Name: Listeria monocytogenes Kullanarak Enfekte Farelerde Kültür ve Kalp Kolonizasyonunda Kardiyak Hücrelerin Bakteriyel İstilasının Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Öğrenin, Listeria monocytogenes ile kardiyak hücre istilasını in vitro ve in vivo modeller kullanarak değerlendirme yöntemini. Bu protokol, enfeksiyon mekanizmalarını anlamak ve tedavi stratejileri geliştirmek için araştırmacılara güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Halk Sağlığı Servisi tarafından AI41816 ve AI099339 (N.E.F.) ve NIAID'den F31AI094886-01 (P.D.M.) tarafından desteklendi. İçerikler yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka finansman kaynaklarının resmi görüşlerini temsil etmez.

<ol><li>Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+hot+dogs+to+host+cells%3A+how+the+bacterial+pathogen+Listeria+monocytogenes+regulates+virulence+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression.</a> Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).</li>
<li>Drevets, D. A., Bronze, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+epidemiology%2C+human+disease%2C+and+mechanisms+of+brain+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).</li>
<li>Farber, J. M., Peterkin, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes.+a+food-borne+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen.</a> Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).</li>
<li>Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+how+Listeria+monocytogenes+targets+and+crosses+host+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers.</a> Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).</li>
<li>Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+listeriosis+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Human listeriosis and animal models.</a> Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).</li>
<li>Bou Ghanem, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InlA+promotes+dissemination+of+Listeria+monocytogenes+to+the+mesenteric+lymph+nodes+during+food+borne+infection+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice.</a> PLoS Pathog. 8, e1003015(2012).</li>
<li>Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+infection+with+signature-tagged+Listeria+monocytogenes+reveals+organ-specific+growth+and+dissemination+routes+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs.</a> Infect Immun. 80, 720-732 (2012).</li>
<li>Alonzo, F. 3rd, Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+subpopulations+of+Listeria+monocytogenes+with+enhanced+invasion+of+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells.</a> J Med Microbiol. , (2011).</li>
<li>Adler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+pseudotumor+of+the+heart+caused+by+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect%22%5BJournal%5D)">Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection.</a> J Infect. 58, 161-163 (2009).</li>
<li>Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocarditis+due+to+Listeria%3A+description+of+two+cases+and+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature.</a> Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).</li>
<li>Brouqui, P., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocarditis+due+to+rare+and+fastidious+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Endocarditis due to rare and fastidious bacteria.</a> Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).</li>
<li>Brusch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+infections+in+the+immunosuppressed+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Dis+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Cardiac infections in the immunosuppressed patient.</a> Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).</li>
<li>McCue, M. J., Moore, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocarditis+with+microabscess+formation+caused+by+Listeria+monocytogenes+associated+with+myocardial+infarct%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct.</a> Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).</li>
<li>Menard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+L-type+calcium+channel+expression+during+retinoic+acid-induced+differentiation+of+H9C2+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells.</a> J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).</li>
<li>Czuprynski, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+silage%2C+sandwiches+and+science%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Health+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science.</a> Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).</li>
<li>Grundler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surface+proteins+InlA+and+InlB+are+interdependently+required+for+polar+basolateral+invasion+by+Listeria+monocytogenes+in+a+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).</li>
<li>Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+extravillous+trophoblasts+restrict+intracellular+growth+and+spread+of+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes.</a> PLoS Pathog. 7, e1002005(2011).</li>
<li>Kimes, B. W., Brandt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+a+clonal+muscle+cell+line+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Properties of a clonal muscle cell line from rat heart.</a> Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).</li>
<li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+Listeria+monocytogenes+07PF0776%2C+a+cardiotropic+serovar+4b+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain.</a> J Bacteriol. 194, 3552(2012).</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını bildirmektedir.

L. monocytogenes, bir dizi farklı hastalık tezahürüne neden olabilecek yaygın ve iyi karakterize bir insan patojenidir15. Bakteri daha önce, sırasıyla merkezi sinir sistemine ve gelişmekte olan fetüse ulaşmak ve kolonileştirmek için kan-beyin bariyeri ve plasental-fetal bariyerler gibi bariyerler arasında geçiş yapabilme yeteneği ile tanımlanmıştır. Organizmanın bu dokuları kolonize etme in vivo yeteneği genellikle hedeflenen organları oluşturan kültürdeki temsili hücreleri istila etmek için ...

