Name: Atomik Kuvvet Spektroskopi Tek Molekül Yapışma incelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Öğrenin tek polimeri AFM kantilever ucuna kovalent bağlama yöntemini. Polietilen glikol bağlayıcıları kullanarak yüzey desorpsiyon spektroskopi deneyleri için tekrarlanabilir ölçümler yapın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar maddi destek için DFG'ye (Hu 997/2-2) teşekkür eder. FS, Hanns-Seidel-Stiftung'u (HSS) kabul eder. SKr, Elitenetzwerk Bayern tarafından Karmaşık Arayüzlerin Malzeme Bilimi doktora programı çerçevesinde desteklenmiştir. SKi, finansal desteği için SFB 863'e teşekkür eder.

NOT: hazırlık, veri toplama ve veri analizi adımları içeren proses akışının genel bir bakış için Şekil 2&#39;ye bakınız. 1. Reaktif Kurulumu NOT: Tüm kimyasallar dikkatle ele alınması gerekir ve böylece laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz koruması kullanılmalıdır. Tüm işlemler, bir laboratuar ocak içinde gerçekleştirilmelidir. Özellikle, özel eldivenler kloroform kullanılması durumunda kullanılmalıdır. <ol><li> Kuru hızla kloroform ve mağaza kuru ama bir haftadan daha uzun olmayan düşük su içeriği ile kimyasalları kullanın. APTES ((3-aminopropil) triethoxysilan) ve PEG (polietilenglikol) (Tablo 1 e bakınız) için -20 ° C sıcaklıkta ve nitrojen veya argon gazı altında, her iki kimyasal saklayın higroskopiktir ve PEG havada oksidasyon tabidir. </li><li> Ideal olarak, bir nitrojen atmosferde ile bir Torpido gözü sistemi içinde, daha küçük hacimde hazırlanması, atmosferik oksijen ve neme stokunun sık maruz kalmasını önlemek için,yeniden. </li></ol> 2. Ekipman Kurulumu NOT: olası çapraz bulaşmayı önlemek için, her adım için taze ve temiz kapları kullanın. <ol><li> Temiz cam ve 60 ° C&#39;de bir ultrasonik banyoda 30 dakika, deterjan çözeltisi içinde cımbız. </li><li> Durulayın ve ultra saf su ile iki kez iyice aşama 2.1 sonikat ekipman. </li><li> RCA çözelti içinde aşama 2.1 Isı donatımı (ultra-saf su, hidrojen peroksit ve amonyak (5: 1: 1)) 75 °, 45 dakika için bir fırın içinde Cı ve daha sonra ultra-saf su ile durulanır. </li><li> Son olarak, bir kuru nitrojen akımı altında ya da bir fırında (100 ° C, 3 saat) olarak cam ve cımbız kurutun. </li></ol> 3. İpucu İşlevselleştirilmesi NOT: cımbız, kaplar, paslanmaz çelik, PTFE, cam ya da uygunsa organik çözeltiler, kimyasal olarak stabil olan herhangi bir başka malzemeden yapılmış. Aksi belirtilmediği sürece, R tüm adımları gerçekleştirmekİnkübasyon çözeltisi miktarı gerekli T. konsol fiş sayısına bağlıdır. Çıkma tüm zamanların ilgili çözümleri dalmış emin olun. NOT: Organik buharların solunması bir başlık kullanın. <ol><li> Konsol yüzeyi (&#39;aktivasyon&#39;) (yaklaşık 0.5 saat) üzerinde, OH-gruplarının oluşumu: <ol><li> Temiz bir cam slayt ve bir plazma odasına (100 W) koyun (10-100 pN / nm: SİN, yay sabiti malzeme) taze konsol yongaları yerleştirmek için cımbız kullanın. </li><li> Odasını (~ 0.1 mbar) boşaltın. </li><li> Oksijen gazı ile Taşkın odası ve yine tahliye. </li><li> (:% 20, süre: 15 dk, süreç basıncı: 0.25 mbar gücü) plazma işlemi etkinleştirin. </li></ol></li><li> Dirseklerin amino-silanizasyon (yaklaşık 1 saat): <ol><li> Plazma işlemi sırasında ideal bunu - APTES çözeltisi 2,5 ml hazırlayın cam Petri kabındaki (Tablo 1). </li><li> ImmediatelPlazma işleminden sonra y aseton 1 saniye, her konsol daldırma ve APTES çözeltide hemen sonra koyun. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Dikkatlice 10 ml aseton ve bir kez de 10 ml kloroform içinde iki kez konsol fiş yıkayın. </li><li> İsteğe bağlı son adım: temiz bir cam slayt üzerinde bir önceki aşamada elde edilen Talep konsol yongaları ve 70 ° C&#39;de 30 dakika boyunca pişirin. Yüzey aktivasyonu, örneğin, UV tedavisi 12 için alternatif stratejiler de vardır unutmayın. </li></ol></li><li> PEGylation (yaklaşık 2 saat): NOT: Amino-silanizasyonla sırasında adımlar 3.3.1-3.3.4 yapınız. NHS ve maleimid grupları, sulu ortamlarda hidrolize tabi PEG kendisi havada oksidasyon tabidir. Bu nedenle, (özellikle adımlar arasında) zamanlama kritik bir parametredir. Daha fazla bilgi için 13 bakın. <ol><li> Kloroform çözeltisi (Tablo 1) hazırlayın. </li><li> Yoğunlaşmayı önlemek içinSıcak PEG bölüntüsünün açılması ve uygun miktarda tartım önce oda sıcaklığına kadar tozlar. </li><li> Polimerler ya da amino grupları ile lipidlerin bağlanması için, ayrıca tamamen çözününceye kadar bunları döndürme, kloroform solüsyonu NHS-PEG-NHS (6 kDa) ve metil-PEG-NHS (5 kDa) çözme. Konsantrasyonları için Tablo 1&#39;e bakınız. <ol><li> Alternatif. tiyol grupları ile polimerlerin bağlanması için ayrı ayrı kloroform çözeltisi içinde Mal-NHS- PEG ve metil-PEG-NHS çözer. </li></ol></li><li> NHS- veya maleimide- ve metil-ile-sonlanan PEG molekülleri (500, tipik olarak 1) arasında belirli sayıda oranını ayarlamak için gereken çözüm karıştırın. Ideal oranı hazırlık-deney döngüsü bir seri tekrarlı belirlenmelidir unutmayın. </li><li> Kloroform buharlaşmasını önlemek üzere bir kloroform, doymuş bir atmosfer içinde 1 saat süre ile, PEG çözeltisi içinde konsol fiş inkübe edin. </li></ol></li><li> Molekül konjugasyon Probe(&gt; 1 saat): Not: Aşağıdaki 3.4.1-3.4.3 AFM ucuna farklı bir prob molekülleri kovalan bağlanması için üç örnek tarif edilmiştir. Her bir molekül için protokol ayarlanmalıdır. Örnek 1 ve 3, NHS-kimya örnek 2&#39;de tiol işlevselleştirilmiş polimer PI g-PS maleimid-kimya ile PEG&#39;e bağlanmış ise kullanılması daha fazla not. Detaylar 14 için bkz. <ol><li> Poli (amino asit), poli-D-tirosin (40-100 kDa) için <ol><li> 1 M NaOH içinde polytyrosine konjüge prob molekülü içinde çözülür. 1 mg / ml konsantrasyon ayarlayın. </li><li> Fonksiyonlaştırma hemen önce sıkma tuzdan arındırma sütunları (7 kDa MWCO) kullanılarak sodyum borat tamponu (pH 8.1) için NaOH Değişimi </li><li> Daha sonra, 5 ml etanol ve son olarak borat tamponu, 5 ml kloroform içinde, 5 ml, ilk konsol durulayın. </li><li> Polytyrosine borat tampon çözeltisi içinde 1 saat süre ile konsol fiş inkübe ve borat tampon maddesi ile durulanırve ultra saf su. Ölçüme kadar ultra saf su içinde saklayın. </li></ol></li><li> Doğrusal bir omurgasından (poliizopren, 119 kDa) sahip olan aşılanmış yan zincirler (polistiren, 88 kDa) 14 polimerler için <ol><li> Kuru kloroform içinde PI g-PS çözündürülür. 4 mg / ml konjugasyon çözeltisinin konsantrasyonu ayarlayın. </li><li> Kloroform, 5 ml ile konsol durulayın ve konjügasyon çözelti içinde en az 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Kloroform, 5 ml içinde tekrar durulanır ve kloroform ile doymuş bir ortamda kloroform içinde depolamak ölçüm kadar (kloroform buharlaşmasını önlemek için). </li></ol></li><li> Lipid PAPA için <ol><li> Kuru kloroform içinde PAPA&#39;YI eritin. 20 mM konsantrasyonu ayarlayın. </li><li> 5 ml etanol ve lipid çözeltisi içinde 1 saat süre ile konsolun inkübasyondan önce, aşırı saf su, 5 ml konsol durulayın. </li><li> İnkübasyondan sonra, kloroform 5 ml etano 5 ml konsol durulamal ve (bu sırayla) ılık, ultra saf su 5 ml bağlanmamış prob molekülleri kaldırmak ve kloroform kalıntılarının kurtulmak için. Hemen fonksiyonelleştirilmiş ipuçlarını kullanın. Kadar gerekli Alternatif, kloroform saklayabilirsiniz. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52456/52456fig1.jpg" /> Şekil 1. (A) şematik NHS kimya örneği kullanarak ucu fonksiyonelleştirme sürecini gösteren. Bir amino grubu aracılığıyla ucu bir prob molekülünü bağlamak için kullanılan (B) Kimyasal bağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 4. Yüzey Hazırlama <ol><li> Kendinden monte tek tabaka (SAM) Not: ilk olarak, örneğin bir yüzey olarak, kendi kendine bir araya tek tabaka seçildi. Literatürde 15 Bakınız </sAyrıntılar için&gt; kadar. <ol><li> Her biri 30 dakika için ultrasonik banyo içinde, aşırı saf su içinde iki kez daha sonra, deterjan çözeltisi ve temiz bir cam kayar. Daha sonra, ilave bir temizleme adımı olarak, 15 dakika boyunca 75 ° C&#39;de RCA çözeltisi (adım 2.3) yerleştirin. </li><li> Ceket 10 mil krom, nikel ve vakumlu bir kaplayıcı 100 nm altın ile kayar. Sonra önce doğrudan bir sonraki adıma RCA çözeltisi içinde tekrar buzdolabı ve temiz saklamak. </li><li> 12 saat boyunca 2 mM 1-dodecanthiol / etanol çözeltisi içinde, önceki aşamada elde edilen slaytlar inkübe edin. tiyol grupları, altın yüzeyine bağlanan ve bir hidrofobik tek tabakalı kendine bir araya getirmektedir. Bir azot gazı akımı ile etanol ve ultra saf su ve sonra kuru ile slaytlar durulayın. CCD kamera 10 ile bir gonyometre statik temas açısı ölçümleri ile hazırlanan yüzeye hidrofobikliğini onaylayın. </li></ol></li><li> Hidrojen sona elmas Not: ikinci, örneğin bir yüzey olarak, bir hidrojen sona elmas seçildi. Daha önce tarif edildiği gibi 16 yüzey hazırlığı gerçekleştirilmiştir. </li><li> Desteklenen çift katlı lipid NOT: Son örnekte, bir yüzey, destekli lipit iki tabakalı (SLB) bir yüzey olarak kullanılmıştır. Bu tür bir yüzey elde etmek için, fosfolipit POPC oluşan büyük tek lamelli vesiküller (LUVler) içindeki bir çözeltisi (0.1 mg / ml) çekme yöntemi ile oluşturulmuştur. Daha sonra LUV çözeltisi 50 ul Taze kırılmış mika tabaka (A = 1 cm²) üzerine konuldu ve 30 dakika süreyle inkübe edildi. Son olarak çözelti, ultra saf su 20 ml ile yıkandı. SLBS hazırlanmasına ilişkin ayrıntılı bilgi için 17,18 bakınız. </li></ol> 5. Veri Toplama NOT: deneyler için, sıvı ölçmek için yeteneği sağlayan bir AFM, kullanın. veri toplama ve veri analizi işlemleri ne olursa olsun kullanılan AFM modeli uygulanabilir. Ayrıca, bazı deneylerde bu sıcaklık kontrolü imkanı bulunması avantajlıdırSıvı hücre içinde e. Konsol saptırma lazer ışını saptırma yöntemiyle 19 ile tespit edilmiştir. Yay sabitleri ısıl gürültü yöntemi 20 ile belirlenmiştir. <ol><li> Sıvılarında ölçmek için uygun bir AFM konsol tutucu içine fonksiyonlandırılmış konsol yerleştirin. </li><li> (Hazırlık yukarıya bakınız) yüzey koyun AFM içine numune alınacak ve sıvı ile örtün. Hem konsol ve yüzey artık konsol ucu yüzeyine doğru bakacak şekilde sıvıya batırılmış olmalıdır. Birçok durumda bir sıvı damla yeterli olduğuna dikkat edin. Sıvının her durumda buharlaştırılarak bir kapalı akışkan hücre kullanılarak, örneğin, kaçınılmalıdır. </li><li> Varsa, kontrolör üzerinde istenen sıcaklığını ayarlamak. </li><li> Sistem, en azından yarım saat boyunca dengelenmeye bırakın. </li><li> Etkileri sönümleme herhangi bir yüzeye çıkarmak için uzak yüzeyden konsol ile konsolun bir termal gürültü spektrumu kaydedin. Not genellikle 1 olduğu0 ya da daha fazla spektrumu yeterli bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için kartı olması gerekir. </li><li> Yüzeyi yaklaşın. Ucu geometrisi ve uç işlevselleştirilmesini korumak amacıyla yaklaşım süreci dikkatle yürütülen gerektiğini unutmayın. Bu aralıklı, kontak modunda, yaklaşan, örneğin, gerçekleştirilebilir. </li><li> Nm / volt olarak ölçülen ters optik kolu hassasiyeti (InvOLS) belirleyin. Sert bir yüzeye karşı konsol ucu iterek bunu yapın. <ol><li> Fotodiyot gerilimi değişim vs piezo seyahat mesafesi eğimini ölçerek InvOLS belirleyin. Konsol uç yüzeyi ile temas halinde olan kuvvet-mesafe eğrisi parçası için bir çizgi monte edin. Lipit bilayers gibi yumuşak bir yüzey içeren deneylerde, bir çift katlı lipid (&#39;kusur noktalar&#39;) ile kaplı olmayan alanlarda bu adımı yürütmek. </li></ol></li><li> Isıl gürültü spektrumu bir harmonik osilatör takarak yay sabiti (pN / nm) belirleyin. Kullanımyay sabiti belirlenmesi için otomatik yazılım fonksiyonu; aksi takdirde edebiyat 20 danışın. </li><li> Denemeyi başlatın. <ol><li> Her deneysel koşul Tutanak sayıda kuvvet-mesafe eğrileri. 1 mikron mesafe geri, 5 kHz, 1 mikron / sn ucu hızı Örnekleme oranı: Genellikle, deneysel parametreler için aşağıdaki değerleri kullanın. Not: Bazı durumlarda, incelenen deney dinamiklerine bağlı olarak, (&#39;bekleme süresi&#39;) yüzeyi ile temas halinde ucu ile belli bir süre beklemek gerekli olabilir. Not: Deney özel parametreler, yukarıda verilen değerlerden büyük ölçüde sapma gösterebilir. </li><li> Uzun süreli ölçümler sırasında, fotodiyot yeniden konumlandırarak zaman zaman fotodiyot üzerine lazer konumunu sıfır. </li><li> İsteğe bağlı: Her kuvvet eğrisi sonra, başka bir xy konumuna AFM-ucu değiştirin. </li><li> Deneyin sonunda, duyarlılık ve bahar belirlemek ConstaSistemin tutarlılık ve istikrar kontrol etmek için tekrar nt. NOT: öncesi ve deney sonrası yay sabiti ve duyarlılık karşılaştırılması da sistemin özellikleri ve bahşiş özellikleri deney boyunca değişmeden kaldığını sağlamak için bir araçtır. Yay sabitleri farkı (&lt;=% 15) çok büyük değilse yay sabiti tayin içsel belirsizlik de% 15 civarında olduğu, onlar, ortalama olabilir. Daha büyük farklar için, ilk bulmak ve daha fazla deneyler ile devam etmeden önce değişen belirgin yay sabiti nedenini ortadan kaldırmak için tavsiye edilir. </li></ol></li></ol> 6. Veri Hazırlama NOT: genellikle newton ve nanometre yanı sıra veri açıklanmıştır düzeltmek için birimleri dönüştürmek için deney belirli tip bağımsız yürütülen bu bölümde genel veri hazırlama adımlarında. Deney belirli veri analizleri br olaniefly ilgili temsili bir örneği bölümünde aşağıda daha ayrıntılı olarak tarif edildiği. <ol><li> Tipik olarak, tüm veri hazırlama yürütmek ve analiz yazılımı IGOR 6 Pro dayalı, örneğin ev-yazılı algoritması tarafından otomatik adımları. </li><li> InvOLS [nm / V] ve bahar sabit [NN / nm] ile çarpılarak yürürlüğe ham sapma sinyali (Defl) [V] dönüştürün. </li><li> Yüzey (boş kanat) yeterli mesafede dirsekteki kuvvet 0 nN olur şekilde kuvvet Ofset. </li><li> Gerçek ucu konumunu dikkate konsol bükülmesini alır z *, (yüzey göre ölçülen da denir ayrılması) hesaplayın: <img alt="Denklem 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52456/52456eq1.jpg" /></li><li> Z * = 0 yüzeyinin z pozisyonuna karşılık gelecek şekilde Z * Ofset. NOT: Burada, F ucu ve dolayısıyla viraj hareket kuvvetKonsol (adım 6.2 olarak tespit edilmiştir.) z, (doğrudan alet ile gösterilir) ve k, yay sabitesine (adım 5.8 belirlenen) temsil ölçülen z sensör konumu s. </li></ol><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52456/52456fig2.jpg" /> Numune hazırlama, veri toplama ve veri analizi gösteren Şekil 2. Süreç akış diyagramı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol><li>Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Single+Membrane+Proteins+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Single-Molecule+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy.</a> Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).</li>
