Tavan Kültürlerde Olgun adipositlerinde ve dediferansiyonunu ile İnsan adipoz Kök Hücre Üretimi
7 Mart 2015
Olgun adipositler, homojen bir fibroblast benzeri hücre popülasyonuna yol açan farklılaşma yoluyla bol miktarda kök hücre kaynağını temsil edebilir. Kollajenaz sindirimi, olgun adipositleri insan yağından izole etmek için kullanılır. Protokolümüzün amacı, insan olgun adipositlerinden multipotent, farklılaşmış yağ hücreleri elde etmektir.
Olgun adipoositler, in vitro ortamda öncül hücrelere farklılaşma kapasitesine sahiptir. Bu, olgun hücrelerin tamamen medya ile doldurulmuş bir flask içinde ve baş aşağı şekilde kültüre edildiği bir teknik olan mühürlü kültür aracılığıyla gerçekleştirilir. Yüzen hücreler flaska yapışır ve morfolojilerini değiştirerek, lipidlerle dolu yuvarlak bir hücreden uzamış fibroblast benzeri bir hücreye dönüşür. Homojen.
Uzamış hücre popülasyonları, doku örneklerinin laboratuvara ulaşmasının ardından elde edilebilir ve kültüre alınabilir. Yağ dokularını tartın ve ihtiyaç duyulan adiposit sayısına bağlı olarak, uygun hacimdeki örneği 50 ml'lik bir tüpe yerleştirin. Sindirim işlemi sonucunda, gram başına yaklaşık 1 milyon hücre elde etmeniz beklenir.
Tavan kültürleri, 25 santimetrelik flask başına 500.000 hücre ve altı kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuk için 50.000 hücre ile gerçekleştirilir; kollajenaz eklenmiş KRH çalışma tamponu ilave edin, dokuyu makasla ince parçalara ayırın ve hazırlığı 37 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sırasında, tüpler ve şırınga düzeneğini hazırlayın. Yarı saydam çözeltiyi, cımbız yardımıyla bir naylon süzgeçten geçirerek plastik bir behere dökün.
Hücre preparasyonunu süzgeçten geçirin ve nazikçe 5 ml KRH çalışma tamponu ile yıkayın. Filtre edilen hücre süspansiyonunu tüp ve şırınga yardımıyla 50 ml'lik bir tüpe aktarın. Olgun adipositleri yaklaşık 10 dakika boyunca bekletin.
Hücreler flotasyon yoluyla tamponun üst kısmına ulaşacaktır. Tamponu alttan yavaşça aspire edin. Yıkama işlemi için bir şırınga ve tüp kullanarak 20 ml KRH çalışma tamponu ekleyin.
Yıkama adımlarını iki kez tekrarlayın. Adiposit süspansiyonunu beş ml son hacme getirmek için tampon çözeltiyi toplayın ve hemositometre kullanarak hücre sayımına geçin; bir T 25 flask'ının hacminin dörtte üçünü %20 buzağı serumu ile desteklenmiş D-M-E-M-F 12 ile doldurun, flask'a 500, 000 olgun adiposit aktarın. Flask'ı medya ile tamamlayın ve üst yüzeydeki hava kabarcıklarını giderin.
Balona özel yapım bir kapak vidalayın. Balonu, %5 carbon dioxide içeren bir hücre kültürü inkübatöründe bir hafta boyunca ters çevrilmiş şekilde inkübe edin. Kalan kabarcıklar hücre yapışmasını bozabileceği için balonun hareket ettirilmesinden kaçının.
Kuyucukların tabanına bir lamel yerleştirin. Plastik burcu kuyucuğun içine ekleyin ve kuyucuğu sekiz ml besiyeri ile doldurun. Hava kabarcığı kalmadığından emin olun.
Pipet ucunu yerleştirmek için boşluk bırakacak şekilde, burcun üzerine bir lamel yerleştirin. 50,000 hücre örneği alın ve ucunuzu lamel ile burç arasına yerleştirerek enjekte edin. Plakayı %5 karbon dioksit içeren bir hücre kültürü inkübatöründe bir hafta veya daha kısa bir süre inkübe edin.
Deney tasarımına bağlı olarak, hücrelerin farklı bir plaktaki lamelleşmiş kapak camına yapışması için en az üç gün gereklidir. Kapak camlarını 2 ml besiyeri içinde ters çevirin. Sürekli kültürdeki kapak camları daha sonra immünofloresan deneyleri veya D-N-A-R-N-A ve protein ekstraksiyonları için formalinde fikse edilebilir.
Olgun adipositlerin farklılaşmadan çıkması (de-differansiyasyon), hücre morfolojisinde önemli değişikliklere neden olur. Bu süreçte adipositler fenotiplerini kaybeder ve genellikle lipid depolama işlevleriyle ilişkili transkriptlerin ekspresyonu azalır. Bu immünofloresan görüntü, farklılaşmadan çıkmanın çeşitli aşamalarındaki adipoz hücreleri temsil etmektedir.
Yuvarlak morfolojiye sahip hücreler, olgun adiposit belirteci olan FABP four ekspresini sürdürürken, uzamış hücreler literatüre göre artık bunu eksprese etmemektedir. Genellikle D yağ hücreleri olarak adlandırılan D diferansiye yağ hücreleri; genç, yaşlı, zayıf veya OB tabanlı hastalardan elde edilebilir. Bunların uzun süreli kültür kapasiteleri ve kanıtlanmış multipotansları mevcuttur.
Aynı zamanda doku mühendisliği ve hücre terapisi için sahip oldukları potansiyeli de beğeniyorum. Bunlar, adiposit fizyolojisinin spesifik incelemeleri için yeni bir model teşkil edebilirler.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, olgun adipositlerin multipotent kök hücrelere dediferansiyasyonunu incelemektedir. Araştırmacılar, kollagenaz sindirimi ve mühürlü kültür tekniklerini kullanarak, fibroblast benzeri hücrelerden oluşan homojen bir popülasyon elde etmek amacıyla bu hücreleri izole edip kültüre alabilirler.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kök hücre araştırmaları
- Adiposit biyolojisi
- Hücre kültürü teknikleri
Arka Plan
- Olgun adipositler, öncül hücrelere dediferansiye olabilirler.
- Bu işlem, spesifik kültür yöntemleri kullanılarak in vitro olarak gerçekleştirilebilir.
- Kök hücreler elde etmek için adipositlerin izolasyonu kritik öneme sahiptir.
- Kollajenaz sindirimi, hücre izolasyonu için standart bir yöntemdir.
Çalışmanın Amacı
- İnsan olgun adipositlerinden multipotent, dediferansiye yağ hücreleri elde etmek.
- Bu hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol oluşturmak.
- Dediferansiyasyon sırasındaki morfolojik değişiklikleri incelemek.
Kullanılan Yöntemler
- Olgun adipositlerin izole edilmesi için kollagenaz sindirimi.
- Dediferansiyasyonu teşvik etmek için mühürlü kültür tekniği.
- Dediferansiyasyonu onaylamak için hücre morfolojisi değerlendirmesi.
- Doku ağırlığına dayalı hücre veriminin miktar tayini.
Ana Sonuçlar
- Gram başına yaklaşık 1 milyon hücrenin başarılı bir şekilde izole edilmesi.
- Dediferansiye hücreler, uzamış fibroblast benzeri morfoloji sergilemiştir.
- Tanımlanan yöntemler aracılığıyla homojen hücre popülasyonları elde edilmiştir.
- Olgun adipositlerin kök hücre kaynağı olma potansiyeli kanıtlanmıştır.
Sonuçlar
- Olgun adipositler etkili bir şekilde multipotent kök hücrelere dönüştürülebilir.
- Belirtilen yöntemler, kök hücre araştırmaları için güvenilir bir yaklaşım sunmaktadır.
- Bu çalışma, adiposit plastisitesinin anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yürütücü Endüstriyel Uygunluk
Olgun adipositlerin multipotent kök hücrelere dediferansiyasyonu, rejeneratif tıp ve doku mühendisliği uygulamaları için yeni bir kaynak sunmaktadır. Bu yaklaşım, adiposit fonksiyonunun ve metabolik özelliklerin depoya özgü karakterizasyonuna olanak tanıyarak metabolik hastalık araştırmalarında hedef doğrulamasını desteklemektedir. Yöntem, kanıtlanmış multipotensiyete özelliğine sahip fibroblast benzeri hücrelerin üretilmesi için ölçeklenebilir bir platform sağlayarak, adiposit odaklı terapötik keşiflerde preklinik model geliştirme ve mekanistik risk azaltma süreçlerini kolaylaştırmaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Adiposit plastisitesinin sorgulanmasına ve metabolik hastalık yolaklarında terapötik hipotezlerin test edilmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Depoya özgü adiposit izolasyonu aracılığıyla fonksiyonel hedef doğrulaması için tekrarlanabilir bir sistem sunar.
- Bilimsel Değer: Yolak açıklığa kavuşturmak için dediferansiye hücrelerden oluşan homojen popülasyonlar oluşturarak öngörü güvenilirliğini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Standartlaştırılmış kollagenaz sindirimi ve tavan kültürü teknikleri aracılığıyla, sonraki iş akışları için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Kontrollü adiposit verimi (doku gramı başına yaklaşık 1 milyon hücre) ile assay standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Bilimsel Değer: Dediferansiyasyon belirteci olarak doğrulanmış FABP4 aşağı regülasyonuna sahip fibroblast benzeri hücreler kullanarak güvenilir bileşik değerlendirmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Adiposit fizyolojisinin post-spesifik incelemesi için hastalıkla ilişkili sistem geliştirmeyi destekler.
- Operasyonel Değer: Dediferansiye yağ hücrelerinin uzun süreli kültür kapasitesi aracılığıyla, keşiften preklinik doğrulamaya kadar translasyonel sürekliliği sağlar.
- Bilimsel Değer: D-fat hücrelerinin çok potanslılığını ve doku mühendisliği potansiyelini göstererek risk ayarlı ilerleme kararlarını kolaylaştırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, özellikle metabolik hastalıklar ve rejeneratif tıp programları için, erken hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik çalışmalara kadar uzanan keşif sürecine entegre edilmektedir.
- Keşif Biyolojisi: Adiposit dediferansiyasyonunu in vitro modelleyerek hipotez testlerini ve biyolojik risk azaltma süreçlerini destekler.
- Tarama: Standartlaştırılmış hücre izolasyonu ve morfoloji değerlendirmesi aracılığıyla analiz hazırlığı ve kantitatif çıktılar sağlar.
- Analitik: Farklı koşullar altındaki dediferansiyasyon durumlarını karşılaştırmak için FABP4 ekspresyon değişiklikleri gibi ölçülebilir sonuçlar sunar.
- Translasyonel Araştırma: Dediferansiye olmuş adipositlerin uzun süreli kültürü ve çok potanslılığının gösterilmesi aracılığıyla preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla depo-spesifik araştırma boyunca adiposit türevli kök hücreler üretmek için yeniden kullanılabilir bir kapasite oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Adiposit fenotip değişimindeki mekanistik belirsizliğin azaltılması yoluyla öngörülebilir güvenilirlik.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış kolajenaz sindirimi ve ters kültür protokolleri aracılığıyla standardizasyon ve ölçeklenebilirlik.
- Stratejik Değer: Ön lider optimizasyonu öncesinde depoya özgü metabolik özelliklerin karakterizasyonuna olanak tanıyarak daha iyi devam/durdur kararları.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış kök hücre verimi ve diferansiyasyon potansiyeli değerlendirmesi yoluyla riskten arındırılmış önceliklendirme.
Uygulama Hususları
- Primer adiposit izolasyonu ve kollajenaz sindirim tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Ters çevrilmiş flakon veya 6 kuyucuklu plaka tavan kültürlerini sürdürebilecek hücre kültürü altyapısını gerektirir.
- Laboratuvarlar arasında tutarlı adiposit verimi ve dediferansiyasyon değerlendirmesi için ekipler arası standardizasyon gereklidir.
- Protokolün farklı depolardan gelen yağ dokularına veya donör özelliklerine uygulanması sırasında adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Ters kültür sırasında hava kabarcığının neden olacağı bozulmaları önlemek için medyanın hassas şekilde doldurulması gerekliliği gibi pratik sınırlamaları içerir.
