Name: Embriyonik Fare beyninde İzleme Koşullu Genetik transsinaptik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Öğrenin, embriyonik fare beynindeki sinir devrelerinin gelişimini görselleştirmek için koşullu genetik transsinaptik izleme yöntemini. Bu teknik, tek hücre çözünürlüğünde nöron bağlantılarını analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El yazması hakkındaki eleştirel yorumları için Michael Candlish'e teşekkür ederiz. Bu proje, Ulrich Boehm'e Deutsche Forschungsgemeinschaft hibeleri BO1743/6 ve SFB/TRR 152 P11 ve Z02 tarafından desteklenmiştir.

NOT: Etik Açıklama: hayvan denekleri Prosedürleri Hamburg Üniversitesi ve Saarland Üniversitesi hayvan koruma kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. Hazırlık ve Embriyonik Doku Fixation <ol><li> Embriyoların teşrih ve hayvanlar kurban edilmeden önce doku sonraki tespiti için çözümler hazırlamak için gerekli tüm ekipman düzenleyin. NOT: Her zaman (7.4 pH değerinin, 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 4 PFA), taze% 4 paraformaldehit (PFA) solüsyon hazırlanır. </li><li> Bir etik onaylı prosedüre zamanlı hamile kadın fare Euthanize. </li><li> Bir platform üzerine fare aktarın. % 70 etanol ile karın ventral tarafı ıslatın ve karın boşluğuna maruz keskin bir makas kullanarak dikey bir kesi yapmak. </li><li> Embriyonik zinciri tanımlamak ve dikkatle kullanarak künt forseps çekin ve buz gibi soğuk PBS içine yerleştirin. </li><li> Bireysel embriyolar çıkarınince makas ve forseps kullanarak embriyonik zinciri. Embriyoların etrafında ekstra doku çıkarın ve buz gibi soğuk PBS yıkayın. </li><li> (PFA içine embriyo transferinden önce) küçük bir kuyruk biyopsisi alın ve cinsiyet tanımlama ve izleyici alel genotiplemesi PCR için kuyruk lizis tamponu içinde kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> En dıştaki tarafında embriyodan başlayın ve bir çalkalayıcı üzerinde buz üzerinde buz soğukluğunda% 4 PFA içeren bir tüp içine ayrı ayrı embriyo transferi. </li><li> Sabit sallayarak E13.5 yaş veya buz üzerinde 1.5 saat genç embriyolar bekletin. Sabit sallayarak buz üzerinde 2.5 saat yaş E14.5 ve E15.5 embriyolar bekletin. </li><li> Embriyolar yaş E16.5 veya yaşlı için, başını kesmek ve PFA çözeltisi içinde kafa iliklerine önce dış deri kaldırmak. E16.5 embriyo Başlıkları sürekli çalkalanarak buz üzerinde 4.5 saat süreyle batırılmış olabilir. </li><li> Uygun tespit edildikten sonra, buz gibi soğuk PBS ile embriyolar üç kez yıkayın. Batarlarsa kadar 4 ° C de PBS çözeltisi içinde% 30 sakroz içine embriyo transferinealt. </li></ol> 2. Donma <ol><li> Dondurma işlemine başlamadan önce gerekli tüm malzemeleri düzenleyin: cryo-kalıp, cryo-eldivenler, tüy entomolojisi forseps, işaretleyici kalem ve optimal kesim sıcaklığının bileşik (Ekim) </li><li> Kalıcı alkole dirençli işaretleyici ile cryo-kalıp Etiket (doku, tarih ve genotip yönünü söz). Bir buz kovası ezilmiş kuru buz ve% 100 etanol içinde bir çamuru hazırlanır. Izopentanın içeren iç cam beher yerleştirin. İzopentan soğuması için 10 dakika bekleyin. </li><li> Bu arada, sukroz çözeltisi doku kaldırmak laboratuvar mendil kullanarak doku çevresinde aşırı sukroz silin. Doku karşılamak için yeterli Ekim ile önceden etiketlenmiş cryo-kalıba doku aktarın. Ekim herhangi bir hava kabarcıkları kaçının; Özellikle doku etrafında. </li><li> Doku hasarı önlemek için tüy entomoloji forseps kullanarak Ekim doku yönlendirin. Cryo-mol aktararak dondurma başlayınönceden soğutulmuş izopentan banyosuna ö. Düzgün donma olmaz gibi OCT içine izopentanın sıçrama yok. -80 ° C de, alüminyum folyo ve mağaza örnekleri sarın. </li></ol> 3. Cryosectioning <ol><li> Bir sirostat kullanılarak beş serisi &#39;14 mikron ince seri bölümleri kesin ve immünofloresan (IF) analizi için Superfrost® Plus cam slaytlar üzerinde toplamak. Kullanılan kadar -80 ° C &#39;de slaytlar saklayın. </li></ol> Tyramide Sinyal Amplifikasyon (TSA) Protokolü kullanma 4. Tracer görselleştirme <ol><li> Boyama için gerekli olan tamponlar ve reaktifler hazırlayın. Her zaman taze kullanım gününde Tris-NaCI-Tween (TNT) tamponu hazırlayın. <ol><li> 1 L&#39;lik bir son hacme kadar 1 ml pipet kullanarak Tween 20 500 ul ekle, 1 M Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM NaCl, 30 ml ve GKD 2 O 100 ml ile TNT tamponu hazırlayın. Yavaş yavaş Tween 20 ekleyin ve tüm Tween 20 olmasını sağlamak için yukarı ve aşağı birkaç kez pipet floşÇözelti. </li><li> Tris-NaCI-Blokaj kadar 1 L&#39;lik bir son hacme pH 7.5, 5 mM NaCl, 30 ml ve GKD 2 O, 1 M Tris-HCl, 100 ml kullanılarak (TNB), tampon Engelleme Reaktif 5 g ekleyin hazırlanması ile (Resim yavaş yavaş tampon küçük artışlarla kiti) karıştırılırken. (Bu, 30-60 dakika daha uzun zaman almak gerekir) tamamen bloke edici tepkin madde çözünmesi için sürekli karıştırılarak 55 ° C&#39;ye yavaş yavaş solüsyon ısıtın. Homojen ısıtma 55 ° C&#39;de su banyosu kullanın ulaşmak için. çözüm sütlü görünecektir. Kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin çözüm. Uzun süreli depolama için -20 ° C&#39;de kısım saklayın. </li><li> Moleküler Biyolojisi / HPLC-grade DMSO (takımla birlikte verilmektedir), biyotin tiramid reaktifi sulandırın. Bunun üzerine bağlı olarak kit, DMSO uygun miktarı değişebilir kullanılır. 4 ° C &#39;de stok solüsyonu saklayın. NOT: İlgili Cre ve R26 allelleri için heterozigot hayvanlardan Bölümler devre analizi için kullanılabilir. Kullanım sveriliş negatif kontrol olarak sırasıyla bir Cre veya bir R26 alel, taşıma littermates. Tam çift heterozigot hayvanlardan slaytlar gibi negatif kontrol slaytlar davranın. Buna ek olarak, bir çift heterozigot hayvandan bir kontrol slayt bunlarla TSA ayıracı (Yükseltilmemiş kontrol) dışarıda bırakın. </li></ol></li><li> Keskin bir neşter taze doku bölümleri çevreleyen aşırı Ekim kaldırmak ve bir PAP kalemle bölümler etrafında sınır işareti kullanma. </li><li> Oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca (RT) slaytlar kurutun. 5 dakika her TNT RT 3x slaytlar yıkayın. Endojen peroksidaz aktivitesi söndürmek için% 0.3 30 dakika boyunca buz soğukluğunda metanol içinde H2O 2 solüsyonu oda sıcaklığında slaytlar inkübe edin. </li><li> 5 dakika boyunca PBS ile yıkayın 3x oda sıcaklığında her biri. Doku geçirgenliği için PBS içinde% 0.5 Triton-X 100, 10 dakika boyunca inkübe edin. 5 dakika her TNT RT 3x slaytlar yıkayın. </li><li> TNB ile Blok 30 için (slayt başına 200-300 ul engelleme çözümü)nemli bir oda içinde oda sıcaklığında Min. Tüm bölümleri tamamen TNB tarafından karşılanmaktadır emin olun. Slaytlar adımlar arasında kurumasına izin vermeyin. </li><li> Fazla engelleme tamponu süzün ve izleyici kabul primer antiserumun uygulamak oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C &#39;de 2 saat TNB içinde seyreltildi (1: GTT 15.000 tavşan anti-GFP: BL 1000 keçi anti-WGA, 1). Tamamen doku bölümü (slayt başına 200-300 ul) karşılamak için yeterli hacim kullandığınızdan emin olun. NOT: Burada önerilen primer antiserumlar dilüsyonları ayarlanması gerekebilir. </li><li> 5 dakika ajitasyon ile her TNT RT 3x slaytlar yıkayın. </li><li> (: Anti-WGA 500 at anti-keçi IgG&#39;si, 1: oda sıcaklığında 1 saat TNB içinde, anti-GFP için 5000 keçi anti-tavşan IgG 1), ilk antiserum ana tanıyan biyotinlenmiş sekonder antiserumu ile bölümleri inkübe edin. </li><li> 5 dakika çalkalanarak her biri için oda sıcaklığında, TNT ile yıkayın 3x. 100 streptavidin (SA) ile birleştirilmiş bayır yaban turpu peroksidaz (SA-HRP, Resim wi: 1 inkübenemli bir oda içinde oda sıcaklığında 30 dakika için TNB içinde kiti) th. 5 dakika her TNT RT 3x slaytlar yıkayın. Bu arada TSA eritin. </li><li> (Kit ile sağlanan, BL görselleştirme ve GTT için TSA + kiti için TSA kiti kullanın) TSA amplifikasyon seyreltici içinde TSA 01:50 seyreltin. Oda sıcaklığında tam olarak 10 dakika için seyreltilmiş TSA doku bölümleri inkübe edin. Gelecek deneyler için kalan seyreltilmiş TSA reaktifi kullanmayın, ideal bir önceki yıkama aşamasında, kullanımdan hemen önce TSA Seyreltik; her zaman taze hazırlayın. </li><li> 5 dakika ajitasyon ile her TNT RT 3x slaytlar yıkayın. Oda sıcaklığında 30 dakika için TNB içinde 500 Alexa Fluor® 546 streptavidin: 1 ile inkübe edin. 5 dakika ajitasyon ile her TNT RT 3x slaytlar yıkayın. </li><li> Nükleer boyama için oda sıcaklığında PBS içinde% 5 bisbenzimid çözelti içinde 10 dakika süreyle inkübe edin. 5 dakika ajitasyon ile her TNT RT 3x slaytlar yıkayın. Fluromount G ile monte ve Epifloresans veya konfokal mikroskopi gerçekleştirin. <em&gt; Sorun giderme: Tracer transferi etkinliği (kullanılan Cre sürücü hattı ile belirlenir) üreten hücrelerde ROSA26 mahalinin ifade düzeyine bağlıdır ve nöral devre üzerinde (izleyici, yakınsama