Listeria monocytogenes, yaşlılar, hamile kadınlar, HIV/ AIDS'li kişiler ve kemoterapi alan kişiler de dahil olmak üzere duyarlı popülasyonlarda ağır hastalığa neden olabilecek gram-pozitif hücre içi patojendir1. Bu popülasyonlardaki enfeksiyon sıklıkla kontamine gıda ürünlerinin yutulması sonucu ortaya çıkan bir şeydir ve çoğu enfeksiyon büyük ölçekli gıda kaynaklı salgınlarla ilişkilidir2,3. İnsanlarda ve diğer memelilerde, L. monocytogenes ince bağırsağın epitel sınırından geçiş yapabilir ve daha sonra karaciğere taşınabilir4,5. Hayvan modelleri, yutulan bakterilerin bağırsak villi içinde çoğaldığını ve portal damardan karaciğere geçtiğini veya mezenterik lenf düğümleri aracılığıyla kan akışına yayıldığını, karaciğere hematojen yayılmasına yol açarak6,7dalağı olduğunu göstermektedir. Karaciğer ve dalakta, bakteri hem profesyonel fagositlere hem de yerleşik parenkimal hücrelere alıma aracılık edebilir ve bu organlarda hızla enfeksiyonlar oluşturur. Bakteri yükü arttıkça, çok sayıda bakteri kana geri dağılır ve burada merkezi sinir sistemi ve plasenta (varsa) dahil olmak üzere hassas dokuları daha fazla kolonileştirebilir. Bu bölgelerin kolonizasyonu, menenjit, ensefalit ve fetal kürtaj dahil olmak üzere insanlarda listeriosis'in en yaygın belirtilerini önler2.
L. monocytogenes'in seçilmiş alt nüfuslarının son zamanlarda kardiyak doku içinde istila etme ve çoğaltma kapasitesi gelişmiş olduğu gösterilmiştir8. Kalp tutulumunun belirtileri çeşitlidir ve endokardit ve perikarditten iletim anormallikleri9-13ile tamamlanan fulminant miyokarditlere kadar değişir. Yılda L. monocytogenes kardiyak olguların genel sayısı düşüktür, ancak enfeksiyonun bu yönü genellikle iyi tanınmadığı için tahmin edilebilir. Kalbin patojenler tarafından kolonizasyonu genellikle önceden var olan valvüler hasar veya yapay kalp kapakçıkları gibi konak yatkınlıkları gerektirir. Bununla birlikte, herhangi bir kardiyak hasar ve / veya anormallik yokluğunda enfekte hayvanların kalplerini kolonileştirme kapasiteleri ile dikkat çeken L. monocytogenes izoleleri vardır8.
Burada, canlı hayvan enfeksiyonlarının yanı sıra doku kültüründe istila tahlilleri kullanılarak enfekte hayvanlar içindeki kardiyak dokunun bakteriyel kolonizasyonunu değerlendirmek için in vitro ve in vivo yöntemler açıklanmaktadır. Bu yöntemler sadece enfekte hayvanlarda kardiyak dokuyu kolonize etme potansiyeline sahip suşları tanımlamak için değil, aynı zamanda kardiyak hücre istilasını artırmaya ve / veya kalp patolojisinde değişikliklere neden olan bakteriyel gen ürünlerinin tanımlanması için de yararlı olmalıdır. Bu yöntemler kardiyotropinin birden fazla suş arasında karşılaştırılmasına kolaylaşır. Burada açıklanan yöntemler için L. monocytogenes 10403S kardiyotropik olmayan bir suşun iyi çalışılmış bir temsilcisi olarak, klinik izolat 07PF0776 ise kardiyotropik bir suşun temsili bir örneği olarak kullanılmaktadır. Bu iki suş, in vitro kardiyak hücrelerin bakteriyel istilası ve enfekte farelerin kalplerinin kolonizasyonu için bir karşılaştırma sağlamak için seçildi vivo. İzole 07PF0776, HIV+ hastasında ölümcül aritmiye neden olan bir müdahale apsesinden kurtarılan klinik birizoledir 8. L. monocytogenes izolatları virülans potansiyellerinde değişebilir ve Listeria'nın bağışıklık baskılayıcı ve hamile kadınları enfekte etme eğilimi göz önüne alındığında, bu popülasyonlardaki kişiler farklı klinik izolatları değerlendirirken dikkatli olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>Difco</td><td>BHI Et Suyu Tabanı</td><td>237200</td><td>2 kg Beyin Kalp İnfüzyon tozu (agarsız)</td></tr><tr><td>Difco</td><td>Agar</td><td>214510</td><td>2 kg Granül Agar</td></tr><tr><td>Difco</td><td>BHI Agar</td><td>241810</td><td>2 kg Beyin Kalp İnfüzyon Tozu in vitrojen içinde %7,5 Agar LB</td></tr><tr><td></td><td>Et Suyu Tabanı</td><td>12975-084</td><td>2 kg Luria Et Suyu Baz Tozu (agarsız)</td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Glass Lameller</td><td>12-545-80</td><td>12 mm cam lameller</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>24 oyuklu Doku Kültürü Plakası</td><td>35-3047</td><td>24 kuyulu, Plazma ile işlenmiş Doku Kültürü Plakası</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>14mL Polistiren tüp</td><td>352051</td><td>14 ml Polistiren tüpler</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>96 oyuklu U-alt plaka</td><td>35-3077</td><td>Doku kültürü ile tedavi edilmemiş 96 oyuklu plaka</td></tr><tr><td>Corning</td><td>%0,05 Tripsin, 0,53 mM EDTA (1X)</td><td>25-052-CI</td><td>Doku kültürü için Tripsin EDTA'nın stok çözeltisi</td></tr><tr><td>Corning</td><td>DMEM (Yüksek glikoz, yüksek piruvat)</td> <td>15-013-CU</td><td>FBS, glutamin veya antibiyotik içermeyen DMEM ortamı</td></tr><tr><td>Corning</td><td>Pen / Strep / Glut Çözeltisi</td><td>30-009-CI</td><td>Doku kültürü için penisilin, streptomisin ve L-glutamin stok karışımı</td></tr><tr><td>Corning</td><td>Gentamisin</td><td>30-005-CR</td><td>Doku kültürü için 50 mg / ml Gentamisin stok çözeltisi</td></tr><tr><td>Cellgro (Corning)</td> <td>L-Glutamin</td><td>25005197</td><td>Stok Antibiyotiksiz L-glutamin çözeltisi</td></tr><tr><td>Denville</td><td>75cm^2 Şişe</td><td>T1225</td><td>75 cm2 doku kültürü ile muamele edilmiş şişe</td></tr><tr><td>Denville</td><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td>2013004</td><td>1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri</td></tr><tr><td>ATCC</td><td>H9c2 Kardiyak Miyoblastlar</td><td>CRL-1446</td><td>Sıçan kardiyak miyoblastları</td></tr><tr><td>Hyclone</td><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>SH30070.63</td><td>Fetal Sığır Serumu</td></tr></tbody></table>

