Name: Fare Kemik İliği monositlerin Takip İn Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Keşfedin fare kemik iliği monositlerinin iki foton görüntüleme ile canlı takibini. Bu yöntem immünohematolojide monosit mobilizasyon mekanizmalarını ve kemoterapi sonrası davranış değişikliklerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar editoryal yardım için Anne Daron ve Pierre Louis Loyher teşekkür etmek istiyorum, iki-foton mikroskop ve yardım damızlık fareler için hayvan Facility &quot;NAC&quot; ve Camille Baudesson yardım için Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS). Hibe sözleşmesi kapsamında bu sonuçlara önde gelen araştırma Avrupa Topluluğu&#39;nun Yedinci Çerçeve Programı fon aldı (FP7 / 2007-2013) n 304.810 ° - baskınlar, ve n Université Pierre et Marie Curie gelen Inserm den 241.440-Endostem, ° &quot;Ortaya &quot;la gelen&quot; &quot;dan,&quot; Ligue contre le kanser Derneği la Recherche sur le Kanser dökün &quot;ve gelen&quot; Agence Nationale de la Recherche &quot;Program Doğuşu 2012 (ANR-EMMA-050). PH la &quot;Ligue contre le kanser&quot; tarafından desteklendi.

NOT: Tüm deney protokolleri Fransız Hayvan Deneyleri Etik Kurul tarafından onaylanan ve sayı A-75-2065 ile &quot;Hizmet Koruma et Santé Animales, Çevre&#39;den&quot; tarafından doğrulanmıştır. Örnek boyutları deneylerin tekrarlanabilirliğini sağlamak için seçilmiş ve hayvan etiği düzenleme 3R göredir. Mouse 1. Hazırlık <ol><li> Anestezi <ol><li> Görüntüleme kısa bir süre (en az 1 saat) için, ketamin (100 mg / kg) ve ketamin (10 mg / kg) ihtiva eden bir tuzlu su çözeltisi içinde 200 ul karın içinden enjeksiyonu ile fare uyuşturan. </li><li> Alternatif olarak, görüntüleme uzun süre (4 saat kadar), bir uyarlanmış maske aracılığıyla O 2 / N 2 O, bir 70/30 karışımı içinde buharlaşmış izofluran% 2.5 bir inhalasyon ile fare uyuşturan. </li><li> NOT: Bu şekilde daha kararlı bilinçsizlik sağlar ve ilaçların seri intraperitoneal önler. </li&gt; <li> Fare uyuşturulduktan sonra, pense ile ayak pedi uyarılması yoluyla bilinç için kontrol edin. </li></ol></li><li> Vasküler boyama / ek boyama <ol><li> Vasküler boyama için: kuyruk damarından damardan Rodamin-Dextran 200 ul (2 MDA salin tamponu içinde 10 mg / ml) enjekte edilir. </li><li> Nötrofil boyama için: kuyruk damarından salin çözeltisi 100 ul (klon 1A8) Ly6G-PE 2 ug enjekte edilir. </li></ol></li><li> Sabitleme <ol><li> Immobilizasyon için, mikroskop ve anestezik gaz İnhalatörde uyarlanmış bir ölçüye stereotaktik tutucu kullanın. NOT: sterotaktik tutucu hayvanın kafasını sıkmak için diğer çıkarılabilir ve uyarlanabilir iki metal plaka parantez, bir sabit olmak ve bir metal destek olduğunu. </li><li> Nefes hareketleri izolasyonu sağlamak için tespit plakaları arasında fare kafasını takın. Istinat plakaları ve sk germek için kafa arasındaki kulaklarını sıkıniçinde. istikrarın ve hayvan nefes refahı için kontrol edin. </li></ol></li><li> Saç derisini çıkarın <ol><li> Dikkatle gözlerle temas kaçınarak, steril bir aplikatör ile kafa derisi saç ıslak etanol% 70 kullanın. </li><li> Tam frontal kemik parietal kemiğin geriye doğru derisi kaldırmak için steril makas ve pense ile cilt kesin. Kapsamlı kanamayı önlemek için gözleri ve kulakları 3 mm&#39;ye kadar uzak tutun. Kafatası (periost) kapsayan gevşek bağ dokusu çıkarın. Sıcak PBS-batırılmış kağıt havlu ile kalan saç yıkayın. </li></ol></li><li> Daldırma sistemi kurmak <ol><li> Doğrudan dağılımını kontrol etmek, küçük bir iğne kullanılarak kafatası cerrahi yapıştırıcı ile 18mm çapında bir lastik halka yapıştırın. (30 ul yeterli olmalıdır) sızmasını önlemek için kauçuk halka tüm çevresi boyunca tutkal. </li><li> PBS-batırılmış kağıt havlu ile halka altında son bir kez kafatası temizleyin ve sonra tam daldırma için 37 ° C PBS ekleyinkafatası. Göz kuruluğu önlemek için fare her göz NaCl% 0.9 solüsyonu veya belirli oftalmik merhem bir damla ekleyin. Amaç altında stereotaktik tutucu sürükleyin. </li><li> Yaklaşık doğrudan iletim yoluyla mikroskop oküler kullanılarak alanını yerleştirin. </li></ol></li></ol> 2. İki foton Görüntüleme Edinme <ol><li> Seçici 680 1.080 nm ayarlanabilir, NUR ışık 140fs darbeleri sağlayan Safir kristal lazer, lazer ve güç kontrolü için bir acousto-optik modülatör: Ti ile birleştiğinde bir multiphoton mikroskop kullanın. 2 dikroik aynalar (565 nm ve 690 nm), 565/610 ve 500/550 bant geçiren filtreler kombinasyonu ile (3 floresan kanalları aynı anda kayıt etkin) 3 harici olmayan descanned dedektörleri (NDD) içeren bir yapılandırmayı kullanın ve bir 20 (NA = 1) suya daldırma hedefi × bir plan apochromat ile 485 kısa geçiren filtre,. </li><li> ANAES iyi homeothermy izin vermek için, ısıtma odacığı ayarlamaanestezisi sağlanır fare., NOT: Sıcaklık daha iyi stabilite için oturumu görüntüleme önce 1 saat ayarlanmış olabilir. Bizim durumumuzda, 32 ° C anestezi fare optimal vücut ısısını (36-37 ° C) elde etmek için seçilmiştir ve 4 saat kadar muhafaza edilir. Bu sıcaklık, kullanılan (dijital sistemi bu noktada kontrol etmek için kullanılabilir) sisteme adapte edilebilir. Buna ek olarak, kullanılan ısıtma odası siyah / koyu ve dış ışık kirlenmesini önlemek için sistemde (hedefleri ve motorlu plaka) bir kısmını kapsamaktadır. </li><li> Sistemi açın <ol><li> Safir lazer, daha sonra tüm mikroskop sistemi: Ti açın. Toplama yazılımı başlatın. 870 nm lazer dalga boyu aralığını ayarlayın. Kayıt için uygun NDD seçin. NOT: Bizim durumumuzda, ikinci harmonik üretimi (SHG) 19 ve mavi floresan proteini (eCFP) 485 kısa geçiş filtresi sonra NDD tarafından tespit edilir. 