Tümör-stromal Etkileşim için üç boyutlu Co-kültür Modeli

Bu prosedürün genel amacı, üç boyutlu bir ko-kültür yöntemiyle akciğer kanseri hücreleri ile kanserle ilişkili fibroblastlar arasındaki hücre etkileşimlerini incelemektir. Bu işlem, toplanan akciğer dokusunun bir milimetrelik parçalar halinde kıyılmasıyla elde edilen insan akciğer kanseri ilişkili fibroblastlarının primer kültürü aracılığıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, tripsinize edilmiş hücreleri içeren bir kolajen çözeltisi karıştırılarak fibroblast gömülü kolajen jeller hazırlamak ve jelleşmesi için altı kuyucuklu bir plakaya aktarmaktır.

Ardından, kanser hücreleri ve fibroblastlardan oluşan boyutlu bir ko-kültür hazırlamak için akciğer adenokarsinoma hücreleri her bir jelin yüzeyine ekilir ve yüzer bir kültür oluşturmak için jel, kuyucuğun kenarından ayrılır. Son adım, büzülmüş jellerin altı kuyucuklu bir plakaya yerleştirilmiş bir ağ üzerine konularak havaya maruz bırakılmasıyla hava-sıvı arayüzü kültürü ve invazyon analizinin gerçekleştirilmesidir. Son olarak, kanser hücresi invazyonunu ve morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için histolojik incelemeler kullanılır.

Bu prosedürün iki boyutlu tek katman kültürü gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok hücreli etkileşimlerin üç boyutlu kültür koşullarında incelenebilmesidir. Bu prosedür, metin protokolünde açıklandığı ve referans verildiği üzere, toplanan akciğer dokusundan fibroblastların primer kültürü ile başlar. Bu videoda, insan akciğer kanseri dokusu yerine fare akciğerleri kullanılmıştır.

Akciğer dokusu örneğini, içinde kültür ortamı bulunmayan 10 santimetrelik bir doku kültürü tabağına yerleştirin. Steril pens ve bistüri kullanarak dokuyu yaklaşık bir milimetre boyutunda küçük parçalara bölün. Bu işlem sırasında parçaların kurumasını önleyin; aksi takdirde hücre büyüme verimliliği bozulur. Her bir parçanın çevresinde boş bir alan kalacak şekilde, küçük akciğer dokusu parçalarını birbirinden ayrı olarak yerleştirin.

Bir skalpel bıçağı kullanarak doku kültürü kabının yüzeyinde çizikler oluşturun. Alternatif olarak, doku parçalarının kapsama alanı, birkaç pasajdan sonra hücre büyümesi ve hücre çoğalmasının etkinliğini artırır. İlk olarak, her kuyucuğun içinde birbirine 1,5 santimetre uzaklıkta iki noktaya silikon gres sürün.

Ardından, kıyılmış doku parçalarını her birinin merkezine tek tek yerleştirin. Daha sonra, silikon gresi kullanarak lamelini plağın yüzeyine sabitleyin. Doku kesitleri kurumadan önce, kaba veya altı kuyucuklu plakaya nazikçe kültür ortamı ekleyin.

Hücrelerin verimli büyümesi büyük ölçüde kaybolmuştur. Numuneler kurumuşsa, kollajen jel oluşumu için doku kesitlerinin ayrılmasını önlemek amacıyla besiyerini çok hızlı dökmeyiniz. Fibroblastları bir kat fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayınız ve tripsinizasyondan sonra büyüyen hücreleri ayırmak için yaklaşık beş dakika boyunca trypsin one ekleyiniz.

37 °C'de, %10 FBS ile desteklenmiş dokuz mililitre DMEM kullanarak hücreleri ayırın, ortamda süspansiyon halindeki hücreleri 10 mililitrelik bir tüpe toplayın ve hücre peletleri oluşturmak için 200 ila 300 ×g hızında santrifüjleyin. Elde edilen peletleri, mililitre başına yarım milyon hücre yoğunluğunda %100 FBS içinde yeniden süspanse edin. Kolajen jel hazırlığı öncesinde, kolajen jel hazırlığında kullanılacak reaktifleri, pipetleri ve tüpleri bir buzdolabında soğutun.

Ardından, fibroblast süspansiyonunu FBS Tip 1 A kolajen 5X-DMEM ve rekonstitüsyon tamponu ile kuvvetlice pipetleyerek, pipetleme işlemi sırasında kabarcık oluşumunu önleyerek homojen bir karışım hazırlayıp kolajen jeli oluşturun. Daha sonra, karışımın 3 mL'sini altı kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna ekleyin ve kolajen jel üzerinde kanser hücresi kültürü için inkübatörde 37 °C'de, sarsılmadan 30 ila 60 dakika boyunca jelatinleşmeye bırakın. Kanser hücrelerini 3D ko-kültür ortamında 1 × 10⁵ hücre/mL yoğunlukta süspanse edin.

Resüspande edilmiş, A 5 49 akciğer adenokarsinom hücresi çözeltisinden iki mililitre her bir jelin yüzeyine dökün. Jel kontraksiyonunu gerçekleştirmek için deneysel koşullara bağlı olarak ko-kültürdeki kanser hücrelerinin veya fibroblastların hücre sayısını modifiye edin. Kanser hücrelerinin kolajen jele tutunabilmesi için jelleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ardından her birini ayırın ve her kuyucukta yüzer bir kültür oluşturun. Altı kuyucuklu plakadaki her bir jeli, her iki ila üç günde bir, eğimli 21 gauge iğne veya küçük bir spatula kullanarak kuyucuk kenarından ayırın. Kuyucukları iki mililitre 3D ko-kültür ortamı ile yenileyin.

Beş gün boyunca her gün her bir jelin boyutunu ölçün. Son olarak, kolajen jel analizi için metin protokolüne bakın. Kolajen jelleri beş gün boyunca 37 °C'de kültüre ettikten sonra.

Büzülmüş jelleri bir süzgecin üzerine yerleştirerek havaya maruz bırakın. Yeni altı kuyucuklu plakalar için süzgeci, akış sitometrisi için kullanılan ticari hücre süzgeçlerinden oluşturun. Her kuyucuğu nazikçe 11 milliliters 3D ko-kültür ortamı ile doldurun.

Steril bir kaşık kullanarak jelleri ağın üzerine yerleştirin ve bu koşulda jellerin üzerinde kalan tüm medyumu uzaklaştırın. Jeller medyuma batırılmış durumdayken, jelin üst yüzeyi havaya maruz kalır. Bu kültür koşulunu hava-sıvı arayüzü olarak tanımlayın.

Tümör mikroçevresini taklit eden bu ko-kültür yöntemi, kollajen jeller içine gömülmüş fibroblastlar ile kanser hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanışlı bir araçtır. A 5 49 hücreleri, fibroblastların gömülü olduğu bir kollajen jel üzerinde ko-kültür yapılmış ve jel, ortam içeren bir ağ üzerine yerleştirilerek A 5 49 hücre tabakası havaya maruz bırakılmıştır. Burada, altı kuyuklu bir plakanın kuyucuğundaki ağ üzerine yerleştirilmiş jelin, hematoksilen ve eozin ile yapılan histolojik analizlerini gösteren temsili bir resim yer almaktadır.

Üç boyutlu kültürlenmiş jelin kesitlerinin boyanması, 5 49 hücrenin akciğer kanseri ilişkili fibroblastlar içeren kollajen jele invazyon yaptığını ortaya çıkarmıştır. Bu prosedürün ardından, tümör stroma etkileşimindeki spesifik gen fonksiyonu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla gen ekspresyonu veya knockdown gibi diğer yöntemler uygulanabilir.