spin enfeksiyonu</td></tr><tr><td>PBS (fosfat tamponlu salin)</td><td>Hücrelerin yıkanması için kullanılan</td> <td>Corning</td><td>21-040-CV</td></tr><tr><td>Polibren (heksadimethreen bromür)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689</td><td>Viral enfeksiyon etkinliğini artırmak için kullanılır. 5 & mikro'da kullanılır; g / ml konsantrasyonu.</td></tr><tr><td>Hücre popülasyonlarını sıralamak için kullanılan</td> <td>FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>cihazı Hücre analizi için kullanılan</td><td>FACSCanto</td><td>BD Biosciences</td><td></td> cihazı</tr><tr><td>Phoenix-GP</td><td>Gary Nolan'dan</td><td></td> hediye <td>retroviral partiküller üretmek için kullanılan hücre hattı</td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>Mediatech</td><td>MT35015CV</td><td>hücre büyümesi ve SupT1 hücrelerinin sıralanması için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-1942</td><td>İnsan T lenfoblastları</td></tr><tr><td>HEK 293T hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>SupT1 hücreleri için SV40 büyük T-antijeni RPMI</td></tr><tr><td>1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td>hücre büyüme ortamını</td></tr> da içeren İnsan Embriyonik Böbrek hücreleri</tbody></table>

multiplexed uygulamaları için floresan proteinleri ile genetik barkodlama

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Floresan proteinler, floresan boyalar ve genel olarak floroforlar moleküler hücre biyolojisi alanında devrim yaratmıştır. Özellikle, floresan proteinlerin ve genlerinin keşfi, lokalizasyon için protein füzyonlarının mühendisliğini, transkripsiyonel aktivasyonun analizini ve ilgilenilen proteinlerin translasyonunu veya tek tek hücrelerin ve hücre popülasyonlarının genel olarak izlenmesini sağlamıştır. Floresan protein genlerinin retroviral teknoloji ile birlikte kullanılması, bu proteinlerin memeli hücrelerinde kararlı ve güvenilir bir şekilde ekspresyonuna izin vermiştir. Burada, bu genlerin, bir hücre popülasyonu içindeki hücrelere kendi biyo-imzalarını vermek için nasıl kullanılabileceği gösterilmektedir. Retroviral teknoloji ile biyoimza elde edildiğinden, hücreler 'süresiz' olarak barkodlanır. Bu nedenle, barkodlu hücrelerin bir karışımı içinde ayrı ayrı izlenebilir ve daha karmaşık biyolojik uygulamalarda kullanılabilirler. Bir hücre karışımındaki farklı popülasyonların izlenmesi, çok sayıda hedefe karşı ilaçların keşfi veya farklı promotörlerin aktivasyon profili gibi çoğullanmış uygulamalar için idealdir. Protokol, farklı genetik floresan belirteçlere sahip barkodlu memeli hücrelerinin nasıl zarif bir şekilde geliştirileceğini ve çoğaltılacağını ve aynı anda birkaç işaretleyicinin veya farklı yoğunluklarda bir işaretleyicinin nasıl kullanılacağını açıklar. Son olarak, protokol, çoğullama yoluyla analiz gücünü artırmak için hücrelerin hücre bazlı tahlillerle birlikte nasıl daha fazla kullanılabileceğini açıklar.

Çoğullama floresan genetik bireysel klonal popülasyonları üretilmiş olan sadece bir kere elde edilebilir biyolojik uygulamalarda amacıyla hücreler barkodlanmaktadır. Barkodlu popülasyonlar az spektral örtüşme net farklı floresan özelliklere sahip olduğunda Çoğullama en etkilidir. Memeli SupT1 hücrelerinin klonal popülasyonları, Şekil 1 &#39;de gösterilen örnek mCherry ve siyano floresan proteini (CFP) ile Barkodlanan hücreleri kolayca bireysel floresan özelliklerini kaybetmeden eş zamanlı olarak analiz ...

