Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Bu prosedürün amacı, kemirgen ventral orta beyninden primer nöronları verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmektir. Bu işlem, öncelikle kemirgen embriyolarının orta beyninin diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise ventral orta beynin dikkatlice izole edilmesidir.

Sıradaki adımda, tek hücre süspansiyonu elde etmek için nöronal dokunun disosiye edilmesi gerekir. Son adım, tutunmuş hücreler daha sonra 24 kuyucuklu plakaya aktarılmadan önce primer nöronların küçük bir hacimde lamel üzerine ekilmesidir. Nihayetinde, kültür içindeki dopaminerjik nöronları tanımlamak için antikor ve immunfloresan mikroskopi kullanılır.

Orta beyindeki dopaminerjik nöronlar, bilişte hareket ve duygu kontrolü ile beynin ödül salgılaması dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonlarda yer alır. Ayrıca Parkinson hastalığı, bağımlılık ve şizofreni dahil olmak üzere nörolojik ve nöropsikiyatrik durumlarda da rol oynarlar. Ventral orta beynin onarılma yöntemi.

Nöronal kültürler, dopaminerjik nöronların fizyolojisini ve hücresel özelliklerini incelemenin yanı sıra, Parkinson hastalığı gibi bozukluklar sırasında meydana gelen dejenerasyonlarının nedenini anlamak için kullanılabilir. İlk olarak, lamel camlarını hazırlayın.

Herhangi bir yağ kalıntısını gidermek için bunları en az 30 dakika boyunca %70 ethanol içinde kaynatın. Ardından lamel camları otoklavlayın. Lamel camlarını 24 kuyucuklu plakalara aktarın ve her birine yarım mililitre polyol all athene ekleyin.

Plakaları oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe etmeye bırakın. Çalışma poliolü veya Athene çözeltisinin raf ömrünün bir ay olduğunu not edin. Ardından, lamel kapaklarını her yıkamada yarım mililitre su kullanarak üç kez yıkayın.

Üç yıkama işleminin tamamı yapılmadığında, kültürlenen hücreler 24 saat boyunca hayatta kalamaz. Ardından, laminin çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi öncelikle buz üzerinde yavaşça çözdüğünden emin olun.

Ardından laminini soğuk D-M-E-M-F 12 içinde çözün ve hemen kullanın. Şimdi her bir kuyucuğa taze hazırlanmış yarım mililitre çalışmaya hazır laminin çözeltisi ekleyin ve plakaları 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Son olarak, cam pipetleri hazırlarken uçlarını normal boyutlarının yarısına gelene kadar cilalıyorum.

Uterin keseleri açığa çıkarmak için abdominal bir insizyon yapın ve forseps kullanarak uterusu serbestçe kesin. Uterusu 100 milimetrelik bir kap içindeki buz gibi soğuk HBSS'ye aktarın ve forseps ile embriyoları çıkarmaya başlayın. İzole edilen embriyoları soğuk HBSS içeren yeni bir kaba aktarın.

Şimdi bir diseksiyon mikroskobu altında, ventral orta beynin bu bölgesine 10x büyütmede erişmeye hazırlanın. Biyo makaslar veya pensler kullanarak, beyni istmustan ve meas ve sefalik di sefalik sınır bölgesinden keserek meas ve sefalik arkı diseke edin. Tüm orta beyni çıkardıktan sonra, medial dorsal orta beyinde bir kesi yapın.

Penset kullanarak meningesleri uzaklaştırın. Bu adım, nöronal kültürlemedeki başarının kritik bir noktasıdır. Nöronal olmayan hücreler kültür koşulları altında ölecek ve komşu nöronlara olumsuz sinyaller gönderecektir.

Şimdi orta beyin dokusunu kelebek şeklinde düzleştirin. Ventral orta beyni bırakacak şekilde, her bir kanadın yaklaşık yarısını steril bir bıçakla kesin. Ventral orta beyni 15 mililitrelik konik bir tüp içindeki buz soğukluğundaki HBSS'ye aktarın.

Ardından, bir saat içerisinde mümkün olduğunca çok embriyoyu diseke etme işlemine geçin. Bir saatten fazla buz üzerinde tutulan embriyolarda hücre canlılığı düşük olur. Dopaminerjik nöronların yüksek canlılığını sağlamak için, diseksiyon ile ekim arasındaki süre bir saati geçmemelidir.

Ek olarak, meninglerin uzaklaştırılması, kapak altındaki nöronların sağkalımı için kritik öneme sahiptir. Ventral orta beyin toplama kabındaki HBSS'yi uzaklaştırın. Ardından, 12 parça doku için yeterli olacak miktarda, bir mililitre ılık 0.05%tripsin A DTA ekleyin.

Dokuyu 37 °C'de beş ila 10 dakika inkübe edin. Çeker ocak altında, tripsin A DTA'yı 1 mL deaktivasyon ortamı ile değiştirin. Karıştırmak için nazikçe şişirin ve ardından, ayrışmış hücrelerin atılmaması için yeterli miktarda ortam bırakarak deaktivasyon ortamını uzaklaştırın.

Ardından, hücreleri kaybetmemeye dikkat ederek dokuları iki kez tam besiyeri ile yıkayın. Şimdi bir mililitre tam besiyeri ekleyin. Daha sonra, tek hücreli süspansiyon elde edilene kadar dokuyu, kabarcık oluşturmadan, alevle uçları düzeltilmiş pipetle triture edin.

Yaklaşık sekiz ila 10 pasaj yeterli olacaktır. Bu sürenin sonunda, hücreleri 400 Gs'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri bir mililitre tam besiyeri içinde yeniden süspande edin.

Süspansiyon elde etmek için hücreleri pipetle dört kez kadar karıştırın. Süspansiyondaki hücrelerin sayımını yaparak sağlık durumlarını değerlendirmeye başlayın. Bunun için hemostatuar sayım hücresi (hemositometre) ile trypan mavisi dışlama yöntemini kullanın.

Şimdi hücre süspansiyonunu mikrolitre başına 1500 hücre olacak şekilde ayarlayın. Ardından sterilize edilmiş mikro santrifüj tüp kapaklarını 100 milimetrelik kaplara aktarın. Hazırlanan lamelleri pens yardımıyla kapakların üzerine yerleştirin.

Lamelleri yıkamayın ve kurumamasına dikkat edin. Her lamelin üzerine 100 µL süspansiyon yükleyin. Bu biraz alışılmadık yöntem %90 kültür canlılığı sağlar ve başarının kritik bir adımıdır.

Ardından Petri kabını kapatın ve bir saat boyunca inkübatöre yerleştirin. İnkübasyon sonrası, lamine camları ortamla birlikte, her kuyucuğunda 37 °C'ye ısıtılmış 400 µL komplet ortam içeren 24 kuyucuklu plakalara dikkatlice aktarın ve hücreleri gece boyunca inkübe edin. İlk birkaç saat, 24 saat içindeki hücre sağkalımı için en kritik süredir. Her kuyucuğa nazikçe 0,5 mL komplet ortam ekleyin.

İki haftada bir. Besiyerinin yarısını değiştirin. Eğer kültür sararırsa, besiyeri değişimi daha erken yapılabilir ancak değişimler yine de seyrek tutulmalıdır.

Dopaminerjik nöronlar bu koşullar altında altı haftadan fazla hayatta kalacaktır. İki haftalık kültürün ardından, tirozin, hidroksilaz ve nöronal markerlara karşı yapılan immünohistokimya, hücrelerin %1'inin dopaminerjik olduğunu göstermektedir. Nöronal projeksiyonlar, ekimden sonraki iki saat içinde ortaya çıkar.

Kültürdeki ilk günün sonunda, aksonlar ve dendritler ayırt edilebilir hale gelir. Bu prosedürü takiben, nöronlar nihayetinde altı haftadan fazla hayatta kalır ve kapsamlı bir uzama gösterir. Dopaminerjik nöronlardaki mekanistik soruları yanıtlamak için viral transdüksiyon, immünofloresan veya elektrofizyoloji gibi diğer yöntemler uygulanabilir.