listeria monocytogenes kullanarak enfekte farelerde kültür ve kalp kolonizasyonunda kardiyak hücrelerin bakteriyel İstilasının değerlendirilmesi

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes, immün sistemi baskılanmış hastalarda, yaşlılarda ve hamile kadınlarda ciddi invaziv enfeksiyonlara neden olabilecek gram pozitif bir fakülte içi patojendir. İnsanlarda listeriosis'in en yaygın belirtileri menenjit, ensefalit ve fetal kürtajdır. İnvaziv L. monocytogenes enfeksiyonunun önemli ama çok daha az belgelenmiş bir sekel kalbi içerir. Kardiyak hastalıktan ölüm oranı tedaviye rağmen% 35'e kadar olabilir, ancak L. monocytogenes kardiyak dokunun kolonizasyonu ve bunun sonucunda ortaya çıkan patolojileri hakkında çok az şey bilinmektedir. Ek olarak, son zamanlarda L. monocytogenes'in subpopulasyonlarının kalp dokusu içinde istila etme ve büyüme kapasitesine sahip olduğu ortaya çıktı. Bu protokol, L. monocytogenes izolatlarının kardiyotropizmini değerlendirmek için kullanılabilecek in vitro ve in vivo yöntemleri ayrıntılı olarak açıklar. Doku kültüründe H9c2 sıçan kardiyak miyoblastların enfeksiyonu ve enfekte farelerin kalplerinin bakteriyel kolonizasyonunun belirlenmesi için yöntemler sunulmaktadır. Bu yöntemler sadece enfekte hayvanlarda kardiyak dokuyu kolonize etme potansiyeline sahip suşları tanımlamak için yararlı değildir, aynı zamanda kalp hücresi istilasını artırmaya ve / veya kalp patolojislerindeki değişiklikleri yönlendirmeye yarayan bakteriyel gen ürünlerinin tanımlanmasını da kolaylaştırabilir. Bu yöntemler ayrıca birden fazla L. monocytogenes suşu arasında kardiyotropizmin doğrudan karşılaştırılmasına da neden olabilir.

L. monocytogenes'in seçilmiş izolatları, hücre kültüründe ve enfeksiyonun fare modellerinde kardiyak hücrelerin gelişmiş istilası sergiler. Şekil 1, agar ortamlarındaki süspansiyonların nokta kaplamasının ardından bakteri kolonilerinin nasıl görünebileceğine dair bir örnek göstermektedir. Bu yöntem, çok sayıda agar ortam plakası kullanmadan bir örnek içindeki CFO'ların doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Şekil 2, 10403S zorlanmasının kalp hücrelerini istila etme yetene...

Listeria monocytogenes gebelerde fetal enfeksiyonlara ve duyarlı popülasyonlarda menenjite neden olur. Bakterilerin subpopulasyonları kalp dokusunu kolonize ederek hastalarda ve laboratuvar hayvanlarında miyokarditlere neden olabilir. Burada L. monocytogenes kardiyak hücre invazyonunun in vitro ve enfekte hayvanlarda kardiyak kolonizasyonun nasıl değerlendirileceğini açıklayan bir protokol sunuyoruz.

Listeria monocytogenes Kullanarak Enfekte Farelerde Kültür ve Kalp Kolonizasyonunda Kardiyak Hücrelerin Bakteriyel İstilasının Değerlendirilmesi

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Bu prosedürün genel amacı, kalp kolonizasyonu ve kardiyak hücre invazyonunun in vivo ve in vitro modelleri kullanılarak, kardiyak hücrelerin mikrobiyal enfeksiyonunu değerlendirmek için etkili yöntemler sunmaktır. Bu işlem, öncelikle bakteri kültürlerinin büyütülmesi ve ardından bakteri hücrelerinin toplanması, yıkanması ve fosfat tamponlu salin içerisinde süspanse edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, cam lamlar üzerinde büyütülen kardiyak hücre monokatmanları bir bakteri süspansiyonu ile enfekte edilir veya bakteri süspansiyonu kuyruk veni enjeksiyonları yoluyla farelere inoküle edilir.Ardından, hücre dışı bakterileri öldürmek için kardiyak hücreler Gentamycin varlığında inkübe edilir ve ardından geri kazanım için hücre lizisi uygulanır. Bakteriler veya enfekte hayvanlar, enfeksiyondan iki ila üç gün sonra sağlık durumları açısından izlenir ve ardından hedef organların izolasyonu için sakrifiye edilir. Son olarak, hücre ve organ süspansiyonları seyreltilir ve hücreler veya hedef organlarla ilişkili canlı bakteri sayılarını belirlemek için spot plaka yöntemi kullanılarak ekilir.Nihai olarak, doku kültüründe büyütülen hücreler için kardiyak hücre invazyon verimliliğini veya hayvanlardaki kardiyak enfeksiyonun verimliliğini ve kapsamını belirlemek amacıyla agar besiyerindeki bakteriyel koloniler sayılır. Bu yöntem, farklı klinik ve çevresel izolat Listeria monocytogenes suşlarının invaziv kardiyak hastalığa yol açma potansiyelini araştırmak için kullanılabilir. Ayrıca, kardiyak dokuyu hedefleyebilen diğer mikrobiyal patojenlere de uygulanabilir veya protokol, ilgi duyulan diğer organ veya dokuları araştırmak için modifiye edilebilir. İnvazyon testi uygulanmadan bir gün önce, H9C2 hücrelerinden oluşan 24 kuyucuklu plaklar hazırlayın ve steril BHI broth'u metin protokolünde açıklandığı şekilde istenen listeria suşları ile inoküle edin.Test edilecek bakteri suşları PBS içinde süspanse edildikten sonra, 24 kuyucuklu plakadaki kuyucuklara PBS'li bakteri çözeltisinden en az 20 µL ekleyin. Örneklerin her kuyucukta eşit şekilde yayılması için plakayı hafifçe sallayın ve plakayı 37 °C'de, %95 nem ve %5 CO2 altında 45 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, biyogüvenlik kabinine geri dönün ve her kuyucuktaki medyumu vakumlu bir pipet kullanarak aspire edin.Ardından, lamelleri yıkamak için her kuyucuğa bir mililitre ısıtılmış PBS ekleyin. Son olarak, PBS vakumlu bir pipet kullanılarak kuyucuklardan aspire edilir. Daha sonra, her kuyucuğa Gentamisin içeren bir mililitre DMEM ekleyin; gentamisin sadece hücrelerin dışında kalan bakterileri öldürecektir.Plakayı inkübatöre geri yerleştirin ve bir saat daha inkübe olmasını sağlayın. Ardından, steril kabin altında, her bir lamelini kuyucuğundan almak için cımbız kullanın ve lamelleri, önceden hazırlanmış, içerisinde 1 mL steril ddh₂O bulunan 14 mL'lik tüplere yerleştirin. Kontaminasyonu önlemek için lameller arasında cımbızı etanola batırın ve alevle sterilize edin.Her bir tüpü kısa bir süre vortekslendikten sonra, her birinden bir alikot alın ve 96 kuyucuklu bir plakadaki kuyucuklara aktarın. Ardından, her bir örnek için 1:10'dan 1:1000'e kadar seri dilüsyon