Myh6-Promotörle Seçim ile kombinasyonu ES-Hücre-Programlama dayanarak Kemirgen Kardiyak Kalp Pili Hücre Agregaların Üretimi

Bu prosedürün genel amacı, oldukça saf sinüs nodal hücreleri üretmektir. Bu, ilk olarak ortamı değiştirerek hücre farklılaşmasını indükleyerek ve tanımlanmış bir boyutta embriyonik cisimlerin oluşumuyla sonuçlanan asılı damlalar yaparak gerçekleştirilir. Daha sonra, embriyonik cisimler jelatin kaplı bir tabak üzerine oturtulur, böylece bir hücre tabakası oluştururlar.

Daha sonra antibiyotik seçimine başlanır ve sadece kardiyomiyositler hayatta kalır. Son olarak, hücre tabakası, hızlı atan tek sinüs nodal hücreleri veya küçük sinüs nodal cisimleri elde etmek için ayrıştırılır. Sonuç olarak, canlı hücre görüntüleme, sinüs nodal hücrelerinin yüksek atım frekanslarını göstermek için kullanılır.

Bu yöntemin temel avantajı, örneğin ilaç testi için yüksek saflıkta sinüs nodal hücreleri üretebilmenizdir. Yöntem, sinüs düğümü hastalığındaki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir, çünkü hücreler bize altta yatan mekanizmalar hakkında bilgi verecektir. Teknoloji, yöntemi geliştiren doktora öğrencimiz Julia Yung tarafından laboratuvarda sunulacak, Bir ES hücre hattı ile başlayarak ve pluripotent kök hücreler, farklılaşma prosedüründen iki gün önce PSC'leri besleyici hücrelerden çıkarmadan iki gün önce metin protokolünde belirtildiği gibi ışınlanmış besleyici hücrelerle birlikte yetiştirildi.

Hücreleri yıkamak için 10 mililitre PBS kullanın. Daha sonra yedi mililitre kollajenaz dört çözelti ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Daha sonra 50 mililitrelik bir tüpe steril bir 40 mikrometre filtre yerleştirin.

Ardından, kollajenaz solüsyonunu beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek PSC kolonilerini dikkatlice durulayın. Hücre süspansiyonunu filtreye aktarın ve filtreyi üç kez durulamak için sekiz mililitre PBS kullanın. Ardından filtreyi ters çevirin ve bir Petri kabına baş aşağı yerleştirin ve filtrenin altına 10 mililitre PBS pipetleyin.

PSC kolonilerini çıkarmak için, şimdi hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 300 kez beş dakika santrifüjleyin. PBS'yi çıkarın, hücreleri bir mililitre Accutane içinde askıya alın ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka işleminden sonra 10 mililitre PBS ekleyin.

Hücre çözeltisini beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve 300 kez G'de beş dakika santrifüjleyin. PBS çıkarıldıktan sonra, hücreleri yeniden süspanse etmek ve hücre sayısı tohumunu belirlemek için 10 mililitre hücre yetiştirme ortamı kullanın. 75 santimetre karelik bir filtre şişesinde santimetre kare başına 15.000 hücre ve şişenin 50 olması gerektiğinde% 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte iki gün boyunca yetiştirin % 70'e kadar birleşik. Hücreleri hasat ettikten ve Resus, metin protokolüne göre farklılaşma ortamında süspanse ettikten sonra, hds'nin kurumasını önlemek için 20 mililitre su ve beş mililitre asılı damla veya HD solüsyonunu ikinci dereceden bir petri kabına pipetleyin.

Ardından, bir tepsiye 50 mililitreye kadar hücre süspansiyonu pipetleyin. Daha sonra Petri kabının kapağını ters çevirin ve 12 kanallı bir pipet kullanarak, her biri 20 mikrolitre hücre süspansiyonu içeren 180 HDS'yi kapağın üzerine yerleştirin. Kapağı dikkatlice ters çevirin ve Petri kabına yerleştirin.