<li>Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+imaging+of+walking+myosin+V+by+high-speed+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy.</a> Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).</li>
<li>Magonov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+in+Analysis+of+Polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers.</a> Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).</li>
<li>Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+mechanics+of+single+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules.</a> Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).</li>
<li>Li, H., Linke, W. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+engineering+of+the+giant+muscle+protein+titin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reverse engineering of the giant muscle protein titin.</a> Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).</li>
<li>Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+DNA+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of DNA mechanics.</a> Current opinion in structural biology. 10 (3), 279-285 (2000).</li>
<li>Zhang, W., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+mechanochemistry+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Single molecule mechanochemistry of macromolecules.</a> Progress in Polymer Science. 28 (8), 1271-1295 (2003).</li>
<li>Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Stretched+Single+Polymers%3A+Atomic-Force-Microscope+Experiments+Versus+Ab-Initio+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory.</a> Physical Review Letters. 94 (4), 048301(2005).</li>
<li>Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lipid+Extraction+-+The+Anchoring+Strength+of+Cholesterol+in+Liquid+Ordered+and+Liquid+Disordered+Phases%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Single Lipid Extraction - The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases.</a> Biophysical journal. 107 (5), (2014).</li>
<li>Pirzer, T., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+mechanism+of+polypeptides+and+their+location+at+hydrophobic+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces.</a> Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).</li>
<li>Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+measurements+with+the+atomic+force+microscope%3A+Technique%2C+interpretation+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications.</a> Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).</li>
<li>Nash, M. A., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Adhesion+of+a+Copolymer+to+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+NANO%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold.</a> ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).</li>
<li>Hermanson, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermanson%2C+G+%22Bioconjugate+Techniques%22">Bioconjugate Techniques</a>. , Academic Press. New York. (1996).</li>
<li>Kienle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+molecular+architecture+on+single+polymer+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Effect of molecular architecture on single polymer adhesion.</a> Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).</li>
<li>Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+monolayers+of+alkanethiols+on+gold%3A+comparisons+of+monolayers+containing+mixtures+of+short-+and+long-chain+constituents+with+methyl+and+hydroxymethyl+terminal+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups.</a> Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).</li>
<li>Dankerl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diamond+Transistor+Array+for+Extracellular+Recording+From+Electrogenic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells.</a> Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).</li>
<li>Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayer+formation+by+vesicle+fusion%3A+the+interaction+of+phospholipid+vesicles+with+surfaces+and+the+effect+of+gramicidin+on+bilayer+properties+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy.</a> Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).</li>
<li>Stetter, F. W. S., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nanomechanical+Properties+of+Lipid+Membranes+are+Significantly+Influenced+by+the+Presence+of+Ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol.</a> Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).</li>
<li>Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+analysis+of+the+optical+beam+deflection+technique+for+use+in+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy.</a> Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).</li>
<li>Hutter, J. L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+atomic-force+microscope+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868(1993).</li>
<li>Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+desorption+kinetics+from+single+molecule+force+spectroscopy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).</li>
<li>Li, I. T. S., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+free+energy+governs+single+polystyrene+chain+collapse+in+water+and+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).</li>
<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory%2C+analysis%2C+and+interpretation+of+single-molecule+force+spectroscopy+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).</li>
<li>Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lipid+Extraction%3A+The+Anchoring+Strength+of+Cholesterol+in+Liquid-Ordered+and+Liquid-Disordered+Phases%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases.</a> Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).</li>
<li>Horinek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+adsorption+on+a+hydrophobic+surface+results+from+an+interplay+of+solvation%2C+surface%2C+and+intrapeptide+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).</li>
<li>Ebner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalization+of+probe+tips+and+supports+for+single-molecule+recognition+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+current+chemistry%22%5BJournal%5D)">Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy.</a> Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).</li>
<li>Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Adhesion+at+the+Solid-Liquid+Interface+Probed+by+a+Single-Molecule+Force+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor.</a> Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).</li>
<li>Morfill, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-matured+recombinant+antibody+fragments+analyzed+by+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Son on yılda, tek bir molekül deneyler moleküler mekanizmaları görülmemiş anlayışlar sağladı ve yaşam bilimleri ve ötesinde paha biçilmez bir yaklaşım olduğu ortaya çıktı oylandı. SMFs deneyler, ideal olarak, tek ve aynı molekül deney bütün boyunca kullanıldığı iyi ve anlamlı istatistikleri elde etmek için. Moleküllerin toplulukları ile deneylerde aksine, SMFs deneyleri nadir olaylar ve gizli moleküler devletleri tespit edebiliyoruz. Tek bir molekül deneylerin başka bir avantajı, moleküler dinamik simülasyonları 24...

