Na fonksiyonel karakterizasyonu ⁺ / H ⁺ Seçim Proton-öldürme Kullanma hücre içi Bölmeler ve Eşanjörleri Plazma Membran Them Express

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücre içi olarak eksprese edilen sodyum proton değiştiricilerin aktivitesini ölçmektir. Bu, önce proton öldürme seçimi ile plazma zarındaki hücre içi sodyum proton değiştiricilerini eksprese eden hücrelerin seçilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, seçilen hücreler asitleştirilir ve daha sonra hücrelerin sodyum proton değişim aktivitesini doğrulamak için hücre içi pH geri kazanımı ölçülür.

İyon taşınmasının hızlı kinetiği daha sonra taşınan katyon ve inhibitörler için afinite sabitlerini belirlemek için ölçülür. Sonuç olarak, seçilen somatik hücrelerin hücre içi pH ve hızlı kinetiğindeki değişikliklerin izlenmesi, hücre içi protein değişiminin fonksiyonel karakterizasyonuna izin verir. Bu tekniğin, mutant taşıyıcıları eksprese etme veya hücre başına kullanma gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, beyaz tip hücre içi taşıyıcıların plazma zarında ekspresyonunu mümkün kılarak fonksiyonlarını doğrudan ölçmeyi mümkün

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir araştırma bilimcisi olan Dr.Mallory şair olacak Proton öldürme prosedürüne başlamak için. İlk olarak, 37 santigrat derecede yükleme çözeltisinde ilgilenilen hücre içi sodyum proton değiştiriciyi ifade eden hücreleri ve bir saat boyunca karbondioksit içermeyen bir inkübatörde inkübe edin. Daha sonra, yükleme solüsyonunu aspire edin ve hücreleri iki kez taze ortamla yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra, ortamı aspire edin ve hücreleri karbondioksit içermeyen bir inkübatörde geri kazanım solüsyonunda inkübe edin. Bir saat sonra, geri kazanım ortamını normal kültür ortamı ile değiştirin ve hücreleri standart kültür koşulları altında büyütün. Hücrelerin hücre içi floresan pH'ını görüntülemek için kararlı klonlar ortaya çıkana kadar bu seçim döngüsünü haftada iki kez tekrarlamak.

İlk olarak, uyarma için uygun kuvars nötr yoğunluk filtreleriyle eşleştirilmiş 450 nanometre ve 490 nanometre dar bant girişim filtrelerine sahip yüksek hassasiyetli bir video kameraya bağlı ters çevrilmiş bir mikroskoptan oluşan bir görüntüleme seti donatıldı. Mümkünse, sodyum proton değiştirici ileri aktivitesini ölçmek için oran bire yaklaşacak şekilde birinci ve ikinci kanallar için karşılaştırılabilir floresan değerleri ayarlamak için uygun filtre setini ve aydınlatma koşullarını kullanın. Daha sonra, hücreleri amonyum yükleme çözeltisinde bir saatlik bir inkübasyon ile asitleştirin.

İnkübasyonun son beş dakikasında karbondioksit yokluğunda, hücreleri metrik pH'a duyarlı bir floresan kalıbı ile boyayın. Kuluçka süresinin sonunda, hücre dışı probu ortadan kaldırmak için hücreleri amonyum yükleme solüsyonu ile rinleyin ve boyanmış hücreleri mikroskoba monte edin. Floresan değerlerin uygun şekilde ölçüleceği ilgili bölgeleri seçin.

Ardından, bir taban çizgisi oluşturmak için birkaç görüntü kaydedin ve floresanda bir düşüş başlatmak için hücreleri RIN çözeltisi ile perfüze edin. PH stabilize olduktan sonra, lityum hidrojen, sodyum hidrojen veya potasyum hidrojen değişiminin aracılık ettiği pH geri kazanım oranlarını ölçmek için hücreleri ilgili çözelti ile inceleyin. Şimdi hücreleri, potasyum klorür ve gerin ile takviye edilmiş hippi çözeltisi ile inceleyin.

Ardından, görüntülerden floresan ölçümlerini toplayın ve sodyum proton değiştiricinin başlangıç hızını ölçmek için verileri metin biçiminde bir elektronik tablo programına aktarın. Yedi, hızlı lityum alımıyla, hücreleri ve çok kuyulu plakaları, az önce gösterildiği gibi Imodium yükleme tekniği ile asitleştirir. Ardından, plakaları gösterildiği gibi iki kez hızlı bir şekilde durulayın.

Daha sonra hücreleri, bir ila 10 mikromolar lityum ve alım süresinin sonunda yaklaşık bir dakika veya daha kısa bir süre boyunca istenen katyon veya ilgili inhibitörler içeren alım çözeltilerinde inkübe edin, alım ortamını dikkatlice çıkarın ve hücreleri hızla yıkayın buz gibi soğuk PBS ile toplam 10 saniyeden daha kısa bir sürede lityum akışını önlemek için hücreler 250 mikrolitre% 25 nitrik asit içinde lying en az bir saat boyunca. İnkübasyonun sonunda pipet ucunun ucu ile her bir kuyucuğun kazınması ve her bir kuyucuktan süspansiyonların yeni mikro santrifüj tüplerine aktarılması. Son olarak, hücresel kalıntıları gidermek için oda sıcaklığında 15.000 G'de beş dakika boyunca santrifüj numuneleri alın ve daha sonra atomik absorpsiyon spektroskopisi ile snat'ın lityum içeriğini ölçün.

Üreticinin talimatlarına göre, proton öldürme seçimi, amonyum zayıf bazının difüzyonuna dayanır. Örneğin, plazma zarında fonksiyonel bir sodyum proton değiştirici eksprese etmeyen hücreler, nötr bir pH değerini geri kazanamazlar ve bu nedenle, tekrarlanan seçim döngülerinden sonra bu temsili görüntüde görüldüğü gibi düz bir şekil ve granüler bir sitozol ile tipik bir asitlenmiş görünüm sergilerler, tam ve stabil bir şekilde hayatta kalan hücreler. Bununla birlikte, asitleşme, burada görüldüğü gibi, plazma zarında eksprese edilen hücre içi sodyum proton değiştiricilerinin aktivitesi ve iyon seçiciliğinin, Imodium yükleme asitlenmesini takiben bu grafiklerde gözlemlendiği gibi çeşitli deneysel koşullar altında indüklenen hücre içi pH'daki değişikliklerin ölçülmesiyle karakterize edilebileceği gibi, burada görüldüğü gibi bireysel hücresel klonlar oluşturur.

Enzim kinetiğine gelince, ilk alım oranları için doz yanıtı, substratlar için afinite sabit değerlerini ve inhibitörlerin inhibisyon sabit değerlerini türetmek için daha fazla kullanılabilir. Gerçekten de, taşıyıcıların ilginç bir özelliği, farklı birleştirme katyonunun taşıma için rekabet etmesi ve bu şekilde gösterildiği gibi lityum alımı ile rekabet ederek sodyum için afinite sabitini ölçme olasılığını vermesidir. Bu prosedürü takiben. RNA susturma ile birleştirilmiş hücre yüzeyi BioInnovation gibi diğer deneyler, ilgilenilen taşıyıcının gerçekten plazma zarında ifade edildiğini doğrulamak için gerçekleştirilebilir.