Name: Manipülasyon ve İn Vitro Olgunlaşma Xenopus laevis oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Öğrenin Xenopus laevis oositlerinde maternal proteinlerin manipülasyonu ve in vitro olgunlaştırma yöntemini. Antisens oligonükleotid veya mRNA enjeksiyonu ile gen fonksiyonlarını erken embriyonik gelişimde inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yararlı tartışmalar için Gurdon laboratuvar üyelerine minnettarız. KM, Wolfson College'da Araştırma Görevlisidir ve Herchel Smith Doktora Sonrası Bursu ve Büyük Britanya Sasakawa Vakfı tarafından desteklenmektedir. Gurdon laboratuvarı, Wellcome Trust (RG69899) ve MRC'DEN J.B.G.'ye verilen hibelerle desteklenmektedir.

<ol><li>Miyamoto, K., Gurdon, J. B. Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiyamoto%2C+K+%22Biology+and+Pathology+of+the+Oocyte%3A+Role+in+Fertility%2C+Medicine%2C+and+Nuclear+Reprogramming%22">Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming</a>. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Second, Cambridge University Press. 1-11 (2013).</li>
<li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo%3A+a+novel+antisense+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).</li>
<li>Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordin+is+required+for+the+Spemann+organizer+transplantation+phenomenon+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos.</a> Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).</li>
<li>Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+requirement+for+HIRA-dependent+H3.3+deposition+revealed+at+gastrulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus.</a> Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).</li>
<li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).</li>
<li>Heasman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+cadherins+and+underexpression+of+beta-catenin+inhibit+dorsal+mesoderm+induction+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Overexpression of cadherins and underexpression of beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos.</a> Cell. 79 (5), 791-803 (1994).</li>
<li>Hulstrand, A. M., Schneider, P. N., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+antisense+oligonucleotides+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The use of antisense oligonucleotides in Xenopus oocytes.</a> Methods. 51 (1), 75-81 (2010).</li>
<li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Wave1+is+required+for+reprogramming+transcription+in+oocytes+and+for+normal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear Wave1 is required for reprogramming transcription in oocytes and for normal development.</a> Science. 341 (6149), 1002-1005 (2013).</li>
<li>Halley-Stott, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+nuclear+transplantation+to+Germinal+Vesicle+stage+Xenopus+oocytes+-+a+method+for+quantitative+transcriptional+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming.</a> Methods. 51 (1), 56-65 (2010).</li>
<li>Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+characterizes+chromatin+presetting+by+NF1+and+Oct1+and+enhances+glucocorticoid+receptor+binding+to+the+MMTV+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter.</a> Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).</li>
<li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).</li>
<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).</li>
<li>Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+transgenesis+by+sperm+nuclear+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection.</a> Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).</li>
<li>Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cycloheximide+on+the+%27autocatalytic%27+nature+of+the+maturation+promoting+factor+%28MPF%29+in+oocytes+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis.</a> Cell. 4 (3), 269-274 (1975).</li>
<li>Smith, L. D., Ecker, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+oocyte+nucleus+in+physiological+maturation+in+Rana+pipiens%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens.</a> Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).</li>
<li>Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+actin+polymerization+is+required+for+transcriptional+reprogramming+of+Oct4+by+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes.</a> Genes & development. 25 (9), 946-958 (2011).</li>
<li>Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+Xenopus+oocytes+using+the+host+transfer+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis).</a> Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Sakane, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+multiple+and+paralogous+genes+in+Xenopus+laevis+using+two+pairs+of+transcription+activator-like+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases.</a> Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).</li>
<li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+RNA%2FCas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Biz burada detay anne faktörleri tüketmek ya da döllenme öncesi dışsal faktörleri aşırı ifade için yeni bir yöntem. Bu sistem iki microinjections gerektirir, ancak bunun yerine ev sahibi transferi yöntemi 7,17 kullanılan kurbağa ameliyatı, atlar. Bu hayvan bakımı açısından kurbağa ameliyatı adımı kaldırmak için en uygunudur. Dahası, biz deneylerin başarısını etkileyen bir faktör biyolojik kurtulmak anlamına transfer deneyleri için ev sahibi kadın kurbağa kalitesi dikkate almak zorunda değilsiniz. Bu nedenle, bu sistemde PMSG-prime kurbağa elde edilen oosit kalitesi başarılı deneyler için anahtar önemli bir biyolojik faktördür. oosit kalitesi yumurtalık veya sonrasında defolliculation toplandıktan sonra yargılanabilir. Herhangi bir anormallik bu aşamada görülürse, yeni bir kurbağa başka yumurtalık toplamak için en uygunudur. Eğer oosit kalitesini kontrol edebilirsiniz başka nokta oosit olgunlaşması peşinde. Eğer progesteron az% 80E-tedavi oosit olgunlaşma belirtileri gösteriyor, daha fazla analiz için embriyo yeterli sayıda elde etmek mümkün olmayabilir. enzimatik defolliculation yerine kılavuzu defolliculation kullanımı da defolliculation için gerekli emek azaltmak için bu sistemi kullanan bir başka avantajdır. Ancak, manuel defolliculation enzimatik tedaviden daha iyi bir gelişme verebilir ki hala mümkün. Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi, in vitro olarak yaklaşık% 10, yüzme larva dönemini ulaşabilir oosit olgunlaşması. Bu veriler, 8 ve yeni enjeksiyon deneyleri rapor da dahil olmak üzere 13 bağımsız deneyden toplanan. Sunucu aktarma yöntemi transfer oosit% 30-60 neurula aşamasına 17 ulaşabilirsiniz beri anlamlı veri elde etmek için her tedavi 75-150 oosit ihtiyacı var. Önerilen yöntem, normal bölünen embriyolar, yaklaşık% 40-60 ulaşabildiklerinden her bir deney grubu 200-300 oosit ile başlarkas tepki aşaması. Bu veriler her iki yöntem de makul bir gelişim hızı desteklediğini gösteriyor. Biz şimdiye kadar bu yaklaşım metamorfoz ile gelişimini destekler belirten, bu tekniği kullanarak kontrol mRNA enjekte ve kontrol antisens oligo-enjekte oosit 10 canlı kurbağa almış. Bizim oosit manipülasyon-ICSI yöntemi yakında döllenmeden sonra, çok erken embriyonik gelişimi sırasında maternal faktörlerin rolünü test etmek için bir fırsat sağlar. Buna ek olarak, gübreleme öncesi kromatin değiştirici faktörlerin ekspresyonu mümkün gelişimi için gerekli olan anne kromatin durumlarını anlamak için gübreleme öncesi anne kromatin pişmanlık yapabilir. Bu strateji, aynı zamanda bu bile gübreleme önce ifade edilebilir beri Transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleaz (TALEN) 18,19 ve CRISPR / CAS9 20,21 olarak mevcut gen düzenleme sistemleri ile de çalışabilir. Bu nedenle, yeni bir yaklaşım potenti vardırark gelecek bir çok uygulama için kullanılır.