Son 30 yılda, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) her üç boyutta molekül uzaysal çözünürlüğü sağlar ve çeşitli çözücü çalıştırılabilir beri biyolojik 1,2 ve sentetik 3 malzeme ve yüzeyleri incelemek için değerli bir görüntüleme tekniği olduğu ortaya çıktı etti ortamları. Buna ek olarak, AFM-tek molekül kuvvet spektroskopisi (SMFs) rejimi μN için pN arasında değişen kuvvetleri ölçmek için sağlar ve 4,5 katlama protein içine örneğin görülmemiş içgörü, polimer fiziği 6 vermiş - 8, ve tek bir molekül yüzey etkileşimi 9 - Tek molekülleri yerine moleküllerin bir topluluk okuyan arkasında 12 .The mantık genellikle nadir olaylar veya gizli moleküler durumları maske etkileri ortalama kaçınmaktır. Bundan başka, bu gibi çevre uzunluğu Kuhn uzunluğu, yapışma serbest enerjisi gibi moleküler parametrelerin çok sayıda olabilirelde edilmiştir. Bu, aşağıdaki örneklerde detaylı olarak tarif edilmektedir. Tipik AFM SMFs deneyde, prob molekülü, bir bağlayıcı molekül vasıtası ile çok keskin ucu ile birleştirilir. ucu kendisi bükülebilir konsolun sonunda yer almaktadır. Uç yüzeyi ile temas haline getirilir ise prob molekülü, bu yüzey ile etkileşim. Yüzeyden molekülün koparılması için ucu, kuvvet ve dolayısıyla serbest enerji geri çekilmesi üzerine konsol sapmasını gözlemleyerek tespit edilebilir. Anlamlı istatistikleri elde etmek için, adı verilen kuvvet-mesafe eğrisi çok sayıda elde edilecek var. Ayrıca, prob molekülü AFM ucuna kovalent bağlanmış olmalıdır (yani, bir ve bütün deney süresi boyunca aynı prob molekülünü kullanarak) gerçek tek bir molekül deneyler var. Burada, bir kovalent bağ aracılığıyla oluşturulması, tek bir molekül ile konsol işlevsellik için bir deney protokolü sunulmaktadır. tek bir molekül ya da bir amino ya da bir tio üzerinden bağlanabilirAFM ucu l grubudur. birleşme işlemi kullanılan polimer çözme özelliklerini hesaba almak için (organik ve sulu) çözücülerin geniş bir yelpazesi içinde uygulanabilir. Birinci bölümde, genel bir protokol kovalent açıklanan bir AFM ucu bir bağlayıcı molekülü vasıtasıyla tek bir molekül (&quot;prob molekülü&quot;) eklemek için. Bu amaçla, organik NHS- ya da maleimid-kimya 13 kullanılır. Üç örnek moleküller için protokol ile birlikte, veri toplama, veri analizi işlemleri tarif edilmiştir ve daha fazla okuma referansları verilmiştir. Örnek moleküllerdir: (lineer) polimeri tirosin, ekleme polimer PI g PS ve lipit POPE. Örnek kovalent sisteinleri eklemek için bu protokolün hafif varyasyonları içerir. Buna ek olarak, bir bölümü, bir elmas yüzey, CH3 -Self monte tek ve lipid çift tabakaları gibi farklı yüzeylerin hazırlanması ile ayrılmıştır. Bu arayüzler ata vartr iyi referanslar ve örnek olmak.