Yeşil floresan protein geninin keşfinden bu yana, floresan proteinler moleküler hücre biyolojisini etkilemiştir. Bu protokol, genetik mühendisliği yoluyla farklı floresan proteinlerin ekspresyonunun, tek tek hücreleri barkodlamak için nasıl kullanıldığını açıklar. Prosedür, çoğullanmış uygulamalar için ideal olan bir hücre karışımındaki farklı popülasyonların izlenmesini sağlar.

Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farklı floresan okumalara dayanan multiple yüksek kapasiteli biyolojik analizleri geliştirmek amacıyla memeli hücrelerini floresanla barkodlamaktır. Bunu gerçekleştirmek için, memeli hücrelerinde floresan proteinlerin stabil bir şekilde eksprese edilerek hücrelerin barkodlanması amacıyla retroviral partiküller kullanılır. Ardından, klonal barkodlanmış popülasyonlar elde etmek için floresan aktive hücre ayıklama işlemi gerçekleştirilir.Ardından klonal popülasyonlar amplifiye edilir, birleştirilir ve birbirlerinden ayırt edilebildikleri, dolayısıyla eş zamanlı olarak kullanılabilecekleri akış sitometrisi ile doğrulanır. Son olarak, barkodlu hücre hatlarına etiketli assay transduksiyonu yapılır. Proteinler ve biyolojik aktivite, barkod kanallarından farklı floresan kanallar kullanılarak izlenir.Sonuçlar, memeli hücrelerin floresan barkodlanmasının yüksek verimli bir ortamdaki çoklu uygulamalar için faydasını kanıtlamaktadır. Bu tekniğin, antikor veya boyanın dikkatli kalibrasyonunu gerektiren mevcut yöntemlere göre temel avantajı, genetik olarak barkodlanmış hücre hatları oluşturulduktan sonra başka bir işlem gerektirmemeleri ve ilgilenilen protein uzun süreler boyunca eksprese edildiği için biyolojik adaptasyonlar için daha fazla kullanılabilmeleridir. Floresan genetik barkodlu hücre hatlarının yüzey analizleri ile birleştirilmesi, biyolojik fonksiyonların veya etkilerin yüksek verimli bir formatta bağımsız olarak incelenmesine olanak tanır.Örneğimizde, farklı viral substratların kesilmesini çoklu olarak izlemek için floresan genetik barkod kaplaması kullanıyoruz. Bu analiz, kesilmede rol oynayan mekanizmaları araştırmak ve yüksek kapasiteli ilaç keşfi için daha fazla kullanılabilir. Transfeksiyondan bir gün önce, 10 santimetrelik bir plakaya %10 FBS içeren DMEM içerisinde 2,5 × 10⁶ Phoenix GP hücresi ekleyin.Bu paketleme hücre hattı, geçici transfeksiyonla retroviral partikül oluşumu için gag ve pole proteinlerini stabil olarak eksprese eder. Transfeksiyon gününde, hücreleri incelemek için bir aydınlık alan mikroskobu kullanın. Transfeksiyon için kullanılabilmeleri için hücrelerin sağlıklı olması ve plakaya monotabaka halinde yapışmış olması gerekir.Ardından, serumsuz DMEM içerisinde 125 mikrolitre olacak şekilde DNA transfeksiyon karışımını hazırlayın. Üç mikrogram veziküler stomatit virüsü zarf glikoproteini vektörü, P-C-I-V-S-V-G, ve ilgilenilen floresan protein genini taşıyan üç mikrogram transfer vektörü ekleyin; ardından 15 mikrolitre polieteramin transfeksiyon reaktifi ekleyerek farklı floresan protein belirteçleri taşıyan viral partiküller elde etmek için karıştırın. Bunu gerçekleştirmek için her bir transfeksiyonu seçilen belirteç ile bağımsız olarak gerçekleştirin.Her bir karışımı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin; inkübasyonun ardından karışımı hücrelere damla damla ekleyerek transfekte edin. Ardından plakaları 37 °C'de inkübe edin. İsteğe bağlı olarak, 24 saat sonra besiyerini yedi mililitre taze besiyeri ile değiştirin.Bu durum hücre sağlığını iyileştirebilse de, süpernatanttaki viral yükü azaltabilir. Transfeksiyondan 48 saat sonra, virüs partiküllerini içeren süpernatantı bir pipet yardımıyla 10 mililitrelik bir şırıngaya aktarın. Filtresi 0.20 micromolar politetrafloroetilen filtre olan şırınganın pistonunu bastırarak filtratı iki mililitrelik mikro santrifüj tüplerine dağıtın.Hemen kullanım için iki mililitrelik bir alikotu ayırın. Kalan viral stok ve alikotları buz üzerinde tutun ve transdüksiyondan 24 saat öncesine kadar -80 °C'de saklayın. Altı kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna 2,0 ila 3,0 × 10⁵ adherent hücre ekin; burada 293T hücreleri kullanılmıştır. Ertesi gün, adherent hücreleri transdüse etmek için plakadaki mevcut medyumu uzaklaştırın.Önceden toplanan 2 mL viral süpernatanta mililitre başına 5 µg poly brain ekleyin ve karışımı hücrelere dikkatlice ilave edin. Plakaları parafilm ile mühürleyin. Ardından plakaları asılı bir kovaya yerleştirin.Santrifüjü 1500 ×g kuvvetinde, 32 °C'de 120 dakika boyunca çalıştırın. Santrifüj işleminden sonra hücreleri 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında inkübe edin. 24 saat sonra, hücre besiyerini en az 72 saat boyunca yenileyin.Transdüksiyon sonrası. Transdüksiyon yüzdesini belirlemek için transdükte edilmiş hücrelerin akış sitometrisi ile analizine hazırlanın. Öncelikle, negatif kontrol olarak benzer bir transdükte edilmemiş hücre hattı kullanarak, kapıların (gate) doğru kanallarda uygun şekilde ayarlandığından emin olun.Parametre kanal voltajını, ilgilenilen her floresan ekseninde negatif popülasyon 10³ değerinin altında olacak şekilde ayarlayın. Ardından, pozitif floresans geçitlerini (gate), negatif kontrolün ötesinde görünen olaylar olarak belirleyin. Daha sonra, transduksiyona uğramış hücreleri kullanarak ilgili floresan kanalındaki pozitiflik yüzdesini belirleyin.Hücreleri, bir mililitre %100 FBS içeren 15 mililitrelik konik tüplere sıralayın. Ardından, sıralanmış popülasyonları asılı bir kovada çöktürün. Santrifüj rotorunu 32 °C'de 524 ×g hızında beş dakika boyunca çalıştırın.Santrifüj işleminden sonra hücreleri bir mililitre taze besiyerinde yeniden süspande edin, ardından 6 cm'lik bir plakadaki 2 ml DMEM içerisine 2 × 10⁶ hücre ekin. Bu konsantrasyonda konfluens %60'ın altında kalacak ve en az iki gün boyunca büyüme ve bölünmeye olanak tanıyacaktır. Amplifikasyon için zaman tanımak amacıyla hücreleri birkaç gün boyunca 37 °C'deki bir inkübatöre yerleştirin.Klonal popülasyonlar, orijinal olarak transdükse edilmiş hücrelerden veya sort edilmiş hücrelerden üretilebilir. Bu aşamada, bireysel klonlar yerine seçilen floresansa dayalı sık popülasyonların sort edilmesi, gelecekteki seçimler için yedek bir popülasyonun sağlanmasını garanti eder. Gerektiğinde, sort işlemi için kapıları (gate) ilgilenilen popülasyonlara göre ayarlayın ve kapıların en az bir log ölçek kadar ayrı olduğundan emin olun. Otomatik bir hücre yerleştirme birimi kullanarak ayırt edilebilir popülasyonlar elde etmek için tek hücreleri 96 kuyucuklu plakalara sort edin; kuyucuk başına ortalama bir hücre düşeceğini unutmayın.Bazı kuyucuklarda hiç hücre bulunmayabilir, bazılarında ise birden fazla hücre olabilir. Ayıklama işleminin ardından, tekil klonları çoğaltmak için hücreleri 37 °C'de en az iki hafta inkübe edin. Büyüyen popülasyonların birden fazla hücreden değil, tekil hücrelerden kaynaklandığından emin olmak için hücreleri düzenli olarak mikroskop altında inceleyin.Ayrıca iki hafta geçtikten sonra hücrelerin aşırı büyümediğinden emin olun. Muhtemel klonal popülasyonları akış sitometrisi ile tarayın ve bunları negatif kontrol popülasyonu ile karşılaştırın. Gerçek klonal popülasyonlar çok dar floresan paternlerine sahip olmalıdır.Ortalama yoğunluk ve popülasyon sıkılığına göre en belirgin şekilde ayrışmış popülasyonları seçin. İhtiyaç duyuldukça bunları çoğaltın veya stokları kısa süreler için negatif 80 degrees Celsius'ta %10DMSO içeren dondurma ortamında ya da daha uzun süreler için sıvı azot içinde saklayın. Ardından, klonal popülasyonların çoklu yüksek kapasiteli tarama sisteminde başarıyla kullanılıp kullanılamayacağını test edin.Belirgin absorbsiyon, emisyon spektrumları olan ve/veya farklı yoğunluklara sahip bir dizi klon seçin ve bunları tek bir tüp tohumda birleştirin. Birleştirilen hücrelerden 50,000 adedini, 200 µL takviyeli DMEM içinde, 96 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna ayrı tüplerden ekleyin. Akış sitometresindeki parametreleri ve kompanzasyon değerlerini ayarlamak için kullanılacak negatif ve tek renkli kontrolleri hazırlayın.Kompansasyon değerlerini ayarlayın. Ardından, bağımsız olarak oluşturulan floresan hücre hatlarının her birinin ayırt edilebildiğinden emin olmak için örneği analiz edin. Barkodlu hücre hatlarını biyolojik bir uygulamaya uyarlamak için, öncelikle bir etikete veya floresan proteine füzyon olarak ya da internal ribozom giriş bölgesi (IRES) aracılığıyla bağlandıkları şekilde mühendisliği yapılmış assay elementlerini seçin.Western blotting, akış sitometrisi veya mikroskopi yoluyla kolay tespit sağlayan Ires. Burada kullanılan sistem, bir HIV zarf proteininin hücre yüzeyinde eksprese edildiği ve HA ile flag etiketlerinin açığa çıktığı bir biyolojik analizden oluşmaktadır. Analiz proteini, TD tomato eksprese eden barkodlu bir hücrede eksprese edilmektedir.Proteinin kesimi, FSE işaretli Anti-Flag antikoru ile boyama yapılarak izlenebilir. Protein kesilmediğinde