Name: Na fonksiyonel karakterizasyonu + / H + Seçim Proton-öldürme Kullanma hücre içi Bölmeler ve Eşanjörleri Plazma Membran Them Express (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Öğrenin hücre içi Na+/H+ değiştiricilerinin fonksiyonel karakterizasyonu için proton öldürme seçimi ve hücre içi pH ölçümü yöntemlerini. Bu teknik, iyon taşıma kinetiği ve afinitesi hakkında doğrudan veri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, pH ve iyon taşınması üzerinde çalışan, burada açıklanan ölçümleri ortaya çıkaran ve geliştiren bilim camiasının tüm üyelerine derinden borçludur. Burada kullanılan H+ öldürücü seçim tekniğini ortaya çıkaran Dr. Jacques Pouysségur'a özellikle teşekkür ederler. Nice-Sophia Antipolis Üniversitesi'ne, CNRS'ye, ANR'ye (JCJC SVSE1 NHEint) ve ICST Labex'e destek için teşekkür ederler.

1. H + Killing Seçim <ol><li> Hücre çizgileri <ol><li> Kararlı olarak NHE-eksikli hücrelerin transfekte (örneğin, CCL39 türetilmiş PS120 hücre çizgisi 16) bir fibroblast hücre çizgisinde etkili transfeksiyon verimi ve seçim üretecek memeli ifade vektörü ve transfeksiyon yöntemi herhangi bir kombinasyonu kullanılmıştır. NOT: Yıllarca Kalsiyum Fosfat yağış 19 iyi transfeksiyon verimi ile kullanılmıştır. Bu, Lipofectamine2000 gibi ticari reaktifler ile daha yakın değiştirilmiştir, transfeksiyonlar imalatçının talimatlarına uygun olarak yerine getirilmektedir. </li></ol></li><li> Çözümler <ol><li> Aşağıda tarif edilen üç steril çözeltiler hazırlayın. Filtrasyon (0.22 mikron) tarafından bu çözümleri sterilize edin. <ol><li> 50 mM NH4CI, 70 mM kolin klorid, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCI2, 5 mM gl içeren bir NH4 + Yükleme çözeltisi hazırlayın (pH 7.4)ucose ve pH 7.4&#39;te 15 mM MOPS. </li><li> 120 mM kolin klorür, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCI2, 5 mM glukoz, pH 7.0, 15 mM HEPES içeren bir durulama çözeltisi (pH 7.0) hazırlayın. </li><li> PH 7.4&#39;te 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCI2, 5 mM glukoz ve 15 mM HEPES içeren bir kurtarma çözeltisi (pH 7.4) içinde hazırlayın. </li></ol></li></ol></li><li> CO2 bozabilir bu tamponlama neden olur 5% &#39;si olarak, - seçim başlamadan önce, (&quot;serbest&quot; kuluçka CO2 olarak adlandırılır) dış tanktan ek CO2 ile 37 ° C&#39; de kullanılabilen bir hücre kültürü kuluçka elde asidifikasyon. Ile yaklaşık 2 x 10 8 hücreleri (tipik olarak yaklaşık 20 konfluent 100 mm plakalar) için ilgi NHE sentezleyen hücre soyu yükseltin. </li><li> H prosedürü öldürme +: <ol><li> 3 de, yükleme Çözüm, 1 saat için ilgi hücre NHE-ifade eden hücreleri inkübeCO 2 -ücretsiz inkübatör 7 ° C. </li><li> Yükleme çözeltisi aspire ve daha sonra, yukarıda tarif edilen, durulama çözeltisi içinde iki kez yıkayın. Asitlenmesini üretecek bir dik NH 4 + gradyan oluşturulmasını zedeleyecek artık dışı NH 4 Cl ortadan kaldırmak için verimli bu adımı gerçekleştirin. </li><li> Aspirasyon ile durulama ortamı ortadan kaldırmak ve CO2 serbest inkübatör içinde 37 ° C&#39;de tekrar geri kazanım çözeltisi içinde bir saat için kuluçkalayın. </li><li> Normal kültür ortamında (% 7.5 FCS, tipik olarak DMEM) ile kurtarma ortamı yerine ve (% 5 CO2 ve% 95 hava içeren nemli bir atmosferde 37 ° C), standart kültür koşullarında hücreler büyür. </li></ol></li><li> Stabil klonlar ortaya kadar haftada iki kez seçim bu döngüyü tekrarlayın. NOT: Hücre kültürü ve seçim koşulları konusunda özel dikkat. Iş Ay o daha eğilimli herhangi bir kontaminasyon tarafından harap olabilirkültür ve tekrarlanan hücre manipülasyonlar uzun bir süre sonra CCur. <ol><li> Burada, klonlar yükseltmek ve bireysel olarak daha bölümlerde 2-3 açıklanan onları karakterize, ya karakterizasyon önce hücresel nüfus oluşturmak için onları bir araya havuz seçebilirsiniz. </li></ol></li><li> Sayaç-seçilmesi ebeveyn asit duyarlı fenotip (Şekil 1B) döndürülür olabileceği olanlar tarafından asitlenme dirençli hücreleri korumak için zaman zaman seçim (yaklaşık iki haftada) uygulayın. </li></ol> 2. Hücre içi pH Ölçümleri 2.1) Floresans pH Görüntüleme <ol><li> 490 nm&#39;de uyarıldığında, pH&#39;a duyarlı ve üretici protokollerine göre bir 445 mil izosbetik noktası sahip rasyometrik pH&#39;a duyarlı fluoresan boya BCECF / AM kullanın. <ol><li> Seçenek olarak ise, üreticinin protokollerine aşağıdaki diğer pH&#39;a duyarlı prob kullanılır. </li></ol></li><li> Bir görüntüleme set con kullanınyüksek hassasiyet video kamera bağlanmış bir ters mikroskop sisting. 450 nm ve uyarma için uygun kuvars nötr yoğunluk filtreleri ile eşleştirilmiş 490 nm dar bant girişim filtreleri ile bu seti donatın. <ol><li> Mümkünse oranı da hem λ1 ve / veya λ2 için, ya doyurarak veya çok düşük ayarlanmış bazal floresan değerlerini önlemek 1. yaklaşır, böylece λ1 ve λ2 kurulum karşılaştırılabilir floresan değerlerine filtreler ve aydınlatma koşulları uygun seti kullanın. Bu hücre içi pH değişiyor olsa oranı tespit edilmiş olmayabilir gibi o önemli eserler verebilir. NOT: Bu sistem uygun emisyon dalga boyunda (BCECF için 535 nm) hızlı perfüzyon, zaman atlamalı, yukarıda zikredilen iki dalga boylarında uyarım ve satın izin gerekir. Yazılım otomatik veri toplama ve depolama sağlayan sistemi donatın. </li></ol></li></ol> NHE İleri Faaliyet 2.2) Ölçüm (eldesiSitosolden protonlar) <ol><li> NH4 + Yükleme çözeltisi içinde 1 saat süren kuluçkalamadan hücreleri asitleştirin CO2 yokluğunda (adım 1.4). </li><li> Son beş dakika boyunca solüsyon ile BCECF-AM (5 uM nihai konsantrasyon) ilave edilir ve daha sonra hücre dışı prob ortadan kaldırmak için NH 4 + yükleme çözeltisi