Nörolojik Hastalıklar Çalışmaları Yaratma ve Kullanma hiPSC Türetilmiş NPC A Guide

Bu prosedürün genel amacı, nörolojik hastalıklara katkıda bulunan hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için bir platform olarak, insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden veya hiPSC'lerden nöral progenitör hücreler veya NPC'ler üretmektir. Bu işlem, öncelikle hiPSC'lerin çift smad inhibitörleri kullanılarak nöral rozetlere farklılaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise bu nöral rozetlerin toplanması ve genişletilebilir NPC popülasyonlarına dönüşmelerine izin verilmesidir.

Ardından, spin enfeksiyonu ile lentiviral transdüksiyon gerçekleştirilir. Gen ekspresyonunu manipüle etmek için verimliliği artıran bu adım kullanılır. Son adım, NPC'lerin süspansiyonda büyütülerek kendiliğinden nörosferler oluşturmalarını sağlamaktır.

Sonuç olarak, bu platform çeşitli hücresel fenotipleri analiz etmek için kullanılabilir. Örneğin, genetik manipülasyonun nöronal migrasyon üzerindeki etkisinin ölçülmesi gibi. Bu yöntem, migrasyon gibi hücresel mekanizmalar hakkında bilgi sağlayabilir.

Ayrıca replikasyon, oksidatif stres, apoptoz ve nörit büyümesi gibi diğer biyolojik süreçlerin incelenmesinde de uygulanabilir. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin veya yüksek PSC'lerin diferansiyasyonu, 14. günde nöral rozetlerin enzimatik seçimi için apiko-bazal polariteye sahip nöroepitelyal hücrelerin yuvarlak kümeleri olarak karakterize edilen görünür nöral rozetlerin oluşumuna yol açar. Yapışmış embriyo gövdelerinden (ebs) medyumu aspire edin ve altı kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa bir mililitre nöral rozet seçici reaktif ekleyip 37 °C'de bir saat inkübe edin.

Bir saat sonra. Her kuyucuktaki enzimi nazikçe uzaklaştırmak için P 1000 pipet kullanın ve her kuyucuğa bir mililitre D-M-E-M-F 12 ekleyin. Rozetleri yıkamak için bir mililitre D-M-E-M-F 12'yi toplayın ve hızla tekrar kuyucuğa boşaltın; böylece rozetleri plakadan ayırın.

Rozetleri bir falcon tüpüne toplayın. Bir mililitre daha D-M-E-M-F 12 pipetleyin ve kalan rozetleri ayırmak için hızlıca aynı kuyucuğa boşaltın. Tritürasyon yapmayın ve rozet agregatlarını parçalamamaya çalışın. Nöral rozetleri aynı falcon tüpüne toplayın.

Tüm nöral rozetler toplandıktan sonra rozetler kolayca ayrılmazsa, daha fazla enzim eklenebilir ve bu işlem tekrarlanabilir. Falcon tüpünü 300 G hızda üç dakika boyunca santrifüjleyin. Yıkama solüsyonunu aspire edin ve yeniden süspande edin.

Rozetleri iki mililitre nöral progenitör hücre besiyerinde süspanse edin. Hücreleri poli-L-ornitin laminat kaplı altılı duvar plakasına aktarın ve 37 °C'de bir hafta boyunca büyütün. Bu laboratuvarda, nöral progenitör hücreler veya NPC'ler, matrigel plakalarında büyütülmekte, her iki günde bir beslenmekte ve çok yüksek yoğunlukta tutulmaktadır.

NPC'leri ayırmak için, önce medyumu aspire edin ve ardından altı kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa bir mililitre sıcak accutane ekleyerek 37 °C'de 10 ila 15 dakika inkübe edin. Ayrılan hücreleri, mümkün olan en az mekanik stresle, D-M-E-M-F 12 içeren 15 mililitrelik bir tüpe nazikçe aktarın. Hücreler enzim pelletindeyken titrasyon yapmayın; hücreleri 1000 G'de beş dakika santrifüj ederek pellete getirin. Santrifüjasyon sonrası süpernatantı aspire edin ve NPC'leri yeniden süspande edin.

Yeniden süspansiyon ve hücre sayımı sonrası, altı kuyucuklu bir plakanın konfluent her bir kuyucuğu için yaklaşık bir mililitre NPC besiyeri içinde 5 ila 10 milyon hücre beklenir. NPC'leri sürdürmek için altı kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna yaklaşık 1 ila 2 milyon NPC hücresi ekleyin. Nörosfer oluşum verimliliği deneyler ve hücre hatları arasında farklılık gösterir, ancak genellikle nonadherent altı kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna 200.000 ile bir milyon arasında hücre ekildiğinde en iyi sonuçlar alınır; kümelenme meydana gelirse ekilen hücre sayısını azaltın. İdeal olarak bölme işleminden bir ila iki gün sonra ekim yapın.

Transfekte edilen hücrelerin yüzdesini artırmak için NP NPC'ler lentiviral veya retroviral vektörlerle transdukte edilmelidir. Spin enfeksiyonu uygulayın. Her kuyucuktaki medyumu aspire edin ve istenen enfeksiyon çokluğu (MOI) değerine seyreltilmiş ilgili aşırı ifade veya kontrol lentivirüsleri veya retrovirüsleri ile değiştirin.

