Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

İnce bağırsak kriptlerinden insan enteroidlerini ve hem cerrahi dokudan hem de biyopsilerden toplanan kolon kriptlerinden kolonoidleri oluşturmak için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu metodolojik makalede, insan enteroidlerinin ve kolonoidlerinin başarılı bir şekilde büyümesi ve sürdürülmesi için gerekli olan kültür modalitelerini sunuyoruz.

Bu işlemin genel amacı, bağırsak dokularından insan girişleri oluşturmaktır. Bu, önce bağırsak mukozasının alttaki submukozal dokudan diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, epitelin bağ dokusundan ayrılmasını teşvik etmek için mukozayı EDTA ile inkübe etmektir.

Daha sonra, bağırsak kriptleri ayrışmış epitelden ayrılır. Son olarak, bağırsak kriptleri bazal membran matrisinde kültürlenir. Sonuç olarak, kültürlenmiş OID'lerin epitel organizasyonunu ve spesifik epitel belirteçlerini göstermek için immünohistokimya teknikleri kullanılır.

Bu yöntemin anlamı, artık hastaya özgü biyopsilerden OID'ler üretebilmemizdir, bu da artık bu dokuyu laboratuvarda bağırsak hastalıklarına ve teşhislerine bakmak için kullanabileceğimiz anlamına gelir, ki bunu şimdiye kadar hiç yapamamıştık. Tamponları ve reaktifleri hazırladıktan sonra, metin protokolüne göre, bazal membranı buz üzerinde çözün ve doku alındığında 37 santigrat derecede bir karbondioksit inkübatöründe 24 oyuklu bir plakayı önceden inkübe edin. DPBS berraklaşana kadar dokuyu yıkamak için KO'nun PBS'sini kalsiyum ve magnezyum veya DPBS olmadan kullanın.

Dokuyu buz gibi soğuk DPBS ile doldurulmuş silikon kaplı bir cam Petri kabına, mukozal tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve minuçin pimleri ile dokuyu gererek ve sabitleyerek sabitleyin. Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında, alttaki mukozayı submukoza ve bağ dokusundan çıkarmak için mikro diseksiyon makası ve ince nokta kavisli forseps kullanın. Daha sonra mukozal taraf yukarı bakacak şekilde, disseke edilmiş mukozayı silikon kaplı cam Petri kabı üzerine düz bir şekilde gerin ve sabitleyin.

Kavisli forseps kullanarak, mukozanın yüzeyini nazikçe kazıyın. Bu adım, hazırlığın kalitesini artırmak için gereklidir. Mukozayı taze hazırlanmış iki milimolar EDTA şelasyon tamponu ile örtün.

Daha sonra, dokuyu buz üzerinde yıkadıktan sonra, diseksiyon mikroskobu altında metin protokolüne göre üç ila dört kez, bağırsak kriptlerini bir pipetle serbest bırakmak için mukozayı nazikçe kazımak için kavisli forseps kullanın. Kript süspansiyonunu Petri kabından yavaşça çıkarın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Ardından, hemen hemen tüm kriptlerin mukozadan çıkarıldığından emin olmak için dokuyu kontrol edin.

Kript süspansiyonunu 150 mikrometrelik bir filtreden iki kez süzün ve akışı kontrol etmek için bir mikroskop kullanın Kript süspansiyonunu yıkadıktan ve gereken kript sayısını metin protokolüne göre beş mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe aktardıktan sonra, kript fraksiyonunu 150 Gs ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, önceden soğutulmuş pipet uçları ve bazal membran matrisi Yeniden Askıya Alma kullanarak süpernatanı çıkarın. Kript peleti.

Kuyunun ortasındaki bazal membran matrisini yavaşça çıkararak, oyuk başına bazal membran matrisinde 50 mikrolitre kript süspansiyonu uygulayın. Bazal membran matrisinin tam bir polimerizasyonunu sağlamak için plakayı 37 derece Santigrat %5 karbondioksit inkübatöründe 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, bazal membran matrisini, her biri 2.5 mikromolar CHIR 9 0 2 2 1 mikromolar ile desteklenmiş 500 mikrolitre tam insan mini bağırsak ortamı ile kaplayın.

Ve Thien, iki gün sonra ortamı değiştirerek dokuyu inkübe eder, daha sonra her gün. Bu şekil, tüm dokudan yeni izole edilmiş kriptlerin tipik bir örneğini göstermektedir. Biyopsiden izole edilen kript sayısı tüm dokudan daha azdır.

İki biyopsi ısırığı genellikle tek geçişte gerçekleştirilir. Her biyopsi ısırığı, biyopsi başına ortalama 50 ila 100 crips ile 10 milimetre karelik bir yüzeyle sonuçlanır. Beş ila altı gün boyunca kültür ve bazal membran matrisinden sonra, Crips, ince bağırsak için entero küreler ve kolon için kolon küreleri oluşturmak üzere yuvarlanır ve yedi gün sonra geçer.

Burada gösterilen biyopsilerden oluşturulan girişler veya OID'ler, tohumlamada daha düşük bir yoğunlukta aynı gelişime uğrar. Bu nedenle, paketleme genellikle kültürde 10 ila 12 gün sonra yapılır. Burada gösterildiği gibi, hem OID'ler hem de OID'ler bir luminal taraf sunar ve bir epitel ile kaplıdır.

Proliferatif hücreler OID'ler içinde gözlenebilir ve tomurcuk uçlarında bulunur. E katrin ile boyanmış OID'lerin konfokal görüntülemesi burada yeşil renkte epitel hücrelerini göstermektedir. Bu şekil, epitel hücre adezyon molekülü genindeki konjenital mutasyona bağlı olarak kistik fibrozis ve püsküllü enteropatisi olan bir hastadan büyüyen girişleri göstermektedir.

Bu prosedürü veya gerçek zamanlı PCR veya Western kanı gibi bir yöntemi takiben, bir gen veya ilgilenilen prob ile ilgili ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hastanıza özel sorularınızı yanıtlamak için laboratuvarınızda verimli bir şekilde girişler oluşturabilmek için insan Crips'i tutarlı bir şekilde nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.