<table><tr><tbody><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Hellmanex III alkali sıvı konsantre (deterjan çözeltisi)</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RCA (ultra saf su, hidrojen peroksit (%35), amonyak (%32); 5:1:1(h/h/v))Sigma</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Vectabond reaktifi / APTES (3-Aminopropil)trietoksisilan</td><td>Vectorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuru aseton (< 50 ppm H2O)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuru kloroform (> %99,9)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trietilamin</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasaf su</td><td>Biochrom, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-sodyum tetraborat (>&nbsp; %99,5)</td><td>Biochrom, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borik Asit Biochrom</td><td>, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek Fonksiyonlu &alfa;-metoksi-&omega;-NHS PEG, 5 kDa, " metil-PEG-NHS"</td><td>Rapp, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifonksiyonel &alpha;,&omega;-bis-NHS PEG, 6&nbsp; kDa, " NHS-PEG-NHS"</td><td>Rapp, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifonksiyonel &alfa;-maleimidoheksanoik- &omega;-NHS PEG, 5 kDa, " Mal-PEG-NHS"</td><td>Rapp, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prob molekülü (polimer, lipid, etc.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Yeterli miktarda emzikli cam kristalleştirici kaplar (10&nbsp; ml), cam Petri kapları (500 & mikro; l) ve cam kapaklar</td><td>VWR International GmbH, Almanya</td><td></td><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Laboratuvar fırını modeli UF30</td><td>Memmert, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrollü sonikatör</td><td>VWR International GmbH, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plazma sistemi "Femto", 100 W</td><td>Diener, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Her organik çözücü için ayrı bir cam şırınga</td><td>VWR International GmbH, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>VWR International GmbH, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri (0,5 ml veya 1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetler: 10-100 ve mikro; l, 50-200 ve mikro; l ve 100-1.000 & &mikro; l</td> Sıcaklık kontrollü akışkan hücreli <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM (örneğin Biyoısıtıcılı MFP-3D)</td><td>Asylulm Research, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soft SiN konsollar, tipik olarak silisyum nitrürden (SiN) yapılır (yay sabiti 100 pN/nm'den az, örn. MLCT)</td><td>Bruker AXS, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

atomik kuvvet spektroskopi tek molekül yapışma incelenmesi

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomik kuvvet spektroskopisi yüzeyleri ve arayüzleri de molekülleri incelemek için ideal bir araçtır. Kovalent bir AFM ucu üzerine çift tek moleküllerin büyük bir çeşitlilik için deneysel bir protokol sunulmuştur. Aynı zamanda AFM ucu ucuna AFM bağlı tek molekülleri incelemek için bir ön koşuldur ucu ve alt tabaka arasındaki spesifik etkileşimleri önlemek için pasifize edilir. Analizler yapışma kuvveti, yapışma uzunluğu, kısa bir süre sunulmaktadır ve ileri okuma için dış referanslar verilmektedir katı yüzeyler ve biyo-arayüzleri bu moleküllerin serbest enerjisini belirlemek için. Örnek molekülleri, poli (amino asit) polytyrosine olan ekleme polimer PI g PS ve fosfolipid POPE (1-palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3-fosfoetanolamin). Bu moleküller CH 3 -SAMs gibi farklı yüzeyler, hidrojen sona elmas kusturulmuş ve çeşitli çözücü koşullarda lipit katmanlarını desteklenmektedir. Son olarak,kuvvet spektroskopik tek bir molekül deneyler avantajları gerçekten tek bir molekülün deneyde incelenmiştir belirtilen yöntemler karar da dahil olmak üzere ele alınmaktadır.

Aşağıda yukarıda belirtilen sonuçları örneğin molekülleri, yani polimer poli (amino asit) polytyrosine tarif ekleme polimer PI g PS ve fosfolipid POPE sunulmaktadır. İlk olarak her örnek için temin edilmiştir, veri toplama ve veri hazırlama için özel ayrıntıları deney. Daha sonra, bu moleküller, farklı yüzeylerden dezorbe deneylerde için örnek sonuçlar (CH 3 -SAMs, hidrojen sona elmas ve lipid bilayers) gösterilmektedir. Yapışma kuvveti, yapışma uzunluğu ve serbest enerji belirlenmesi tanıtıldı. ...

Çok çeşitli tek molekülleri kovalent olarak bir AFM ucuna bağlamak için bir protokol sunulmuştur. Bu moleküllerin katı mesnetler ve biyo-arayüzler üzerindeki yapışma kuvvetini ve serbest enerjisini belirlemek için prosedürler ve örnekler verilmiştir.

Atomik Kuvvet Spektroskopi Tek Molekül Yapışma incelenmesi

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Bu prosedürün genel amacı, aynı moleküllerle birden fazla kez dört spektroskopik yüzey desorpsiyon deneyi gerçekleştirmek amacıyla, tek bir polimeri bir AFM konsantre ucuna bağlamaktır. Bu işlem, öncelikle hidroksil grupları oluşturmak için ucun yüzeyinin plazma ile aktive edilmesiyle, ikinci adımda ise uç yüzeyinde amino grupları oluşturan bir test çözeltisi ile konsantre ucun amino silanizasyonu ile gerçekleştirilir.Üçüncü adım, polietilen glikol moleküllerinin amino gruplarına bağlanmasıdır. Bu moleküller, uç ile substrat arasındaki spesifik olmayan etkileşimleri önler ve polimerler için bağlayıcı moleküller olarak görev yapar. Son olarak, bir prob oluşturmak için polimerler polietilen glikol moleküllerine konjuge edilir.Ölçümler, bu prosedürün gerçekten aynı polimer kuvvet probunun eksiksiz bir deney seti veya benzer şekilde, yüzlerce kuvvet-mesafe eğrisi için kullanılmasını mümkün kıldığını göstermektedir. Tek molekül deneylerinin topluluk yöntemlerine göre temel avantajı, topluluk ortalamasında gizli kalacak olan nadir konformasyonların ve seyrek durumların incelenebilmesidir. Küçük boyutları sayesinde bu deneyler, moleküler dinamik simülasyonları ile doğrudan karşılaştırılabilir.İlk adım, prob moleküllerinin kantiiever ucuna kovalent olarak bağlanmasıdır. Taze silikon nitrür cantilever çiplerle başlayın; yay sabiti 10 ila 100 pN/nm olan çipler kullanın.Bunları temiz bir cam lam veya Petri kabına yerleştirmek için cımbız kullanın. Ardından, çiplerin bulunduğu lamı, oda vakumlandıktan ve 0,25 millibar ve 20 watt değerlerinde 15 dakika boyunca oksijenle yıkanan 100 watt'lık bir plazma odasına yerleştirin. Sonraki adımlarda, plazma işlemi sırasında organik buharların solunmasını önlemek için bir çeker ocak kullanın.Cam bir petri kabı içerisinde konsol kirişlerin amino silanizasyonu için hazırlık yapın ve 2.5 milliliters yükseltme test çözeltisi yerleştirin. Ayrıca, aseton içeren bir kap hazırlayın. Plazma işlemi tamamlandıktan hemen sonra konsol kirişleri geri alın.Sırasıyla her bir konsolu bir saniye boyunca asetona batırın ve ardından Optus solüsyonuna yerleştirin. Devam etmeden önce konsolları oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Konsollar inkübe olurken, suyun ve havanın bileşenler üzerindeki etkilerini en aza indirmek için pegilasyon hazırlıklarına başlayın.Biri m peg ve NHS, diğeri ise boya içeren daha önceden hazırlanmış eph tüpleri ile başlayın. NHS Peg. Her bir tüpün içeriğinin ağırlığını belirleyin.Ardından, EG NHS içeren tüple çalışın ve kloroform ekleme aşamasına geçin. Final konsantrasyonu 25 millimolar olacak şekilde ve sonraki adımlarda kantileverleri örtecek yeterli miktarda kloroform ekleyin. Tozun çözündüğünden emin olmak için tüpü bir vorteks karıştırıcıya yerleştirin.Diyetle çalışmak için EG NHS içeren tüpü kenara ayırın. NHS peg. Nihai konsantrasyon 0,25 millimolar olacak şekilde kloroform ekleyin.Tozun tamamen çözündüğünden emin olmak için bir vorteks karıştırıcı kullanın. Ardından, diet NHS peg ile metil peg NHS molekülleri arasındaki oranı ayarlamak için çözeltileri karıştırın. Bu oran tipik olarak 1:500'dür.Buharlaşmayı sınırlamak için kapaklı küçük bir cam Petri kabı temin edin ve bunu konsolları oluşturacak karışımla doldurun. İnkübasyonu tamamlayın. APT test çözeltisi için, durulama amacıyla yaklaşık 10 mililitre aseton içeren iki kap ve bir kap kloroform hazır bulundurun.Her birini iki kez asetona ve bir kez kloroforma daldırın ve ardından polietilen glikol çözeltisine yerleştirin. Kabı kapatın ve konsolları çözelti içerisinde tutun. Bir saat boyunca, bu durumda poli amino asit poli de tirozin olan bir prob molekülünün kovalent bağlanması için hazırlık yapın.Bir molar sodyum hidroksit hacmi ile başlayarak, prob molekülünü mililitre başına bir miligram konsantrasyona ulaşana kadar bunun içinde çözün. Poli D tirozin için, fonksiyonelleştirmeden hemen önce sodyum hidroksit yerine pH 8 ila 8.5 sodyum borat tamponu kullanın.Konsol kollarının polietilen glikol çözeltisindeki inkübasyonları tamamlandığında, onları durulamak için üç kap ve bir kap poli tirozin bore hazırlayın. Durulama için kullanılacak sekiz tampon çözeltisi; 5 mL kloroform, 5 mL etanol ve 5 mL bore tamponundan oluşur. Yaklaşık 300 µL poli tirozin bore tampon çözeltisi kullanın.Konsol kirişleri geri alın ve her birini sırasıyla önce kloroforma, ardından etanola ve sonrasında bore eight tampon çözeltisine daldırın. Konsol kirişlerini politirozin bore eight tampon çözeltisine yerleştirmeden önce, çiplerin bir saat boyunca inkübe olmasını sağlayın. Bir saatlik sürenin sonunda, konsol kirişlerini durulamak için bir kapta yaklaşık 5 mL bate tampon çözeltisi ve başka bir kapta 5 mL ultrapure su hazırlayın; ayrıca onları saklamak için 20 mL ultrapure su bulundurun.Konsol kirişleri alın ve her birini önce Boite tamponuna, ardından durulamak için ultrapure suya daldırın. Daha sonra saklamak için ultrapure suya daldırın. Konsol kirişleri artık veri toplama işlemi için kullanılabilir.AFM ucu fonksiyonelleştirildikten, bir yüzey hazırlandıktan ve monte edildikten sonra, AFM veri toplama adımlarına başlayın. İlk olarak, fonksiyonelleştirilmiş kantileveri, sıvılarda ölçüm yapmaya uygun bir AFM kantilever tutucusuna yerleştirin. Ardından, kantilever tutucusunu AFM kafasına bağlayın.Kaldıracı ve yüzeyi daldırmak için sıvı hücresine su dökerek işleme devam edin. Ardından AFM başlığını sıvı hücresinin üzerine indirin. Sistemin en az yarım saat boyunca dengelenmesini bekleyin.Dengelenmeden sonra, kantileveri yüzeyden uzağa konumlandırın ve ardından termal gürültü spektrumlarını kaydedin; yüzey sönümleme etkilerini hariç tutmak için yeterli bir sinyal-gürültü oranı elde etmek amacıyla 10 veya daha fazla spektrum gereklidir. Sonrasında, ters optik kaldıraç hassasiyetini ölçmek için yüzeye dikkatlice yaklaşın.Bu işlem, kuvvetin piezo hareket mesafesine karşı kaydedilmesi için konsol ucunun sert bir yüzeye bastırılmasını içerir. Temas sırasındaki eğimi ölçün ve ters optik kaldıraç hassasiyetini belirlemek için bu değerin tersini alın. Ardından, ters optik kaldıraç hassasiyeti ve termal gürültü spektrumlarını kullanın. Termal gürültü spektrumuna bir harmonik osilatör uydurarak konsolun yay sabitini belirleyin.Şimdi veri toplama için uygun parametreleri ayarlayın. Veri toplama işleminin sonunda, her bir deneysel koşul için çok sayıda zorlanmış mesafe eğrisi kaydedin. Sistemin tutarlılığını ve stabilitesini kontrol etmek için hassasiyeti ve yay sabitini yeniden belirleyin.Kırmızı renkle gösterilen bu zorlanmış mesafe izi örneği, metil kendi kendine organize olmuş tek tabakalı saf olmayan sudan poli tirozin geri çekilmesinden alınmıştır. Sıfır kuvvete olan tek basamaklı düşüş, tek bir molekülün ayrılmasını göstermektedir. Sigmoidal uyum siyah renkle gösterilmiştir.Çıkarılan plato uzunluğu ve plato kuvveti oklarla belirtilmiştir. Kantileverin uzama-geri çekilme hızı 0.5 µm/s ve yüzeydeki bekleme süresi bir saniyeydi. Ölçüm için kullanılan farklı sıvı ortamlar, çıkarılan plato kuvvetinde değişikliklere neden olmuştur.Bu histogramlar, saf su ve su-etanol karışımlarındaki ölçümler için elde edilen plato kuvvetini yansıtmaktadır. Her bir çözelti için tek bir polimer üzerinde en az 300 kuvvet-mesafe izi kaydedilmiştir. Burada, saf suda ve su-etanol karışımlarındaki ölçümler için elde edilen plato uzunluğuna ait benzer histogramlar gösterilmiştir.Etanol eklenmesi, poli tirozin ile yüzey arasındaki hidrofobik etkileşimi zayıflatarak daha düşük bir plato kuvvetine ve plato uzunluğunda azalmaya yol açar. Bu durum, tepe plato uzunluğuna karşı tepe plato kuvvetinin verildiği bu grafikte özetlenmiştir. Uzmanlaşıldığında, fonksiyonelleştirme protokolü geliştirme aşamasından sonra yaklaşık dört saat içinde tamamlanabilir.Bu teknik, fizik ve kimya alanındaki araştırmacıların arayüzeylerdeki polimerlerin yapışmasını ve kırılmasını incelemelerine olanak sağlamıştır.

