Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

Bu prosedürün genel amacı, bağırsak dokularından insan enterositleri üretmektir. Bu işlem, öncelikle bağırsak mukozasının altındaki submukozal dokudan diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, epitelin bağ dokusundan ayrılmasını teşvik etmek için mukozanın EDTA ile inkübe edilmesidir.

Ardından, bağırsak kriptleri ayrıştırılmış epitelyumdan ayrılır. Son olarak, bağırsak kriptleri bazal membran matriksinde kültüre edilir. Nihayetinde, kültüre edilen OID'lerin epitelyal organizasyonunu ve spesifik epitelyal belirteçlerini göstermek için immünohistokimya teknikleri kullanılır.

Bu yöntemin önemi, artık hastaya özgü biyopsilerden OID'ler üretebilmemizdir; bu da bağırsak hastalıklarını ve tanılarını incelemek için bu dokuyu laboratuvarda kullanabileceğimiz anlamına gelir ki bu daha önce mümkün değildi. Metin protokolüne uygun olarak tamponlar ve reaktifler hazırlandıktan sonra, doku teslim alındığında bazal membranı buz üzerinde çözdürün ve 24 kuyucuklu bir plakayı 37 °C'de karbondioksit inkübatöründe ön inkübasyona bırakın. DPBS berraklaşana kadar dokuyu yıkamak için kalsiyum ve magnezyum içermeyen KO PBS veya DPBS kullanın.

Dokuyu, buz gibi soğuk DPBS ile doldurulmuş, silikon kaplı cam bir Petri kabına mukozal yüzeyi yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve minuchin pinleri kullanarak dokuyu gerdirip sabitleyerek tutturun. Ardından, bir diseksiyon mikroskobu altında, mikrodiseksiyon makasları ve ince uçlu kavisli pensler kullanarak alttaki mukozayı submukozadan ve bağ dokusundan ayırın. Son olarak, mukozal yüzeyi yukarı bakacak şekilde, diseke edilen mukozayı silikon kaplı cam Petri kabına düz bir şekilde gerdirip sabitleyin.

Kavisli pens kullanarak mukoza yüzeyini nazikçe kazıyın. Bu adım, preparat kalitesini artırmak için gereklidir. Mukozayı yeni hazırlanmış 2 mM EDTA şelasyon tamponu ile kaplayın.

Ardından, dokuyu buz üzerinde, metin protokolüne uygun olarak bir diseksiyon mikroskobu altında üç ila dört kez yıkadıktan sonra, kavisli pensler kullanarak mukozayı nazikçe kazıyın ve bir pipet yardımıyla bağırsak kriptlerini serbest bırakın. Kript süspansiyonunu Petri kabından nazikçe alın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, neredeyse tüm kriptlerin mukozadan uzaklaştırıldığından emin olmak için dokuyu kontrol edin.

Kript süspansiyonunu 150 µm'lik bir filtreden iki kez süzün ve bir mikroskop yardımıyla akışı kontrol edin. Kript süspansiyonunu yıkadıktan ve metin protokolüne uygun olarak gerekli miktardaki kripti beş mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktardıktan sonra, kript fraksiyonunu 4 °C'de 150 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, önceden soğutulmuş pipet uçlarını kullanarak süpernatantı uzaklaştırın ve kript peletini basement membrane matrix içinde yeniden süspande edin.

Önceden ısıtılmış plakadaki her bir kuyucuğun merkezine, bazal membran matrisi içindeki kript süspansiyonundan 50 µL yavaşça enjekte ederek uygulayın. Bazal membran matrisinin tamamen polimerize olması için plakayı 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO2 içeren bir inkübatörde 30 dakika inkübe edin. Ardından, bazal membran matrisinin üzerine, her biri 2.5 µM CHIR 99021 ile takviye edilmiş 500 µL komple insan mini bağırsak medyumu ekleyin.

Ardından Thien, dokuyu inkübe eder ve iki gün sonra, sonrasında ise gün aşırı olarak besiyerini değiştirir. Bu şekil, tüm dokudan taze olarak izole edilmiş kriptlerin tipik bir örneğini göstermektedir. Bir biyopsiden izole edilen kript sayısı, tüm dokudakinden daha azdır.

Genellikle tek bir geçişte iki biyopsi örneği alınır. Her bir biyopsi örneği, biyopsi başına ortalama 50 ila 100 kript içeren 10 milimetrekarelik bir yüzey sağlar. Beş ila altı günlük kültür ve bazal membran matrisi uygulamasının ardından, kriptler kümelenerek ince bağırsak için entero küreler ve kolon için kolono küreler oluşturur ve yedi gün sonra pasajlanır.

Burada gösterilen biyopsilerden oluşturulan organoidler veya OID'ler, ekim sırasında daha düşük bir yoğunlukta aynı gelişim sürecinden geçerler. Bu nedenle, paketleme genellikle kültürde 10 ila 12 gün sonra yapılır. Burada gösterildiği gibi, hem OID'ler hem de OID'ler lüminal bir yüzeye sahiptir ve bir epitel ile kaplıdır.

OID'ler içerisinde proliferatif hücreler gözlemlenebilir ve bunlar tomurcuk uçlarında yer alır. Burada yeşil renkte e-kadherin ile boyanmış OID'lerin konfokal görüntülemesi epitel hücrelerini göstermektedir. Bu şekil, kistik fibrozis ve epitel hücre adezyon molekülü genindeki konjenital bir mutasyona bağlı tufting enteropatiye sahip bir hastadan büyütülen enteroidleri göstermektedir.

İlgilenilen bir gen veya prob ile ilgili ek soruları yanıtlamak için bu prosedür veya real-time PCR veya Western blot gibi yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hastaya özgü sorularınızı yanıtlamak amacıyla laboratuvarınızda etkili bir şekilde enterler üretebilmek için insan Crips'lerini nasıl tutarlı bir şekilde izole edebileceğiniz konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.