500/550 bant geçiren filtre ve rodaminle dekstran t ile tespit edildikten sonra eCFP da NDD tarafından tespit edilirO NDD 565/610 bant geçiren filtre sonra. </li></ol></li><li> Satın alma ayarlarını yapma <ol><li> Yazılımın &quot;canlı kazanım&quot; görüntüleme komutunu kullanın ve mikroskop yön kontrolü kullanarak, eCFP ve Rodamin sinyali ile bir bölgeye odağı ayarlamak. En az foto-hasarı ile en iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için en az bir lazer güç. NOT: Kullanılan güç ayarı ilgi bölgenin derinliğine göre değişir. Genellikle AOM ayarları 15 mW civarında hedefi ötesinde bir lazer gücü temsil% 20 civarında, ayarlanır. Her NDD foto-ağartma ve fotoğraf zararı azaltmak için Proje Yönetim Ekipleri kazanç gücünü artırmak için daha iyidir. Tipik satın alma ayarları tek 1.58 us piksel bekleme süresi ile tarama ve 1.5 büyütme 512 x 512 piksel çözünürlük vardır. </li></ol></li><li> Ilgi Seç bölgeleri <ol><li> Kayıt parametreleri ayarlandıktan sonra, tekrar &quot;canlı&quot; satın alma komutunu kullanınve gerçek zamanlı olarak izlenmesi gereken bir arzu (x, y, z) alanını seçmek için doku anket. NOT: Genellikle, biz vasküler ve parankimal alanlar hem de dahil olmak üzere bir alan seçti. </li><li> &quot;Pozisyon&quot; yazılım komutu ile alan kaydedin. Not: Bu komut x, y, farklı uzak alanlarda z koordinatlarını ezberler. </li><li> Seçin ve aynı prosedürü kullanarak (3 kadar) ilgi ek alanları kayıt. </li><li> Seçilen büyütme ile gerekli hacme göre birinci hafızaya pozisyona &quot;z-yığın&quot; yazılım komutu ile 3D z-yığını ayarlayın. İlk derin konumunu ve daha sonra yüksek konumunu ezberleyin. Derinliği ile lazer gücünü Normale. NOT: Birden fazla eşzamanlı alan görüntüleme için, 12 mikron kalınlığında bir hacim elde etmek her alan için 3 mikron z-adımlarla ayrılan 5 dilim kazanır. Bu ayarlar, çalışılan hücre tipine uygun olabilir. </li></ol></li><li> Başlat edinimi <ol><li> Seçmek220; zaman serileri &quot;yazılım komutu ve zaman aralığı süresini ve döngü sayısını seçin. &quot;Denemeyi başlatmak&quot; yazılım komutu seçerek gerekli zaman atlamalı ve süresine göre zaman atlamalı görüntüleme başlayın. NOT: Bizim durumumuzda, biz 30 dakika gerçek zamanlı temsil 60 döngüleri sırasında bir hacim, her 30 sn kazanır. Daha küçük zaman atlamalı damardaki hızlı hücre haddeleme izlemek için gerçekleştirilebilir. Bu durumda ince z-yığın ve en fazla 2 farklı alanlarda aynı anda kaydedilebilir. </li><li> Set up düzenli olarak izlenmesi. <ol><li> Her zaman bilinçsiz olduğundan emin olmak için hayvan izlemek. NOT: bıyık veya hayvanın bacakları Çalkalamalı canlanma göstergeleri vardır. Hayvanın solunum sarsıntılı durumda, izofluran miktarı biraz azaltılabilir. Edinimi sırasında Güçlü doku sürüklenme fare canlanma bir göstergesidir. </li><li> Hedefi emin olunuz batırılır. 37 ° C PBS betwee yenileyinn iki satın almalar (30 dk). NOT: edinimi sırasında sinyal Aşamalı kaybolması PBS kaçak göstergesidir. </li></ol></li></ol></li><li> Prosedürün Sonu <ol><li> Gerekli videolar kaydedilir sonra, hızla resüsitasyon önce servikal dislokasyon ile hayvan euthanize. Not: yara iyileşmesi uzunlamasına görüntüleme gerçekleştirmek için sınırlandırır 24-48 saat içinde bir yara oluşmasına yol açar. </li></ol></li></ol> 3. Veri Analizi <ol><li> Drift düzeltme <ol><li> 3D Otomatik izleme için Imaris Bitplane yazılımını kullanın. </li><li> Imaris 3D görüntü dizisi açın. Seçin komutunu &quot;nokta&quot;, ve homojen alanda dağıtılan mümkünse, 4 farklı bağlantı noktaları en az her zaman noktalarında için manuel izleme (klik + shift) oluşturmak. </li><li> &quot;Düzenlemek parça&quot; sekmesinde &quot;Doğru sürüklenme&quot; komutunu kullanarak sürüklenme düzeltme uygulayın. </li><li> T edinO x düzeltme, y ve z özellikle kalite artefactual kararsız önlemek için. NOT: düzeltme değil tatmin edici değilse, diğer bağlantı noktalarını deneyin ya da analiz videoyu hariç. </li></ol></li><li> Hücre izleme <ol><li> Komutu &quot;Yeni noktalar eklemek&quot; kullanın ve algoritma ayarı &quot;zamanla iz noktalar&quot; seçeneğini seçin. Bir sonraki adıma gidin. </li><li> &quot;Kaynak kanalı&quot; komutunu kullanarak ilgi tüm kanalda ya otomatik hücre izleme prosedürü uygulayın. 10 mikron Set nesneleri (yani, hücreler) çapı. Bir sonraki adıma gidin. NOT: seçim ölçülen sinyalin nesneler ve özgünlüğü arasındaki ayrım bağlıdır. Kısacası, tüm kanalda otomatik izleme Saptanan sinyal ilgi nesneye özgü yalnızca mümkündür. SHG ve eCFP hem 485 kısa geçiş filtresi sonra NDD tarafından tespit Çünkü, izleme daha spesifik ve 5 sonra NDD tarafından kaydedilen eCFP sinyalini kullanarak etkili olacak00/550 bant geçiş filtreleri. Kümelenmiş veya yoğun paketlenmiş nesneler 3.1.2 adıma benzer bireysel nesnelerin manuel seçim gerektirir. </li><li> , &quot;Kalite&quot; filtre türünü seçin belirsiz nesnelerin izleme dışlamak için eşik ayarlayın. Bir sonraki adıma gidin. </li><li> İki noktalar arasındaki &quot;Max mesafe&quot; ve &quot;Boşluk boyutu&quot; doğru parametreleri ile &quot;Brown Algoritması Motion&quot; seçiniz. Parça nesil doğrulayın. </li><li> Parçalar otomatik olarak hesaplanır sonra, &quot;parça süresi&quot; filtre türünü seçin Tracks (4 kez puan temsil eden) daha kısa, 120 sn ortadan kaldırmak için eşiğini ayarlamak. </li><li> Zorunlu: otomatik izleme sonra, parça kalitesini kontrol edin. <ol><li> Nesneleri parça yolları takip kontrol etmek için zaman çubuğunu önüne sermek. , &quot;Düzenlemek&quot; sekmesinde bulunan iz noktası düzeltme seçenekleri kullanın değilse: &quot;delete&quot; komutu (herhangi bir iz s silmek sahte veya uygunsuz parçaları silinoint ayrı ayrı) &quot;kesmek&quot; komutunu kullanarak. Parça yolu süreksiz ise, eksik zaman noktaları (klik + shift) ekleyin belirli bir yolda tüm noktaları seçin ve kullanmak &quot;düzenlemek parça&quot; sekmesinde komutunu &quot;connect&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Niceleme parametreleri <ol><li> &quot;Tercihler&quot; komutu &quot;İstatistik&quot; sekmesini seçin listesinde ilgi dinamik parametrelerini seçin. Seçin komuta ve oluşturulan excel dosyasını kaydetmek &quot;dosyasına tüm istatistikleri verme&quot;. NOT: Çeşitli dinamik parametreler doğrudan böyle bir parça uzunlukları, anlık hız, ortalama hız gibi yazılım elde edilen ve doğruluk takip edilmektedir. Hareketlilik katsayısı 6, 20 tespit edilebilir ancak doğrudan yazılım tarafından sağlanan değil. </li><li> Her hücre için, zaman (Dt), her dönem için değiştirmelerin ortalamasını hesaplamak (30 sn zaman atlamalı film için, ¨t 30, 60, 90 sn, vb olacak).Zaman aralığının bir fonksiyonu olarak kare yerinden ortalamasını çizilir. Eğrinin doğrusal parçası eğiminin hesaplanması ile motilite katsayısı elde edilir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ovchinnikov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Gal4-dependent+transgenes+in+cells+of+the+mononuclear+phagocyte+system+labeled+with+enhanced+cyan+fluorescent+protein+using+Csf1r-Gal4VP16%2FUAS-ECFP+double-transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice.</a> J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).</li>
<li>Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+and+macrophages+regulate+immunity+through+dynamic+networks+of+survival+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Monocytes and macrophages regulate immunity through dynamic networks of survival and cell death.</a> J Innate Immun. 2, 204-215 (2010).</li>
<li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19, 71-82 (2003).</li>
<li>Robbins, C. S., Swirski, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple+roles+of+monocyte+subsets+in+steady+state+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The multiple roles of monocyte subsets in steady state and inflammation.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 2685-2693 (2010).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+and+progenitor+cells+induce+monocyte+emigration+in+response+to+circulating+toll-like+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem and progenitor cells induce monocyte emigration in response to circulating toll-like receptor ligands.</a> Immunity. 34, 590-601 (2011).</li>
<li>Jacquelin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+reduces+Ly6Chigh-monocyte+motility+within+and+release+from+the+bone+marrow+after+chemotherapy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 reduces Ly6Chigh-monocyte motility within and release from the bone marrow after chemotherapy in mice.</a> Blood. 122, 674-683 (2013).</li>
<li>Swirski, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325, 612-616 (2009).</li>
<li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+the+immune+system%3A+progress%2C+pitfalls+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li>
<li>Charo, I. F., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+roles+of+chemokines+and+chemokine+receptors+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation.</a> N Engl J Med. 354, 610-621 (2006).</li>
<li>Milo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+reveals+promiscuous+crosspresentation+of+blood-borne+antigens+to+naive+CD8%2B+T+cells+in+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging reveals promiscuous crosspresentation of blood-borne antigens to naive CD8+ T cells in the bone marrow.</a> 122, 193-208 (2013).</li>
<li>Cavanagh, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+bone+marrow-resident+memory+T+cells+by+circulating%2C+antigen-bearing+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of bone marrow-resident memory T cells by circulating, antigen-bearing dendritic cells.</a> Nat Immunol. 6, 1029-1037 (2005).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+is+a+major+reservoir+and+site+of+recruitment+for+central+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells.</a> Immunity. 22, 259-270 (2005).</li>
<li>Travlos, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of the bone marrow.</a> Toxicol Pathol. 34, 548-565 (2006).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels%3A+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> J Exp Med. 188, 465-474 (1998).</li>
<li>Rashidi, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+of+mouse+bone+marrow+reveals+differential+niche+engagement+by+quiescent+and+naturally+activated+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging of mouse bone marrow reveals differential niche engagement by quiescent and naturally activated hematopoietic stem cells.</a> Blood. , (2014).</li>
<li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li>
<li>Cariappa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perisinusoidal+B+cells+in+the+bone+marrow+participate+in+T-independent+responses+to+blood-borne+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes.</a> Immunity. 23, 397-407 (2005).</li>
<li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317, 1767-1770 (2007).</li>
<li>Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+and+extracellular+matrix+in+vivo+by+using+second-harmonic+generation+and+two-photon+excited+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 11014-11019 (2002).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annu Rev Immunol. 26, 585-626 (2008).</li>
<li>Yost, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+neutrophil+extracellular+trap+%28NET%29+formation%3A+a+novel+innate+immune+deficiency+of+human+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates.</a> Blood. 113, 6419-6427 (2009).</li>
<li>Devi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+reveals+a+new+leukocyte+recruitment+paradigm+in+the+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus.</a> Nat Med. 19, 107-112 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