vb üreten nöronların sayısı örneğin) analiz edecektir. Bu nedenle burada önerilen primer antiserumlar dilüsyonları düşük ya da aşırı sinyal önlemek için ayarlanması gerekebilir. Arka plan her zaman uygun kontrol slaytlar (yukarıya bakınız) kullanılarak analiz edilmelidir. </li></ol> Embriyonik Bölüm 5. τlacZ Boyama <ol><li> Boyama için gerekli olan tamponlar ve reaktifler hazırlayın. Her zaman taze Kullanmadan önce LacZ tampon C hazırlamak. <ol><li> 1 mi% 70 dimetilformamit (DMF), X-gal 40 gramı ekleyerek, 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid (X-gal) stok çözeltisi (40 mg / ml) hazırlayın. Uzun süreli depolama için -20 ° C&#39;de alüminyum folyo ve mağaza ile kaplayın. </li><li> Hazırlayın nitro mavi tetrazolyum (NBT) st1 mi% 70 DMF NBT 50 gramı ekleyerek ock çözeltisi (50 mg / ml). Uzun süreli depolama için -20 ° C&#39;de alüminyum folyo ve mağaza ile kaplayın. </li><li> LacZ% 25 glutaraldehid 80 ul,% 4 5 ml PFA, 1 M 20 ul kullanılarak MgCI2, 500 mM EGTA, 100 ul bir son 1, 1 M fosfat tampon maddesi pH 7.4 içinde çözdürülür ve GKD 2 O kadar tespit maddesi hazırlanması 10 ml hacmi. </li><li> LacZ 500 mM EGTA, 5 ml, 500 ml&#39;lik bir nihai hacme kadar 50 mi ile kombine edilmiştir fosfat tamponu, pH 7.4 ve 1 M, 2, O, MgCl2 1 M A izlenerek ve 1 ml tampon hazırlayın. </li><li> 1 mi 1 M MgCI2, 500 mM EGTA, 5 ml, 5 mi% 1 sodyum deoksikolat,% 10 NP-40, 100 mi, 50 1 M fosfat tampon maddesi pH 7.4 içinde çözdürülür ve GKD 2 O kullanılarak LacZ tampon B hazırlanması 500 ml&#39;lik bir nihai hacme kadar. </li><li> NBT stok çözeltisi 10 ul ve LacZ tampon B, 1 ml X-gal stok çözeltisi 12.5 ul kullanımdan hemen önce taze sağlayın ve alüminyum folyo ile kapak ekleyerek LacZ tampon C hazırlayın. </li></ol&gt; </li><li> (Bu arada, bir PAB kalem ile preparatların hazırlanması), en az 10-15 dakika boyunca oda sıcaklığında slaytlar kurutun. </li><li> LacZ ile bölüm kimyasal buhar-başlığın içinde, nemlendirilmiş bir odacıkta, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca tespit maddesi düzeltildi. 3 kez PBS ile yıkayın, 2 mM MgCl2 ile desteklenmesiydi. </li><li> LacZ slaytlar oda sıcaklığında 10 dakika her biri için bir 3 kez yıkama tamponu LacZ tampon A ile slaytlar durulayın. 5 dakika her LacZ tampon B ile 2 kez yıkayın. Nemli bir oda içinde 6 saat veya gece boyunca 30-37 ° C&#39;de LacZ tampon C slaytlar inkübe edin. NOT: LacZ tampon C yeterli hacmi ekleyin; slaytlar inkübasyon sırasında kurumasına olmamalıdır. </li><li> Uygun bir inkübasyon süresinden sonra, PBS ile kayar, 2 mM MgCl2 ile desteklenmesiydi yıkayın. Kısaca GKD 2 O. ile bölümleri durulayın Mayer&#39;in glisin jelatin ile lamel. Bir diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleme set-up ile donatılmış bir ışık mikroskobu için uygundur. </li></ol> 6. Gender ve Tracer Genotipleme <ol><li> 1 M Tris-HCl, pH 8.5, 500 mM EGTA, 100 ul 1 ml&#39;si kullanılarak kuyruk liziz tamponu,% 10 SDS, 200 ul 5 M NaCl ve GKD 2 O 400 ul, 10 ml lik bir son hacim yapmak için. </li><li> Bir kuyruk biyopsi içeren her Eppendorf tüpüne kuyruk lizis tamponu 500 ul ekleyin. 100 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar proteinaz K ilave. 55 ° C&#39;de bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika için 17,000 x g&#39;de santrifüjleyin örnekleri. Yeni bir santrifüj tüpüne süpernatant aktarın. Yüzer izopropanol 500 ul ekle. Yukarı ve aşağı tüpler ters çevrilerek en az 5 dakika boyunca karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 17,000 x g&#39;de santrifüj dönerler. Süpernatantı dökün. % 70 etanol içinde 200 ul ekle. En az 5 dakika boyunca çalkalanır. </li><li> 5 dakika için 17,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Bir Pipetman (kapalı dökmek değil) ile süpernatantı. 15-30 dakika boyunca bir sıcak oda (37 ° C) pelet kurutun. </li><li> 100 ul süspanse peletgeniş çaplı süzülmüş ipuçlarını kullanarak düşük TE pH 8.0 ya da su. Uygun erimesi için gece boyunca ° C&#39;de 1 saat boyunca ve 37 ° C&#39;de 55 ° C olarak koyun. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> PCR reaksiyonu (kuyruk DNA&#39;sının 1 ul, her bir primerden 2.5 ul DMSO, 10:00, 25 her dNTP uM ve 1 M betain ihtiva eden 50 ul reaksiyon karışımı) için DNA 1 ul kullanın. Genotipleme ve cinsiyet tespiti için PCR primerleri malzemeleri tabloda listelenmiştir. </li></ol>

<ol><li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).</li>
<li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).</li>
<li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li>
<li>DeFalco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-assisted+mapping+of+neural+inputs+to+a+feeding+center+in+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus.</a> Science. 291, 2608-2613 (2001).</li>
<li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+arcuate+nucleus+kisspeptin+neurons+communicate+with+GnRH+neurons+in+utero%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero.</a> J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).</li>
<li>Horowitz, L. F., Montmayeur, J. P., Echelard, Y., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+approach+to+trace+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A genetic approach to trace neural circuits.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3194-3199 (1999).</li>
<li>Maskos, U., Kissa, K., ST Cloment, C., Brulet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+trans-synaptic+transfer+of+green+fluorescent+protein+allows+the+genetic+mapping+of+neuronal+circuits+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retrograde trans-synaptic transfer of green fluorescent protein allows the genetic mapping of neuronal circuits in transgenic mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10120-10125 (2002).</li>
<li>De Roux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypogonadotropic+hypogonadism+due+to+loss+of+function+of+the+KiSS1-derived+peptide+receptor+GPR54%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10972-10976 (2003).</li>
<li>Seminara, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GPR54+gene+as+a+regulator+of+puberty%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">The GPR54 gene as a regulator of puberty.</a> N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).</li>
<li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+completion+of+puberty+in+female+mice+depend+on+estrogen+receptor+alpha-signaling+in+kisspeptin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor alpha-signaling in kisspeptin neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 22693-22698 (2010).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat. Genet. 21, 70-71 (1999).</li>
<li>Seibler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+copy+shRNA+configuration+for+ubiquitous+gene+knockdown+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice.</a> Nucleic Acids Res. 33, e67(2005).</li>
<li>Semaan, S. J., Kauffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+on+the+epigenetic+and+transcriptional+regulation+of+the+Kiss1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).</li>
<li>Feil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-activated+site-specific+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ligand-activated site-specific recombination in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).</li>
</ol>

Çıkar çatışması beyan edilmedi.

Genetik olarak tanımlanmış sinirsel nöral devreleri iz transgenler olarak transsinaptik izleyiciler ifade ajanları veya neurotopic virüs stereotaksik enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında bir çok avantaja sahiptir. İlk olarak, izleyici, bir endojen protein olarak üretilir ve bu nedenle herhangi bir bağışıklık karşılığını ortaya etmez ve seçici bir sinir yolu yüksek ölçüde tekrarlanabilirliği farklı hayvanlarda analiz edilebilir. Bu bir non-invaziv bir yöntemdir, çünkü İkincisi, bu utero örneğin, sterotaksik enje...

Anatomik yol izleme beyin ve davranış arasındaki ilişkiyi deşifre 1 en sık kullanılan araçlardan biridir. Nöral devre izleme teknolojileri İlerleme farelerde 2 genetik tanımlanan nöron nüfus nöral devreleri takip yeteneği ile sinirbilimcileri ihsan etmiştir. Bu teknik gelişmelerin rağmen özellikle embriyonik olgunlaşma sırasında nöral devrelerin oluşumunu çözülmeye zor kalır. Bugüne kadar geliştirilen izleme yöntemlerinin çoğu transsinaptik izleyiciler stereotaksik enjeksiyonu ya da genetik olarak tadil edilmiş nörotropik virüsleri (Şekil 1) 2,3 dayalı olmasıdır. Bu teknikler bağlantı mekansal ve zamansal çözünürlük gibi gelişmekte olan beynin, enjeksiyon yerinde ve en impor enjeksiyon yerinde tekrarlanabilirliği, potansiyel inflamasyon içine teknik açıdan zor izleyici enjeksiyonlar gibi çeşitli içsel sınırlamalar elde ederkennörotrop virüslerin neden rı değerlendirilerek sitotoksisite bunların kullanımını sınırlamak 4. Alternatif bir yöntem, genetik olarak değiştirilmiş farelerde transgenler olarak transsinaptik izleyiciler bildirmektir. Son zamanlarda bu tekniği modifiye ve herhangi bir genetik tespit nöronal nüfusun 5 nöral devreleri eşleştirmek için bir ikili genetik transsinaptik izleme sistemi geliştirdik. Kre-aracılı sonra Bizim deneysel strateji çift yönlü izleyici arpa lektin (BL) da 6 ya da ROSA 26 lokusundan GFP (GTT) 7 kaynaşmış retrograd izleyici Tetanos Toksin parçası Cı sergileyen iki yeni knock-in fare suşlarının dayanmaktadır rekombinasyon. Burada seçici Kisspeptin üreten nöronlarda BL ve GTT, üreme eksen 8,9 olgunlaşmasını düzenleyen karıştığı bir neuropeptide ifade etmek, bu fare suşları kullanıldı. Biz bu teknik öpücük gelişimini ve olgunlaşmasını görselleştirmek için uygun olduğunu göstermekdişi fare beyninin 5 embriyonik gelişimi sırasında peptin sinir devresi. Yetiştirme stratejisi R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) ve R26-GFP-TTC (GTT) izleyici hatları knock-rekombinant ROSA26 alleller taşıyan suşlar 5 vardır. R26-dünyası ve R26-GTT aleller bağlı iki loxP sitelerinin 5 tarafından kuşatılır, güçlü transkripsiyon durdurma sinyali, varlığına bağlı olarak, transkripsiyonel olarak sessizdir. Dünyası ve GTT transgenin sentezlenmesi transkripsiyon durdurma sinyali kre-aracılı çıkarılması ile aktive edilir. R26-R26-BIZ ve GTT alleller sadece Cre sürücü hattı ile geçerek bağımsız olarak kullanılabilir. Ilgili Cre ve R26 aleller için analiz hayvanlar heterozigoz için kullanılabilir. Bir Cre ya da bir R26, aleli taşıyan yavrular, sırasıyla, kontrol olarak kullanılır. Seçenek olarak ise, bu t oluşturmak da mümkündürknock-Riple Kre, R26-R26-BIZ ve GTT alleller taşıyan hayvanlar, ancak bu bir ek haçı gerektirir.

<table><tbody><tr><td>Bisbenzimid (Hoechst 33258 boya)</td> <td>Sigma</td><td>14530-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>Cryo kalıp (Peel-a-way)</td> <td>Polyscience Inc.</td><td>18646A-1</td><td>22 x 22 x 20mm</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Formamid (DMF)</td><td>VWR Kimyasalları</td><td>23470,293</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Güney Biyoteknoloji</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehit</td><td>Sigma</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit</td><td>Sigma</td><td>34988-7</td><td></td></tr><tr><td>İzopentan (Metil 2-bütan)</td> <td>Sigma</td><td>M32631-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser'in glisin jelatini</td><td>Merck</td><td>1092420100</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>494437-1L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ROTH</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Sigma</td><td>298-83-9</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 ikame</td><td>Fluka</td><td>743.85</td><td></td></tr><tr><td>EKİM</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>PAP kalemi</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Parafarmaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma</td><td>D6750-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost slaytları</td><td>Thermo Scientific</td><td>FT4981GLPLUS</td><td></td></tr><tr><td>TSA kiti</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL700</td><td></td></tr><tr><td>TSA plus kiti</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL749A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>ROTH</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ROTH</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>ROTH</td><td>2315.1</td><td></td></tr> DIC görüntüleme ile donatılmış <tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>Light mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 Axio Vision yazılımı</td><td></td>ile donatılmıştır</tr><tr><td>Fluroscence mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 Axio Vision yazılımı</td><td></td>ile donatılmıştır</tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-WGA (BL'yi tanır)</td><td>Vektör Laboatories</td><td>AS-2024</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinylayted at anti-keçi IgG</td><td>Vektör Laboatories</td><td>BA-9500</td><td></td></tr><tr><td>Biyotinile keçi anti-tavşan IgG</td><td>Vektör Laboatories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-GFP (GTT'yi tanır)</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-GnRH</td><td>Afinite Biyo Reaktif</td><td>PA1-121</td><td></td></tr><tr><td>Dylight488-eşek tavşan önleyici IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10038</td><td></td></tr><tr><td>SA-Alexa Fluor 546</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>S-11225</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Primerler</td></tr><tr><td>BL Fwd (BIZ genotiplemesi için)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC</td></tr><tr><td>BL Rev (BIZ genotiplemesi için)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCCCTCGCCGCAGAACTC</td></tr><tr><td>Cre Fwd (Cre genotipleme için)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG</td></tr><tr><td>Cre Rev (Cre genotiplemesi için)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC</td></tr><tr><td>TTC Fwd (GTT genotiplemesi için)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT</td></tr><tr><td>TTC Rev (GTT genotiplemesi için)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCGTCCTTGAA</td></tr><tr><td>XY Fwd (cinsiyet genotiplemesi için)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>TGAAGCTTTTGGCTTTGA</td></tr><tr><td>XY Rev (cinsiyet genotiplemesi için)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCGCTGCCAAATTCTTTG</td></tr><tr><td>ROSA26 Fwd</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr><tr><td>ROSA26 Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GCAGATGGAGCGGGAGAAAT</td></tr><tr><td>SA Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr></tbody></table>

embriyonik fare beyninde İzleme koşullu genetik transsinaptik

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomik yol izleme, beyin ve davranış arasındaki ilişkiyi deşifre etmek için çok önemlidir. Bununla birlikte, beynin embriyonik olgunlaşması sırasında nöral devrelerin oluşumunu çözmek teknik olarak zordur, çünkü bugüne kadar geliştirilen çoğu transsinaptik izleme yöntemi stereotaksik izleyici enjeksiyonuna bağlıdır. Bu sorunun üstesinden gelmek için, fare beyninde koşullu genetik transsinaptik izleme için ikili bir genetik strateji geliştirdik. Bu amaçla, Cre aracılı rekombinasyondan sonra ROSA26 lokusundan çift yönlü transsinaptik izleyici arpa lektini (BL) ve retrograd transsinaptik izleyici Tetanoz Toksin fragmanı C'yi seçici olarak eksprese etmek için iki tamamlayıcı knock-in fare suşu oluşturduk. Bu farelerde hücreye özgü izleyici üretimi genetik olarak kodlanmıştır ve mekanik izleyici enjeksiyonuna bağlı değildir. Bu nedenle, deneysel yaklaşımımız embriyonik murin beyninde nöral devre oluşumunu incelemek için uygundur. Ayrıca, sinapslar arasında izleyici transferi sinaptik aktiviteye bağlı olduğundan, bu fare suşları, beyin gelişimi sırasında genetik olarak tanımlanmış nöronal popülasyonlar arasındaki iletişimi tek bir hücre çözünürlüğünde analiz etmek için kullanılabilir. Burada, yeni rekombinant ROSA26 alellerini kullanarak fare embriyolarında transsinaptik izleme için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu deneysel tekniği, gelişmekte olan dişi fare beynindeki üreme ekseninin olgunlaşmasının altında yatan nöral devreyi tanımlamak için kullandık.

Bu bölümde R26-BIZ (B L I RES-τlac Z) ve R26-GTT (G FP- TT C) allelleri ile çalışma elde edilebilir temsilcisi sonuçları gösterir. Burada üreme ekseni düzenleyen nöral devrelerin olgunlaşmasını analiz R26-R26-BIZ ve GTT allellerini kullanın. Omurgalılarda üreme merkezi gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH), hipotalamus salgılayan nöronların, küçük bir alt grubu ile kontrol edilir. Kisspeptin GnRH nöron için güçlü bir aktivatör, GnRH ve Kisspeptin nöronlar ...

İkili bir genetik stratejiden yararlanarak, Cre aracılı rekombinasyondan sonra tamamlayıcı transsinaptik izleyicileri eksprese eden farelerde nöral devre izleme için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Hücreye özgü izleyici üretimi genetik olarak kodlandığından, deneysel yaklaşımımız, murin embriyonik beyin gelişimi sırasında tek hücre çözünürlüğünde nöral devrelerin oluşumunu ve olgunlaşmasını incelemek için uygundur.

Embriyonik Fare beyninde İzleme Koşullu Genetik transsinaptik

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Aşağıdaki deneyin amacı, çift yönlü hareket eden trans-sinaptik bir izleyici, yalnızca retrograd şekilde hareket eden ikinci bir izleyici ve hedef hücreden hareket etmeyen üçüncü bir etiket olmak üzere üç farklı hücre etiketleme sistemi kullanarak embriyonik fare beynindeki nöral devrelerin gelişimini görselleştirmektir. Bu yöntemle hedef nöronun, yukarı akışlı (upstream) nöronların ve aşağı akışlı (downstream) nöronların tanımlanması mümkündür. Sonuçlar, bu deneysel protokolün embriyonik dişi fare beynindeki nöral devrelerin oluşumunu tek hücre çözünürlüğünde analiz etmek için kullanılabileceğini göstermektedir.Bu yöntem, belirli nöral devrelerin ne zaman oluştuğu ve embriyonik gelişim sırasında nasıl organize oldukları gibi gelişimsel nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem ayrıca yetişkin farelerdeki nöral devreleri izlemek için de kullanılabilir. Spesifik olarak, genetik olarak tanımlanmış nöronlar arasındaki sinaptik aktiviteyi analiz etmek için kullanılabilir ve farklı deneysel koşulların bir nöral devreyi zaman içinde nasıl modüle edebileceğini analiz etmek amacıyla uygulanabilir.Yeni ötanize edilmiş hamile bir fare ile başlayın. Karn

conditional-genetic-transsynaptic-tracing-in-the-embryonic-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

Bu makalede ayrıntılı olarak utero serebral korteks ve farelerde E14.5 de hipokampus electroporate bir protokol tanımlamaktadır. Biz de bu bu iki beyin bölgelerinde dendrit ve dikenler incelemek için değerli bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Synaptically bağlı nöronların izleme için bir yöntem tarif edilmektedir. Biz bir ilgi hücre popülasyonu tanımlı genetik hücre tiplerinden sinaptik girdi alıp almadığını soruşturma yönündeki bir hücrenin TVA özgüllüğü kullanın.

Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral

Kaynak: Denaxa, M., el al., Kemogenetik Olarak Tasarlanmış Kortikal İnternöron Progenitörlerinin Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Nakli. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, ilgilenilen geni taşıyan bir plazmit vektörünün embriyonik bir beyin dilimindeki internöron progenitörlerine enjekte edilmesi ve ardından plazmit girişi ve gen ekspresyonu için elektroporasyon prosedürünü göstermektedir. Bu modifiye edilmiş progenitörler daha sonra beyin bozukluklarını tedavi etmek için kullanılabilir.

Fare Kortikal İnternöron Progenitörlerinde Agaroz Gömülü Elektroporasyon Destekli Gen Transferi

Gelişimsel nörobiyoloji temel bir soru nasıl nöron ağları embriyonik beyinde kurulan olmasıdır. Burada bu Cre / Lox-plazmid ve dorsal internöronlar etiket ve çeşitli gelişim aşamalarında kendi aksonal projeksiyonlar ve sinaptik hedefleri izlemek için kuş Beyin içinde piggyBac-aracılı DNA aktarılması sistemi olarak yeni genetik araçları ile bir elektroporasyon tekniği kombine.

Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon

Hipotalamusun fonksiyonel ve tıbbi önemine...

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Biz bir in vitro hazırlık kullanarak beyin çekirdekleri içine anterograd veya retrograd tracer enjeksiyonları yoluyla nöronlar ve süreçlerini etiketlemek için bir teknik açıklar. Biz i n markalama doğruluğunu artırmak amacıyla bir avantaj floresan işaretli fare mutantları ve temel optik donanım alarak izleyici elektroporasyon vitro varolan yöntemi değiştirilebilir.

Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki

Bu protokol, radyal olarak göç eden kortikal nöronların doğrudan gözlenmesi için talimatlar sağlar. N utero elektroporasyonda, organotipik dilim kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme, göç eden nöronlardaki ilgi genlerinin aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun etkilerini doğrudan ve dinamik olarak incelemek ve gelişme sırasındaki farklılaşmalarını analiz etmek için birleştirilir.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

Gen beyinde hücre-otonom fonksiyonları kaybı inducing tarafından okudu ya da seyrek nüfus hücre işlevinin kazanmak. Burada, rahim içinde elektroporasyon Cre recombinase işlev içinde vivokaybına neden için floxed genler ile kortikal nöronlar geliştirme seyrek nüfus sunmak için açıklamak.

CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks rahim içinde elektroporasyon ile inducing

Transmisyon elektron mikroskobu ve rahimde iletim sinir sisteminin iyi ultrastructure morfolojik değişiklikler geliştirme sırasında çalışmak için güçlü bir yaklaşımdır. Bu kombine yöntem değişiklikleri içine derin anlayışlar nöroplastisite ile ilgili topografik ifadelerinin temel yapısal detayları verir.

Sonra Ultrastructural nöroplastisite parametrelerinde Utero iletim gelişmekte olan fare beyin ve omurilik değerlendirilmesi

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Öğrenin, embriyonik fare beynindeki sinir devrelerinin gelişimini görselleştirmek için koşullu genetik transsinaptik izleme yöntemini. Bu teknik, tek hücre çözünürlüğünde nöron bağlantılarını analiz eder.

Embriyonik Fare beyninde İzleme Koşullu Genetik transsinaptik

Daha fazla video keşfet