durulayın. </li><li> Mikroskop hücreleri monte ve istikrarlı bir temel kaydetmek için birkaç fotoğraf çekmek. Durulama çözeltisi (yukarıya bakın) serpmek. Bu asitleştirme tekabül eden floresans bir düşüşüne yol açar. </li><li> PH stabilize sonra, Li + / H +, Na + / H + veya K + / H + değişimi aracılığı ile pH yükselmesinin oranını ölçmek için aşağıdaki çözümlerden herhangi serpmek. Her bir çözelti bir potansiyel birleştirme katyon H + değişimi için test edilecek olan içerir. Bunlardan biri taşınıyorsa, bu değerden uygun olacak 495 nm&#39;de bir floresan artışı ile sonuçlanırond hücre içi pH zam için: PH 7.4&#39;de 120 mM LiCİ, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glükoz ve 15 mM HEPES PH 7.4 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glükoz ve 15 mM HEPES PH 7.4&#39;de 125 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glükoz ve 15 mM HEPES </li></ol> NHE Ters Faaliyet 2.3) ölçümü NOT: Burada ilke transmembran iyonik eğimleri ters etmektir. <ol><li> Ölçümden önce, ilgi konusu hücre içi katyon ile yük hücreleri (aşağı bakınız). </li><li> BCECF / AM (bkz: adım 2.2.2) ile 5 dakika boyunca onları inkübe; , yıkayın video mikroskobu onları monte edin. </li><li> Yükleme çözüm serpmek ve istikrarlı bir temel kaydetmek için birkaç fotoğraf çekmek. </li><li> Bazal istikrar, görüntü hücreleri bir hücre dışı asidik ortam 120 m içeren perfüze olan pH değişimleri sonraE kolinklorid, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM glükoz ve pH değeri 6.5 olan 15 mM MES,. </li><li> LiCİ yüklemesi için, pH 7.4 ile 120 mM LiCİ, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCI2, 5 mM glukoz ve 15 mM HEPES oluşan bir çözelti içinde, 2 saat boyunca kuluçkalayın. Atom emme spektroskopisi ile ölçülen hücre içi lityum yaklaşık 60 mM arasında bir değer elde edilir. </li><li> Na yüklemesi için, 1mM ouabain varlığında pH 7.4&#39;te 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCI2, 5 mM glukoz ve 15 mM HEPES oluşan bir çözeltiye, iki saat süreyle kuluçkalayın Na / K ATPaz engellemek için. Bu koşullar altında, hücre içi Na konsantrasyonu, 40 mM arasındadır. Not: sitosolik K + konsantrasyonu 140 mM aralığında ve bir dışarı doğru yönlendirilmiş K + gradyanı elde etmek için, bu nedenle kolay olduğu gibi K + yükleme gerekli değildir. </li></ol> 2.4) Veri Tedavi ve Kalibrasyon: Not: Bu adım ileri ve geri ölçümler için de geçerlidir. <ol><li> Her bir deneyin sonunda, 6.5 ile 7.4 arasında pH değerlerine ayarlanmış 140 mM KCI, 20 mM HEPES ve 5 uM nigerisin eden bir çözelti ile hücreleri serpmek. </li><li> Metin biçiminde altındaki görüntüleri floresan ölçümleri gibi verileri (gri düzeyleri yoğunluk seviyelerini temsil eden) ve ihracat toplayın ve bir elektronik tablo programı kullanarak aşağıda açıklanmıştır davranırım. </li><li> Her bir hücre ya da aşağıdaki denklem kullanılarak ilgili bölge için hücre içi pH değerini hesaplayın: pH = pKa + (Log (R-Rmin) / (R max R)) x F dk (λ2) / F max (λ2) </li><li> F min (λ2) / K ma x (λ2), deneyler boyunca 450 nm floresansta bir azalma ile sonuçlanır sistemi ağartıcı veya kaçak var ise, bu oran kullanın. Ancak bu, çok nadiren des kullanılan koşullarda gözlenenaçıklanan şekilde deneyleri. </li><li> Kalibrasyon verileri her pH ölçümü sonunda mevcut gibi gelen hesaplanan değerler kalibrasyon için kullanılan pH değerleri farklı olup olmadığını kontrol edin. Bu durumda, aşağıdaki yordamı kullanarak kalibrasyon tüm deneysel belirlenen pH değerleri ayarlayın: <ol><li> Aşağıdaki katsayısı (Q, kalibrasyon değerleri arasında ölçülen değerler / Fark arasındaki fark) hesaplayın. Hesaplanan değerler karşılık gelen kalibrasyon değerlerini eşit olacak şekilde Q ile bütün veri kümesi ilave veya çıkarma ile son ayarlamayı yapın çarpın. </li></ol></li></ol> Hızlı Li + Alımına tarafından NHE7 başlangıç ​​Oranları 3. Ölçümler <ol><li> Çok yuvalı plakalar üzerinde Tohum hücreleri (6 yanı sıra 24) üzerinde ya da 20 de tarif edilen alternatif olarak nigericin / sığır serum albümini (BSA) asitlendirme tarif NH4 + yükleme tekniği kullanarak bunları asitleştirmek. </li><li&gt; Durulama Plakalar iki kez hızla yukarıda tarif edilen durulama çözeltisi kullanılarak ve daha sonra arzu edilen miktarda (hafif, Km değerlerinde altında) 1-10 mM lityum içeren alım Çözeltilerin hücreleri ve katyon istenen konsantrasyonlar ve / veya ilgi duyulan inhibitörleri inkübe zaman. </li><li> Bu taşıma başlangıç ​​oranları koşullarda faaliyet sağlamak için kısa ve tutarlı alım süreleri (genellikle bir dakika veya altında) koruyun. Ayrıca alımı için kullanılan tüm çözümler izotonik olduğundan emin olun. </li><li> Alım süresi sonunda, dikkatli bir şekilde alımı ortamı ortadan kaldırmak ve buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile hücreler dört kez yıkayın. (Dördü ideal için az 10 sn) lityum akışını önlemek için mümkün olduğunca hızlı bu yıkar gerçekleştirin. </li><li> Lyse% 25 Nitrik asit hücreler. % 25 nitrik asit, oyuk başına 250 ul uygulanır ve daha sonra pipet ucu ile her bir oyuğa hurda ve yeni mil bütün iyi süspansiyonu transfer, en az 1 saat bekletincrocentrifuge tüp. </li><li> Selüler artığın ayrılması için 15,000 x g&#39;de (oda sıcaklığı), 5 dakika boyunca, onları santrifüj, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine lizat aktarın. </li><li> Atomik absorpsiyon spektroskopisi 21 ile süpernatanların lityum içeriğini ölçün. NOT: Farklı şirketler Lityum oyuk katot lambası ile donatılmış gereken atomik absorpsiyon spektrometre sağlamak. Bu makineler çok hassas ama aynı zamanda oldukça hassas olarak üreticinin talimatlarını izleyin. </li></ol>

<ol><li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V-type+H%2B-ATPase+in+vesicular+trafficking%3A+targeting%2C+regulation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li>
<li>Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+and+the+endosomal-lysosomal+pathway%3A+emerging+roles+of+CLC+chloride+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters.</a> J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).</li>
<li>Kornak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+a3+subunit+of+the+vacuolar+H%28%2B%29-ATPase+cause+infantile+malignant+osteopetrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis.</a> Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).</li>
<li>Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ClC-5+chloride+channel+knock-out+mouse+-+an+animal+model+for+Dent%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease.</a> Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).</li>
<li>Kasper, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+chloride+channel+ClC-7+leads+to+lysosomal+storage+disease+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration.</a> Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).</li>
<li>Poet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+storage+disease+upon+disruption+of+the+neuronal+chloride+transport+protein+ClC-6%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).</li>
<li>Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+Na%2B%2FH%2B+exchanger+isoforms+are+distributed+to+Golgi+and+post-Golgi+compartments+and+are+involved+in+organelle+pH+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation.</a> J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).</li>
<li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC9A6+mutations+cause+X-linked+mental+retardation%2C+microcephaly%2C+epilepsy%2C+and+ataxia%2C+a+phenotype+mimicking+Angelman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome.</a> Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).</li>
<li>Mignot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mutation+in+SLC9A6+gene+in+a+patient+with+Christianson+syndrome+and+retinitis+pigmentosum%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum.</a> Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).</li>
<li>Morrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+autism+loci+and+genes+by+tracing+recent+shared+ancestry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry.</a> Science. 321 (5886), 218-223 (2008).</li>
<li>Lasky-Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+scan+of+the+time+to+onset+of+attention+deficit+hyperactivity+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+B+Neuropsychiatr+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder.</a> Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).</li>
<li>Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+studies+in+ADHD%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association studies in ADHD.</a> Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).</li>
<li>Meda, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+scale+multivariate+parallel+ICA+method+reveals+novel+imaging-genetic+relationships+for+Alzheimer%27s+disease+in+the+ADNI+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort.</a> Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microdeletion+in+Xp11.3+accounts+for+co-segregation+of+retinitis+pigmentosa+and+mental+retardation+in+a+large+kindred%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet+A%22%5BJournal%5D)">A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred.</a> Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).</li>
<li>Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+primary+structure%2C+and+expression+of+the+human+growth+factor-activatable+Na%2B%2FH%2B+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter.</a> Cell. 56 (2), 271-280 (1989).</li>
<li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+mutation+abolishing+Na%2B%2FH%2B+antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li>
<li>Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+properties+of+fibroblast+mutants+overexpressing+an+altered+Na%2B%2FH%2B+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter.</a> J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).</li>
<li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intracellular+Na%2B%2FH%2B+Exchanger+NHE7+effects+a+Na%2B+coupled%2C+but+not+K%2B+coupled+proton-loading+mechanism+in+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis.</a> Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).</li>
<li>Wigler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+mammalian+cells+with+genes+from+procaryotes+and+eucaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes.</a> Cell. 16 (4), 777-785 (1979).</li>
<li>Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+the+activation+of+the+Na%2FH+exchanger+NHE-1+by+cytoplasmic+acidification+and+mitogens%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens.</a> EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).</li>
<li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenomic+Effects+of+Cisplatin%3A+Acute+Inhibition+of+Mechanosensitive+Transporters+and+Channels+without+Actin+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling.</a> Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).</li>
<li>Boron, W. F., De Weer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pH+transients+in+squid+giant+axons+caused+by+CO2%2C+NH3%2C+and+metabolic+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors.</a> J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).</li>
<li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B-H%2B+exchange+in+gastric+glands+as+measured+with+a+cytoplasmic-trapped%2C+fluorescent+pH+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).</li>
<li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+image+processing+of+intracellular+pH+in+gastric+oxyntic+and+chief+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells.</a> Nature. 325, 447-450 (1987).</li>
<li>Quentin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhBG+and+RhCG%2C+the+putative+ammonia+transporters%2C+are+expressed+in+the+same+cells+in+the+distal+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron.</a> J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).</li>
<li>Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+NH3+through+the+human+urea+transporter+B%3A+a+new+gas+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokol, mevkiye-yönelik mutagenez ile birincil dizisini değiştirmeden, plazma membranında, hücre içi, Na + / H + değiştiriciler ifade eden hücreleri seçin açıklamaktadır. Bu değiştirici hemen karakterize edilebilir. Bu yöntem, plazma membranında veziküler, Na + / H + değiştiricileri ifade edecek hücre hatları seçmek için hücre içi proton hücresel zehirlilik dayanmaktadır. Bu örneğin, Li +, K +, veya Cs + olarak...