boyama görülür, ancak protein kesildiğinde yeşil floresan işaretleme artık belirgin değildir. Barkodlu hücrelerde biyolojik testi kurmak için, hücreleri seçilen test elemanlarını içeren viral partiküllerle transduce edin.Seçilen hücrelere viral SUP natin ekleyin ve santrifüjle döndürün. Ardından, hücreleri floresan işaretli anti HA antikorları ile inkübe edin. Son olarak, HA için pozitif olan assay elementlerini içeren hücreleri izole etmek için barkodlanmış hücreleri ayrıştırın.Son olarak, her biri farklı bir substrat içeren bir deneye sahip olan, farklı barkodlanmış hücre hatları birleştirildi. Hücre karışımı Anti-Flag ve ZI konjuge antikor ile inkübe edildi ve protein kesilmesinin gerçekleşip gerçekleşmediğini belirlemek amacıyla akış sitometrisi ile analiz edildi; böylece deneye geri dönüldü ve farklı genetik barkodlu hücre hatlarının ayırt edilebildiği uygun kanalda popülasyonlar analiz edildi veya çözümlendi.TD tomato için PE kanalı kullanılır, ardından salgı yolu üzerindeki yüzeyde eksprese edilen proteinlerin kesilmesini analiz etmek amacıyla fite kanalında analiz yapılarak substratın doğası çözülür ve pozitif popülasyon ortaya çıkarılır. Sub T one hücreleri, TD tomato eksprese etmek üzere floresan barkodlanmış ve farklı yoğunluklarda üç popülasyona ayrılmıştır. Ardından her bir popülasyona, vahşi tip HIV zarf proteini, mutant HIV zarf proteini veya dengue virüsünün ekspresyonunu indüklemek için farklı bir retrovirüs ile transdüksiyon yapılmıştır.Her biri flag ve HA etiketleri ile çevrelenmiş PRM sınır proteini. Transdükte edilen hücreler, anti HA ve Anti-Flag antikorları ile inkübe edildi. Mühendislik ürünü analiz proteininin varlığını doğrulamak için anti HA boyaması, proteinin parçalanıp parçalanmadığını belirlemek için ise Anti-Flag boyaması gerçekleştirildi.Boyanmamış kombine popülasyonlar akış sitometrisi ile analiz edildiğinde, klonal popülasyonlar TD domates barkodu temelinde ayırt edilebilmiş, ancak fit kanalında ayırt edilememiştir. Buna karşılık, aynı popülasyonlar flag fit antikoru ile boyandığında, bir popülasyon flagg için pozitif sonuç vermiştir. Barkodlama temel alındığında, bu popülasyon mutant HIV zarf substratı it taşıyan popülasyon olarak kolayca tanımlanabilir.Artık, retro valf teknolojisinin akış sitometrisi ile birlikte nasıl kullanılacağı konusunda çok iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Floresan genetik barkodlu hücre hatları oluşturmak için, çoklu formatta dört biyolojik uygulama, floresan genetik barkodlu hücreleri çoklu formatta hücre tabanlı analizlerle birleştirme yeteneği yüksek çıktı kapasitesini önemli ölçüde artırır. Hücre hatları oluşturulduktan sonra, onları dondurmak önemlidir.Ardından bunları periyodik olarak çözün, yeniden analiz edin ve tekrar dondurun. Floresan işaretli genetik barkodlu hücre hatları oluşturmak başlangıçta zaman alıcı olsa da, bir kez kurulduğunda gelecekteki uygulamaların tekrarlanabilirliğini ve dayanıklılığını önemli ölçüde artırır.