Xenopus laevis geliştirme 1 incelemek için yaygın olarak kullanılan, güçlü bir model organizmadır. Xenopus yumurta ve bol (memeli meslektaşları karşılaştırma yaklaşık 0.1 mm olmak, yaklaşık 1.2-1.4 mm) alışılmadık büyük olmasıdır. Yumurta (4,000-8,000 hücreleri ile sahnede 8-8,5 meydana gelen, MBT) orta-blastula geçiş kadar embriyo gelişimini götürmek için yeterli olan anne sentezlenmiş ve depolanan bileşenler içerir. MBT sonra daha da geliştirilmesi doğrudan embriyonik gen ürünleri üreten zigotik genom aktivasyonu, eşlik ediyor. Çeşitli çalışmalar gelişimi için önemli anne faktörlerini belirlemeyi amaçladık. Birçok çalışma, anne proteinlerin durum bozunma gastrula aşamasında 2-4 de gözlenebildiği döllenmiş embriyolar haline morfolino oligonükleotitler de dahil olmak üzere anti-his oligonükleotidler (oligos) enjeksiyonu dayanır. Alternatif olarak, mRNAlar döllenmiş em enjekte edilirbryos gen fonksiyonlarını rahatsız veya aşın proteinlerin kaderlerini izlemek için. Bununla birlikte, tek bir hücre aşamasında embriyoların içine enjeksiyon normal MBT önce çok erken evrelerinde maternal protein ifade seviyelerini etkilemez. Heasman ve Wylie, bu sorunu aşmak için 5 konak aktarma yöntemi kurdu. Bunların bir yöntemde, el defolike oosit antisens oligoları ile enjekte edilir ve ana kadın 6 transfer edilir. Erken dönemde embriyo gelişimi olarak azaldı proteinlerin rolleri incelenmiş böylece proteinler Fertilizasyondan önce aşağı regüle edilir. 7 &#39;da gözden geçirilen bu anne tüketme yöntemi olup, anne proteinlerin çeşitli benzersiz gelişim roller belirlenmesine yol açmıştır. Döllenme önce mRNA anne tükenmesi ya da aşırı ifadesi manuel defolliculation ve ev sahibi transferi olmadan elde edildiği, bu raporda, biz ayrıntı bizim yeni geliştirilen yöntem, içinde8. Manuel defolliculation zaman ve konak transferi bir sürü genellikle böylece anne tükenme yöntemi sık kullanımı engelleyici, usta teknikleri ve hayvan cerrahisi için özel lisans ihtiyacı gerektirir. Defolliculation ve ev sahibi transferi sırasıyla, enzimatik defolliculation 9,10 ve intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) 11-13 ile ikame edilir. Yumurta ICSI başlangıçta transgenik kurbağalar 12 üretmek için kullanıldı. Sperm ve embriyonik çekirdekleri ayrıca in vitro olgunlaşması amfibi oosit 11,14,15 nakledildi. Burada, biz in vitro olgunlaştı oosit sperm enjekte etmek bizim adım adım yöntemi göstermek antisens oligolar veya mRNA ile ön-enjekte.

<table><tbody><tr><td>Hamile Kısrak Serumu Gonadotropin (PMSG)&nbsp;</td><td>MSD Hayvan Sağlığı</td><td>Vm 01708/4309</td><td>PMSG-Intervet 5000iu enjeksiyon çözeltisi için toz ve çözücü</td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu (MS222)</td> <td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Anestezi için</td></tr><tr><td>Liberase TM Araştırma Sınıfı</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>Oosit defollikasyonu için. -20&nbsp'de saklayın; &#176;C.</td></tr><tr><td>Drummond Nanoject</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-205/206</td><td>Mikroenjeksiyon</td></tr><tr><td>cam kılcal damar için&nbsp;</td><td>Alfa laboratuvarları</td><td>7" Drummond # 3-000-203-G / XL</td><td>Mikroenjeksiyon Mikropipet</td></tr><tr><td>Çektirmesi için&nbsp;</td><td>Mikroenjeksiyon için</td> <td>SUTTER Enstrüman Modeli</td><td>D-97</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td> in vitro olgunlaşma ve ICSI</td></tr><tr><td>için 14 ml ultra berrak santrifüj tüpü ve nbsp;</td><td>Beckman Coulter Birleşik Krallık Ltd</td><td>344060</td><td>Sperm saflaştırma için</td></tr><tr><td>OptiPrep Yoğunluk Gradyan Ortamı (İodiksanol)</td> <td>Sigma</td><td>D1556</td><td>Sperm saflaştırması için</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Hücre geçirgenliği reaktifi</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Hybaid&nbsp;</td><td>HB-SHK-1</td><td>Oosit defollikasyonu için</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu (Stereo zoom mikroskobu)</td><td>ZEISS</td><td>Semi SV6</td><td>Oosit toplama ve mikroenjeksiyon</td></tr><tr><td>için 50 & mu; m gözenek filtresi</td><td>CellTrics</td><td>04-0042-2317</td><td>Sperm saflaştırması için</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100XP</td><td>Sperm saflaştırması için</td></tr><tr><td>50 ml santrifüj tüpü</td><td>Cellstar Greiner Bio-One</td><td>227261 veya 210261</td><td>Oosit toplama ve defollikasyon reaksiyonu</td></tr><tr><td>15 ml santrifüj tüpü</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td>Sperm saflaştırma için</td></tr><tr><td>90 mm Petri Yemek&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>101VR20/C</td><td></td></tr><tr><td>Kolay Kavranan Hücre Kültürü Kabı, 60 & x&nbsp; 15 mm</td><td>FALCON</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Kolay Kavranan Hücre Kültürü Çanağı, 35 nbsp; x&nbsp; 15 mm</td><td>ŞAHIN</td><td>351008</td><td></td></tr></tbody></table>

manipülasyon ve<em&gt; İn vitro</emve&gt; olgunlaşma<em&gt; xenopus laevis</emintrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, embriyonik geliştirme Çalışması

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amfibi yumurtaları, embriyonik gelişimi incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Erken embriyonik gelişim, oogenez sırasında biriken maternal olarak depolanan faktörler tarafından yönlendirilir. Bu tür maternal faktörlerin erken embriyonik gelişimdeki rollerini incelemek için, işlevlerini embriyonik gelişimin en başından itibaren manipüle etmek arzu edilir. Geleneksel gen girişim yolları, antisens oligonükleotidlerin (oligolar) veya mRNA'nın döllenmiş yumurtalara enjekte edilmesiyle elde edilir ve bu da sırasıyla spesifik proteinlerin yetersiz veya fazla ekspresyonunu sağlar. Bununla birlikte, bu yöntemler normalde protein ekspresyonu etkilenene kadar birkaç saatten fazla zaman gerektirir ve bu nedenle, gen fonksiyonlarının müdahalesi erken embriyonik aşamalarda etkili değildir. Burada, döllenmeden önce maternal proteinlerin ekspresyon seviyelerinin değiştirilebildiği deneysel bir sistem sunuyoruz. Yumurtalıklardan elde edilen Xenopus laevis oositleri enzimlerle inkübe edilerek defolliküle edilir. Antisens oligolar veya mRNA'lar, germinal vezikül (GV) aşamasında defolliküle oositlere enjekte edilir. Bu oositler in vitro olarak metafaz II (MII) aşamasında yumurtalara olgunlaştırılır, ardından intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) yapılır. Bu şekilde, ICSI embriyolarının %10'a kadarı yüzme kurbağa yavrusu aşamasına ulaşabilir, böylece spesifik gen yıkımı veya aşırı ekspresyonunun fonksiyonel testlerine izin verilir. Bu yaklaşım, erken embriyonik gelişimde maternal olarak depolanan faktörlerin rollerini incelemek için yararlı bir yol olabilir.

In vitro olgunlaştı oosit kullanarak ICSI embriyoların Embriyonik gelişim (Şekil 3A) incelendi. MII sahneye GV oosit olgunlaşması oranları değişkendir ve büyük ölçüde oosit kalitesine bağlıdır. İyi deneylerde, GV oosit neredeyse% 100 nihayet MII aşamada yumurta haline, oosit olgunlaşması progesteron ve gösteri işaretleri cevap. Tüm oositler ICSI olgunlaşmış tabi tutulur ve enjekte klivaj edilen yumurtaların yaklaşık% 25&#39;i (Şekil 3A, n = kontrolü için 13 oligo enjekte oosit karıştırılmış ve n = herhangi bir oligo-enjekte edilmiş oositlerde 7) yapılmıştır. Yaklaşık% 60 ya da kontrol oligo-enjekte edilmiş oositlerde veya enjeksiyon oosit elde ayrılır embriyolar,% 80, sırasıyla Blastula / gastrula aşamasına. Blastula / gastrula embriyoların% 82 n iyi kalitede olduğunu ise blastula / gastrula embriyolar arasında, oligo-enjekte örneklerde embriyoların yaklaşık yarısı (anormal bölünme ve apoptoz neredeyse hiçbir işaret) iyi kalitedeile enjekte örnekleri (Şekil 3A). Enjekte örnekleri içinde% 60 ve parçalanan embriyoların% 29 (Şekil 3A) yaptı ise Son olarak,% 41 ve oligo enjekte örneklerde bölünen embriyolar% 11, sırasıyla, kas tepkisini ve yüzme larva aşamalarında ulaşmıştır. Bu ICSI embriyolar, normal ve anormal embriyolar (Şekil 3B) karışımlarıdır. Bazıları metamorfoz geçiren ve kurbağalar 8 olgun geliştirmek. Bu sonuçlar IVM ve ICSI takip GV oosit içine antisens oligonükleotitlerin, enjeksiyonu, etkili erken embriyo gelişimini sağlayan öneririz. Antisens oligos kendisi enjeksiyon embriyonik gelişimini azaltır rağmen, biz hala böyle gelişimsel oranları kontrol gibi birçok deneysel amaçlar için yeterli embriyolar elde edebiliyoruz, RT-PCR, böylece batı leke ve. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52496/52496fig1highres.jpg" /> İncir<html> ure 1: Xenopus tipik örnekleri, in vitro maturasyon deneyler için kaliteli ya da kötü kalite oosit laevis. (A) kötü kaliteli oosit bir örnek. Örneğin, yamalı pigmentasyon gösteren oositlerin daha sonraki deneyler için kullanılmamaktadır. Her Xenopus oosit çapı yaklaşık 1.2-1.4 mm laevis. (B) kısmen defolike oosit. oosit sağ yarısı kan damarlarının varlığı ile ayırt edilebilir folikül hücreleri, ile kaplıdır. Bir ok folikül hücreleri serbest ve enjeksiyon iğnesi enjekte edildiği içine bir alanı gösterir. (C) eşit büyüklükte ve hayvan yarımkürede ve bitkisel yarımkürede arasında açık kontrast eşit pigmentli hayvan hemisfer göstermek kaliteli oosit, bir örnek. 2496 / 52496fig2highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 2:. Xenopus öncesi ve olgunlaşma sonrası oosit laevis oosit olgunlaşması sonra, berrak beyaz lekeler hayvan hemisfer ve folikül hücreleri üst kısmında görünen soyulmuş edilir. Her bir Xenopus laevis oosit çapı yaklaşık 1 mm&#39;dir. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52496/52496fig3highres.jpg" /> Şekil 3: in vitro olgunlaştı oosit üretilen ICSI embriyoların, geliştirilmesi. Her aşamada ICSI embriyolar (A) Development özetlenmiştir. Kontrol IVM ve ICSI takip antisens oligonükleotidler (kontrol oligo enjeksiyon) veya enjeksiyon (non enjeksiyon) olmadan, şifreli olan oositler enjekte edildi. Her aşamada embriyolar gelen sayı çubukları üzerinde gösterilir. ± SEM gösterilir idi. N = 4-13 bağımsız deney / farklı females. (B) ICSI embriyoların hayatta örnekleri. Bu tailbud aşamasındaki embriyolar yaklaşık 200 oosit, bir başlangıç ​​materyali olarak kullanıldığı bir deneyde, imal edilmiştir.

Xenopus laevis immatür oositlerini manipüle etme, oositlerin yumurtalara in vitro olgunlaşması ve intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu yöntemlerini açıklıyoruz. Bu protokol, bazı maternal proteinlerin bozulmasına ve döllenmede ilgilenilen genlerin aşırı ekspresyonuna izin verir ve bu nedenle erken embriyonik gelişimde spesifik faktörlerin rollerini incelemek için değerlidir.

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Bu deneyin amacı, kurbağa yumurtalarının döllenme aşamasında oositlerde depolanan maternal proteinleri susturmak veya ilgilenilen proteinleri aşırı ifade etmektir. Bu, belirli bir proteini yıkmak veya aşırı ifade etmek için enzimatik olarak deregüle edilmiş olgunlaşmamış oositlere antisense oligoların veya mRNA'nın enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak oositler, oositlerin yumurtalara olgunlaşmasını indükleyen progesteron içeren ortama aktarılır.Ardından, knockdown veya aşırı ifadenin embriyonik gelişim üzerindeki etkisini gözlemlemek amacıyla, in vitro olgunlaştırılmış yumurtalara sperm enjekte edilir. Nihayetinde, oligo enjekte edilmiş oositlerin yüzen iribaşlara kadar gelişimi, gen knockdown veya aşırı ifadesinin fonksiyonel testi niteliğindedir. Bu tekniğin, konakçıya transfer gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, standart protokoller kullanarak kurbağa cerrahi sürecini atlayabilmemizdir.MBS artı ps içeren dokuz santimetrelik bir petri kabı içerisinde, sağlıklı sitler içeren SAC üzerinde bir opus toplayın. Ardından, ovaryumu bir ila iki santimetre genişliğinde kare parçalara ayırın. Sitler içeren parçalanmış ovaryumdan yaklaşık beş mililitreyi yeni bir 50 mililitrelik tüpe toplayın.Ardından dokuları birkaç kez MBS artı PS ile durulayın ve yumurtaları 15 milliliters taze MBS artı ps içerisinde toplayın. Şimdi, süspansiyona yedi ünite defoliasyon enzimi ekleyin ve en azından kısmen defoliye olana kadar süspansiyonu nazik bir ajitasyonla inkübe edin. Bu işlem, inkübasyondan sonra en az bir saat sürecektir.Reaksiyonu durdurmak için tübü MBS ve Ps ile doldurun. Çözeltiyi hücrelerin üzerine doğrudan değil, tüp duvarına gelecek şekilde çekin. Dokuların çökmesini bekleyin ve ardından üstteki sıvıyı ve ajanı boşaltın.Küçük, olgunlaşmamış hücreler yüzeye çıkacaktır ve bunlar da atılmalıdır. Yıkama işleminden sonra bu yıkama adımını toplam 10 kez tekrarlayın. Hücreleri, MBS artı ps içeren dokuz santimetrelik bir petriye aktarın.Kabı bir diseksiyon mikroskobuna transfer edin ve buradan itibaren sitleri mümkün olduğunca 16 ila 18 °C'de tutun. Dumont sınıflandırmasını kullanarak cam bir pipet yardımıyla kaliteli Altıncı Evre sitleri seçin ve bunları MBS artı ps içeren yeni bir kaba toplayın. Kaliteli bir sit, hayvansal hemisferde düzenli pigmentasyon göstermeli ve hayvansal ile bitkisel hemisfer arasında net bir ayrım sergilemelidir.Ayrıca hepsinin yaklaşık olarak aynı boyutta olması gerekir; bu çap yaklaşık 1,2 ila 1,4 milimetre arasında olacaktır. Her enjeksiyon için yaklaşık 200 ila 300 sit toplayarak deney başına yaklaşık 1000 sit elde edin. O bölgesinin kalitesi başarının anahtarıdır.Hazırlık sırasında yumurtalıkta herhangi bir anormallik görülürse, farklı bir sürüden yumurtalık almanızı ve işleme yeniden başlamanızı öneririm. Antisense oligonun enjeksiyonuna hazırlık için, bir mikro enjektörün metal pistonunu en düşük konumuna getirin ve yağla doldurulmuş bir cam kapiları metal pistona yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, iğnenin ucunu küçük cerrahi makaslar kullanarak kesin.Mümkün olduğunca ince bir uç hazırlayın. Sıradaki lazere geçin. Mikroskop tablasına bir şerit parafilm yerleştirin ve üzerine 1 µg/µL konsantrasyonundaki nükleik asit çözeltisinden 3 µL damlatın.Bununla iğnenin ucunu doldurun. Eğer hava sıkışıyorsa, açıklık daha geniş hale getirilmelidir. Şimdi enjeksiyon iğnesinin ucundan yaklaşık yarım milimetre uzağa görünür bir işaret koyun.Ardından hücrelerin enjeksiyonuna geçerek önce bir tanesini enjekte edin; iğnenin girebileceği, folikül hücrelerinden arınmış bir alan bulun. İğne ucunu, germinal vezikülün altındaki merkez noktayı hedefleyerek ekvatoryal sınır boyunca yerleştirin. Aynı anda, hücreyi karşı taraftan pensle sabitleyin.