investigating-single-molecule-adhesion-by-atomic-force-spectroscopy

Research

JoVE Journal

Engineering

Mühendislik

Hem molekülleri etkileşen hücrelerin yüzeylerinde demirlemiş olan reseptör-ligand etkileşimi kinetiği ölçmek için bir yapışma frekans tahlil açıklanmıştır. Bu mekanik tabanlı test mikropipet basınçlı bir insan adezyon sensörü olarak kırmızı kan hücresi ve integrin αLβ2 ve hücrelerarası adezyon molekülü-1 reseptörleri ve ligandlar etkileşim olarak kullanarak örneklenir.

Yapışma için Frekans Testi Yerinde</emHücre-Hücre Arayüz Çapraz Junctional Moleküler Etkileşimler> Kinetik Analizi

Selülozomlar, selülozu sindirmek için tasarlanmış multienzim kompleksleridir. AFM tabanlı SMFS, selülozomla ilişkili protein düzeneklerinin mekanik özelliklerini ve katlanma konfigürasyonunu incelemek için kullanıldı. Selülozom montajında yer alan bireysel reseptör-ligand komplekslerinin etkileşimlerini incelemek için protein immobilizasyonu, veri toplama ve veri analizi için eksiksiz bir iş akışı sunuyoruz.

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Kolloidal prob nanoskobu, kolloidal sistemlerin fiziksel stabilitesi ve pıhtılaşma kinetiği hakkında bilgi edinmek ve biyolojik sistemleri kullanarak ilaç keşfi ve formülasyon bilimlerine yardımcı olmak için çeşitli alanlarda kullanılabilir. İçinde açıklanan yöntem, bu tür sistemleri incelemek için nicel ve nitel bir araç sağlar.

Kolloidal Probe Nanoscopy kullanarak parçacık-parçacık Etkileşimleri Nicel ve Nitel Sınav

Burada bir atomik kuvvet mikroskopu (AFM) ile tek bir molekül kuvveti spektroskopi ölçümleri ile iyi tanımlanmış bir inorganik yüzey ve ya peptitler veya amino asitler arasındaki etkileşimlerin kuvvetini ölçmek için bir protokol mevcut. ölçümü ile elde edilen bilgiler, daha peptid inorganik madde interfazda anlamak önemlidir.

Tek Molekül Kuvvetleri Spektroskopisi kullanarak İnorganik Malzemelerle Amino Asitler ve Peptitler Etkileşimi içine Trendleri

Biz ayrıntılı yordamlar ve mekanik özellikleri ve mekanik unfolding yollar tek protein moleküllerinin bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmek için stratejileri açıklar. Ayrıca seçim ve bloklama iyi tek protein molekülü kayıtları için bir başvuru olarak temsilcisi sonuçları göster.

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

Bu iletişim kuralı ile örneklenir bir heterobifunctional silane Bağlantı Aracısı atomik kuvvet mikroskobu dayalı tek molekül kuvvet spektroskopisi için tasarlanmış silikon-oksit yüzeyler için proteinlerin immobilizasyon kovalent açıklar RrgA etkileşim (pilus-1 İpucu adhesin, S. pneumoniae) fibronektin ile.

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

Burada, protein monomerini kontrollü bir dizi ile protein polimeri oluşturan enzimler tarafından biraraya getirmek ve tek moleküllü kuvvet spektroskopisi çalışmaları için yüzeyde hareketsiz hale getirmek için bir protokol sokuyoruz.

OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Prob moleküllerinin atomik kuvvet mikroskobuna kovalent bağlanması (AFM) kantilever uçları fiziksel özelliklerinin araştırılması için gerekli bir tekniktir. Bu bize yüksek tekrarlanabilirlik ile AFM tabanlı tek molekül kuvvet spektroskopisi ile polimerlerin germe kuvveti, desorpsiyon kuvveti ve uzunluğu belirlemenize olanak sağlar.

AFM tabanlı Kuvvet Spektroskopisi için Tek Moleküllerin Kovalent Eki

Topluluk kuvvet spektroskopisi (EFS), biyofiziksel ve biyosensing alanlarında bir grup biyomoleküler yapının mekanik olarak açılması ve gerçek zamanlı olarak algılanması için sağlam bir tekniktir.

Kesme Kuvvetleri ile Topluluk Kuvveti Spektroskopisi

Biz tek-molekül floresan görüntüleme için minimize hidrodinamik büyüklüğü ile kolloidal Kuantum noktalarının hazırlanması tarif. Konvansiyonel kuantum noktaları ile karşılaştırıldığında, bu nanopartiküller globüler proteinlerin boyut olarak benzer ve tek-molekül parlaklık, fotodegradasyon karşı kararlılık ve proteinleri ve hücreleri nonspesifik bağlanma direnci için optimize edilmiştir.

Tek molekül Görüntüleme için kompakt Kuantum Noktaları

Öğrenin tek polimeri AFM kantilever ucuna kovalent bağlama yöntemini. Polietilen glikol bağlayıcıları kullanarak yüzey desorpsiyon spektroskopi deneyleri için tekrarlanabilir ölçümler yapın.

Atomik Kuvvet Spektroskopi Tek Molekül Yapışma incelenmesi

Daha fazla video keşfet