hazırlayın. Daha sonra, önceden ısıtılmış kuru LB plakalarına her bir dilüsyonu damlatın; damlacıklar kuruduktan sonra plakaları 37 °C'lik bir inkübatörde gece boyunca bekletin ve ertesi sabah kontrol edin.Her bir noktadaki koloni sayısını sayın ve farelere L monocytogenes inoküle etmek için değerlendirilen her bir suş için lamel başına bakteri sayısını hesaplamak amacıyla seriyi kullanın. Enjeksiyon sırasında hayvanı sabitlemek için bir hayvanı koşuma yerleştirin. Enjeksiyon bölgesini temizlemek ve kuyruk venini genişletmek için bir alkol pedi kullanın.Ardından, bir mililitrelik bir şırınga ve 27.5 gauge iğne kullanarak, farenin kuyruk venine istenen kültürden 200 microliters dikkatlice enjekte edin. Hayvanı yeni bir kafese yerleştirmeden önce, enjeksiyon sonrası oluşabilecek herhangi bir kanamayı durdurmak için kağıt havlu kullanın. Hayvanlar, biyogüvenlik kabini altındaki metin protokolüne uygun olarak 72 saate kadar süre sonra sakrifiye edildikten sonra, hayvanı bir diseksiyon bloğuna sabitleyin ve doyurmak için %70 ethanol kullanın.Abdomen ve toraks üzerinde, vajinal açıklıktan ksifoid çıkıntıya kadar uzanan ve her iki kolun aksillasına doğru ilerleyen Y şeklinde bir insizyon yapın. Deriyi geri çekin. Bacaklardaki iğneleri çıkarın ve bunları sabitlemek için kullanın.Diseksiyonu açın ve peritonyumu nazikçe kesin; bağırsakları, mideyi, karaciğeri ve dalağı açığa çıkarın. Karaciğerin üst kısmındaki hepatik veni ve koronal ligamenti kesin; karaciğerin altında bulunan, ince bağırsağın ilk bölümüne ve sırt kas yapısına bağlanan ek ligamentleri uzaklaştırın. Karaciğeri, 50 mililitrelik bir tüp içindeki beş mililitre steril DD H2O içine yerleştirin.Ardından, dalağın damar yapılarını ve bağlarını kesin ve dalağı ayırıp beş mililitre DDH two o içeren ayrı bir tüpe yerleştirin. Şimdi diyaframı bulun ve toraksı görüntülemek için göğüs kafesi boyunca nazikçe kesin; toraksı açmak, kalbi ve akciğerleri ortaya çıkarmak için ksifoid çıkıntı ve sternum boyunca boyuna kadar kesin. Pens kullanarak kalbi apeksinden nazikçe kavrayın ve aorta ile pulmoner damarlarda gerginlik oluşturmak için yukarı kaldırın.Ardından, kalbi serbest bırakmak için damarları kesin ve kalbi ayrı bir su tüpüne yerleştirin. Metin protokolüne uygun olarak bir homojenizatör hazırladıktan sonra, bir karaciğeri en az iki dakika boyunca veya organın görünür kısımları kalmayana kadar homojenize edin. Prob üzerindeki büyük kalıntıları temizlemek için cımbız kullanın.Tüm organ örnekleri homojenize edildikten sonra, karaciğer ve dalak örnekleri için 1/10'dan 1/10.000'e kadar, kalp örnekleri için ise 1/10'dan 1/1000'e kadar seri dilüsyonlar hazırlayın; dilüsyonları önceden ısıtılmış LB agar plaklarına ekleyin. Organların yeterince enfekte olduğunu doğrulamak için seyreltilmemiş örnekler ayrı plakalara ekilebilir. Plakalar kuruduktan sonra, plakaları 37 °C'deki inkübatöre yerleştirin. Seyreltilmiş örneklerin bulunduğu 96 kuyucuklu plakaları sarmak için parafilm kullanın ve ertesi gün -80 °C dondurucuya yerleştirin.Koloni sayısını belirleyin ve organ başına düşen toplam bakteri sayısını hesaplamak için seyreltmeleri kullanın. Burada, 1 0 4 0 3 s suşunun kalp hücrelerine girme yeteneğini 07 PF 0 7 7 6 suşu ile karşılaştıran doku kültürü tabanlı bir analiz örneği gösterilmektedir; 07 PF 0 7 7 6 suşu iki kattan fazla sonuç vermiştir. Gentamisin uygulamasının ardından, 1 0 4 0 3 s ile enfekte edilen hücrelerle karşılaştırıldığında, enfekte H nine C two kardiyak hücrelerinden bakteriyel CFU'lar geri kazanılmıştır.Bu şekil, enfeksiyondan üç gün sonra enfekte farelerin karaciğer, dalak ve kalplerinden bakterilerin geri kazanımını göstermektedir; atropic suş zero seven PF 0 7 7 6 veya suş 1 0 4 0 3 s ile enfeksiyon, enfekte farelerin karaciğer ve dalaklarından geri kazanılan benzer bakteri sayılarıyla sonuçlanır. Ancak, zero seven PF 0 7 7 6 ile enfekte edilen farelerin kalbinden tespit edilebilir sayıda bakteri elde edilme olasılığı daha yüksektir ve bu organda daha yüksek bakteri yükleri sergilerler. Bu prosedürün ardından, bakteriyel hücreden hücreye yayılımın ve doku tek tabakalarının etkinliği veya enfeksiyon bölgelerine immün hücre katılımının dinamikleri gibi ek soruları yanıtlamak için floresan tabanlı mikroskopi ve organ histolojisi gibi diğer yöntemler kullanılabilir.

assessing-bacterial-invasion-cardiac-cells-culture-heart-colonization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Listeria monocytogenes farelerde bağışıklık yanıtlarını ve genetik yatkınlık bakterilerin hücre içi eğitim için bir model organizmadır. Bu yöntem, bakteri yükü ölçmek ve Listeria enfeksiyonu nedeniyle bağışıklık hücreleri değişiklikleri belirlemek için FACS analiz için farelerin karaciğer ve dalak tek hücre süspansiyonları oluşturmak için bir olanak sağlar.

Ile Enfekte Fare Bakteriyel Yük ve Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Listeria monocytogenes</em

Kaynak: McMullen, P. D., Freitag, N. E. Listeria monocytogenes kullanılarak enfekte farelerde kültürde kardiyak hücrelerin bakteriyel invaziyası ve kalp kolonizasyonunun değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2015)Bu video, bir farenin kuyruk damarına Listeria monocytogenes'in enjekte edilip sistemik enfeksiyon oluşturulmasını gösteriyor. Bakteriyel dolaşımı, organ kolonizasyonu ve dokuyu homojenleştirerek, seri seyreltme ve kaplama yoluyla kalpteki bakteri yükünün nicelendirilmesini gösterir.

Listeria monocytogenes'in kuyruk venine enjeksiyonu sonrası fare kalbinde bakteriyel yükün nicelendirilmesi

Bu video, enfeksiyon yayılımını incelemek için plasental dokularda bir enfeksiyon modeli oluşturma yöntemini göstermektedir. Bir ex vivo plasental organ kültürü, fakültatif bir hücre içi parazit olan Listeria monocytogenes ile enfekte olur. Bakteriler, plasenta dokusuna girmek için ekstravillöz trofoblastları (EVT'ler) istila eder ve daha sonra hücreden hücreye yayılma yoluyla diğer hücrelere yayılır.

Ex Vivo Organ Kültüründe Bakteriyel Enfeksiyon Modeli Oluşturma Tekniği

Bu video, Listeria monocytogenes ile enfekte olmuş perfüze fare beyninden enfektif bakteri yükünün niceliğinin ölçülmesini göstermektedir.

Listeria monocytogenes Enfeksiyonunu Takiben Bir Fare Beyninde Bakteriyel Kolonizasyonun Değerlendirilmesi

Bu kağıt kullanılarak farenin oral enfeksiyonu için yeni bir yöntemi...

Sözlü İletim<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Kirlenmiş Gıda Yutma ile Farelerde

Listeria monocytogenes sıklıkla hücre içi asalaklığın çalışma için büyük bir model olarak kullanılan bir Gram pozitif bakteri patojendir. Geç L. Görüntüleme küçük müdahale edici RNA ekranlar bağlamında enfeksiyon aşamaları monocytogenes, hedef konakçı hücrelerin bakteriyel bir enfeksiyon için gerekli hücresel yolların küresel çalışma sağlar.

Bakteriyel Patojen Hücresel Enfeksiyon Soruşturma inlc salgılanmasına Görüntüleme<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Streptococcus pneumoniae, kalpte ayrık pürülan olmayan mikroskobik lezyonlar oluşturur. Kardiyak mikrolezyon oluşumunun bir murin modeli için protokol ana hatlarıyla belirtilmiştir. Mikroskopi kullanılarak mikrolezyon görselleştirmesi, erken ve geç mikrolezyonlar arasında ayrım ve nekahat dönemindeki hayvanların kalplerinde kardiyak yeniden şekillenmeyi tespit etme yöntemleri hakkında talimat verilmektedir.

Görselleştirme<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Kalp Microlesions ve sonraki Kardiyak Tadilat içinde

Bu protokol, Listeria monocytogenes EGD suşu ile (L. monocytogenes) C57BL / 6J fareleri aşılamak için ve doğal öldürücü (NK) hücreleri, doğal katil T (NKT) hücreler tarafından interferon-y (IFN-γ) tepkilerini ölçmek açıklamaktadır ve adaptif T sonrası enfeksiyon lenfosit. Bu protokol ayrıca patojen modifiye LD 50 dozu ile enfeksiyondan sonra farelerde hayatta kalma çalışmaları yürütmek açıklamaktadır.

Deneysel Enfeksiyon<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Ana İnterferon-γ Yanıtları incelenmesi için Bir Model Olarak

Bir fare modeli enterohemorrhagic bioluminescence etiketli bakteri kullanarak E. coli (EHEC) kolonizasyon için detaylı bir protokol sunulmuştur. Kollarındaki bu bakteriler tarafından bir non-invaziv görüntüleme sistemi içinde canlı hayvan vivo içinde tespiti geçerli anlayışımız EHEC kolonizasyon ilerletebilirsiniz.

Non-invaziv Vivo içinde Bioluminescence sistemi tarafından fare konak Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonizasyon algılama

Enfeksiyon sırasında Listeria Monositogenez beyin kolonize etmek kan - beyin bariyerini geçiş yapabiliyor. Bu protokol için organlara enfeksiyon farelerin takip bakteriyel kolonizasyon değerlendirmek nasıl gösterir. Beyin parankimi bakteriyel numaraları belirli tespiti için bütün organ perfüzyon gerçekleştirmek için bir yordam sağlanmıştır.

Listeria Monositogenez Enfeksiyon beyin

Biz faktörler ana bilgisayar kodlama faaliyetlerini analiz için kullanılan her iki tüp bebek ve içinde vivo enfeksiyonu deneyleri tarif.

Bakteriyel Pathogen sonda için hücresel ve Organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma

Öğrenin, Listeria monocytogenes ile kardiyak hücre istilasını in vitro ve in vivo modeller kullanarak değerlendirme yöntemini. Bu protokol, enfeksiyon mekanizmalarını anlamak ve tedavi stratejileri geliştirmek için araştırmacılara güvenilir bir yaklaşım sunar.

Listeria monocytogenes Kullanarak Enfekte Farelerde Kültür ve Kalp Kolonizasyonunda Kardiyak Hücrelerin Bakteriyel İstilasının Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal

Listeria monocytogenes Kullanarak Enfekte Farelerde Kültür ve Kalp Kolonizasyonunda Kardiyak Hücrelerin Bakteriyel İstilasının Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet