Zebra balığı Keratosit Eksplantlarındaki Deri Yara İyileşmesi Toplu Hücre Göç ve reepithelialization Eğitim için

Bu prosedürün genel amacı, kolektif hücre göçü ve epitelyal yara iyileşme çalışmalarında kullanılmak üzere zebra balığı keratositlerinin ekplan kültürlerini oluşturmaktır. Bu, önce anestezi uygulanmış yetişkin zebra balığından bağlı epitel dokusuna sahip pulların çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Bağlı dokuya sahip pullar, hücrelerin yapışmasını sağlamak için bir kültür kabına yerleştirilir.

Daha sonra kültür ortamı, deneysel tasarım tarafından belirtilen herhangi bir işlemle birlikte eklenir. Son olarak, hücreler inkübe edilir ve istenen zaman dilimi boyunca video mikroskobu ile gözlemlenir. Sonuç olarak, göç veya hücresel morfolojideki değişikliklerin yanı sıra zaman içinde proteinlerin veya diğer belirteçlerin ekspresyonunu göstermek için çeşitli tahliller kullanılabilir.

Bu tekniğin, transforme hücre kültürü yöntemi gibi mevcut yönteme göre ana avantajı, eksplant kültürünün, in vivo olarak hücrenin özelliklerine yakından yeniden bir araya gelen birincil olmasıdır. Bu yöntem, epitelyal yara iyileşmesi alanında, toplu göçün rolü ve epitelden mezenkimal geçişe gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü ölçekler büyüme yüzeyine yapışmayabilir veya herhangi bir kültür kabında büyüyemeyebilir.

Bu prosedürü göstermek, her ikisi de laboratuvarımda kıdemli araştırma görevlisi olan Jose Rap PanIN tıp öğrencisi Chana TI ve Agnes Pasquale olacak. Bu deneye hazırlanmak için, ticari bir klorsuzlaştırma maddesi kullanarak veya suyu 24 saat bekleterek yaklaşık 1,5 litre musluk suyunu klordan arındırın, ardından üç litrelik beherin her birini doldurmak için 500 mililitre kullanın. Herhangi bir işlemden önce balıkları tutmak için bir beheri ve üçüncü behere geri kazanım için ikinci bir tanesini etiketleyin.

Mililitre trica başına 100 mikrogram ekleyin. Balıkları uyuşturmak için sığ bir tepsiyi buzla doldurun. Kültür ortamını oda sıcaklığına ısıtın ve temiz kuyumcular, cımbızlar toplayın.

Cımbızları, uçlarını %70 etanole batırarak ve bir bunsen brülöründen geçirerek temizleyin ve etanolün yanmasına izin verin. İstenilen sayıda balığı yakalayın ve bir tutma kabına koyun. Tek bir balığı anestezi kabına aktarın.

Balığı metin protokolüne göre uyuşturduktan sonra, buza aktarın ve cımbızı tutan elin kuyruğuna bakacak şekilde yatay olarak yerleştirin. Pulları çıkarmak için cımbızı balığa paralel olarak yerleştirin. Uç bir terazinin kenarındayken, pulun balığın vücudundan yükselmesine neden olmak için cımbızın düz tarafını balığın yan tarafına hafifçe bastırın.

Tartıyı kavramak için cımbız kullanın, ardından koparın ve ters çevirmeden doku kültürü kabına yerleştirin. Solungaç bölgesinden, yanal çizgiden ve yüzgeçlerden kaçınarak, büyük bir yetişkinden en fazla 12 ölçek çıkararak prosedürü tekrarlayın. Balığı kurtarma kabına yerleştirin ve anestezinin etkilerinden kurtulduğundan emin olmak için izleyin.

Daha sonra balığı ayrı bir tanka aktarın ve tam ölçek rejenerasyonuna izin vermek için balığın 21 gün boyunca iyileşmesine izin verin. Deneye bağlı olarak, plastik başına 20'ye kadar ölçek yerleştirin. 35 milimetre doku kültürü ile muamele edilmiş tabak veya cam başına dört ila altı ölçek.

Alt tabak, her bir kültür kabına nazikçe 1,2 mililitre tam orta maddesi eklemeden önce pulların tabağa yapışmasına izin verin. Mikroskopi yapmak için X explan kültürlerini istenen süre boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Hücre tabakaları içeren bir kabı inkübatörden çıkardıktan sonra, mikroskop aşamasına yerleştirin.

Zaman içinde görüntü çekmeyi kolaylaştırmak için başlangıçta odaklanmak için dört x objektif kullanın. Sahne alanında her hücre yaprağının konumunu ve/veya çanağın yönünü işaretleyin. Hücre tabakalarını deney protokolüne göre çeşitli zaman noktalarında fotoğraflayın ve deney için yalnızca hareketsiz görüntülere ihtiyaç duyuluyorsa, inkübatöre geri yerleştirin.

İmmünofloresan mikroskobu için numuneleri sabitlemek için, oda sıcaklığında çözeltileri hazırlayın ve önceden ısıtın. OSE bölgelerini floresan altında görüntülemek için, bu videoda daha önce anlatıldığı gibi patlıcan yetiştirmek için cam tabanlı 35 milimetre tabak kültür kapları kullanın, kültür ortamını çıkarmadan, her yemeğe 1,1 XPBS'de 0,8 mililitre %4 paraldehit ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Sonra çözeltiyi aspire edin. Her yemeğe ilave 0.8 mililitre sabitleyici ekleyin ve ikinci bir beş dakikalık inkübasyondan sonra çözeltiyi aspire edin. Harici ligandlar veya epitoplar kullanmadıkça, bir XPBS inkübesinde beş dakika boyunca 0,5 mililitre% 0,2 TRITTON X 100 ekleyerek hücrelere nüfuz edin.

Çözeltiyi çıkarmadan önce, bir XPBS'ye 0,5 mililitre% 1 BSA ekleyin ve inkübasyondan sonra oda sıcaklığında bir saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin, çözeltiyi aspire edin ve antikor boyamaya devam edin. Alternatif olarak, bir XPBS'ye bir ila iki mililitre %1 BSA ekleyin ve üç ila dört hafta boyunca dört santigrat derecede saklayın. İmmünofloresan yapın.

Burada gösterildiği gibi metin protokolüne göre, EXPLAN kültürü oluşturulduktan birkaç saat sonra ölçeğin altından göç eden keratosit tabakaları gözlemlenebilir. Bazen, toplu olarak göç eden tabakadan kopmuş, bireysel olarak göç eden bir keratinosit gözlenebilir. Başlangıçtaki tabaka ilerleme hızı son derece hızlıdır, ancak hücreler kültürün ilk 48 saati boyunca yayıldıkça bu oran hızla yavaşlar.

Hızlı artış, hücre proliferasyonu ile ilişkili değildir, çünkü floresan EDU ile 24 saat boyunca etiketlendikten sonra, hücrelerin yaklaşık% 10'u, dönüştürülmüş hücre hatlarında görülenden çok daha düşük bir oranda hücre bölünmesi kanıtı gösterir. X explan oluşturulduğunda tedavi eklendiğinde, bazı bileşikler kollektif hücre göçünü değiştirir. Örneğin, burada gösterildiği gibi, bazı MMP inhibitörleri 24 saat sonra hücre tabakası alanını azaltır.

Kültürde, yapışma oluşumunu bozmak için kültür ortamına çözünür RGD içeren peptit eklendiğinde, tabakanın ön kenarındaki topal hızla büzülür ve daha sonra tabakanın ön kenarı ayrılır ve geri çekilir ve proteinlerin tabaka içindeki lokalizasyonunu değerlendirmek için iki dakikadan az bir süre içinde veya litre ve takip eden hücreler, Tüm tabaka bu şekilde gösterildiği gibi sabitlenebilir ve boyanabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 10 ila 15 dakika içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, bu prosedürü takiben, sitlerin kültür kabına yapışması için zaman tanıdıktan sonra ön ısıtma kültür ortamını eklemeyi unutmamak önemlidir.

QPCR gibi diğer yöntemler, zaman ve/veya tedavi durumuna bağlı olarak gen ekspresyonundaki değişiklikler gibi herhangi bir ek soruyu yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü izledikten sonra, çeşitli prosedürlerde kullanılmak üzere IDE explan kültürlerinin nasıl oluşturulacağı konusunda çok daha iyi bir fikre sahip olmalısınız.