genetic-barcoding-with-fluorescent-proteins-for-multiplexed

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Oligonükleotid çiftli florasan boncuklar kullanarak bir örnek içinde mikroorganizmaların tespiti için çoklama yöntemi açıklar. Bir örnek içindeki tüm organizmalar Amplikon bir panel prob-çiftli boncuk melezleşmiştir. LUMINEX veya Bio-Plex enstrüman, boncuk, boncuk türü ve hibridizasyon sinyali için her bir sorgu için kullanılır.

Oligonükleotid çiftli Floresan Mikroküreler kullanarak Kompleksi Klinik ve Çevre Örneklerinde Bakterilerin Multiplex Algılama

Tetradların Barkod Etkin Sıralama (BEST), izole bozan ve tetradların aralanması manuel süreçleri değiştirir. İYİ, agar plakaları üzerine sıralama floresan-aktive edilmiş hücre tarafından iki baştan izole cam boncuklar ile çalkalama ile sporlar ayırır ve rasgele dizilmiş koloniler moleküler barkod ile aynı orijinal tetrat türetildi belirler.

İYİ: tetradların Barkod Etkin Sıralama

Bakteriyel Fitness belirlenmesi için bu moleküler tabanlı yaklaşım dijital PCR üzerinden nicelik benzersiz genomik DNA barkodları kullanarak mikroorganizmaların kesin ve doğru algılanmasını kolaylaştırır. Protokol, Salmonella suşları için rekabetçi dizinin hesaplanmasında açıklanmaktadır; Ancak, teknoloji, herhangi bir genetiği değiştirilmiş organizmanın mutlak ölçümlerini gerektiren protokollere kolayca adapte olmaktadır.

Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

Burada fare embriyonik dokularında gen ekspresyonunu profillemek için çok katlı tek hücreli mRNA dizileme yöntemi ni sunduk. Damlacık tabanlı tek hücreli mRNA dizileme (scRNA-Seq) yöntem çoklama stratejileri ile birlikte aynı anda birden fazla örnekten tek hücre profili olabilir, hangi önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve deneysel toplu etkileri en aza indirir.

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Çok katlı barkodlama görüntü analizi son zamanlarda tümör mikroçevresinin karakterizasyonunu geliştirmiş ve hücre kompozisyonu, fonksiyonel durum ve hücre-hücre etkileşimleri hakkında kapsamlı çalışmalara izin vermiştir. Burada, oligonükleotid konjuge antikorların barkodlamasını ve siklus görüntülemeyi kullanarak, yüksek boyutlu bir görüntü analiz tekniğinin kullanılmasına izin veren bir boyama ve görüntüleme protokolünü tanımlıyoruz.

Parafin doku örneklerinin tek hücreli analizinde immünoprofilleme ve mekansal haritalama karakterizasyonu için çoklanmış barkodlama görüntü analizi

Bu rapor, otomatik bir slayt boyayıcı üzerinde multipleks immünofloresan (mIF) testleri için otomatik bir protokolü açıklar. Translasyonel araştırmalarda çok sayıda doku slaytında özel mIF tahlilleri için ideal olan standart yüksek verimli doku otomatik boyalayıcıları ve tam slayt floresan görüntüleyiciler üzerinde uzamsal proteomiklerin yüksek tekrarlanabilirliğini gösterir.

Translasyonel Araştırmalar için Yüksek Verimli Otomatik Multipleks İmmünofloresan Testleri

Bu protokol, murin FFPE melanom dokularının DNA barkod tabanlı görüntülenmesi için bir multipleks immünofloresan antikor paneli tasarlamak için adım adım bir kılavuz sağlar. Ayrıca, murin melanom tümörü bağışıklık mikro ortamına ilişkin uzamsal proteomik içgörüler oluşturmak için açık kaynaklı araçlar kullanan bir görüntü analizi boru hattını da açıklıyoruz.

Genetik Olarak Yeniden Programlanmış Murin Melanomundan FFPE Örneklerini Analiz Etmek için DNA Barkod Tabanlı Multipleks İmmünofloresan Görüntüleme

Bu protokol, formalin sabit parafine gömülü doku kesitlerinde protein görüntüleme kütle sitometrisi ile multipleks mRNA tespiti için bir metodolojiyi detaylandırır.

Çift modaliteli Moleküler Kartografi: Multipleks mRNA Tespitinin Protein Görüntüleme Kütle Sitometrisi ile Entegre Edilmesi

Öğrenin, memeli hücrelerini floresan proteinlerle genetik barkodlama yöntemiyle çoklu yüksek verimli biyolojik analizler için nasıl izleyeceğinizi. Retroviral parçacıklar ve akış sitometrisi kullanılarak geliştirilen bu teknik, aynı anda birden fazla hücre popülasyonunun takibini sağlar.

Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

Daha fazla video keşfet