Fare Kemik İliği monositlerin Takip İn Vivo

Bu prosedürün genel amacı, iki foton görüntüleme kullanarak canlı bir farenin kafatası kemik iliğindeki monosit kaçakçılığını görselleştirmektir. İlk olarak, fare uyuşturulur ve damar sistemini etiketlemek için bir çürük çözeltisi, rumine dekstran enjekte edilir. Fare daha sonra özel bir metal desteğe yerleştirilir ve parietal kemiğin arkasından ön kemiğe kadar olan kafa derisi çıkarılır.

Daha sonra cerrahi yapıştırıcı ile doğrudan kafatasına bir lastik halka uygulanır ve rezervuarlar sıvı tuzlu su ile doldurulur. Son olarak, kafatası kemik iliği içinde zaman içinde floresan hücre gelişimini izlemek için çoklu foton mikroskobu kullanılır. Bu ben, immünohematoloji alanında, kararlı durumda veya kemoterapiden sonra monosit mobilizasyon mekanizması gibi önemli bir soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Dolayısıyla bu yöntem, modüler monositlerin davranışı hakkında fikir verebilir. Kullanılan grip raportörünün özgüllüğüne bağlı olarak diğer kemik iliği hücre alt kümelerini incelemek için de uygulanabilir. Aşağıdaki protokol, bir titanyum safir kristal lazer ile birleştirilmiş bir çoklu foton mikroskobu ve lazer güç kontrolü için bir op modülatörü kullanır.

Üç floresan kanalın aynı anda kaydedilmesini sağlamak için, konfigürasyon, 565 nanometre ve 690 nanometre, dikroik aynalar, 565, 610 nanometre ve 500, 550 nanometre bant geçiren filtreler ve bir 485 kısa geçiren filtre. Bu kurulumda, ikinci harmonik üretimi veya SHG ve camgöbeği floresan proteini veya CFP'nin, 485 kısa geçiren filtreden sonra NDD tarafından tespit edildiğine dikkat edin. CFP ayrıca NDD tarafından da tespit edilir.

500'den sonra 550 bant geçiren filtre ve Rod Domine Dextran NDD tarafından algılanır. 565 610 bant geçiren filtreden sonra, görüntülemeden birkaç saat önce ısıtma odasını 32 santigrat dereceye ayarlayın. Bu sıcaklık, deney boyunca fareyi en uygun vücut sıcaklığında tutacaktır.

Burada kullanılan ısıtma odasının karanlık olduğunu ve sistemin hedeflerini ve motorlu plakasını kapladığını unutmayın. Bu, harici ışık kirliliğini önlemeye yardımcı olur. Önce sistemi açmak için titanyum safir lazeri açın, ardından mikroskop sisteminin geri kalanını açın.

Satın alma yazılımını başlatın. Burada Zeiss Zen yazılımı kullanılmaktadır. Lazer dalga boyu aralığını 870 nanometre olarak ayarlayın.

Ardından kayıt için uygun NDD'yi seçin. Bu deneyde kullanılan fare, BOS bir reseptör promotörü kontrolü altında camgöbeği floresan proteini eksprese eden Mac blue adı verilen transgenik bir faredir. Önerilen anestezi yöntemi, görüntülemenin uzunluğuna bağlıdır, bu nedenle ayrıntılar için ekteki belgeye başvurmak en iyisidir.

Bu prosedürün zor bir yönü, damarı kaçırmak oldukça kolay olduğu için T damar enjeksiyonudur. Böyle bir durumda, bunun yerine retroorbital enjeksiyon yapın. Fare uyuşturulduktan sonra, ayak tabanını uyararak bilinç kaybını kontrol etmek için pense kullanın. Önümüzdeki.

Damar sistemini boyamak için kuyruk damarına veya nötrofil boyamasına 200 mikrolitre çubuk domin dekstran enjekte edin. LY altı GPE içeren 100 mikrolitre salin enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, farenin başını mikroskoba ve anestezik gaz inhalerine uyarlanmış özel yapım bir stereotaktik tutucunun tutma plakaları arasına yerleştirin.

Bu, solunum hareketlerinin görüntülemeyi etkilememesini sağlar. Cildi kulaklar ve kafa arasında germek için tutma plakalarını sıkın. Kararlılığı kontrol edin.

Kafaya pense ile hafifçe bastırarak, kafa hareket etmemelidir. Ardından hayvanın normal nefes aldığından emin olun. Fareyi iki foton görüntülemeye hazırlamak için, gözlerden kaçınmaya özen göstererek kafa derisinin saçına %70 etanol uygulamak için bir parmağınızı kullanın.

Ardından kafa derisini ortaya çıkarmak için kesikli bir örtü yerleştirin. Daha sonra, steril makas ve pense kullanarak cildi kesin ve kafa derisini parietal kemiğin arkasından ön kemiğe kadar tamamen çıkarın. Yoğun kanamayı önlemek için gözlerden ve kulaklardan üç milimetre mesafe bırakın.

Kafatasını kaplayan gevşek bağ dokusunu veya periosteuumu çıkarın. Ardından ılık bir PBS ıslatılmış kağıt havlu kullanarak, kalan saçları burada gösterildiği gibi yıkayın. Küçük bir ölçü iğnesi kullanarak, 10 milimetre çapında bir lastik halkanın tüm çevresine cerrahi yapıştırıcı sürün.

Ardından lastik halkayı başka bir PBS ıslatılmış kağıt havluyla doğrudan kafatasının üzerine yerleştirin. Halkanın içini son bir kez temizleyin. Kafatasını tamamen daldırmak için sıcak PBS ekleyin.

Ardından stereotaktik tutucuyu hedefin altına yerleştirin. Fare yerleştirildikten sonra, kafatasını görüntülemek için doğrudan iletimli mikroskop oküler kullanın ve kabaca mikroskop görüş alanına yerleştirin. Görüntüleme yazılımı penceresinin sol üst köşesinde, canlı alım'a tıklayın.

Yazılımdaki mikroskop yön kontrolü kullanılarak pencerenin ortasında dokunun canlı bir taraması görünecektir. Odağı ayarlamak için CFP ve çubuk domine sinyali olan bir bölgeyi bulun. Ardından, minimum fotoğraf hasarı ile en iyi sinyal-gürültü oranını elde etmek için lazer gücünü minimuma ayarlayın.

Yazılımda bir sonraki adımda, kanal sekmesine tıklayın ve fotoğraf ağarmasını ve fotoğraf hasarını azaltmak için her NDD için PMT'lerdeki kazanç gücünü artırın, ardından edinme ayarlarını 1,58 mikrosaniye piksel bekleme süresi ve 512 x 512 piksel çözünürlük ile 1,5 büyütme ile tek taramaya ayarlamak için uygun sekmeye tıklayın. Kayıt parametreleri ayarlandıktan sonra, canlı alım komutuna tıklayın ve gerçek zamanlı olarak izlenecek istenen bir x, y, Z alanını seçmek için dokuyu inceleyin. Burada hem vasküler hem de parankimal alanları içeren bir alan seçilir.

Sonraki konumlar sekmesinde gösterilen alanın X, Y, Z koordinatlarını kaydetmek veya kaydetmek için. Ekle'ye tıklayın. İlgilenilen tüm koordinatları kaydetmek için bu işlemi en fazla üç ek alanla tekrarlayın.

Koordinatlar, yazılıma talimat vermek için yanındaki konumlar sekmesinde görünecektir. Üç DZ'lik bir görüntü yığını yakalamak için, ilk kayıtlı konuma gitmek için yazılımdaki konumlar sekmesinde taşı'ya tıklayın ve yazılımın sol üst kutusunda Zack'i seçin. Bu, Z yığını sekmesini açacak, en yüksek Z konumuna hareket edecek ve lazer gücünü buna göre ayarlayacaktır.

En son ayarla'ya tıklayın, ardından en derin konuma geçin. Lazer gücünü ayarlayın. Ardından önce sete tıklayın.

Yığın analizinin kalınlığı, incelenen hücreye hızlı bir şekilde uyarlanmalıdır. Hareketli hücreler hızlı bir şekilde Fransızca'dan çıkacaktır, bu nedenle daha kalın bir yığın edinmeniz gerekecektir. Sonra yavaş hareket eden hücreler için elde edersiniz.

Sol üstteki kutuda, zaman serisi sekmesini açmak için zaman serisi komutunu seçin. Döngü sayısını ve zaman aralığını ayarlayın. Burada, 60 döngü için her 30 saniyede bir bir hacim elde edilecektir.

Bu, gerçek zamanlı olarak 30 dakikayı temsil eder. Ana pencerede hızlandırılmış görüntülemeye başlamak için, prosedür boyunca deneyi başlat'ı seçin, bilinçsiz olduğundan emin olmak için hayvanı izlemeye devam edin. Ayrıca hedefin uygun şekilde daldırıldığından emin olun.

Sekans yakalandıktan sonra, ılık PBS eklemek için bir pipet kullanın. Ardından 30 dakikalık ikinci bir satın alma işlemine başlayın. Alım sırasında sinyalin ilerleyici olarak kaybolması görülürse, PBS sızıntısı olup olmadığını kontrol edin.

Gerekli tüm videolar kaydedildikten sonra, intra vital görüntüleme ile kemik iliği fizyolojisini incelemek için ekteki belgede açıklandığı gibi veri analizi yapıldı, bir Mac blue transgenik fareye 2 milyon Dalton çubuk domin dekstran enjekte edildi ve iki foton lazer tarama mikroskobu ile görüntülendi. Bu videoda gösterildiği gibi, elde edilen mikrografta, 2 milyon Dalton çubuk domin dekstran ile boyanmış damar sistemi kırmızı kemikle gösterilmiş, mavi ile gösterilen ikinci harmonik nesil tarafından görselleştirilmiştir. Camgöbeği içinde gösterilen ECFP pozitif monositler, damar sistemi ile kemik arasında koyu renkli alanlar olarak görülen parankimal nişler içinde ve damarlar içinde bulunur.

Bireysel hücre yörüngesini hesaplamak için hızlandırılmış görüntüleme yapıldı. Bu video, parankimal monositlerin göç davranışını göstermektedir. ECFP sinyali camgöbeği rengindedir ve her kırmızı nokta için göç yolları yeşil renkte görünür.

Burada vasküler monositlerin göç davranışı görülebilir. Bu veriler, hücrelerin hem ortalama hızını hem de ortalama kare yer değiştirmesini hesaplamak için kullanılabilir. Vasküler monositlerin, parankimal monositlere kıyasla hem artmış yer değiştirme hem de artmış hız gösterdiğine dikkat edin.

Bu videoyu izledikten sonra, fare kemik iliği monositlerini iki fotoğraf görüntüleme kullanarak in vivo olarak nasıl izleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların, hematopoezin çok önemli bir bölgesini temsil eden kemik iliğindeki hücre göçü ve etkileşimini, aynı zamanda antijen hazırlama ve immünolojik hafıza gibi diğer temel işlevleri keşfetmelerinin yolunu açtı.