NPC medyumunda, altı kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğuna 1,5 mililitre kullanın; bir plaka santrifüjünde, oda sıcaklığında ve 1000 G'de bir saat boyunca döndürün. Döndürme işleminden sonra, hücre ölümünü azaltmak için plakayı tekrar inkübatöre yerleştirin. Medyumu, döndürme enfeksiyonundan sonra sekiz saat içinde değiştirin.

Hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için NPC türevli NEUROSPHERES'leri bir kez NPC medyası ile yıkayarak bu prosedüre başlayın. Plakayı 45 derecelik bir açıyla eğerek nörosferlerin çökmesini sağlayın ve ardından nörosferleri aspire etmeden mümkün olduğunca fazla medyayı uzaklaştırın. Taze medya ile değiştirin.

Ardından, P 200 pipet kullanarak mikroskop altında NPC türevli NEUROSFERLERİ manuel olarak seçin ve her bir neurosferi matrigel kaplı 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına tek tek aktarın. Sonuçlardaki değişkenliği azaltmak için benzer boyutlardaki neurosferlerin seçilmesi önemlidir. 96 kuyucuklu plaka içindeki her bir neurosfere, soğuk NPC medyumunda seyreltilmiş ek 0,5 miligram matrigel ekleyin.

Bir pipet ucu kullanarak her bir nevrosferin kuyucuğun ortasına manuel olarak merkezlenmesini sağlayın. Nevrosfer göçünün gerçekleşmesi için 48 saat bekleyin. Hücreler istenen immünohistokimyasal belirteçlerle fikse edilip boyandıktan sonra, nevrosferlerin tamamını bir Forex mikroskop objektifi kullanarak fotoğraflayın. Radyal göçü ölçmek için Image J yazılımını kullanın.

En uzağa göç eden hücrelerin kenarlarını manuel olarak çizmek için serbest biçimli seçim aracını kullanın. Analyze sekmesi altında bulunan set measurements penceresinde, area seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun. Ardından, ortaya çıkan şeklin alanını hesaplamak için measure fonksiyonunu kullanın.

Alan ölçüm değerini ve dairenin alan formülünü kullanarak dış yarıçapı aynı şekilde belirleyin, orijinal nörosferin kenarının izini sürün. Alanı ölçün ve iç yarıçapı hesaplayın. Toplam radyal migrasyonu, dış ve iç yarıçaplar arasındaki fark olarak hesaplayın.

Bu görüntüler, yüksek PSC'lerden embriyo gövdelerine, nöral rozetlere, NPC'lere ve nöronlara kadar olan yüksek PSC nöral diferansiyasyon aşamalarını göstermektedir; doğrulanan NPC'ler, çoğu hücrede NPC belirteci olan nesting ve nöral kök hücre transkripsiyon faktörü SOX two eksprese eder. Tüm NPC popülasyonlarında Beta üç tubulin boyaması da görülmektedir. NPC'ler ayrıca nöral kök hücre transkripsiyon faktörü PAC six ve beyin öncül belirteci four brainin'i de eksprese eder.

TBR2, ancak LMX1A ve FOXA2 gibi orta beyin belirteçlerini dışarıda bırakan NPC'ler; yeşil ile gösterilen %70 ila %80 oranında beta three tubulin pozitif nöronlara ve kırmızı ile gösterilen %20 ila %30 oranında glial fibrillary acidic protein pozitif astrositlere farklılaşabilir, bu durum yüksek kaliteli yüksek PSC örneğidir. NPC'ler hücrelerin çoğunda neston ve SOX2 eksprese ederken, düşük kaliteli NPC'lerde yalnızca SOX2 negatif ve nest in negatif hücre yamaları bulunur. Yüksek kaliteli NPC'lerden farklılaşmış dört haftalık nöronlar map2 AB ve beta three turbulent eksprese eder.

Yüksek titreli bir lentiviral veya retroviral vektör ile başarılı transdüksiyonun ardından, hücrelerin %80'inden fazlası floresan raporcu ile işaretlenmiştir. Vektöre dahil edilen nörosfer üretimi, yaklaşık bir hafta boyunca kültürde sağlıklı kalabilen, nispeten homojen boyutta bir nörosfer popülasyonu sağlar.

Düzenli besleme ile, matrijeldeki gelişimin ardından 48 saatlik migrasyon öncesi ve sonrasındaki şu brightfield görüntülerinde gösterildiği gibi, sağlıklı nörosferlerde nörosfer migrasyonu güçlü bir şekilde gerçekleşir. Bu teknik, şizofreni alanındaki araştırmacıların, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilmiş NPC'lerde nöromigrasyonu incelemelerinin yolunu açmıştır. Retrovirüs ile çalışmanın potansiyel olarak tehlikeli olabileceğini ve virüsün potansiyel olarak mevcut olduğu durumlarda tüm doku kültürü çalışmalarının BSL-2+ koşullarında yapılması gerektiğini unutmayın.