Akış adlı lökositlerin üzerine Stromal hücreler Etkilerinin İncelenmesi

Bu prosedürün genel amacı, dokya yerleşik hücrelerin, vasküler endotel hücrelerinin inflamasyon sırasında lökositlerin toplanmasını destekleme yeteneğini nasıl etkilediğini incelemektir. Bu, öncelikle iki in vitro vasküler modelden biri olan mikro slayt modeli veya filtre modeli kullanılarak endotel hücrelerin mezenkimal kök hücrelerle ko-kültürlerinin oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Bu kültürler, akış analizinden önce sitokin ile işleme tabi tutulur.

Akış tabanlı yapay sistem, kullanılan model sisteme göre yapılan modifikasyonlarla adım adım kurulur. Son adım, lökositlerin endotel hücreleri üzerine perfüze edilmesi ve akıştan hücre göçlerinin yanı sıra sonraki davranışlarının gözlemlenmesidir. Nihayetinde, bu çok hücreli akış tabanlı adezyon deneyleri, mezenkimal kök hücreler ile endotel hücreler arasındaki etkileşimin inflamasyon sırasında nötrofil göçünü baskıladığını göstermiştir.

Bu yöntem, lökosit trafiği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, mezenkimal kök hücreler gibi doku yerleşik hücreler bu süreci nasıl modifiye eder? Kronik inflamasyon veya kanser gibi hastalıklarda bu durum değişir mi? Bu bilgileri yeni terapötik stratejiler geliştirmeye yardımcı olmak için kullanabilir miyiz? Başlamak için, akış sistemini kurmak amacıyla metin protokolünde açıklandığı gibi mikroslayt modelini veya filtre modelini kullanarak endotel hücreleri ile mezenkimal kök hücrelerin ko-kültürlerini oluşturun.

Öncelikle ısıtıcıyı açın ve 37 °C'ye ayarlayın. Ardından, pistonu çıkarılmış 20 mL'lik bir şırıngayı ve beş mL'lik bir şırıngayı üç yollu bir musluğa bağlayın. Sonrasında, valf ile üç yollu musluk arasındaki mesafe kadar uzunlukta yaklaşık 2,4 mm'lik bir hortum ölçüp kesin.

1,3 mm çapındaki tüpten 8 ila 10 mm uzunluğunda bir parça kesin ve bunu kalın tüpün bir ucuna yerleştirin. Kalın tüp tarafını üç yollu musluğa takın ve ince tüpün ucunu, yıkama rezervuarını oluşturmak için elektronik üç yollu mikro valfin bir portuna bağlayın.

Ardından, musluğu mikropor bant kullanarak perspeks hazneye sabitleyin. Sonrasında, altı ila sekiz milimetre uzunluğunda kalın ve ince tüplerden oluşan bir parça hazırlayın ve ince tüpü, kalın tüpün bir ucuna yerleştirin. Kalın tüpün ucunu, pistonu çıkarılmış iki mililitrelik bir şırıngaya takın.

Şimdi, örnek rezervuarını oluşturmak için iki mililitrelik şırınganın ince tüp ucunu elektronik mikro valf üzerindeki bir porta bağlayın. Ardından, mikro valf ile mikroskop tablasının merkezi arasındaki mesafe kadar uzun bir ince tüp parçası ölçün ve kesin. Mikro lam modeli için, ince tüpün ucuna 8 ila 10 milimetrelik bir kalın tüp parçası takın.

Ardından, kalın borunun ucuna L şeklinde bir konnektör yerleştirin. Bu parça, mikro slayta veya filtre modeline bağlanacaktır. İnce borunun ucuna 8 ila 10 mm uzunluğunda bir parça portex mavi hat manometre bağlantı borusu takın.

Ardından ince tüp ucunu mikro valf üzerine yerleştirin. Tüp, yıkama ve numune rezervuarları için ortak çıkış yolu olacaktır. Rezervuarları, sığır serum albümini içeren fosfat tamponlu salin ile doldurun.

Hava kabarcıklarını gidermek için PBSA'yı borulardan geçirerek borulama sistemini önceden hazırlayın, ardından manometre borusunu 50 mililitrelik bir cam şırıngaya bağlayın. Mikro slayt modeli için, cam şırıngaya giden manometre borusunun ucuna yalnızca 10 ila 12 milimetrelik kalın bir boru parçası takın. Kalın borunun ucuna L şeklinde bir konnektör yerleştirin.

Şırıngayı 10 mililitre PBSA ile doldurarak ön hazırlık yapın. Şırıngayı, tübe bağlı olan ucu yukarı bakacak şekilde ters çevirin ve yeniden beş mililitre PBSA ile doldurmadan önce tüm hava kabarcıklarını dışarı itin. Son olarak, cam şırıngayı infüzyon ve geri çekme işlemleri için bir şırınga pompasına yerleştirin.

Akış için mikro lamları hazırlamak amacıyla cam şırınganın doldurma hızını ve çapını ayarlayın. Mikro lamı, ters faz kontrast mikroskobunun tablasına yerleştirin. PBSA'nın giriş borusu üzerinden akmasını sağlamak için üç yollu musluğu çevirin.

L şeklindeki konnektörü, bir mikro slayt kanalının giriş portuna bağlayın. Ardından, şırınga pompasından gelen L şeklindeki konnektörü kanalın çıkış portuna yerleştirin. Mikro slayt üzerine damlamış olan tüm PBSA'yı temizleyin.

Alternatif olarak, filtre modeli için önce metal bir şablon kullanarak parafilmden cam lamla aynı boyutta bir parça kesin. Ardından, akış kanalını oluşturmak için yine metal bir şablon kullanarak parafilm üzerinde 20 x 4 mm boyutunda bir yuva açın. Cam lam üzerindeki akış kanalını işaretlemek için parafilm contayı kullanın.

Altı kuyucuklu filtreyi lam üzerine hizalayın. Filtrenin akış kanalı işaretlerini kapattığından emin olun. Filtreyi 10 numara bir bistüri kullanarak dikkatlice kesin.

Ardından, akış kanalı yuvasının filtrenin ortasında olduğundan emin olarak filtreyi bir paraform conta ile dikkatlice kapatın. Temiz bir peçete parçası kullanarak mevcut tüm hava kabarcıklarını dışarı itin. Şimdi, lamine camı Perspex akış hücresinin alt plakasındaki girintiye yerleştirin.

Üst perspeks plakayı contanın üzerine yerleştirin ve plakaları birbirine vidalayın. PBSA yıkama tamponunun valf üzerinden akışına izin vermek için üç yollu musluğu çevirin. Ardından, manometre borusunu üst perspeks plakanın giriş portuna bağlayın.

Kabarcıkların geçmesini sağlamak için akış kanalından PBSA geçirin. Ardından, şırınga pompasındaki manometre borusunu perspeks plakanın çıkış portuna bağlayın. Haznenin üst plakasına damlamış olan tüm PBSA'yı temizleyin.

Son olarak, endotel hücreleri üzerinden lökositleri perfüze etmek için filtrelerin üzerindeki endotel hücrelerini görüntülemek üzere hazneyi ters faz kontrast mikroskobunun tablasına yerleştirin ve odağı ayarlayın. Odak ayarı yapıldıktan sonra şırınga pompasını yeniden doldurmaya ayarlayın ve çalıştır düğmesine basın. Endotel hücre monotabakasını görüntülemek için örnek rezervuarına iki mililitre saflaştırılmış nötrofil ekleyin ve iki dakika boyunca ısınmaya bırakın.

Ardından endotelyumu iki dakika boyunca PBSA ile yıkayın. Nötrofilleri endotelyum üzerinden perfüze etmek için vanayı açın. Nötrofil bolusunu dört dakika boyunca uygulayın.

Valfi kapatın ve deneyin geri kalanı boyunca yıkama rezervuarından PBSA perfüzyonu gerçekleştirin. Deneyi yürütürken, endotel hücre monotabakasını bozacağı ve adherent nötrofillerin kopmasına neden olacağı için analiz sırasında hiçbir noktada hava kabarcıklarının geçmediğinden emin olun. Nötrofil göçünü, nötrofil akışı sırasında veya perfüzyon sonrası dijital görüntü yakalama yazılımı kullanarak kaydedin.

Objektifi giriş portundaki kanalın kenarına getirip portun ortasını belirleyerek kanalın merkezini tespit edin. Tüm dijital kayıtları, akış kanalının merkezinde en az beş ila 10 alanda veya nötrofil akışı sırasında gerçekleştirin. Tek bir alanın görüntülerini bir dakika boyunca her 10 saniyede bir alın, kanal boyunca ilerleyerek başka bir alanı bir dakika boyunca kaydedin.

Perfüzyon sonrası kayıt için bu işlem, bolus süresi boyunca tekrarlanır. Lökosit davranışını değerlendirmek amacıyla, akış kanalının merkezi boyunca beş ila 10 alanda on saniyelik bir kayıt yapın. On saniyelik aralık boyunca her saniyede bir görüntü alın.

Bu, akıştan yakalama için yeterli sürenin sağlanmasına ve adherent nötrofillerin davranışlarının analiz edilmesine olanak tanır. Her 30 saniyede bir görüntü alarak, en az 10 transmigre nötrofil içeren tek bir alanı beş dakika boyunca kaydedin. Göç eden hücrelerin hızını hesaplamak için on saniyelik başka bir alan serisi daha kaydedilebilir.

Bu, nötrofillerin endotelyal tek tabaka boyunca göç etmesi için zaman tanır. Son olarak, şırınga pompasını durdurun, önce çıkış tüpünü, ardından giriş tüpünü çıkarın, akış hücresini sökün ve örnek rezervuarını PBSA ile durulayın; metin protokolünde açıklanan lökosit göçü ve davranış analizine geçmeden önce işlemi sonraki filtreler ve mikro slayt kanalları için tekrarlayın. Mikro slayt modelinde, tümör nekroz faktörü alfa ile sitokin stimülasyonu, nötrofillerin endotelyuma adezyonunu doz bağımlı bir şekilde önemli ölçüde artırmıştır.

Ek olarak, endotelyal yüzeyde yuvarlanan nötrofil yüzdesinde TNF alfa dozuna bağlı bir azalma gözlemlenmiştir. Bu durum, endotelyal monokatmanı boyunca göç eden ve böylece transendotelyal göçe uğrayan nötrofil yüzdesinde doz bağımlı bir artış olarak yansımıştır. Filtre tabanlı akış analizinde benzer sonuçlar gözlemlenmiştir.

Örneğin, TNF alfa stimülasyonu nötrofil adezyonunu doz bağımlı bir şekilde artırmıştır. Endotel hücrelerinin kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerle ko-kültürü, endotel hücrelerine kıyasla nötrofil adezyonunu önemli ölçüde azaltmıştır. Mikro slayt modelinden beklendiği üzere tek başına kültüre edilmiştir.

Benzer şekilde, filtre tabanlı model kullanıldığında da ko-kültürde monokültüre kıyasla daha az adezyon görülmesiyle benzer etkiler gözlemlenmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, enflamasyon sırasında lökositlerin katılımını etkilemek için stromal hücrelerin endotel hücrelerle nasıl iletişim kurduğunun nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.