Çoğu hücre içi bölmeleri olgunlaşması, insan ticareti, proteinler veya hormonlar ve yükleme nörotransmitterlerin geri dönüşümü için önemli bir parametredir asidik lümen pH görüntüler. Bu sitosol ve vesiküler içeriği arasındaki pH gradyanı veziküler CIC klorür taşıyıcılar 2 bağlanmış, vaküoler H + ATPazların 1 ile elde edildiği gösterilmiştir. Her iki knock-out (KO) farelerde ve insan hastalarda, bu taşıyıcıları önemi onların genlerinde 3-6 mutasyonlar neden ağır fenotip tarafından vurgulanmıştır. Sodyum-hidrojen değiştirici SLC9A ailesinin üyeleri, aynı zamanda, Na + / H + değiştirici NHEs olarak adlandırılan hücre-içi pH ve hücre hacmi düzenlenmesinde anahtar etkileyiciler yanı sıra epitelden asit-baz eşdeğerleri vektör taşıma olduğu gösterilmiştir . Plazma zarı NHEs yanı sıra, üç yüksek + / H + değiştiriciler, NHE-6, 7, Na korunmuşve 9, trans-Golgi ağı ve erken endozomlarda 7 olarak ifade edilmiştir. Onların genlerinde mutasyonlar Angelman benzeri veya Christianson sendromları 8-9, aile temelli otizm 10 ve Dikkat Eksikliği Hiperaktivite Bozukluğu 11-12 ile bağlantılı olmuştur. Bu dönüştürücüler ayrıca Alzheimer hastalığı yatkınlık 13 ve X-bağlantılı mental retardasyon bitişik genler gibi nörodejeneratif sorunlara 14 sendromları dahil edilmiştir. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar beyin gelişimi ve / veya fonksiyon bu hücre içi NHEs önemini vurgulamak. Bu eşanjörleri hücre içi lokalizasyonu doğru onların iyon seçicilik ölçümleri, ulaşım yönü, kinetik parametreleri, ve düzenleme önler. Hücre içi bölümlerinde ifade tüm nakliyeciler için olduğu gibi, onların biyokimyasal faaliyetlerini değerlendirmek ve dolayısıyla tam olarak fizyolojik rolleri ve Mechan anlamak son derece zorizm kendi patolojik etkileri altında yatan. Yüksek sitozolik K + konsantrasyonu dayanarak, en çok yaygın kabul gören hipotez onlar K + birleştiğinde proton akış taşıyıcıları olarak görev olmasıydı. Bu değer sabit bir veziküler pH&#39;sını muhafaza etmek için V-ATPazların proton pompalama telafi edilebilir bir proton sızıntı olması, hipotez edilmiştir. Bu görsel maddenin amacı, plazma membranında veziküler taşıyıcıları ifade, ve (ii) bu nakil fonksiyonlarını ölçmek için, bağımsız iki yaklaşım göstermek için hücre çizgilerinin genetik olarak seçilmesi ile sağlayan bir yöntemi göstermek için, (i) &#39;dir. Üç yıl önce, Pouysségur ve Franchi NHE ailesinin 15 üyesi moleküler klonlama ve karakterizasyonu etkin bir genetik yaklaşım öncülük etmiştir. Bu tarama yöntemi olarak hücre içi proton toksisite dayanıyordu. İlk adım hücre hatları eksik elde etmek olduHerhangi bir Na + / H + değişimi bu taşıyıcı geri döndürülme oranı kullanılarak, plazma membranında ifade edilmiştir. Fibroblastlar (CCL39 hücre çizgisi), Na + ya da Li + önceden yüklenmiş ve daha sonra 2 saat süre ile bir asidik hücre dışı ortam (pH 6.5) içine yerleştirildi. Bu fonksiyonel, Na + / H + değişimi ifade eden hücrelerin ölümüne ve damar sertliği-yetersizliğine sahip hücrelerin (PS120 hücre çizgisi) 16 seçimine yol açmıştır. Bikarbonat içermeyen bir ortam içinde kültive edilince, bu hücreleri, akut hücre içi asitlenme çok hassastır. Bu tür hücreleri, akut hücre içi acidifications sunulur Sonuç olarak, eğer plazma membranında herhangi bir işlevsel proton akış mekanizması sentezleme pozitif (bakınız 17) seçilir. Bu gibi asitleştirme teknikler plazma membranında WT hücre içi NHEs zorla ifade sağlayan kusurları trafiğe sahip hücre çizgileri izole etmek için kullanılabilir. Ökaryotik, Na + / H deEşanjörleri elektro +, onlar kanalları ölçmek için büyük bir başarı ile kullanılmaktadır elektrofizyolojik yaklaşımlarla ölçülebilir değildir. Bu yazıda, bu nedenle hücre içi pH ölçümleri ve lityum alımının hızlı kinetik bu değiştirici aktivitesini ölçmek için nasıl gösterir. Temel kavramlar aynı gibi, bu seçim bölümü için geliştirilmiş süreçlerin birçok fonksiyonel ölçümler için doğrudan kullanılan olduğunu fark etmek ilginçtir. İlginç bir şekilde, bu metinde tarif edilen yaklaşımı kullanılarak seçilmiş hücre çizgileri mevcut trafik kusur veziküler potasyum kanalı TWIK1 18 olarak plazma zarının diğer veziküler proteinlerin daha büyük bir ifadesine neden olduğu gözlenmiştir. Bu veziküler transmembran proteinler için genel bir tutma kusur mekanizmasının seçimi doğru işaret. Dolayısıyla bu seçim prosedürü ve Mayıs üretir hücrelerihücre içi bölmelerin zar proteinleri üzerinde çalışanlar için ümit veren bir araç oluşturmaktadır. Yanı sıra burada sunulan ölçüm teknikleri olmayan diğer Elektrojenik taşıyıcıları çalışmak için geçerli olabilir.