Hücrelerin ebs oluşturmasına izin vermek için iki gün inkübe ettikten sonra, ikinci dereceden Petri kabının kapağını dikkatlice çevirin ve iki Petri kabından elde edilen EBS'yi 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. EBS'nin tüpün dibine çökmesi için 10 dakika bekleyin, ardından mümkün olduğunca fazla besiyerini aspire edin. EBS'yi askıya almak için 10 mililitre farklılaşma ortamı kullanın ve süspansiyonu 10 santimetrelik bir Petri kabına aktarın.

Hücreler dört gün boyunca süspansiyon halinde kültürlendikten sonra, metin protokolüne göre, EBS'yi jelatin kaplı 10 santimetre karelik bir hücre kültürü kabına aktarın ve sonraki iki ila altı gün boyunca mikroskop altında inkübe edin, hücrelerin atım odakları ve hücreler atmaya başladıktan üç gün sonra bir hücre tabakasının oluşumu için hücreleri kontrol edin, Ortamı aspire edin ve 10 mililitre taze farklılaşma ekleyin. Dört gün sonra hücrelere mililitre başına 400 mikrogram G dört 18 içeren ortam. Hücre tabakasını aspire etmeden ortamı dikkatlice çıkarın.

Sonra hücreleri yıkamak için 10 mililitre PBS ekleyin. PBS'yi dikkatlice çıkardıktan sonra, 10 mililitre kollajenaz dört çözeltisi ekleyin ve hücreleri 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra, 37 santigrat derecede beş dakika inkübe ettikten sonra, süspansiyonu 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek kuvvetlice karıştırın ve hücreleri 37 santigrat derecede beş dakika daha inkübe edin.

Küçük kümelerden oluşan bir süspansiyon mevcut olmalıdır. Daha sonra 20 mililitre PBS ekleyin ve 300 kez 10 dakika santrifüjleyin. G, PBS'yi dikkatlice aspire edin ve indüklenmiş sino atriyal cisimler veya sab'ler oluşturuyorsa, mililitre başına 400 mikrogram G dört 18 içeren 12 mililitre farklılaşma ortamı kullanın, hücreleri askıya alın ve farklılaşma ortamı eklemek yerine tek düğüm hücreleri oluşturmak için 24 kuyulu jelatin kaplı bir plakanın altı kuyusuna her biri iki mililitre görün.

PBS'yi çıkardıktan sonra, hücreleri askıya almak için beş mililitre Accutane kullanın ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin. Süspansiyonu 37 santigrat derecede beş dakika inkübe ettikten sonra karıştırın.

20 mililitre PBS ekleyin ve 12 mililitre farklılaşma ile 300 kez G'de beş dakika santrifüjleyin. G dört 18 içeren ortam. Hücreleri askıya alın ve 24 kuyulu jelatin kaplı bir plaka kültürünün altı oyuğuna her biri iki mililitre görün ve metin protokolüne göre hücrelerin analizini yapın.

Bu videoda gösterilen protokolü kullanarak, isab S, isab S'nin ayrışmasından sonra burada görüldüğü gibi dakikada yaklaşık 450 atım frekansına sahip pluripotent kök hücrelerden üretilebilir. Bu hücreler, hiperpolarizasyonla aktive edilmiş siklik nükleotid kapılı katyon gibi sinüs düğümünün işlevi için gerekli olan proteinlerin yüksek ekspresyon seviyelerini gösterir. Kanal dört, HCN dört, concon four, contrimion beş conxion 30.2 ve MYH altı.

Kanal blokeri ZD 7 2 88 veya muskarinik reseptör agonisti carakol ile tedavi edildiğinde, iab'dan türetilen hücreler önemli ölçüde azalmış bir atım frekansı sergiler. Beta adrenal reseptör agonisti izopren ise yüksek bir atım frekansına yol açar. Genel olarak, tekniğimiz kalp pili işlevselliğini ve hastalıklarını daha iyi anlamanın yolunu açacaktır.

Bu videoyu izledikten sonra, PLU potent kök hücrelerden tamamen işlevsel sinüs nodal hücrelerinin nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız.