Name: Tümör-stromal Etkileşim için üç boyutlu Co-kültür Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Keşfedin akciğer kanser hücreleri ve kanserle ilişkili fibroblastlar arasındaki tümör-stromal etkileşimleri üç boyutlu ko-kültür modeli kullanarak. Bu yöntem, kanser biyolojisi araştırmalarında fizyolojik olarak daha uygun bir platform sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (26461185 ve 25460137) tarafından desteklenmiştir.

NOT: Bu çalışma, uygun Etik Komiteleri tarafından onaylandı. İnsan Akciğer Fibroblastları 1. İlköğretim Kültürü <ol><li> Akciğer dokusunun Koleksiyon: <ol><li> Doğrudan cerrahi ameliyathane insan akciğer doku örnekleri edinin. Olabildiğince uzak olarak tümör toplanan kanserli olmayan numune ile, kanserli ve kanserli olmayan akciğer dokusundan yaklaşık 1 cm 3 blok toplayın. </li><li> Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı, 100 birim / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 0.25 ug / ml amfoterisin B (serumsuz ortam) ile takviye edilmiş (DMEM) içinde örnekleri askıya alındı. Steril 50 ml tüpler içinde asılı örnekleri koruyun ve laboratuvara transfer. Not: Fibroblastlar yüksek göçmen ve epitel, endotel ve düz kas hücreleri gibi diğer hücre tipleri ile karşılaştırıldığında, proliferatif. sonucudur yöntemi fibroblastların bu özelliklerinden yararlanmak ve outgro alırdoku kesitlerinden kanat hücreleri fibroblastlar bol miktarda bulunmaktadır. Çeşitli hücre geçiş sonrası, diğer hücre tipleri saflaştırılmış fibroblast hücre kültürlerinde elde edilen hayatta ve% 10 cenin sığır serumu (FBS) ile birlikte DMEM yaymak için başarısız olur. hücrelerin, birincil kültür, aşağıdaki 3-7 geçişleri kullanılabilir. </li></ol></li><li> Hücre akıbet için eksplant kültürü ve iklimlendirme: <ol><li> Modifikasyonlar 5 ile önceden bildirilen protokolü kullanarak fibroblast primer kültürünü gerçekleştirin. </li><li> Laboratuarda, kültür ortamında 10 cm uzunluğunda bir doku kültür tabağına, doku numuneyi ve küçük bölümler halinde kesilir ~ steril forseps ve bir neşter kullanılarak boyut olarak 2-3 mm arasındadır. Bu süreçte, aksi halde hücre akıbet verimliliği bozulur, bölüm kuru yapmamak. </li></ol></li><li> Epitel hücre tabakası ve bağ dokusu Ayrılması: <ol><li> 4 ° C &#39;de 16 saat süre ile kültür 2000 poliüretan / ml dispaz I içeren ortamda ve kültür kesme doku bölümleri bekletin. &lt;/ Li&gt; <li> Bir çanak için doku bölümleri transfer ve bitişik bağ dokusundan epitel hücre katmanı ayırınız. Mikroorganizmaların kirlenmesini önlemek için temiz bir tezgah bölümleri işleyin. Not: epitel hücrelerinin ana bir kültürü gerekirse, adım 1.3 gerçekleştirin. Sadece fibroblastlar izole edilmesi ise daha sonra eksplant kültürü ve hücre geçişleri saflaştırılmış fibroblast popülasyonları elde epitel hücreleri için elverişsiz olması nedeniyle, adım 1.3 sayın. </li></ol></li><li> Doku kesitlerinin Ek: <ol><li> İki neşter kullanılarak 1 mm&#39;lik parçalar halinde dokuları kıyma. Adet kadar küçük değilse, bunlar çanak daha kolay ayırmak ve hücreler çanak yüzeyinde büyümek için başarısız olur. </li><li> Her parça çevreleyen boş bir alana korumak için birbirinden küçük akciğer dokusu bölümleri yerleştirin. Doku bölümlerinin bağlanmasını kolaylaştırmak için bir bisturi bıçağını kullanarak doku kültürü çanağı yüzeyinde çizikler yapın. NOT: TaraklıAyrıca hücrelerin göç hangi boyunca kesitler sunmak, hücre büyümesini kolaylaştırmak için görünür. <ol><li> Seçenek olarak ise, ayrı ayrı, bir 6-yuvalı plakanın her oyuğuna kıyılmış doku parçaları yerleştirmek ve bir kayar kapak ile kapak. Silikon gres kullanılarak plaka yüzeyine kapak kayma takın. </li><li> Her iyi steril bir iğne kullanarak 1.5 cm arayla iki noktada silikon gres yerleştirin. Doku parçaları Kapsama çeşitli pasajlar aşağıdaki hücre akıbet ve hücre yayılımı etkinliğini artırır. </li></ol></li></ol></li><li> Müteakip eksplant kültürü: <ol><li> Numuneler kurumaya eğer etkin hücre akıbet çoğunlukla kaybolur gibi doku bölümleri, kurumasına önce hafifçe çanak kültür ortamı ekleyin. Çok hızlı doku bölümleri ayırmak gibi orta dökmeyin. </li><li> % 10 FBS&#39;li DMEM içinde kültür hücreleri. Ek yüzdürme gelen dekolmanı teşvik gibi, yüzen sağlar ki çok sadece doku karşılamak için yeterli ortamı kullanın, ancakçanak. </li></ol></li><li> Hücre geçişi: <ol><li> Kültür çanağı tekrar hareket doku bölümlerinin ayrılması yol gibi her zaman dikkatli bir kültür ortamı kullanın. </li><li> 5-7 gün boyunca 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde kültür kaplarına yerleştirin. Her gün orta Refresh, orta değişiklikleri sırasında minimal kültür yemekleri anlaştım. Fibroblastlar önümüzdeki birkaç hafta içinde doku kesitlerinin kenarından büyümek. Not: ~ 2-3 hafta sonra, üzerinde büyüme fibroblastlar neredeyse yüzey alanının miktarına bağlı olarak, kaynaşmaya eriştikten. </li><li> 1x hücrelerin PBS ile yıkayın ve plakasına tripsin 1 ml. </li><li> Tripsinizasyondan sonra,% 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM 9 ml kullanarak hücreleri ayırmak. Doku kesitleri ile birlikte bir 10 ml tüp içinde ortam içinde süspansiyon haline getirilmiş hücreler toplanır. Hücre topakları oluşturmak üzere santrifüjden sonra, yeni bir ortam içinde elde edilen pelet yeniden süspanse edin. </li><li> Yeni bir cul üzerine hücreleri ve doku bölümleri TohumTure çanak, hangi noktada doku hücreleri yapışır ve büyürken çanak eklemek başarısız. Ertesi gün, aspirasyon ile yüzen doku parçaları kaldırmak ve orta değiştirin. Ekli fibroblastlar sonraki kültürlerle yaymak. </li></ol></li></ol> İnsan akciğer fibroblastlan ve Kanser Hücreleri 2. Üç boyutlu Co-kültür <ol><li> Hücre ve reaktiflerin hazırlanması: <ol><li> Yaklaşık 2 x 10 5 epitel hücreleri ve kuyu başına 2.5 x 10 5 fibroblastlar kullanın. (3 mg / ml, pH 3) FBS (% 100), yeniden oluşturma tamponu (50 mM NaOH, 260 mM NaHCO 3, 200 mM HEPES), 5x DMEM DMEM fibroblast kültürü için% 10 FBS ile takviye edilmiş kolajen tip IA hazırlanması ve 3D ko-kültür ortamı (1: kanser hücreleri fibroblast kültür ortamı ve kültür ortamına 1 karışımı). </li><li> Kültür A549 akciğer adenokarsinoma hücreleri, fibroblastlar ve DMEM A549 3D ko-kültür,% 10 FBS ile takviye edilmiştir. </li></ol></li><li> Kollajen jel formation: <ol><li> 1x PBS ile 10 cm çanak kültüre fibroblast yıkayın, ve ben plakasına tripsin 1 ml ekleyin. 37 ° C&#39;de ~ 5 dakika boyunca tripsinizasyondan sonra,% 10 FBS ile takviye edilmiş, 9 ml DMEM kullanılarak hücreleri ayırmak. 10 ml&#39;lik bir tüp içinde bir ortam içinde süspansiyon haline hücreleri toplamak, ve hücre topakları oluşturmak üzere 200-300 xg&#39;de santrifüj. </li><li> 5 x 10 5 / ml&#39;lik bir yoğunlukta% 100 FBS içinde elde edilen pelet yeniden süspanse. </li><li> Buz üzerinde kolajen jel hazırlayın. Aşağıdaki prosedüre önce bir soğutucuda reaktifler, pipet ve tüpler soğutun. Hatta, buz üzerinde, karışım bir ölçüde katılaştığı ve toplam hacim, tüm bileşenlerin toplamından daha azdır. </li><li> Her bir oyuğa olarak, FBS fibroblast süspansiyonu (2.5 x 10 5 hücre), 0.5 mi, 2.3 mi türü IA kollajen, 670 ul 5x DMEM ve 330 ul sulandırma tamponu karıştırılarak kollajen jel hazırlamak. Jeller oda sıcaklığında kolayca ayarlamanıza olanak verir. <ol><li> Şiddetle homojen bir mil sağlamak için pipetsoğutun. Pipetleme işlemi sırasında hava kabarcıkları oluşturarak kaçının. </li></ol></li><li> 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna karışım (3 mi) ilave edilir ve 30-60 dakika boyunca bozukluğu olmadan 37 ° C&#39;de inkübatör içinde jelatinleştirilmesi için izin verir. </li></ol></li><li> Kollajen jel üzerinde Kanser hücre kültürü: <ol><li> 6 değişiklikler ile daha önce rapor protokol kullanılarak, üç boyutlu bir ko-kültür yapın. </li><li> 1 x 10 5 / ml&#39;lik bir yoğunlukta 3D ko-kültür ortamı içinde (ya da A549 hücrelerinin durumunda,% 10 FBS&#39;li DMEM içinde) yeniden süspanse edin, kanser hücreleri. </li><li> Her jel yüzeyi üzerine yeniden süspanse hücre çözeltisi (2 x 10 5 hücre) 2 ml dökün. Deney koşullarına bağlı olarak ko-kültür kanser hücreleri ya da fibroblastlarının hücre sayısını değiştirir. </li></ol></li><li> Jel daralma: <ol><li> Kanser hücreleri kolajen jel ile uygun böylece 37 ° C&#39;de gece boyunca jeller inkübe edin. Her jel ayırın ve o her iyi bir &#39;yüzen kültürü&#39; oluşturmak6-çukurlu plaka f. NOT: Bir yüzen kültürü kullanarak, jelin, boyutu çeşitli değişiklikler birlikte kültüre kanser hücreleri ve fibroblastlar arasındaki hücresel etkileşim aracılık eder mekanik gerilim ve kolajen degradasyonu ile uyarılmaktadır. </li><li> Kuyunun kenarına her jel ayırmak için açılı 21 G iğne veya küçük spatula kullanın. Her 2-3 günde bir, 3 boyutlu ortak-kültür ortamı içinde 2 ml ile kuyu yenileyin. 5 gün boyunca her gün, her jelin boyutu ölçülür. </li></ol></li><li> Kolajen jellerin analiz: <ol><li> Böyle Sircol tahlili gibi kollajen kantitasyon yöntemleri kullanarak her jel kollajen içeriğini ölçün. Jeller 5 RNA topladıktan sonra Transkriptomik analiz veya kantitatif RT-PCR gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> 3. Hava-sıvı Arayüz Kültür ve Invasion Testi <ol><li> 5 gün boyunca 37 ° C &#39;de, kolajen jel kültürlendikten sonra yeni 6- bir ağ örgü üzerinde (70 um gözenek boyutu) yerleştirerek hava almasına jeller maruzhavuzlu plakalar hazırlanmıştır. Akış sitometrisi için kullanılan ticari olarak temin edilebilen hücre süzgeçler mesh olun. </li><li> Yavaşça 3D ko-kültür ortamı 11 ml her bir doldurun. </li><li> Steril bir kaşık kullanarak örgü üzerine jeller yerleştirin ve jeller kalan orta kaldırmak. Havaya jel üst yüzeyini açığa ederken bu durum üzerinde, orta jeller daldırın. Hava-sıvı arayüzü olarak bu kültürün durumu tanımlayın. Not: kuluçka makinesi içinde 37 ° C &#39;de hava-sıvı arayüzü kültür muhafaza 5-7 gün sonra, invazif kanser hücrelerinin jel içine göç ederler. Hücre tipine ve hücresel etkileşimler sonucu olarak, kanser hücrelerinde hücre morfolojik değişim değişik derecelerde hava-sıvı arayüzü kültürü ile uyarılmaktadır. </li><li> Histolojik değerlendirme için, oda sıcaklığında bir gece boyunca formalin jel saptamak ve parafin içine gömmek. Hematoksilen ve eosin (H &amp; E) ile dikey bölümleri (4 mikron) Leke. Immünohistokimyasal analiz o gerçekleştirinn bölümler 4. </li></ol>

<ol><li>Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts-a+key+host+cell+type+in+tumor+initiation%2C+progression%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Ups.+J.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis.</a> Ups. J. Med. Sci. 117 (2), 187-195 (2012).</li>
<li>Augsten, M., Hägglöf, C., Peña, C., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digest+on+the+role+of+the+tumor+microenvironment+in+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers.</a> Cancer Microenviron. 3 (1), 167-176 (2010).</li>
<li>Augsten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+as+Another+Polarized+Cell+Type+of+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts as Another Polarized Cell Type of the Tumor Microenvironment.</a> Front. Oncol. 4, 62(2014).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+lung+cancer-associated+fibroblasts+in+three-dimensional+in+vitro+co-culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Characterization of human lung cancer-associated fibroblasts in three-dimensional in vitro co-culture model.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (1), 158-163 (2012).</li>
<li>Ohshima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+gingival+fibroblast-epithelial+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in gingival fibroblast-epithelial interaction.</a> J. Dent. Res. 89 (11), 1315-1321 (2010).</li>
<li>Ikebe, D., Wang, B., Suzuki, H., Kato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+keratinocyte+stratification+by+a+dominant+negative+JunB+mutant+without+blocking+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Suppression of keratinocyte stratification by a dominant negative JunB mutant without blocking cell proliferation.</a> Genes Cells. 12 (2), 197-207 (2007).</li>
<li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer%3A+a+novel+tumor-promoting+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).</li>
<li>Paulsson, J., Micke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+cancer-associated+fibroblasts+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).</li>
<li>Navab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+gene-expression+signature+of+carcinoma-associated+fibroblasts+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108 (17), 7160-7165 (2011).</li>
<li>Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+cancer-associated+fibroblasts+from+human+colon+tumors+shows+specific+prognostic+gene+expression+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of cancer-associated fibroblasts from human colon tumors shows specific prognostic gene expression signature.</a> Clin. Cancer Res. 19 (21), 5914-5926 (2013).</li>
<li>Hägglöf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+PDGFRbeta+expression+in+prostate+tumors+and+non-malignant+prostate+tissue+predicts+prostate+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Stromal PDGFRbeta expression in prostate tumors and non-malignant prostate tissue predicts prostate cancer survival.</a> PLoS One. 5 (5), e10747(2010).</li>
<li>Saito, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forkhead+box+F1+regulates+tumor-promoting+properties+of+cancer-associated+fibroblasts+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Forkhead box F1 regulates tumor-promoting properties of cancer-associated fibroblasts in lung cancer.</a> Cancer Res. 70 (7), 2644-2654 (2010).</li>
<li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).</li>
<li>Calvo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+YAP-dependent+matrix+remodelling+is+required+for+the+generation+and+maintenance+of+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts.</a> Nat. Cell Biol. 15 (6), 637-646 (2013).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+induces+human+lung+fibroblast-mediated+collagen+gel+contraction+via+histamine+H1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor.</a> Exp. Lung Res. 40 (5), 222-236 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Cafs kanser hücrelerini çevreleyen ECM&#39;nin bir bileşenini oluşturmaktadır ve tek tümör için bir iskele sağlar, ancak aynı zamanda aktif tümör gelişiminde 7 katılmaz. Biriken deliller CAF-aracılı tümör ilerlemesi 8 kritik rolleri vurgulayarak, nihai prognozu cafs veya ilgili moleküllerin etkisini unravels. Bir önceki çalışmada, akciğer cafs 4 izole etmek sonucudur yöntem kullandı. Bu deneyde, bulaşık yüzeyi üzerine doku kesiti yapışma bakım kritiktir. Hücr...

Kanser dokusu, kanser ile tümör stromal mikroçevresi arasındaki yakın etkileşimler yoluyla gelişen, kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'ler), bağışıklık hücreleri, tümör damarları ve hücre dışı matristen (ECM) oluşan bir organ türü olarak algılanabilir. CAF'ler, kanser hücreleri üzerinde mitojenik, pro-migrasyon ve pro-invaziv etkiler gösteren çözünür faktörlerin (sitokinler, büyüme faktörleri ve kemokinler) ana kaynağıdır. Ayrıca tümör damarı oluşumunu uyarırlar ve kemik iliği türevi hücreler (BMDC) gibi öncü hücreleri işe alırlar. Aktive edilmiş CAF'ler, ECM'nin üretiminde ve yeniden modellenmesinde rol oynar, böylece kanser hücrelerinin büyümesini ve yayılmasını teşvik eder1. CAF'ler ayrıca tümör hücresi kolonizasyonunu ve metastazı kolaylaştıran ve kök hücre fenotiplerini komşu kanser hücrelerine verebilen bir niş sağlar. Patolojik gözlemler, kanser dokularındaki stromal reaksiyonların veya fibrotik değişikliklerin kötü prognozun göstergesi olduğunu göstermektedir. Son çalışmalar, gen imzası gibi tümör stromal özelliklerinin hasta prognozunu öngörebileceğini de göstermiştir. Ayrıca, CAF'tan türetilmiş faktörler kemoterapiye duyarlılığı modüle edebilir ve CAF'lerin ilaç duyarlılığını ve direncini belirlemedeki rolünü vurgulayabilir2.
CAF'lar, tümör mikroçevresi içindeki farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimlere aracılık eden sinyal yolları yoluyla tümör ilerlemesinin desteklenmesinde çok yönlü bir rol oynadığından, kanser tedavileri için yeni hedefler olarak artan ilgi görmüşlerdir. Kanser mikroçevresi içindeki hücre popülasyonlarının heterojenliği, CAF'leri hedeflemek için bir engel teşkil etmektedir. α-düz kas aktini (α-SMA), fibroblast aktivasyon proteini (FAP) ve fibroblast spesifik proten-1 (FSP-1: S100A4 olarak da adlandırılır) gibi CAF'lar için çeşitli belirteçler önerilmiştir; bununla birlikte, bu moleküler belirteçler, CAF'leri kanserli olmayan dokularda bulunan diğer hücrelerden ayırt etmek için spesifik değildir3. Bu nedenle, CAF'lerin spesifik özellikleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Bu amaçla, primer kültürlenmiş KAF'leri hasta uyumlu normal fibroblastlarla karşılaştırmak bilgilendiricidir.
Son zamanlarda, çeşitli kanser türlerinde hasta kaynaklı CAF'ler üzerinde yapılan analizler bildirilmiştir ve kanserli olmayan dokulardan türetilen fibroblastlarla karşılaştırıldığında benzersiz gen ekspresyon paternleri ve hücre davranışları ortaya çıkmıştır. İnsan akciğer kanseri dokularından izole edilmiş CAF'leri kullanarak, akciğer CAF'lerinin özelliklerini değerlendirmemizi sağlayan üç boyutlu bir ko-kültür yöntemi geliştirdik. Bu modelde, CAF'lerin akciğer kanseri hücre invazyonu, proliferasyonu ve kollajen jel kontraksiyonu üzerindeki etkilerini araştırdıkve bu da akciğer CAF'lerinin tümör teşvik edici rollerini deneysel olarak özetledi 4.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen tip IA</td><td>Nitta jelatin Inc.</td><td>CELL-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sulandırma tamponu</td><td>Nitta jelatin Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapak kayması</td>, <td>NUNC</td><td>174934</td><td></td></tr>, <tr><td>Silikon gres</td>, <td>Dow, Corning, Toray</td><td>Yüksek vakumlu gres</td><td></td></tr>, <tr><td>Dispase I</td>, <td>WAKO</td><td>386-02271</td><td></td></tr>, <tr><td>6 oyuklu plaka</td>, <td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr>, <tr><td>Hücre süzgeci (70 & mu; m)</td> <td>BD Şahin</td><td>352350</td><td></td></tr></tbody></table>

tümör-stromal etkileşim için üç boyutlu co-kültür modeli

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Kanser ilerlemesi (başlangıç, büyüme, invazyon ve metastaz), kötü huylu hücreler ile çevredeki tümör stromal hücreleri arasındaki etkileşimler yoluyla gerçekleşir. Tümör mikroçevresi, hücre dışı matrikse (ECM) gömülü fibroblastlar, immün hücreler, vasküler endotel hücreleri, perisitler ve kemik iliği türevi hücreler gibi çeşitli hücre tiplerinden oluşur. Kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'ler), çözünür faktörlerin salgılanması, anjiyogenez ve ECM'nin yeniden şekillenmesi yoluyla pro-tümörjenik bir role sahiptir. Kanser hücresinin hayatta kalması, çoğalması, göçü ve istilası için deneysel modeller çoğunlukla iki boyutlu tek hücreli ve tek katmanlı doku kültürlerine veya Boyden odası tahlillerine dayanmıştır. Bununla birlikte, bu deneyler hastalıklı bir organdaki fizyolojik veya patolojik koşulları tam olarak yansıtmaz. Tümör stromal veya tümör matriks etkileşimlerini daha iyi anlamak için, çok hücreli ve üç boyutlu kültürler, hücreler arası iletişimi ve kanser hücresi davranışının ECM'ye bağlı modülasyonunu araştırmak için daha güçlü araçlar sağlar. Bu tür bir çalışma için bir platform olarak, kanser hücrelerinin CAF'lerin birincil kültürleri ile gömülü kollajen jelleri üzerinde kültürlendiği deneysel bir model sunuyoruz.

Bu ko-kültür yöntemi, tümör mikro taklit, kollajen jeller gömülü kanser hücreleri ve fibroblastlar arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir araçtır. Kolajen jel kasılması, kanser hücresi yayılımını tamamen ve morfolojik değişim önceki çalışmada, üç parametre, bu deneysel modelinde değerlendirildi. Kanser hücre çoğalması da Ki67 immün 4 kullanılarak tahmin edilmiştir. Akciğer doku örnekleri bir rezeksiyon akciğer lobu (Şekil 1A) kanserli ve kanserli olmayan bölümlerde toplanmıştır. Örnekle...

Burada, kanser hücresi davranışının çok hücreli etkileşimlerini ve hücre dışı matrise bağlı modülasyonunu araştırmak için yararlı olan üç boyutlu ko-kültür için bir protokol sunuyoruz. Bu deneysel modelde, kanser hücreleri, insan kanseriyle ilişkili fibroblastlarla gömülü kollajen jelleri üzerinde kültürlenir.

Tümör-stromal Etkileşim için üç boyutlu Co-kültür Modeli

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Bu prosedürün genel amacı, üç boyutlu bir ko-kültür yöntemiyle akciğer kanseri hücreleri ile kanserle ilişkili fibroblastlar arasındaki hücre etkileşimlerini incelemektir. Bu işlem, toplanan akciğer dokusunun bir milimetrelik parçalar halinde kıyılmasıyla elde edilen insan akciğer kanseri ilişkili fibroblastlarının primer kültürü aracılığıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, tripsinize edilmiş hücreleri içeren bir kolajen çözeltisi karıştırılarak fibroblast gömülü kolajen jeller hazırlamak ve jelleşmesi için altı kuyucuklu bir plakaya aktarmaktır.Ardından, kanser hücreleri ve fibroblastlardan oluşan boyutlu bir ko-kültür hazırlamak için akciğer adenokarsinoma hücreleri her bir jelin yüzeyine ekilir ve yüzer bir kültür oluşturmak için jel, kuyucuğun kenarından ayrılır. Son adım, büzülmüş jellerin altı kuyucuklu bir plakaya yerleştirilmiş bir ağ üzerine konularak havaya maruz bırakılmasıyla hava-sıvı arayüzü kültürü ve invazyon analizinin gerçekleştirilmesidir. Son olarak, kanser hücresi invazyonunu ve morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için histolojik incelemeler kullanılır.Bu prosedürün iki boyutlu tek katman kültürü gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok hücreli etkileşimlerin üç boyutlu kültür koşullarında incelenebilmesidir. Bu prosedür, metin protokolünde açıklandığı ve referans verildiği üzere, toplanan akciğer dokusundan fibroblastların primer kültürü ile başlar. Bu videoda, insan akciğer kanseri dokusu yerine fare akciğerleri kullanılmıştır.Akciğer dokusu örneğini, içinde kültür ortamı bulunmayan 10 santimetrelik bir doku kültürü tabağına yerleştirin. Steril pens ve bistüri kullanarak dokuyu yaklaşık bir milimetre boyutunda küçük parçalara bölün. Bu işlem sırasında parçaların kurumasını önleyin; aksi takdirde hücre büyüme verimliliği bozulur. Her bir parçanın çevresinde boş bir alan kalacak şekilde, küçük akciğer dokusu parçalarını birbirinden ayrı olarak yerleştirin.Bir skalpel bıçağı kullanarak doku kültürü kabının yüzeyinde çizikler oluşturun. Alternatif olarak, doku parçalarının kapsama alanı, birkaç pasajdan sonra hücre büyümesi ve hücre çoğalmasının etkinliğini artırır. İlk olarak, her kuyucuğun içinde birbirine 1,5 santimetre uzaklıkta iki noktaya silikon gres sürün.Ardından, kıyılmış doku parçalarını her birinin merkezine tek tek yerleştirin. Daha sonra, silikon gresi kullanarak lamelini plağın yüzeyine sabitleyin. Doku kesitleri kurumadan önce, kaba veya altı kuyucuklu plakaya nazikçe kültür ortamı ekleyin.Hücrelerin verimli büyümesi büyük ölçüde kaybolmuştur. Numuneler kurumuşsa, kollajen jel oluşumu için doku kesitlerinin ayrılmasını önlemek amacıyla besiyerini çok hızlı dökmeyiniz. Fibroblastları bir kat fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayınız ve tripsinizasyondan sonra büyüyen hücreleri ayırmak için yaklaşık beş dakika boyunca trypsin one ekleyiniz.37 °C'de, %10 FBS ile desteklenmiş dokuz mililitre DMEM kullanarak hücreleri ayırın, ortamda süspansiyon halindeki hücreleri 10 mililitrelik bir tüpe toplayın ve hücre peletleri oluşturmak için 200 ila 300 ×g hızında santrifüjleyin. Elde edilen peletleri, mililitre başına yarım milyon hücre yoğunluğunda %100 FBS içinde yeniden süspanse edin. Kolajen jel hazırlığı öncesinde, kolajen jel hazırlığında kullanılacak reaktifleri, pipetleri ve tüpleri bir buzdolabında soğutun.Ardından, fibroblast süspansiyonunu FBS Tip 1 A kolajen 5X-DMEM ve rekonstitüsyon tamponu ile kuvvetlice pipetleyerek, pipetleme işlemi sırasında kabarcık oluşumunu önleyerek homojen bir karışım hazırlayıp kolajen jeli oluşturun. Daha sonra, karışımın 3 mL'sini altı kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna ekleyin ve kolajen jel üzerinde kanser hücresi kültürü için inkübatörde 37 °C'de, sarsılmadan 30 ila 60 dakika boyunca jelatinleşmeye bırakın. Kanser hücrelerini 3D ko-kültür ortamında 1 × 10⁵ hücre/mL yoğunlukta süspanse edin.Resüspande edilmiş, A 5 49 akciğer adenokarsinom hücresi çözeltisinden iki mililitre her bir jelin yüzeyine dökün. Jel kontraksiyonunu gerçekleştirmek için deneysel koşullara bağlı olarak ko-kültürdeki kanser hücrelerinin veya fibroblastların hücre sayısını modifiye edin. Kanser hücrelerinin kolajen jele tutunabilmesi için jelleri 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.Ardından her birini ayırın ve her kuyucukta yüzer bir kültür oluşturun. Altı kuyucuklu plakadaki her bir jeli, her iki ila üç günde bir, eğimli 21 gauge iğne veya küçük bir spatula kullanarak kuyucuk kenarından ayırın. Kuyucukları iki mililitre 3D ko-kültür ortamı ile yenileyin.Beş gün boyunca her gün her bir jelin boyutunu ölçün. Son olarak, kolajen jel analizi için metin protokolüne bakın. Kolajen jelleri beş gün boyunca 37 °C'de kültüre ettikten sonra.Büzülmüş jelleri bir süzgecin üzerine yerleştirerek havaya maruz bırakın. Yeni altı kuyucuklu plakalar için süzgeci, akış sitometrisi için kullanılan ticari hücre süzgeçlerinden oluşturun. Her kuyucuğu nazikçe 11 milliliters 3D ko-kültür ortamı ile doldurun.Steril bir kaşık kullanarak jelleri ağın üzerine yerleştirin ve bu koşulda jellerin üzerinde kalan tüm medyumu uzaklaştırın. Jeller medyuma batırılmış durumdayken, jelin üst yüzeyi havaya maruz kalır. Bu kültür koşulunu hava-sıvı arayüzü olarak tanımlayın.Tümör mikroçevresini taklit eden bu ko-kültür yöntemi, kollajen jeller içine gömülmüş fibroblastlar ile kanser hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanışlı bir araçtır. A 5 49 hücreleri, fibroblastların gömülü olduğu bir kollajen jel üzerinde ko-kültür yapılmış ve jel, ortam içeren bir ağ üzerine yerleştirilerek A 5 49 hücre tabakası havaya maruz bırakılmıştır. Burada, altı kuyuklu bir plakanın kuyucuğundaki ağ üzerine yerleştirilmiş jelin, hematoksilen ve eozin ile yapılan histolojik analizlerini gösteren temsili bir resim yer almaktadır.Üç boyutlu kültürlenmiş jelin kesitlerinin boyanması, 5 49 hücrenin akciğer kanseri ilişkili fibroblastlar içeren kollajen jele invazyon yaptığını ortaya çıkarmıştır. Bu prosedürün ardından, tümör stroma etkileşimindeki spesifik gen fonksiyonu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla gen ekspresyonu veya knockdown gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

three-dimensional-co-culture-model-for-tumor-stromal-interaction

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Üç boyutlu heterotipik<em&gt; In Vitro</emYumurtalık Kanseri Başlatma ve İlerleme sırasında Stromal-Epitel Etkileşimleri&gt; Modelleme

Bu videoda, üç boyutlu bir tümör sferoidi ve T hücresi ko-kültürü oluşturmak için bir yöntem gösterilmektedir. Tümör sferoidleri içeren mikrokuyucuklara sahip bir agaroz dökümü hazırlanır, ardından T hücrelerinin eklenmesi takip edilir. İnkübasyondan sonra, bu kurulum, kontrollü bir üç boyutlu ortamda T hücrelerinin tümör sferoidleri ile etkileşiminin incelenmesine izin verir.

Tümör Sferoidlerinde Sızan T Hücrelerinin Üç Boyutlu Ko-Kültür Modeli

Karsinom hücreleri ile Organotipik beyin kesit kokültürü beyin dokusu karsinoma hücre istilası sürecinde floresan gibi parlak saha (video) mikroskopisi ile görselleştirme morfolojik değişiklikler sağlar. Bu model sistem ayrıca hücre değişimi ve ikmal yaklaşımlar sağlar ve manipülasyonlar ve analizlerin bir yelpazede sunuyor.

Bir Organotipik Beyin Dilim ve kanser hücrelerinin 3D Sferoid ile Coculture Sistemi

Bir tekrar oluşturulmuş temel membran üzerinde meme epitelyum hücreleri üç boyutlu kültür iyi huylu meme in vivo mimari özetlemek için, iyi huylu göğüs ve fenotipten malin fenotipi ayırt etmek için yararlı bir yöntemdir. Önemli olarak, bu sistem, diğer dokularda invaziv karsinomları incelemek için uygulanabilir.

Üç Boyutlu Kültürler: Meme hücrelerinin malign Dönüşüm vs Normal Asiner Mimari Eğitim için Bir Aracı

Oksijen ve besin sağlamak için bir perfüzyon biyoreaktör sistemi kullanılarak kültürlenebilen 3D meme kanseri vekilleri oluşturmak için bir yöntem gösteriyoruz. Büyümeyi takiben, vekiller sabitlenir ve ilgilenilen parametrelerin değerlendirilmesi için parafine işlenir. Böyle bir parametrenin, hücre yoğunluğunun değerlendirilmesi açıklanmaktadır.

Hazırlama ve Analizler<em&gt; İn Vitro</em&gt; Üç Boyutlu Meme Kanseri Suretler

Kanser hücreleri bir kollajen jele gömülür ve daha sonra uydu tümörlerinin invazivliği ve oluşumunun izlenebileceği bir 3D kültür sistemi oluşturmak için bir aselüler fibrin jeli içine sıkıştırılır.

Kanser hücre istilası ve Uydu Tümör oluşumu keşfedin Kültür Testi Üç Boyutlu

İn vitro model sistemi, akciğer skuamöz karsinomu (LUSC) ilerlemesi sırasında kanserle ilişkili fibroblastlarla (CAF) 3 boyutlu (3D) bir ortak kültürde doku mimari değişikliklerini yakalamak için geliştirilmiştir. Bu organoid sistem tümör fenotip modüle çeşitli tümör hücre içsel ve dışsal değişikliklerin rollerini araştırmak için benzersiz bir platform sağlar.

Akciğer Skuamöz Karsinom Progresyonunu Modellemek Için Çok Boyutlu Coculture Sistemi

Tümör hücreleri ve stromal fibroblastların heterotipik etkileşimine dayanan üç boyutlu yeni bir küresel model oluşturulmuştur. Burada, spheroidlerin oluşumunu görselleştirmek için tümör hücreleri ve stromal fibroblastlar, hızlandırılmış görüntüleme ve konfokal mikroskopi ortak kültürünü satıyoruz. Bu üç boyutlu model tümör-stroma etkileşimleri ve test kanser terapötik çalışma için ilgili bir platform sunuyor.

Tümör-Stroma Etkileşimi ve İlaç Keşfini İncelemek İçin Yeni Bir Stromal Fibroblast-Modüle 3D Tümör Küresel Modeli

Sunulan yaklaşım aynı anda 3D spheroid tahliller ve T-hücre sitotoksisite kanser hücresi invazyonu değerlendirir. Spheroids bir iskele-free agarose multi-microwell döküm oluşturulur. Eş-kültür ve tip I kollajen matris gömme kanser hücresi invazyonu ve T-hücre aracılı sitotoksisite izlemek için izin veren aynı cihaz içinde gerçekleştirilir.

3D Kültürde Kanser Hücre İstilası ve T-Hücre Sitotoksisitesi İzleme

İlgili insan hastalığını sadakatle nükseden kapsamlı in vitro modeller eksiktir. Mevcut çalışma, insan hepatosellüler karsinomunda tümör-stromal etkileşimi incelemek için güvenilir bir in vitro araç olan üç boyutlu (3D) tümör sferoid oluşturma ve kültürü ssunuyor.

Hepatosellüler Karsinomdaki Tümör-Stromal Etkileşimi Araştırmak İçin Üç Boyutlu Sferoid Modeli

Kanser metastazını incelemek için heteroselüler karışmayı yakalayan 3D kanser modellerine kritik bir ihtiyaç vardır. Çalışmamız, invazyon ve hücresel mekansal dağılımları incelemek için kullanılabilecek iskele ve iskelesiz bir ortamda heteromultisellüler stromal-epitel oluşumunu sunmaktadır.

İstilayı Yönlendirmek İçin Epitelyal Kanser Hücrelerinin İskelesiz 3D Kültürlerinde Heteromultihücreli Stromal Hücreler

Keşfedin akciğer kanser hücreleri ve kanserle ilişkili fibroblastlar arasındaki tümör-stromal etkileşimleri üç boyutlu ko-kültür modeli kullanarak. Bu yöntem, kanser biyolojisi araştırmalarında fizyolojik olarak daha uygun bir platform sağlar.

Tümör-stromal Etkileşim için üç boyutlu Co-kültür Modeli

Daha fazla video keşfet