in vivo görüntüleme yönteminin kritik noktaları görüntüleme süresini maksimize etmek ve inflamatuar hücrelerin dinamiklerini etkileyebilecek bakteriyel kontaminasyon ve inflamasyon riskini en aza indirmek için odak istikrarı sağlamak için vardır. Cerrahi kemik iliği erişmek için minimal gerçekleştirilen gibi kafatası kemik iliği Görüntüleme bu amaçlarını izler. Steril malzeme ve antiseptik kullanımı hücre homeostazındaki pertürbasyon neden olabilecek enfeksiyon riskini sınırlamak için esastır. <p cla...

Kemik iliği hematopoezde merkezi bir rol oynar ve kan ile medüller parankim arasında yapısal olarak yeniden dolaşan, kısa ömürlü dolaşımdaki monositler havuzunu yenileyen 2,3 ve kararlı durum doku makrofajlarının ve dendritik hücrelerin 4 yeniden yapılandırılmasına katılan ana monosit rezervuarını temsil eder. Enflamasyon sırasında veya geçici aplaziden sonra, monositler kemik iliğinden veya dalak 5, 6, 7'den aktif olarak mobilize edilir ve iltihaplı organları kolonize eder. Kemik iliğinden miyeloid hücre mobilizasyonu sürecinde çeşitli kemoatraktan eksen yer almıştır 8, 5, 6,9. Miyeloid bölmenin ötesinde, kemik iliği aynı zamanda T lenfosit astarının 10 önemli bir bölgesi ve immünolojik hafızanın 11,12 bir nişidir. Bu nedenle, bu doku hematoloji ve immünoloji alanındaki çok sayıda araştırma için merkezi öneme sahiptir. Medullar miyeloid hücrelerin yapısal organizasyonu hakkındaki bilgilerimiz esas olarak sabit dokuların histolojik kesitinin analizinden kaynaklanmaktadır 13. Bu statik görüş, fonksiyonel aktivitesinin temeli olan kemik iliğinin farklı bölmeleri arasındaki hücresel değişim dinamiğinin incelenmesine izin vermez.
İntravital görüntüleme, daha önce sadece in vitro sistemlerden tanımlanan hücre hareketliliği, hücre uyumu ve hücreden hücreye etkileşimlerin çalışmasında önemli bir biyolojik girdi oluşturmaktadır. Uygun intravital görüntüleme için teknik zorluklar arasında, ilgilenilen dokuya optik bir bakış açısıyla ulaşma ve fizyolojik (nefes, kas veya peristaltik kasılmalar) veya mekanik sürüklenmelerden (cerrahi sonrası doku bozulması ve uzaması ve mikroskop objektifine maruz kalmanın yanı sıra sıcaklık ve vasküler / oksijenasyon bozulmaları) izolasyonunu en üst düzeye çıkarma yeteneği yer alır. Mikroskobik sürüklenmeler, odağı uzun süre tutma yeteneğini sınırlayabilir ve hücre motilitesinin nicelleştirilmesinde artefaktlara neden olabilir. Bu teknik zorlukları azaltmak için birkaç doku için doğrulanmış bir alternatif, termostatlı ve oksijenli bir ortamda inkübe edilen ekilen doku üzerinde çalışmaktır; Bununla birlikte, lenfatik ve vasküler dolaşımın tamamen bozulması sorunlu olabilir. Kafatası kemik iliğinin intravital görüntülemesinin bu konularla ilgili çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, minimal cerrahi eylem gerektirir. İkinci olarak, bu bölgedeki kemiğin kalınlığı, kemik iliği nişlerinin aşındırma olmadan doğrudan görüntülenmesine olanak tanır ve böylece fizyolojik bozulmaları azaltır. Müller ağ, kemiğin parasagital bölgesinde görüntülenebilir; Bununla birlikte, sinüzoidler, kemik matrisinin daha ince olduğu fronto-parietal bölgede daha belirgindir12,14. 
İntravital görüntüleme, ilgilenilen popülasyonu etiketleyen en doğru floresan raportörün mevcudiyetine dayanır. Evlat edinici transferden önce saflaştırılmış hücre popülasyonunun in vitro olarak etiketlenmesi, hematopoietik kök hücre nişlerinin 15 veya tümör aşılamasını destekleyen kemik iliği endotelyal mikro alanlarının 16 önemli karakterizasyonuna yol açtı ve immünolojideki temel kavramlar hakkında birkaç temel girdi sağladı 17 . Bununla birlikte, bu yaklaşım genellikle yüz binlerce hücrenin daha sonra in vivo olarak tespit etme şansı elde etmesini gerektirir. Bu, boyamayı takiben yüksek ölüm oranı, tüm vücuttaki seyreltme ve aktivasyon durumundaki değişiklik ile açıklanabilir, bu da önyargılı hedef aramaya yol açabilir. Transgenik fare sisteminden endojen etiketleme, bu sınırlamaların büyük ölçüde üstesinden gelir ve endojen osteoblast 8, megakaryositler 18 veya miyeloid-soy alt kümelerinin 6 davranışını görüntülemeye izin verir. Bununla birlikte, incelenen alt küme arasında floresan raportörün özgüllüğü göz önüne alındığında dikkatli olunmalıdır. 
MacBlue fare 1 olarak adlandırılan Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP, gerçek zamanlı görüntüleme 6 ile medüller monositleri incelemek için değerli bir transgenik sistemdir. Yüksek moleküler ağırlıklı rodamin-dekstranın intravenöz enjeksiyonu, medüller parankimi kemik iliğinin vasküler sinüzoid ağından ayırır. Bu yaklaşımı kullanarak, belirli bir fizyopatolojik ilgi bağlamında farklı medüller kompartmanlardaki monosit davranışını izlemek mümkündür. Ayrıca, spesifik bir antikor kullanarak in vivo etiketleme yoluyla monosit dinamiklerini nötrofillerinkiyle karşılaştırmak için ek bir strateji öneriyoruz.

<table><tbody><tr><td>Ketamin</td><td>Merial</td><td></td><td>100 mg / ml, anestezik</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer HealthCare</td><td></td><td>10 mg / ml, anestezik</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td></td><td>% 2.5, anestezik</td></tr><tr><td>O2 / NO2</td><td></td><td></td><td>70/30 karışımı, anestezik</td></tr><tr><td>Rhodamin-Dextran</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>2 MDa, 10 mg / ml, Vasküler boyama</td></tr><tr><td>Ly6G-PE</td><td>Becton-Dickinson</td><td></td><td>klonu 1A8, nötrofil boyama</td></tr><tr><td>Stereotaktik tutucu</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td>cerrahi</td></tr><tr><td>Etanol %</td><td></td><td></td>70 <td>cerrahi</td></tr><tr><td>Steril makas ve pense</td><td></td><td></td><td>cerrahisi</td></tr><tr><td>Kauçuk halka</td><td></td><td></td><td>18 mm çap, cerrahi</td></tr><tr><td>Glubran 2</td><td>Queryo Tıbbi</td><td></td><td>Cerrahi Tutkal, kauçuk halka fiksasyonu</td></tr><tr><td>Küçük ölçülü iğneler</td><td>Terumo</td><td></td><td>cerrahisi</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710 NLO multifoton mikroskobu&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Ti: Safir kristal lazer & nbsp;</td><td>NIR ışığının Tutarlı Bukalemun Ultra</td><td></td><td>140 fsec darbeleri</td></tr><tr><td>Zen 2010</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Satın Alma Yazılımı</td></tr><tr><td>Imaris Bitplane&nbsp;</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Analiz Yazılımı, 3D otomatik izleme</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>D. Dutscher</td><td></td><td>cerrahisi</td></tr><tr><td>Termostatlı oda</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>intravital görüntüleme</td></tr></tbody></table>

fare kemik İliği monositlerin takip<em&gt; İn vivo</em

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Gerçek zamanlı çoklu foton görüntüleme, fizyolojik 3 boyutlu ortamlarında hücre trafiğini ve hücreden hücreye etkileşimleri incelemek için harika bir fırsat sağlar. Bağışıklık hücrelerinin biyolojik aktiviteleri esas olarak motilite kapasitelerine bağlıdır. Kan monositlerinin kan dolaşımında kısa bir yarı ömrü vardır; Kemik iliğinden kaynaklanırlar ve yapısal olarak ondan salınırlar. Enflamatuar durumda, bu süreç artar, bu da kan monositozuna ve ardından periferik enflamatuar dokuların infiltrasyonuna yol açar. Kemik iliğinden vasküler ağa doğru monosit trafiğini kontrol eden biyomekanik olayların tanımlanması, monositin fizyopatolojik önemini anlamak için önemli bir adımdır. Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) farenin kafatası kemik iliğinin iki foton mikroskobu ile in vivo hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirdik. MacBlue faresi, vasküler ağ etiketlemesi ile birlikte bir miyeloid spesifik promotör 1'in kontrolü altında floresan raportörlerin gelişmiş camgöbeği floresan proteinini (ECFP) eksprese eder. Bu yaklaşımın, kemik iliği parankimi ve damar sistemi içindeki göç davranışını ve hücreden hücreye etkileşimleri daha da ölçmek için bireysel medüller monositlerin gerçek zamanlı olarak izlenmesini nasıl sağladığını açıklıyoruz. Bu yaklaşım, kemik iliği monosit alt kümelerinin biyolojisi hakkında yeni bilgiler sağlar ve bu hücrelerin belirli patolojik durumlarda nasıl etkilenebileceğini daha fazla ele almaya izin verir.

Fare kafatası yapısı intravital görüntüleme, kemik iliği fizyoloji çalışmak için iyi bir fırsat sunuyor. Ön-parietal alanı çevresinde ince olan kemik, kemiğin aşınma olmadan medulla nişler erişim elde etmek mümkündür. 1 MacBlue transgenik fare kafatası geniş bir 2D alanını temsil Şekil. kemik matriksi esas olarak SHG 19 tarafından kolayca tespit edilebilir kollajen oluşmaktadır. Rodaminle Dekstranın Enjeksiyon kemik iliği damar ağı lekeleri ve kemik matrisi ve gemilerin ...

Monositler, doğuştan gelen bağışıklığın anahtar düzenleyicileridir ve periferik mononükleer fagositik sistemin yenilenmesinde ve iltihaplanma durumunda kritik bir rol oynarlar. Bu el yazması, monosit mobilizasyon mekanizmasını incelemek için fare kalvaria kemik iliğinin gerçek zamanlı görüntüleme prosedürünü açıklamaktadır.

Fare Kemik İliği monositlerin Takip<em&gt; İn Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Bu prosedürün genel amacı, iki foton görüntüleme kullanarak canlı bir farenin kafatası kemik iliğindeki monosit trafiğini görselleştirmektir. İlk olarak, fare anestezi altına alınır ve damar yapısını etiketlemek için rot, rumine dekstran çözeltisi enjekte edilir. Ardından fare özel bir metal desteğe yerleştirilir ve kafa derisi, parietal kemiğin arkasından frontal kemiğe kadar olan bölgeden kaldırılır.Ardından, cerrahi yapıştırıcı ile kafatasına doğrudan bir kauçuk halka yerleştirilir ve rezervuarlar sıvı salin ile doldurulur. Son olarak, kafatası kemik iliği içerisindeki floresan hücre gelişimini zaman içinde izlemek için çok fotonlu mikroskopi kullanılır. Bu yöntem, immünohematoloji alanındaki, durağan durumdaki veya kemoterapi sonrası monosit mobilizasyonu mekanizması gibi temel bir sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu yöntem, modüler monositlerin davranışı hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, kullanılan floresan raporlayıcının özgüllüğüne bağlı olarak diğer kemik iliği hücre alt kümelerini incelemek için de uygulanabilir. Aşağıdaki protokol, bir titanyum safir kristal lazer ve lazer gücü kontrolü için bir OP modülatörü ile eşleştirilmiş bir çok fotonlu mikroskop kullanmaktadır.Üç floresan kanalının eş zamanlı olarak kaydedilmesini sağlamak için konfigürasyon; üç harici DS olmayan tarama detektörü veya 565 nanometre ve 690 nanometre dikroik aynaların, 565, 610 nanometre ve 500 550 nanometre bant geçiren filtrelerin ve bir 485 kısa geçiren filtrenin kombinasyonundan oluşan nds'leri içermelidir. Bu kurulumda, ikinci harmonik üretimi veya SHG ile siyan floresan protein veya CFP'nin, 485 kısa geçiren filtreden sonra NDD tarafından saptandığını unutmayın. CFP ayrıca NDD tarafından da saptanır.500 550 bant geçiren filtreden sonra, Rod Amin Dextran NDD tarafından tespit edilir. 565 610 bant geçiren filtreden sonra, görüntüleme işleminden birkaç saat önce ısıtma haznesini 32 °C'ye ayarlayın. Bu sıcaklık, deney boyunca farenin optimal vücut sıcaklığında kalmasını sağlayacaktır.Burada kullanılan ısıtma odasının karanlık olduğunun ve sistemin objektiflerini ve motorize tablasını kapladığının not edilmelidir. Bu, dış ışık kontaminasyonunu önlemeye yardımcı olur. Sistemi çalıştırmak için önce titanyum safir lazeri, ardından mikroskop sisteminin geri kalanını açın.Görüntüleme yazılımını başlatın. Burada Zeiss Zen yazılımı kullanılmıştır. Lazer dalga boyu aralığını 870 nanometre olarak ayarlayın.Ardından kayıt için uygun NDD'yi seçin. Bu deneyde kullanılan fare, CSF1 reseptörü promotörünün kontrolü altında siyan floresan protein eksprese eden Mac blue adlı transgenik bir faredir. Önerilen anestezi yöntemi görüntüleme süresine bağlıdır, bu nedenle ayrıntılar için beraberindeki belgeye danışmak en iyisidir.T venine enjeksiyon yapmak, veni kaçırmanın oldukça kolay olması nedeniyle bu prosedürün zor bir kısmıdır. Böyle bir durum gerçekleşirse, bunun yerine retroorbital enjeksiyon uygulayın. Fare anestezi altına alındığında, ayak tabanını uyararak bilinç kaybını kontrol etmek için pens kullanın. Sonraki.Damar sistemini boyamak için kuyruk venine 200 microliters rod domine dextran enjekte edin veya nötrofil boyaması için LY six GPE içeren 100 microliters salin enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, farenin başını mikroskoba ve anestezik gaz inhalerine uyarlanmış, özel yapım bir stereotaktik tutucunun sabitleme plakaları arasına yerleştirin.Bu, solunum hareketlerinin görüntülemeyi etkilemeyeceğini garanti eder. Kulaklar ve baş arasındaki deriyi germek için tutucu plakaları sıkın. Stabiliteyi kontrol edin.Kargaburun ile başa nazikçe bastırıldığında, baş hareket etmemelidir. Ardından hayvanın normal nefes aldığından emin olun. Fareyi iki fotonlu görüntülemeye hazırlamak için, gözlerden kaçınmaya dikkat ederek, parmağınızla kafa derisindeki tüylere %70 ethanol uygulayın.Ardından, saçlı deriyi açığa çıkarmak için kesikli bir örtü yerleştirin. Sonrasında, steril makas ve pensler kullanarak cildi kesin ve saçlı deriyi parietal kemiğin arkasından frontal kemiğe kadar tamamen kaldırın. Yaygın kanamayı önlemek için gözlerden ve kulaklardan üç milimetre mesafe bırakın.Kafatasını örten gevşek