<table><tbody><tr><td>Standart hücre kültürü ekipmanı</td><td></td><td></td><td>Farklı katalog numaralarına sahip birçok cihazdan oluşan H+ öldürme seçimi için kullanılır</td></tr><tr><td>CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>ile inkübatör, CO2</td><td>Heraeus cihazı</td> olmayan inkübatör <td>BB6220</td><td></td></tr><tr><td>PSM1200NF Fisher</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>52010120</tr><tr><td>DMEM orta</td><td>sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS altın</td><td>GE Sağlık</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>Zeeman fırın sistemli Atomik Absorpsiyon spektrometresi</td><td>Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>Nitrik Asit</td><td>sigma</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Floresan video mikroskopi seti</td><td>Leica</td><td></td><td>Farklı katalog numaralarına sahip birçok cihazdan oluşur</td></tr><tr><td>Ters otomatik mikroskop</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td> mikroskop standı Leica 11888906 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> 11505180 <td>11888377</td><td></td></tr><tr><td>olay floresan</td><td>leica</td><td>11888901</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11504166</td><td></td></tr><tr><td>motor braketi</td><td>leica</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>LED iletim ışığı & nbsp;</td><td>Leica</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521580</td><td></td></tr><tr><td>motorlu plaka</td><td>leica</td><td>11522068</td> 11531172 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>11888424</tr><tr><td>kamera çıkışı</td><td>Leica</td><td>11888373</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11507807</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888259</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>görüntü toplama/analiz yazılımı</td><td>Leica</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>optik</td><td>leica</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243 11506203</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>floresan Xenon lamba</td><td>leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>kamera</td><td>hamamatsu</td><td>8100601</td><td></td></tr><tr><td>metafluor / Mmfluor yazılımı</td><td></td><td>11640905</td><td></td></tr><tr><td>pH'a duyarlı prob, BCECF-</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>Nijerin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

na fonksiyonel karakterizasyonu<sup&gt; +</sup&gt; / h<sup&gt; +</sup&gt; seçim proton-öldürme kullanma hücre içi bölmeler ve eşanjörleri plazma membran them express

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endozomal asidifikasyonu gibi sinaptik vesiküller protein geri dönüşüm ve bozulma, reseptör duyarsızlaştırma ve nöro-yükleme gibi işlemler, geniş bir aralığı için önemlidir. Bu asitlenme CIC klorür nakliyecilere birleştiğinde proton ATPazların, aracılık tarif edilmektedir. Elektro-proton taşıyıcıları yüksek ölçüde muhafaza edilmiş, Na + / H + değiştiriciler (NHE) 6, 7 ve 9, bu bölmelerin olarak ifade edilmiştir. Genlerindeki mutasyonlar, insan bilişsel ve nörodejeneratif hastalıklar ile bağlantılı olmuştur. Onların hücre içi lokalizasyonu detaylı fonksiyonel karakterizasyonu engelledi gibi Paradoksal, rolleri, zor kalır. Bu yazının bu sorunu çözmek için bir yöntemi gösterir. Bu plazma membranında hücre içi NHEs tutma akut sitosolik asitlenme kalan kapasitesine sahip mutant hücre hatlarının seçimi oluşur. Daha sonra iyon seçiciliği ve aktivitesini ölçmek için iki tamamlayıcı protokol göstermektedir(i) bir floresan görüntü mikroskopi kullanılarak hücre içi pH ölçümleri göre, ve (ii) bir lityum alımının hızlı kinetik göre: Bu değiştirici. Bu tür protokoller olmayan diğer Elektrojenik taşıyıcıları ölçmek için çıkarım olabilir. Ayrıca, burada sunulan seçim prosedürü bir hücre içi tutma arızalı fenotip hücreleri üretir. Bu nedenle, bu hücreler de plazma zarı diğer veziküler membran proteinleri ifade edecektir. Burada tasvir edilen deneysel strateji, bu nedenle daha sonra veziküler + / H + seçimi için kullanılan değiştiriciler, Na ile birlikte, plazma membranında ifade edilecektir diğer hücre içi proteinleri incelemek için potansiyel olarak güçlü bir araç olarak kullanılabilmektedir.

Seçim: Şekil 1A&#39;da görüldüğü gibi, lH + öldürme seçimi, amonyum zayıf bir baz difüzyon dayanmaktadır. zayıf bazlar ve hücre içi pH üzerindeki asitler difüzyon etkisi Walter Bor ve işbirlikçileri 22 öncülük edilmiştir. Zarif bir fikir pozitif genetik seçimi için ölümcül bir asitlenme sonra Jacques Pouysségur 17 tarafından geliştirilen üretmek için bu olguyu kullanmak için. Böyle bir protokol kapsamında, hücre içi pH değeri yaklaşık 5.5 dur...

Bu makalenin ilk bölümü, plazma zarlarında veziküler Na+/H+ değiştiricileri eksprese eden mutant hücre hatlarının nasıl seçileceğini gösterir. İkinci bölüm, bu değiştiricilerin iyon seçiciliğini ve kinetik parametrelerini belirlemek için kullanılan hücre içi pH ölçümlerine ve hızlı iyon alımına dayalı protokoller sağlar.

Na fonksiyonel karakterizasyonu<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Seçim Proton-öldürme Kullanma hücre içi Bölmeler ve Eşanjörleri Plazma Membran Them Express