Şimdi ayak pedalı kontrolünü kullanarak solüsyonu püskürtün; 4,6 ila 9,2 nanogram arası antisense oligo veya 250 pikogram ila 13,8 nanogram arası haberci RNA püskürtün. Tüm sitlerin enjeksiyonu tamamlandıktan sonra, bunları inkübasyon ortamına aktarın ve proteazomda değişikliklerin gerçekleşebilmesi için birkaç gün inkübe edin.Daha sonra, sitleri minimum miktarda medya ile beş ila sekiz mililitre olgunlaştırma medyumu içeren altı santimetrelik agros kaplı kaplara aktarın. Ardından, sperm enjeksiyonu yapmadan önce sitlerin bu medyada 16 saat boyunca gelişmesine izin verin. Bu protokol için dondurulmuş sperm stoğu hazırlanmış olmalıdır.Olgunlaşma için 16 saatlik inkübasyonun ardından metin protokolüne başvurun. Sitleri, yıkayarak uzaklaştırmak için MBS artı PS içeren altı santimetrelik yumurta kaba kaplı bir kaba çok dikkatli bir şekilde aktarın. Sitler yanlış yönetilirse, ixy öncesinde kendiliğinden aktive olabilirler.Şimdi, olgunlaşmış sitleri sayın ve sitin germinal vezikülünün parçalandığını gösteren beyaz lekelerin olup olmadığını kontrol edin. Eğer %80'den azı iyiyse, ixy prosedüründen sağ çıkacak kadar toplu olarak sağlıklı değillerdir. Devam etmek için.Yeni bir kabı enjeksiyon ortamı ile doldurun ve yarım saat sonra tüm sitleri dikkatlice kaba aktarın. Oligolar için açıklanan aynı enjektör hazırlığını kullanarak, olgun sitlere sperm çözeltisinin enjeksiyonuna geçin. İdeal olarak, enjeksiyon çözeltisindeki her 4.6 nanolitrede bir veya iki sperm bulunmalıdır.Bu enjeksiyon çözeltisini test etmek için, mililitre başına 0,3 mikrogram DPI içeren DPI çözeltisinden damlalar hazırlayın ve bu damlalara 4,6 nanolitre enjekte edin. Ardından, floresan mikroskobu ile her bir damladaki sperm sayısını sayın. Sperm konsantrasyonunu onayladıktan sonra, sitlere 4,6 nanolitre sperm çözeltisi enjekte edin.Çözeltilerin enjekte edilmesi için gereken sürenin tutarlı olduğundan emin olun ve oositleri, enjeksiyonlar arasında minimum duraksama yaparak istikrarlı bir şekilde enjekte edin. Her 100 enjeksiyonda bir sperm çözeltisini değiştirin. Olgunlaşmış tüm oositler enjekte edildikten sonra, kap dört ila beş saat boyunca inkübe edilmeli ve ardından incelenmelidir.Segmentasyon geçirmiş embriyolar için, segmentasyon çizgileri normal döllenmiş embriyolar kadar belirgin olmayabilir; tüm segmentasyona uğramış embriyoları inkübasyon medyasına aktarın ve gece boyunca inkübe olmalarına izin verin. Ertesi gün, hayatta kalan embriyolar 0,1 XMMR'ye aktarılmalıdır; ixy embriyolarının embriyonik gelişimi, in vitro olgunlaştırılmış oositler kullanılarak yapılan iyi deneylerde incelenmiş ve germinal vezikül oositlerinin neredeyse %100'ü progesterona yanıt vererek olgunlaşma belirtileri göstermiştir.Embriyoların yaklaşık %25'i bölünme gerçekleştirdi. Bölünen embriyoların %60 ila %80'i blastogastrula evresine ulaştı ve bunların yaklaşık üçte biri yüzen irbaş evresine ulaştı. ixy embriyoları, hem normal hem de anormal embriyoların bir karışımıydı; bu durum, germinal veziküler oositlere antisense sogo enjeksiyonunun ardından IVM ve Dixie uygulanmasının erken embriyonik gelişime izin verdiğini göstermiştir.Bu videoyu izledikten sonra, faktörizasyon öncesinde maternal proteinlerin nasıl manipüle edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

manipulation-vitro-maturation-xenopus-laevis-oocytes-followed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

İşte biz sitoplazmik mikroenjeksiyon...

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Gübrelenmesi Xenopus oositleri Host Transfer Yöntemi kullanılarak

Xenopus embriyonik epitel, epitel morfolojilerinden sırasında kutup geliştirme ve şekil değişikliği gibi hücre davranışlarını incelemek için ideal bir model sistem . Geleneksel sabit örnekleri histoloji giderek canlı hücre konfokal görüntüleme tarafından tamamlanmaktadır. Burada, kurbağa dokularda izole ve canlı hücre konfokal mikroskopi kullanılarak canlı epitel hücreleri ve hücre iskeletinin görselleştirmek için yöntemler göstermektedir.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Biz Branchiostoma lanceolatum ve döllenmemiş oosit içine burada mRNA enjeksiyonundan sonra floresan proteinleri sağlam ve verimli bir ifade rapor. Bu bazal kordalısı içinde mikroenjeksiyon tekniği gelişimi, gelişmekte olan bu model sistemde teknik yenilikleri geniş kapsamlı vivo görüntüleme ve gen-spesifik manipülasyonlar dahil önünü açacak.

Floresan protein ifadesindeki Branchiostoma lanceolatum Döllenmemiş Oositlerinin içine mRNA Enjeksiyon

El yazması burada Xenopus floresan levhası 'ligandların salgılanmasını ve difüzyon analiz yöntemleri basit bir kümesi sağlar. Bu ligand dağılımını değiştirmek için başka proteinlerin yeteneğini test ve morfojen degradeler düzenleyen mekanizmalar içgörü verebilir deneyleri izin verdiği için bir ortam sağlar.

Konfokal Analizi Kullanımı<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt ve Shh morfogen Gradyanların modülyatorlar Soruşturma

Xenopus embriyolarında, blastocoel'in çatısından alınan hücreler pluripotenttir ve çeşitli dokular oluşturmak üzere programlanabilir. Burada, erken nöral gelişimin temel in vivo ve in vitro özelliklerini araştırmak için bir test sistemi olarak amfibi blastocoel çatı eksplantlarını kullanma protokollerini açıklıyoruz.

Kök hücre benzeri<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Eksplantlarındaki Erken Nöral Gelişim Özellikleri Okuyacak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Yetkin ektodermde bir yanıtı indükleyebilen genlerin ekspresyon klonlaması için bir Xenopus oosit ve hayvan başlığı sistemini tanımlıyoruz ve bu tür genlerin sonraki analizi için teknikleri tartışıyoruz. Bu sistem, çok çeşitli gen ürünlerinin fonksiyonel olarak tanımlanmasında faydalıdır.

Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama<em&gt; Xenopus</em&gt; Oosit ekspresyon sistemi

Anne gen ürünlerinin işlenmesi için kullanılan zebra balığı oositlerin in vitro olgunlaşması için optimize edilmiş bir protokol burada sunulmuştur.

Kullanılması Anne Gen Ürünlerinin Fonksiyonel Manipülasyonu<em&gt; İn Vitro</emZebra balığı&gt; Oosit Olgunlaştırma

Bu protokol, vaskülatürü görselleştirmek ve Xenopus tropicalis'deki karmaşıklığını niceleştirmek için flüorüre dayalı bir yöntemi göstermektedir . İn vivo kardiyovasküler gelişimi incelemek için genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlardan sonra bir embriyonun kalp atımına floresan bir boya enjekte edildikten birkaç dakika sonra kan damarları görüntülenebilir.

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Xenopus laevis 1-hücreli embriyolardan mini embriyolar yapmak için fiziksel bir daraltma yöntemini açıklıyoruz.

Xenopus Mini Embriyoları Üretmek İçin Fiziksel Manipülasyon

Bu protokol, fare oositlerinin in vitro olgunlaşması, in vitro döllenme ve ardından blastosist evresine kadar embriyo kültürü prosedürlerini açıklar.

Fare Oositleri In Vitro Olgunlaşma, Döllenme ve Preimplantasyon Embriyolarının Kültürü

Öğrenin Xenopus laevis oositlerinde maternal proteinlerin manipülasyonu ve in vitro olgunlaştırma yöntemini. Antisens oligonükleotid veya mRNA enjeksiyonu ile gen fonksiyonlarını erken embriyonik gelişimde inceleyin.

Manipülasyon ve

Daha fazla video keşfet