bağ dokusunu veya periostu temizleyin. Ardından, burada gösterildiği gibi, ılık PBS emdirilmiş bir kağıt havlu kullanarak kalan tüyleri yıkayın. Küçük gauge bir iğne kullanarak, 10 milimetre çapındaki bir kauçuk halkanın tüm çevresine cerrahi yapıştırıcı uygulayın.Ardından, PBS ile ıslatılmış başka bir kağıt havlu yardımıyla kauçuk halkayı doğrudan kafatasının üzerine yerleştirin. Halkanın içini son bir kez temizleyin. Kafatasını tamamen daldırmak için ılık PBS ekleyin.Ardından stereotaktik tutucuyu objektifin altına yerleştirin. Fare yerleştirildikten sonra, kafatasıyı görüntülemek ve mikroskop görüş alanında yaklaşık olarak konumlandırmak için doğrudan iletimli mikroskop okülerini kullanın. Görüntüleme yazılımı penceresinin sol üst köşesinde, canlı görüntüleme seçeneğine tıklayın.Yazılımdaki mikroskop yön kontrolü kullanılarak pencerenin ortasında dokunun canlı bir taraması görünecektir. Odağı ayarlamak için CFP ve rod baskın sinyalinin olduğu bir bölge belirleyin. Ardından, minimum fotootararlarla en iyi sinyal-gürültü oranını elde etmek için lazer gücünü minimuma ayarlayın.Yazılımda selanjutnya, kanal sekmesine tıklayın ve fotobleşing ile fotohasarı azaltmak için her NDD'ye ait PMT'lerin kazanç gücünü artırın; ardından, görüntüleme ayarlarını 1.58 mikrosaniye piksel bekleme süresi, 512 x 512 piksel çözünürlük ve 1.5 büyütme ile tekli tarama şeklinde ayarlamak için ilgili sekmeye tıklayın. Kayıt parametreleri ayarlandıktan sonra, canlı görüntüleme komutuna tıklayın ve gerçek zamanlı olarak izlenecek istenen x, y, Z alanını seçmek için dokuyu inceleyin. Burada, hem vasküler hem de parenkimal bölgeleri içeren bir alan seçilmiştir.Ardından, konumlar sekmesinde gösterilen alanın X, Y, Z koordinatlarını kaydetmek veya kayda geçirmek için ekle düğmesine tıklayın. İlgilenilen tüm koordinatları kaydetmek için bu işlemi üç ek alana kadar tekrarlayın.Koordinatlar, yazılıma talimat veren konumlar sekmesinde görünecektir. Üç DZ'lik bir görüntü yığını yakalamak için, yazılımdaki konumlar sekmesinde bulunan konumuna git (move to) seçeneğine tıklayarak kaydedilmiş ilk konuma gidin ve yazılımın sol üst kutusundan Zack'i seçin. Bu işlem Z yığını sekmesini açacak, en yüksek Z konumuna gidecek ve lazer gücünü buna göre ayarlayacaktır."set last" seçeneğine tıklayın, ardından en derin konuma gidin. Lazer gücünü ayarlayın. Sonrasında "set first" seçeneğine tıklayın.Yığın analizinin kalınlığı, incelenen hücrenin hızına göre uyarlanmalıdır. Hızlı hareket eden hücreler görüş alanından çabuk çıkacağından, daha kalın bir yığın elde etmeniz gerekecektir. Yavaş hareket eden hücreler için ise daha ince bir yığın elde edersiniz.Sol üstteki kutudan, zaman serisi sekmesini açmak için zaman serisi komutunu seçin. Döngü sayısını ve zaman aralığını ayarlayın. Burada, 60 döngü boyunca her 30 saniyede bir hacim elde edilecektir.Bu, gerçek zamanlı olarak 30 dakikayı temsil etmektedir. Ana pencerede zaman atlamalı görüntülemeyi başlatmak için prosedür boyunca deney başlat seçeneğini seçin ve hayvanın bilinçsiz olduğundan emin olmak için onu izlemeye devam edin. Ayrıca objektifin uygun şekilde daldırıldığından emin olun.Sıralama görüntülendikten sonra, sıcak PBS eklemek için bir pipet kullanın. Ardından 30 dakikalık ikinci bir görüntüleme işlemine başlayın. Görüntüleme sırasında sinyalin kademeli olarak kaybolduğu görülürse, PBS sızıntısı olup olmadığını kontrol edin.Gerekli tüm videolar kaydedildikten sonra, intravital görüntüleme ile kemik iliği fizyolojisini incelemek için ekteki belgede açıklandığı şekilde veri analizi gerçekleştirilmiştir; bir Mac blue transgenik fareye 2 milyon Dalton rhodamine dextran enjekte edilmiş ve iki fotonlu lazer tarama mikroskobu ile görüntülenmiştir. Bu videoda gösterildiği üzere, elde edilen mikrografta, 2 milyon Dalton rhodamine dextran ile boyanmış vaskülarite kırmızı renkte, ikinci harmonik üretimi ile görselleştirilen kemik ise mavi renkte gösterilmiştir. Siyan renkte gösterilen ECFP pozitif monositler, vaskülarite ile kemik arasında koyu alanlar olarak görülen parankimal nişlerin içinde ve damarların içerisinde yer almaktadır.Tekil hücre yörüngesini hesaplamak için zaman aşımı görüntüleme yapılmıştır. Bu video, parankimal monositlerin migrasyon davranışını göstermektedir. ECFP sinyali camgöbeği renginde olup her bir kırmızı noktanın migrasyon yolları yeşil renkte görünmektedir.Burada, vasküler monositlerin migrasyon davranışı görülebilir. Bu veriler, hücrelerin hem ortalama hızını hem de ortalama kare yer değiştirmesini hesaplamak için kullanılabilir. Vasküler monositlerin, parankimal monositlere kıyasla hem artmış yer değiştirme hem de artmış hız sergilediğine dikkat edin.Bu videoyu izledikten sonra, fare kemik iliği monositlerinin gelişimi sonrası iki foto görüntüleme yöntemi kullanılarak in vivo olarak nasıl takip edileceğine dair kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların, hem hematopoezin çok önemli bir merkezi olan hem de antijen primingi ve immünolojik hafıza gibi diğer temel işlevleri temsil eden kemik iliğindeki hücre göçünü ve etkileşimini keşfetmelerinin önünü açmıştır.

tracking-mouse-bone-marrow-monocytes-in-vivo

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, lösemi gibi kan hastalıkları olan hastalarda tüm BM kusurlarını araştırmak için farenin arka bacaklarından taze tüm kemik iliğini izole etmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

Fare Arka Uzvundan Kemik İliği Alımı

Bu protokol, farelerin kurban edilmesini gerektirmeden femur kemik iliğinin (BM) seri örneklemesi için bir prosedürü tanımlar. Bu prosedür, farelerin BM bileşiminin zaman içinde uzunlamasına çalışmalarını kolaylaştırır ve ex vivo ve transplantasyon çalışmaları için BM içindeki hücrelere seri erişim sağlar.

Canlı Farelerde Femoral Kemik İliği Aspirasyon

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Hematopoietik kök ve projenitör hücreler (HSPCs) ve kemik iliği niş arasındaki etkileşimin doğası tam olarak anlaşılamamıştır. Özel donanım modifikasyonları ve çok adımlı bir satın alma protokolü ex vivo görüntünün kemik iliği alanları içinde bağlantılı etiketli HSPCs, izleme etkileşimleri ve hareket için iki-foton ve konfokal mikroskopi kullanımına izin verir.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Anestezi uygulanmış farelerde intravital konfokal mikroskopi kullanarak kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında mezenterik venlerdeki nötrofillerin ve monositlerin davranışını izlemek için bir protokolü detaylandırıyoruz.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Protokol, femoral kemik iliğindeki hücrelerin hareketini in vivo olarak izlemek için kullanılabilecek yeni bir murin femur pencere odası modelini tanımlar. İntravital multifoton floresan mikroskobu, zaman içinde femur kemik iliğinin üç bileşenini (vaskülatür, kollajen matrisi ve nötrofiller) görüntülemek için kullanılır.

için Femur Pencere Odası Modeli<em&gt; İn Vivo</emFare Kemik İliği içinde&gt; Hücre Takibi

Burada, bir protokol saf CD4 T hücre (T hücre) etkinleştirme, yayılması ve GM-CSF kemik iliği (BM) tarafından indüklenen Th1 farklılaşma vivo içinde belirlenmesi için mevcut-dendritik hücreler (DC) türetilmiş. Ayrıca, bu iletişim kuralını BM ve T-hücre izolasyon, DC üretimi ve DC ve T hücreli evlat edinen transfer açıklar.

Vivo fare modeli ölçü saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve kemik iliği türevi dendritik hücreler tarafından indüklenen Th1 farklılaşma

Burada, fare veya insan yüksek boyutlu kitle sitometri için izole taze kemik iliği (BM) işlemek için bir protokol sunuyoruz (zaman-of-Flight ile sitometri, CyTOF) nötrofil-köklü hücrelerin analizi.

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

Burada, iletim elektron mikroskopisi (TEM) kullanılarak megakaryositlerin yerinde ultrayapısını analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Murine kemik ilikleri toplanır, sabitlenir, epoksi reçineye gömülür ve ultra ince bölümlerde kesilir. Kontrast boyamadan sonra kemik iliği 120 kV'da TEM mikroskobu altında gözlenir.

In Situ İletim Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Murine Megakaryopoez Keşfi

Bu protokol, gen düzenlenmiş hücreler de dahil olmak üzere birkaç hematopoietik veya lösemik kök hücrenin murin ksenogreft modellerinde intrafemoral enjeksiyonunu tanımlar, bu da sadece hücrelerin hızlı ve güvenli bir şekilde nakledilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda kemik iliğinin seri analizlerini de sağlar.

Canlı fareler kullanılarak yapılan basitleştirilmiş intrafemoral enjeksiyonlar, sürekli kemik iliği analizine izin verir

Bu protokol, 7-9 günlük yenidoğan fare kemik iliği hücrelerini izole etmek ve granülosit koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kaynağı olarak L929 hücrelerinin bir süpernatantını kullanarak farklılaşmış makrofajlar oluşturmak için enzimatik olmayan ve basit bir yöntemi tanımlar. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar, yüzey antijenleri F4/80, CD206, CD11b ve fonksiyonel yeterlilik açısından daha fazla analiz edildi.

Yenidoğan Fare Kemik İliği İzolasyonu ve Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Hazırlanması

Keşfedin fare kemik iliği monositlerinin iki foton görüntüleme ile canlı takibini. Bu yöntem immünohematolojide monosit mobilizasyon mekanizmalarını ve kemoterapi sonrası davranış değişikliklerini anlamaya yardımcı olur.

Fare Kemik İliği monositlerin Takip

Daha fazla video keşfet