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hücre içi eksprese edilen sodyum proton değiştiricilerinin aktivitesini ölçmektir. Bu, öncelikle proton öldürme seleksiyonu ile plazma membranında hücre içi sodyum proton değiştiricilerini eksprese eden hücrelerin seçilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, seçilen hücreler asidifiye edilir ve ardından hücrelerin sodyum proton değişim aktivitesini doğrulamak için hücre içi pH geri kazanımı ölçülür.Ardından, taşınan katyonun ve inhibitörlerin afinite sabitlerini belirlemek için iyon transportunun hızlı kinetiği ölçülür. Nihayetinde, seçilen somatik hücrelerin hücre içi pH'ındaki değişimlerin ve hızlı kinetiğin izlenmesi, hücre içi protein değişiminin fonksiyonel karakterizasyonuna olanak tanır. Bu tekniğin, mutant transporterların ekspresyonu veya per hücrelerinin kullanımı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, vahşi tip hücre içi transporterların plazma membranında ekspresyonuna imkan tanıyarak fonksiyonlarının doğrudan ölçülmesini mümkün kılmasıdır.Prosedür, laboratuvarımdan araştırma bilimcisi Dr. Mallory Poet tarafından uygulamalı olarak gösterilecektir. Proton öldürme prosedürüne başlamak için, öncelikle ilgilenilen hücre içi sodyum proton değiştiricisini eksprese eden hücreleri, yükleme solüsyonu içinde 37 °C'de ve karbondioksitsiz bir inkübatörde bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, yükleme solüsyonunu aspire edin ve hücreleri taze besiyeri ile iki kez yıkayın.İkinci yıkamadan sonra ortamı aspire edin ve hücreleri karbondioksitsiz bir inkübatörde geri kazanım çözeltisi içinde inkübe edin. Bir saat sonra, geri kazanım ortamını standart kültür ortamı ile değiştirin ve hücreleri standart kültür koşullarında büyütün. Hücrelerin hücre içi floresan pH değerlerini görüntülemek için stabil klonlar ortaya çıkana kadar bu seleksiyon döngüsünü haftada iki kez tekrarlayın.İlk olarak; 450 nanometre ve 490 nanometre dar bant girişim filtreleri ile eksitasyon için uygun kuvars nötral yoğunluk filtrelerinin eşleştiği, yüksek hassasiyetli bir video kameraya bağlı ters mikroskoptan oluşan bir görüntüleme seti kurulur. Sodyum proton değiştirici ileri aktivitesini ölçmek amacıyla, birinci ve ikinci kanallar için oran bir değere yaklaşacak şekilde karşılaştırılabilir floresan değerleri ayarlamak için mümkünse uygun filtre seti ve aydınlatma koşulları kullanılır. Ardından, hücreler amonyum yükleme çözeltisinde bir saatlik inkübasyon ile asitlendirilir.İnkübasyonun son beş dakikasında karbondioksit yokluğunda, hücreleri rasyometrik pH hassasiyetli floresan boya ile boyayın. İnkübasyon süresinin sonunda, hücre dışı probu uzaklaştırmak için hücreleri amonyum yükleme çözeltisi ile durulayın ve boyanmış hücreleri mikroskoba yerleştirin. Floresan değerlerinin ölçüleceği ilgi bölgelerini uygun şekilde seçin.Ardından, bir baz hat belirlemek için birkaç görüntü kaydedin ve floresan değerinde bir düşüş başlatmak için hücreleri RIN çözeltisi ile perfüze edin. pH stabilize olduktan sonra, lityum hidrojen, sodyum hidrojen veya potasyum hidrojen değişiminin aracılık ettiği pH geri kazanım hızlarını ölçmek için hücreleri ilgili çözelti ile perfüze edin. Şimdi hücreleri, potasyum klorür ve gerin ile desteklenmiş hippies çözeltisi ile perfüze edin.Ardından, görüntülerden floresan ölçümlerini toplayın ve sodyum proton değiştiricinin başlangıç hızını ölçmek için verileri bir hesap tablosu programına metin formatında aktarın. Yedi, hızlı lityum alımı yoluyla, hücreleri ve çok kuyucuklu plakaları az önce gösterilen Imodium yükleme tekniği ile asitlendirin. Sonrasında, plakaları az önce gösterildiği gibi iki kez hızla durulayın.Ardından hücreleri, 1 ila 10 µM lityum ve hedeflenen katyon veya inhibitörlerin istenen konsantrasyonlarını içeren alım çözeltilerinde inkübe edin; alım süresinin sonunda, lityum efleksini önlemek için alım ortamını dikkatlice uzaklaştırın ve hücreleri toplamda 10 saniyeden kısa sürede buz soğukluğundaki PBS ile hızla dört kez yıkayın, ardından hücreleri kuyuk başına 250 µL %25 nitrik asit içinde en az bir saat boyunca lizleyin. İnkübasyonun sonunda her kuyuyu pipet ucunun ucuyla sıyırarak her kuyudaki süspansiyonları yeni mikro santrifüj tüplerine aktarın. Son olarak, hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için örnekleri oda sıcaklığında 15,000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve ardından süpernatantın lityum içeriğini atomik absorbsiyon spektroskopisi ile ölçün.Üretici talimatlarına göre, proton öldürme seçimi amonyum zayıf bazının difüzyonuna dayanmaktadır. Örneğin, plazma membranında fonksiyonel bir sodyum proton değiştiricisi eksprese etmeyen hücreler nötr pH değerini geri kazanamazlar ve bu nedenle, tekrarlanan seçim döngülerinden sonra tam ve stabil şekilde hayatta kalan hücrelerin görüldüğü bu temsili görüntüde olduğu gibi, yassı bir şekil ve granüler bir sitozol ile tipik asidifiye olmuş bir görünüm sergilerler. Buna karşın asidifikasyon, burada görüldüğü gibi bireysel hücresel klonlar oluşturur; plazma membranında eksprese edilen hücre içi sodyum proton değiştiricilerinin aktivitesi ve iyon seçiciliği, Imodium yükleme asidifikasyonunu takiben bu grafiklerde gözlemlendiği üzere, çeşitli deneysel koşullar altında indüklenen hücre içi pH değişimlerinin ölçülmesiyle karakterize edilebilir.Enzim kinetiğine gelince, başlangıç alım hızları için doz yanıtı, substratlar için afinite sabiti değerlerini ve inhibitörler için inhibisyon sabiti değerlerini türetmek amacıyla daha da kullanılabilir. Nitekim, taşıyıcıların ilginç bir özelliği, farklı eşleşen katyonların taşıma için yarışacak olmasıdır; bu da bu şekildeki bir prosedür takip edildiğinde, şekil ile gösterildiği gibi lityum alımı ile yarışma yoluyla sodyum için afinite sabitinin ölçülmesi olasılığını doğurur. İlgilenilen taşıyıcının gerçekten plazma membranında eksprese edildiğini doğrulamak için, RNA susturma ile eşleştirilmiş hücre yüzeyi BioInnovation gibi diğer deneyler gerçekleştirilebilir.

functional-characterization-na-h-exchangers-intracellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Xenopus oositlerindeki enzimlerin heterolog ekspresyonu ve atomik absorpsiyon spektrofotometrisi ile tek tek hücrelere Rb+ veya Li+ alımını ölçerek K+-karşı taşıyıcı P-tipi ATPazların aktivitesini ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, karmaşık kinetik çalışmaları kolaylaştıran radyoizotop akı deneylerine hassas ve güvenli bir alternatiftir.

Na, K ve H, K-ATPaz bölgesindeki tarafından Katyon Taşıma Ölçüm<em&gt; Xenopus</emAtomik Absorpsiyon Spektrofotometresi ile&gt; Oosit: Radyoizotop Tahliller Alternatif Bir

Elektroporasyon, saflaştırılmış bakteriyel virülans efektör proteinlerini doğrudan canlı ökaryotik hücrelere yerleştirmek için kullanıldı. Protein lokalizasyonu konfokal immünofloresan mikroskopi ile izlendi. Bu yöntem, ökaryotik hücrelerde heterolog ekspresyon ihtiyacını ortadan kaldırarak, aktif eksojen proteinleri kullanarak kaçakçılık, fonksiyon ve protein-protein etkileşimleri üzerine çalışmalara izin verir.

Memeli Hücreleri içinde fonksiyonel Bakteriyel Efektör elektroporasyonu

Proteolipozomlar, iyi tanımlanmış bir biyokimyasal ortamda yeniden oluşturulan saflaştırılmış kanalları ve taşıyıcıları incelemek için kullanılır. Bu proteinlerin aracılık ettiği akışı ölçmek için deneysel bir prosedür gösterilmiştir. Sulandırılmış proteinin fonksiyonel özelliklerini kantitatif olarak belirlemek için proteolipozomları hazırlama, kayıtları gerçekleştirme ve verileri analiz etme adımları açıklanmaktadır.

Bir Proteoliposome Tabanlı effluks Deney Cl Tek-molekül Properties belirleme<sup&gt; -</sup&gt; Kanallar ve Nakliyeciler

Kalıtsal kardiyak aritmiler genellikle bir veya daha fazla iyon kanallarının yüzey teslim değiştiren mutasyonlar neden olur. Burada, TSA-201 hücrelerinde eksprese edilen rekombinant iyon kanallarının göreli ve toplam hücre yüzeyi protein ekspresyonunun bir ölçümünü sağlamak için tahliller flow sitometri uyum sağlar.

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Bu el yazması proton taşıma sistemlerinin etkinliğini ölçmek için proton-seçici elektrot ve yöntemleri sıkma yama uygulamaları açıklar. Bu yöntemleri teknikleri proton taşıma etkinlik, ılımlı duyarlılık, zaman çözünürlüğü ve yetersiz hücre içi ortam denetimi gibi çalışma için yaygın olarak kullanılan bazı sınırlamalarının üstesinden gelir.

Elektrofizyoloji ölçüm uygulanması elektro-tarafsız taşıyıcılar etkinlik çalışması için

Burada hızlı, solubilize ve birçok ökaryotik Bor taşıyıcılar homoloji Maya kullanarak SLC4 taşıyıcı ailesi ile arındırmak için bir protokol mevcut. Ayrıca saf homomeric protein multimeric derleme için değerlendirmek için bir kimyasal cross-linking tahlil açıklar. Bu protokoller için zorlu diğer membran proteinlerinin adapte edilebilir.

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

E. coli'de heterolog ekspresyon ve fransız presi kullanılarak hücrelerin lysis'inde üretilen membran vezikül preparatlarında proton-tahrikli membran taşıyıcılarının karakterizasyonu için bir yöntem tanımladık.

E. coli'de Heterolog Ekspresyon ile Membran Taşıyıcılarının Karakterizasyonu ve Membran Veziküllerinin Üretimi

Bu protokol, hücresel bir ortamda reseptörlere gerçek zamanlı olarak adenin nükleotid bağlanmasını ölçmek için bir yöntem sunar. Bağlanma, trinitrofenil nükleotid türevleri ile kanonik olmayan, floresan amino asit ile etiketlenmiş protein arasındaki Förster rezonans enerji transferi (FRET) olarak ölçülür.

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

Nanobodies yapısal biyolojide önemli araçlardır ve tedavilerin gelişimi için büyük bir potansiyel oluşturur. Bununla birlikte, inhibitör özelliklere sahip nanobodies seçimi zor olabilir. Burada elektrojenik membran taşıyıcılarını hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan nanobodların sınıflandırılması için katı destekli membran (SSM) tabanlı elektrofizyolojinin kullanımını gösteriyoruz.

Katı Destekli Membran (SSM) Tabanlı Elektrofizyoloji ile Taşıyıcı Hedefli inhibitör nanobodies seçimi

Bu makalede, Saccharomyces cerevisiae'de aşırı ifade edilen Candida albicans ABC (ATP bağlayıcı kaset) protein Cdr1'in karakterizasyonu için küçük ölçekli bir plazma membran izolasyon protokolü sunulmaktadır. Cdr1 ile etiket arasında 16 kalıntılı bağlayıcı bulunan proteaz-bölünebilir C-terminal mGFPHis çift etiket, Cdr1'in saflaştırılmasını ve deterjan taramasını kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.

Candida albicans Cdr1-mGFPHis Analizi için Küçük Ölçekli Plazma Membran Hazırlama

Bu protokol, membran potansiyelindeki değişiklikleri ölçerek elektrojenik membran proteinlerinin incelenmesi için bir yöntem açıklamaktadır. Bu tahlil, epitel hücre hatlarında endojen olarak eksprese edilen çoklu iyon kanallarının fonksiyonel olarak okunması için bir platform sağlar.

İki Epitel Hücre Hattında İki Endojen İyon Kanalının Yüksek Verimli Fonksiyonel Çalışması için Membran Potansiyelinin Floresan Bazlı Bir Analizi

Öğrenin hücre içi Na+/H+ değiştiricilerinin fonksiyonel karakterizasyonu için proton öldürme seçimi ve hücre içi pH ölçümü yöntemlerini. Bu teknik, iyon taşıma kinetiği ve afinitesi hakkında doğrudan veri sağlar.

Na fonksiyonel karakterizasyonu + / H + Seçim Proton-öldürme Kullanma hücre içi Bölmeler ve Eşanjörleri Plazma Membran Them Express (Video) | JoVE Journal

Na fonksiyonel karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet