Name: Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Öğrenin membran protein topolojisini belirlemeyi canlı hücrelerde GFP kimeraları ve seçici proteaz duyarlılığı kullanarak. Bu yöntem integral membran proteinlerinin yönünü ve işlevini güvenilir şekilde analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Görüntü yakalama ve analizindeki yardımları ve rehberlikleri için CMS'deki Kalsiyum Görüntüleme Çekirdek Tesisine teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından HL102208 ve N.A.B. tarafından desteklenmiştir. Bu yaklaşıma ilk olarak NIH'de Holger Lorenz ve Jennifer Lippincott-Schwartz öncülük etti.

Floresan Protein Kimeralar 1. Nesil ve Doğrulama <ol><li> Standart rekombinant DNA stratejileri 13 ile ilgili proteinin amino ya da karboksil uçları da yeşil floresan protein (GFP) ekleyin. NOT: Bu yaygın olarak GFP kullanılmış olsa da, bu mavi floresan proteinin (CFP), sarı floresan proteini (YFP) gibi diğer varyantlar DsRed ve MCherry kullanılabilecektir. Fluorofor katlama verimliliği, parlaklık ve fotostabilite gelişmeler sürekli olarak yapılıyor ve araştırmacılar yeni nesil yapıları kendilerini boşuna gerekir. <ol><li> Doğru DNA sekansına edin ve GFP grup, ilgi konusu proteini ile çerçeve içinde olduğundan emin olun. Standart rekombinant DNA stratejileri 21 kullanılarak sıralamayı yapın. NOT: Birçok kurum araştırmacı ek bilgi için irtibat için teşvik edilir çekirdek DNA imkanları var. </li><li> Tek ya da çift geçişli membran proteinleri için, oluşturmakfüzyon proteinlerinin 19 amino ve karboksil terminal versiyonları. </li><li> Çok kapsayan proteinler için varsayılan extramembrane döngüler içinde GFP gibi terminaline yerleştirin. Protein ER translokon geçtikten sonra sinyal diziler genellikle proteoliz ile ayrılmaktadır hedef proteinin amino terminaline bağlı floresan füzyon proteini ile transmembran kimeralar üreten özel bir dikkat. </li><li> Sağlam bir amino terminal etiketli floresan proteini içeren olgun bir proteini üretmek üzere kaybolmamış sinyal dizileri söz konusu olduğunda, yarılma sitesi floresan füzyon proteini distalinde yerleştirin. Kimeralarının 21 nesil için standart rekombinant DNA stratejileri istihdam. </li></ol></li><li> Ilgi hücre hattı yeterli uygun lokalize floresan sinyal varlığını belirler. <ol><li> ÖDENEK altında GFP içsel floresan kullanarak Epifloresans mikroskobu altında hücreleri gözlemleyinFiltre set koşulları yedik. 510-560 nm kapsayacak GFP filtre setleri için, doğru filtreler kullanılan fluorophore için kullanılan olduğunu doğrulamaktadır. NOT: gözle değerlendirme sinyali bulunduğu hücresel yapı kolayca arka plan üzerinde giderilmiş olduğunu yeterince güçlü bir sinyal sağlar zaman yeterli sinyal elde edilir. Buna ek olarak, GFP protein boyama modeli, uygun bir organele için işaretler ile tutarlı ve ana etiketlenmemiş proteinin ya da tercihen aynı olmalıdır. </li></ol></li><li> Bir sabit veya geçici transfeksiyon yaklaşımı proteini değerlendirilen dayalı kullanılacaktır belirleyin. NOT: Kararlı transfektanları genellikle geçici sistemlere göre daha ifade düzeyi düşük göze. Geçici ifade (proteine ​​bağlı olarak ~ 5-24 saat sonra transfeksiyon) protein ve artış sinyal yoğunluğunun yüksek düzeyde ekspresyonunu elde edilir, ancak, aynı zamanda, örneğin, protein AGGR gibi aşın eserler yol açabilirhatalı hücre içi lokalizasyonu giden egation veya protein hedefleme yollarının doygunluk,. </li></ol> Hücreler ve Hücre Kültürü 2. Transfeksiyon NOT: Birçok hücre, HEK293, HeLa, COS-7 ve CHO hücreleri 14 de dahil olmak üzere, FPP analizine tabi tutulabilirler. Aşağıdaki açıklama Hek293 hücreleri membran proteinleri ifade dayanmaktadır. <ol><li> Büyüme, insan embriyonik böbrek hücreleri (HEK293) uyumlu tekli katman olarak muhafaza 6 37 ° C&#39;de,% 5 fetal sığır serumu (FBS),% 1 sodyum piruvat ve 250 ug / ml penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Değiştirilmiş Kartal Ortamı (DMEM), ml % 5 CO2 ile soğutuldu. Laminer akış doku kültürü kaputu hücreleri ile tüm çalışmaları gerçekleştirin. T-75 balonuna% 80 konfluent ~ kadar kültür ortamı içinde büyür. </li><li> Transien oluşturmak için lipid, vira- veya elektroporasyon-tabanlı teknolojiler de dahil olmak üzere herhangi bir standart, yüksek verimlilik, düşük toksisite transfeksiyon yöntemi kullanılarak Transfect hücrelerit veya kalıcı tanımlama. Tipik olarak, 1 x 10 6 hücre başına plazmid DNA 2 ug tekrarlanabilir protein ifadesini sağlar. CO2 sahip doku kültürü kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de, uygun bir doku kültürü ortamı içinde 5-48 saat boyunca hücrelerin muhafaza edin. </li><li> Üreticinin protokolüne uygun olarak uygun bir filtre kümesi kullanılarak GFP iç floresan sinyali kullanılarak, epifloresans mikroskobu kullanılarak GFP füzyon proteininin sentezlenmesi için hücre izleyin. Floresan sinyali genellikle transfeksiyonunun takip 24-72 saat içinde maksimuma ulaşır. Floresans sinyali bir maksimum değere ulaştığı zaman hücreler kullanın. Ilgili proteinin ya da GFP kısmı ya karşı antikorlar kullanılarak immünolojik leke analiziyle protein ekspresyonu seviyesini takip edin. </li><li> Kaplanmış lamelleri deneysel analiz plaka hücreleri için. Canlı hücre yapılandırması veya aşağıdaki tespit altında ya görüntüle ve mikroskopi slaytlar monte. Plaka hücreler 24-48 saat içerisinde 60% -80% izdiham elde etmek için. <ol><li> Bütün yüzeyi kaplanana kadar poli-lizin çözeltisi (0.1 mg / ml) ile kaplayın lamelleri. 37 ° C&#39;de bir hücre kültürü kuluçka makinesi içinde, 60 dakika, ardından oda sıcaklığında bir mor ötesi ışık altında 30 dakika boyunca inkübe edin. Aşırı poli-lisin çıkarın ve PBS 3 kez lamelleri durulayın. </li><li> Seçenek olarak ise, yağ daldırma hedefleri ile doğrudan görüntülenmesine olanak vermek üzere bir optik cam alt hücre kültürü plakaları kapsayan bir bölmeli kapak camı üzerine hücreler plaka. Gerçek mikroskopi kurulum araştırmacı mevcut ekipman bağlıdır, ancak hızlı çözüm değişiklikleri yeteneğine sahip olmalıdır. Hücre tipi ve hücre şekli ile ilgili olarak, hücreler, FPP deneyinde zamanında yaklaşık% 60-90 konfluent olmalıdır. </li></ol></li></ol> 3. Floresan Mikroskopi Kurulumu <ol><li> Böyle bir 60X, 1.42 NA immersiyon yağı hedefi olarak maksimum sinyal toplama ve uzamsal çözünürlük, yüksek bir sayısal diyafram (NA) yağ daldırma hedefi kullanın. Inci kullanıne fluorophores uyarmak için lazerler aşağıdaki: argon gazı 488 nm (GFP ve YFP) ve 561 diyot (RFP, mCherry). </li><li> Her yapı için görüntülerin optimal pozlama, kazanç ve yakalama oranını belirleyin. (Adım 7.1.2 bakınız) photobleaching en aza indirmek için lazer yoğunluğu ve maruziyet süresi ayarlayın. </li><li> (Örneğin, bir membran proteini markeri ile uyum içinde membran geçirgenliği için çözünür bir belirteci), uygun bir filtre tercih birden florofor ile çalışmaları için sinyal yansesi en aza indirmek ve sinyal-gürültü oranı en üst düzeye ayarlar. </li></ol> 4. Plazma membran geçirgenliği için optimal şartları oluşturulması <ol><li> (Örneğin, EGFP DsRed), sadece çözünür floresan proteinleri eksprese eden hücrelerden elde edilen hücre kültür ortamı çıkarın. KHM tampon hücreleri, 3 kez (1 dk) yıkayın (110 mM potasyum asetat, 3 mM MgCl2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7.2). Oda sıcaklığında hücreleri ile deneyler ve reaktifler yapın. </li><li> Yer hücreleri on lamelleri bir floresan mikroskop sahnede KHM tamponunda (adım 2.4) ve kontrol &#39;olmayan geçirgenleştirildi&#39; sahne temsil ilk görüntü, toplamak. </li><li> Seçici olarak, plazma membran geçirgenliği için, hücrelere KHM tamponu digitonin (30 uM) ilave edin. 10-60 saniye için 5 ml / dakikalık bir hızla tampon (tampon + digitonin) ile hücrelerin serpmek. </li><li> Yavaş yavaş digitonin konsantrasyonu artırarak optimum digitonin konsantrasyonunu belirlemek. dijitonin uygulama 10-60 saniye içinde çözünen EGFP floresan sinyalinin tamamen kaybı olduğunda uygun dijitonin konsantrasyon elde edilir. Birçok hücre için 10-50 uM digitonin uygulama hücre membran geçirgenliği için yeterli değildir. <ol><li> Için tüm uygulamalar digitonin mümkün olan en düşük konsantrasyon kullanın. Permeabilize arka plan sinyali için geçirgenliği digitonin sonra görüntü Toplama. </li></ol></li><li> Ilgi GFP proteini kimera zar olduğunu doğrulayınplazma zarı 16 digitonin permeabilization aşağıdaki floresan sinyalinin hücresel tutma onaylayarak bütünleşmiş. <ol><li> Bir organel özel floresan proteini 23 Express. Mitokondriyal proteinler, örneğin bu bağlamda 16, pDsRed2-Mito vektör iyi çalışır. Adım 2.1 açıklandığı gibi uygun ifade koşullarını belirleyin. </li><li> Hücre içi organellerin morfoloji digitonin için uzun süreli (60 dk) maruz boyunca sabit kalmasını digitonin konsantrasyon sağlayarak istihdam hücre tipi için uygun olduğundan emin olun. NOT: Bu tür lizozomlardan gibi çeşitli hücresel bölmeleri karşı antikorlar kullanarak Kullanım standart immunofloresan mikroskopi protokolleri, (örneğin, LAMP1), Golgi (örneğin, TGN38), endoplazmik retikulum (örneğin, calnexin), endozomlar (örneğin, Rab5), mitokondri (örn, sitokrom c) işlendi. Hücre içi organel morfolojisi / bütünlük değişiklikleri dramatik ove iser, 60 dakika, bu dijitonin konsantrasyonu çok yüksek olduğu muhtemeldir ve dijitonin konsantrasyonu ve / veya maruz kalma süresinde bir azalma gereklidir. NOT: Digitonin Teneffüs ve cilt ile temasında toksiktir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyin. </li></ol></li></ol> Floresan Protein 5. Proteaz İle Muamele <ol><li> Proteaz ekleyin (proteinaz K; KHM tamponu içinde 50 ug / ml) KHM tampon hücreleri yıkanır ve doğrudan hücreler üzerine. 5 ml sürekli hazırlama banyosu yerçekimi vasıtasıyla beslenmesini perfüzyon sistemi kullanılarak / dakikalık bir akış hızında hücreleri serpmek. <ol><li> 50 ml &#39;lik şırıngaya saklayın çözeltiler ve polietilen boru banyosu (5 ml / dk akış oranı) tek bir çıkış ile bir manifolda bağımsız rezervuar bağlı. Sabit (0.5 mi) banyo hacmi korumak ve el ile perfüzyon rezervuar arasında geçiş yaparak çözelti değişimi elde etmek için bir emme pipet yerleştirin. </li></ol></li><li> Flor belirlemek için görüntüleri toplayınescent sinyal devam ederse veya alçaltır. 30-60 saniye boyunca ilk sinyal yoğunluğunun&gt;% 90 bir kayıp GFP proteini kimera proteolitik bozulması ile tutarlıdır (Örnek Sonuçlar bakınız). </li><li> Hiçbir sinyal bozulması proteinaz K ile görülürse, bu tür kayıp beklenen zaman, KHM tamponunda tripsin (4-8 mM) ile proteinaz K çözümü değiştirin. Gerekirse, proteinaz K, tripsin bir karışımını kullanmaktadır. Proteaz aktivitesini bastırmak için bir ihtiyaç vardır. </li></ol> Dış Etki Plazma Membran Proteinleri 6. Alternatif Yaklaşım <ol><li> Plazma membran proteinleri için, geçirgenliği digitonin önce dış floresan proteinleri kimeralar için tahlil yapmak. KHM tamponu lamelleri hücreleri (5 mi / dakika x 3 dakika) yıkanır, ve ön-proteaz tedavisi için bir görüntü ve Aşama 7&#39;deki gibi ön-proteaz floresan sinyalini ölçmek. </li><li> Proteaz hücreleri Açığa (proteinaz K, 50 ug / ml veya mM KHM tamponunda 4-8 tripsin) tKHM ortam ihtiva eden bir proteaz (akış hızı 5 ml / dak) ile hücrelerin perfüze digitonin arasında da yokluğu. Sinyal kaybolur ya da ne kadar sinyal devam nasıl hızlı bir şekilde belirlemek için, floresan protein görüntüleri toplayın. </li><li> Dijitonin geçirgenliği önce,% 10 serum (FBS) ihtiva eden hücre kültür ortamı içinde hücreleri üç kez (1 dk) yıkayarak, bunların hepsi proteaz etkinliğe söndürün. </li><li> 2 dakika boyunca KHM tamponu (5 ml / dk akış oranı) ile perfüze hücreleri yıkayın. Bir ön-permeabilizasyon görüntü elde. Aşama 4&#39;te tarif edildiği gibi, hücre membran geçirgenliği. </li><li> Aşama 5&#39;te tarif edildiği gibi proteaz ilave edildikten sonra görüntü Toplama. </li></ol> 7. Görüntü Analizi <ol><li> Flüoresan sinyal kaybı gerçek zamanlı olarak izlenmesini mümkün kılan &quot;canlı hücre&quot; kayıt kapasitesine sahip bir ters mikroskop kullanın. Sürekli izleme için, aynı parametreler (pozlama süresi, kazanç, lazer yoğunluğu, vb) kullanır. <ol><li> Exper belirleyinKontrol koşulları altında (yani, KBH sadece tampon) altında ilgi GFP protein floresan sinyalini gözlemlenerek imental parametreleri. 10-20 dakikalık bir süre boyunca sinyal yoğunluğu kayda değer kaybı olmasını sağlamak için bilgisayar odaklı mikroskop kazanç, lazer yoğunluğu ve maruziyet süresi ayarlarını ayarlayın. NOT: Sinyal yoğunluğu bir mutlak değer değil, ama her PI mevcut mikroskop sistemi ve ayarlar dayanmaktadır. Nispi flüoresan yoğunluğundaki değişiklik izler. </li></ol></li><li> Alternatif olarak, proteaz tarafından takip digitonin set zaman noktalarında hücreleri tedavi ve önceki görüntüleme için lamelleri montaj hücreleri düzeltmek. Zaman noktaları ampirik adım 4 ve ilk soruşturma için 5. prosedürleri takip belirleyin, digitonin veya proteaz 0, 30, 60, 120 ve 300 sn sonrası ek başlayacak. <ol><li> Hücreleri (oda sıcaklığında 20 dakika) tam th daldırmak için sabitleyici yeterli bir miktarını (PBS içerisinde% 3.7 paraformaldehit) kullanarak saptamakE hücreler. </li><li> PBS, 20 mM glisin ile (3 x 5 dk) içeren hücrelerin durulanarak artık paraformaldehid söndürüldü. </li><li> Lamel fazla sıvıyı çıkarılması ve bir cam mikroskop 50 ul montaj ortamına lamel tersini Mount lamelleri görüntüleme için slaytlar. Slaytlar görüntüleme gecede önce kurumasını bekleyin. </li></ol></li><li> Floresan mikroskop görüntüleri toplayın bilgisayar kontrollü floresan mikroskop video görüntü yakalama işlevini kullanarak (uygun filtreler altında flüoroforun kullanılan uyumlu setleri). </li><li> İnkübasyon durumunun bir fonksiyonu olarak flüoresan sinyal yoğunluklarını ölçmek. Tek bir hücreyi çevreleyen faiz (ROI) bir bölgede ortalama piksel yoğunluğu edinin. </li></ol>

<ol><li>Sevier, C. S., Kaiser, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+transfer+of+disulphide+bonds+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation and transfer of disulphide bonds in living cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 836-847 (2002).</li>
<li>Brodsky, J. L., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+and+quality+control+in+the+endoplasmic+reticulum%3A+Recent+lessons+from+yeast+and+mammalian+cell+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+In+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum: Recent lessons from yeast and mammalian cell systems.</a> Current Opinion In Cell Biology. 23, 464-475 (2011).</li>
<li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+displaying+the+hydropathic+character+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method for displaying the hydropathic character of a protein.</a> J Mol Biol. 157, 105-132 (1982).</li>
<li>Ott, C. M., Lingappa, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+protein+biosynthesis%3A+why+topology+is+hard+to+predict%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Integral membrane protein biosynthesis: why topology is hard to predict.</a> J Cell Sci. 115, 2003-2009 (2002).</li>
<li>Traxler, B., Boyd, D., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+topological+analysis+of+integral+cytoplasmic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">The topological analysis of integral cytoplasmic membrane proteins.</a> The Journal of Membrane Biology. 132, 1-11 (1993).</li>
<li>Cserzo, M., Wallin, E., Simon, I., von Heijne, G., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+transmembrane+alpha-helices+in+prokaryotic+membrane+proteins%3A+the+dense+alignment+surface+method%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method.</a> Protein Eng. 10, 673-676 (1997).</li>
<li>Geest, M., Lolkema, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+topology+and+insertion+of+membrane+proteins%3A+search+for+topogenic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Membrane topology and insertion of membrane proteins: search for topogenic signals.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 13-33 (2000).</li>
<li>Bogdanov, M., Zhang, W., Xie, J., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+protein+topology+mapping+by+the+substituted+cysteine+accessibility+method+%28SCAM%28TM%29%29%3A+application+to+lipid-specific+membrane+protein+topogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAM(TM)): application to lipid-specific membrane protein topogenesis.</a> Methods. 36, 148-171 (2005).</li>
<li>Chang, X. B., Hou, Y. X., Jensen, T. J., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+membrane+topology+by+glycosylation+site+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator membrane topology by glycosylation site insertion.</a> J Biol Chem. 269, 18572-18575 (1994).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li>
<li>Zamyatnin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li>
<li>Lorenz, H., Hailey, D. W., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+protease+protection+of+GFP+chimeras+to+reveal+protein+topology+and+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization.</a> Nat Methods. 3, 205-210 (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning.+a+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning. a Laboratory Manual</a>. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).</li>
<li>Shah, K., McCormack, C. E., Bradbury, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+you+know+the+sex+of+your+cells%3F+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Do you know the sex of your cells? American journal of physiology.</a> Cell Physiology. 306, C3-C18 (2014).</li>
<li>Wang, H., Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+transmembrane+Ser%2FThr+kinase+complexes+with+protein+phosphatase-1+and+inhibitor-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel transmembrane Ser/Thr kinase complexes with protein phosphatase-1 and inhibitor-2.</a> J Biol Chem. 277, 49605-49612 (2002).</li>
<li>Nixon, A., Jia, Y., White, C., Bradbury, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+protease+protection+reveals+the+topology+of+the+integral+membrane+protein+Lemur+Tyrosine+Kinase+2+%28LMTK2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence protease protection reveals the topology of the integral membrane protein Lemur Tyrosine Kinase 2 (LMTK2).</a> Am J Physiol. 304 (2), C164-C169 (2012).</li>
<li>Tagawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+trafficking+of+caveolar+domains+in+the+cell%3A+caveolae+as+stable%2C+cargo-triggered%2C+vesicular+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly and trafficking of caveolar domains in the cell: caveolae as stable, cargo-triggered, vesicular transporters.</a> J Cell Biol. 170, 769-779 (2005).</li>
<li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+specifying+subunit+VIII+of+human+cytochrome+c+oxidase+is+localized+to+chromosome+11+and+is+expressed+in+both+muscle+and+non-muscle+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues.</a> J Biol Chem. 264, 10595-10600 (1989).</li>
<li>Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+green+fluorescent+protein+as+a+tool+for+visualizing+subcellular+organelles+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells.</a> Curr Biol. 5, 635-642 (1995).</li>
<li>Lorenz, H., Windl, O., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+phenotyping+of+secretory+and+nuclear+prion+proteins+associated+with+inherited+prion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cellular phenotyping of secretory and nuclear prion proteins associated with inherited prion diseases.</a> J Biol Chem. 277, 8508-8516 (2002).</li>
<li>Ben-Gedalya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin-A-induced+prion+protein+aggresomes+are+dynamic+quality-control+cellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin-A-induced prion protein aggresomes are dynamic quality-control cellular compartments.</a> J Cell Sci. 124, 1891-1902 (2011).</li>
<li>Rogers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+of+the+Syrian+hamster+prion+protein+utilizing+chimeric+and+mutant+genes+in+a+vaccinia+virus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping of the Syrian hamster prion protein utilizing chimeric and mutant genes in a vaccinia virus expression system.</a> J Immunol. 147, 3568-3574 (1991).</li>
<li>Lisenbee, C. S., Karnik, S. K., Trelease, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+mislocalization+of+a+tail-anchored+GFP+redefines+the+identity+of+peroxisomal+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Overexpression and mislocalization of a tail-anchored GFP redefines the identity of peroxisomal ER.</a> Traffic. 4, 491-501 (2003).</li>
<li>Brandee, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mislocalization+and+degradation+of+human+P23H-Rhodopsin-GFP+in+knockin+mouse+model+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Mislocalization and degradation of human P23H-Rhodopsin-GFP in knockin mouse model of retinitis pigmentosa.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 9728-9736 (2011).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Membran proteinlerinin doğru yönlendirme ve topoloji bunların uygun fonksiyonu için gereklidir. Membran proteini topoloji anlama önemine rağmen, bu veriler tamamen yoksun olduğu için birçok protein vardır. SOP kolay ve verimli bir membran proteini topoloji belirleme şekli ve en laboratuvarlar tarafından yapılabilir bir sağlar. FPP yaklaşımı, protein topoloji belirlemek için önceki yöntemlere göre önemli avantajlar tanıyor. Örnek olarak, ilgili 31 proteinin tekrar çeşitli etki yönlendirilmiş çok sayıda antikor...

plazma zarları, yanı sıra çok sayıda hücre içi zarlar, iki sulu bölmelerini ayıran engel olarak hizmet vermektedir. Plazma membranı durumunda, ayırma dış tarafı arasında ve hücrenin içinde olduğu; hücre içi organellere için sitoplazma ve organel lümen arasında. Örneğin, endoplazmik retikulum (ER) membran ortamı 1 azaltıcı sitozolik ER lümeninde bir oksitleyici ortam ayırır. Zar proteinleri, ER-bağlantılı, ribozomlar üzerinde sentezlendiği ve ER zar 2 içinde son topoloji elde edilir. proteinler için uygun membran yönelim ve topoloji edinimi normal fonksiyonu için önemlidir. Doğru topolojisi bağlanma partnerleri ile etkileşim zar proteinlerinin uygun etki sağlayan, kritik post-translasyonel modifikasyonlar meydana sağlar ve plazma zar proteinleri durumunda, hücre ile karşılıklı etkileşim ve t yanıt sağlarçevresini o. Tam bir membran proteinin fonksiyonunu değerlendirmek için, bu protein, bulunduğu olan membran, örneğin, zar topolojisine göre yönlendirilmiştir nasıl açıkça şarttır. Membran proteinleri farmakolojik hedefler 3 çoğunluğunu oluşturan bu yana bir protein yüzey yönleri farklı ortamlara maruz kalan bir membran proteini ve hangi topoloji anlamak temel bilimsel bilginin edinimi, ek olarak klinik etkileri işaretlenmiş. Yakın zamana kadar, zaman ve para önemli yatırım gerektirmiştir veya gelmek zor olan reaktifler gerektirmiştir membran proteini topoloji belirleme yaklaşımları. Hem deneysel ve silico yaklaşımlar plazma zarı içinde bulunan proteinlerin membran topolojisini belirlemek için kullanılmıştır. Bireyler değerlendirilir hidrofobisitesine göre membranlı etki ilk tahminleri yanaÇift amino asitler 3, çok sayıda öngörü algoritmalar artık internette mevcuttur ve sadece proteinin amino asit dizisinin bilgisi gerektirir. Ancak, varsayımlar genellikle topoloji 4,5 yanlış atamaları neden böyle modelleme programları, varsayımlara merkezi vardır. Bu bilgisayar tabanlı tahminler geçici zar kapsayan bölgeleri atayabilirsiniz Dahası, onlar her zaman amino ya da proteinlerin karboksi terminali organel lümen veya hücre dış, sitoplazmasında olup olmadığını belirlemek değil. Hesaplama gücü artmış, ve hatta makine-öğrenme algoritmaları 6, bu tür verilerin kullanımı hala bir modeldir ve deneysel elde edilen veriler kullanılarak valide edilmelidir. Membran topoloji doğrudan deneysel belirlenmesi onların imünoreaktivitenin değerlendirilmesi öncesi ve hücre geçirgenleştirmeden sonra yapılmış protein, dağılmış bilinen epitoplarıyla monoklonal antikor panelleri kullanılarak üstlenilmiştir. Buyaklaşım ilgili protein için mevcut olmayabilir antikorlar, bir dizi gereklidir. Alternatif bir strateji yeniden öncesi ve membran geçirgenleştirmeden sonra imünoreaktivite belirlenmesi ardından protein boyunca çeşitli yerlerde, içine myc veya hemagglutinin (HA) gibi epitop etiketleri mühendisi olduğunu. Imünojenik etiketleri ek olarak, ve bu sistein tarama gibi kimyasal değişiklikler (alkalin fosfataz, P-galaktosidaz β, β-laktamaz ya da dahil olmak üzere), enzimatik etiketler, tüm zar proteini topoloji 7,8 belirlemek için kullanılmıştır. Plazma zar proteinlerinin topolojik haritalaması için kullanılan bir başka yöntem de epitop etiketleri için biraz farklı bir yaklaşıma dayanmaktadır. Bu yöntemde etiket dizisi N-bağlantılı glikosilasyon konsensüs sekansı NXS / T&#39;dir. Bu tür bir sekans biyosentetik yolun bir luminal karşı etiketin varlığının lümeninde var olduğunda glikosilasyon yalnızca oluşur yanasitozolik bölmesi kolayca SDS-PAGE jelleri üzerinde bir kitle vardiya olarak görülmektedir. Böyle bir yaklaşım, multispanning iyon kanalının CFTR 9 uygulanmıştır. Tüm bu yaklaşımlar kullanılmıştır olmakla birlikte, bunların hepsi oluşturmak ve çeşitli yapıları sıralamak için moleküler biyoloji önemli yatırımlar gerektiren açıktır. Hücre içi organellere içinde bulunan zar proteinleri ile ilgili topolojik bilgileri belirlemek için daha zor olduğu kanıtlanmıştır. floresan tabanlı teknolojilerin uygulanması, ancak zar topoloji çok basit belirlenmesi yaptı. bimoleküler floresan komplementasyon tekniği (BiFC) o proteinin 10 floresan özelliklerinin korunması, bir fluoresan proteininin iki floresan olmayan fragmanlar arasında etkileşimine dayanmaktadır. Ilk olarak, in vivo 10 protein-protein etkileşimlerini belirlemek için tarif edilmiş olmasına rağmen, bu yaklaşım aynı zamanda kullanılmıştırBitki hücrelerinde 11 zar proteini topolojisini tespit etmek. Bununla birlikte, bu yaklaşım, ilgili protein, aynı zamanda sitosol veya organel lümenine hedeflenen füzyon proteinlerinin çeşitli füzyon proteinlerinin sadece oluşumunu da gerektirir gibi yoğun süresi de, ve ilgi bulunan hücre içi protein membranlar olan bilgi gerektirir . Zar proteini topoloji olarak belirlemenin bir alternatifi daha basit bir yaklaşım 12 tarif edilmiştir. Deney, Fluoresans Proteaz koruma (FPP), GFP ve ilgili gen arasındaki bir füzyon proteini üretilmesini gerektirir. yaklaşım GFP kısmı için spesifik olmayan proteazlar nispi erişilebilirlik üzerine dayanmaktadır; olup GFP bağlı olarak hücre içi organellerin lümeninde bulunan ile proteoliz tarafından korunduğu veya sitoplazmada mevcut olan vasıtasıyla proteolize maruz kalmaktadır. Ilgilenilen proteinin GFP kısmı sitoplazma dönük Böylece, eğer, bu maruz kalacağıproteaz aktivitesi ve floresan sinyali kaybetti. Ilgi protein GFP kısmı (örneğin Golgi lümen gibi) proteazm bir ortam &#39;korumalı&#39; karşı karşıya Tersine, daha sonra floresan sinyali devam edecektir. Proteazlar hücreye girmesine izin, ancak kolesterol bağlayıcı ilaç digitonin kullanılan hücre içi membran bölmeleri girmek değil. Kolesterol omurgalıların baskın steroldür ve özellikle hücre içi bölümlere göre plazma membranında zenginleştirilmiştir. glikozit toksini, dijitonin, bitki Digitalis purpurea&#39;nın elde edilir. Digitonin&#39;dir bu 14,16 (Şekil 1) permeabiliztion seçici membran neden kolesterol açısından zengin zarlar için afinitesi vardır. Küçük sitosolik bileşenlerin çıkış sağlayan ek olarak, dijitonin geçirgenleştirme, aynı zamanda, proteinaz K ya da tripsin gibi eksojen moleküllerin girişini mümkün kılar. FPP protokol fac yararlanırPlazma membranı, ER gibi diğer organellere, oysa, golgi endozomlarda, çok düşük bir kolesterol içeriği vardır mitokondri, 14 olduğu gibi kalır, hücresel kolesterolün 17% 80 kadar ihtiva t. plazma zarının kolesterolün seçici dahil S. gibi çeşitli ökaryotik türlerde dijitonin bağımlı plazma membran geçirgenliği kullanımını sağlayan, çok sayıda ökaryotik hücrelerde gözlenmiştir İnsan 14,18 ile cerevisiae. FPP deneyi (a) proteini zara bağlı / ilgili veya sitosol ve membran proteini, (b) etki serbestçe nüfuz olup sitosol veya organel lümeni yüzler belirlemek için bir basit, hızlı ve oldukça sağlam bir araç sağlar. Bir zar proteini birden yönelimleri varsa, sinyal baskın biçimde ortaya çıkacak ve minör form tespit edilmez. Ilgi proteine ​​GFP kısmının eklenmesi işlevini etkileyebilir ki bazı endişeler olabilir iken ve/ Veya hücre içi lokalizasyonu, bu gerçek aslında daha teorik. Gerçekten de birçok çalışmalar net bir şekilde GFP etiket protein 19,20 özelliklerini değiştirmediğini göstermiştir.

<table><tbody><tr><td>Digitonin</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K Sigma</td><td></td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Cav1-GFP</td><td>Addgene</td><td>44433</td><td></td></tr><tr><td>pAcGFP-1 Golgi</td><td>Clontech</td><td>632464</td><td></td></tr><tr><td>Polilisin</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Montaj Ortamı</td><td>Dako</td><td>cS704</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

floresan proteaz koruma kullanma membran protein topolojisini belirlenmesi (fpp)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

İntegral zar proteinlerinin doğru topolojisi ve oryantasyonu, düzgün işlevleri için gereklidir, ancak bu tür bilgiler birçok zar proteini için oluşturulmamıştır. Canlı hücrelerde membran protein topolojisinin belirlenmesine izin veren floresan proteaz koruması (FPP) adı verilen basit bir teknik sunulmaktadır. Bu teknik, protein topolojisini belirlemek için diğer yöntemlere göre çok sayıda avantaja sahiptir, çünkü zar proteininin çeşitli alanlarına karşı çoklu antikorların mevcudiyetini gerektirmez, büyük miktarlarda protein gerektirmez ve canlı hücreler üzerinde gerçekleştirilebilir. FPP yöntemi, membran topolojilerini ve yönelimlerini belirlemek için yeşil floresan protein (GFP) etiketli membran proteinlerinin bozunması üzerindeki proteazların uzamsal olarak sınırlı etkilerini kullanır. Bu basit yaklaşım, çok çeşitli hücre tiplerine uygulanabilir ve mitokondri, Golgi, endoplazmik retikulum ve endozomal/geri dönüşüm sisteminin bileşenleri gibi çeşitli hücre altı organellerde zar protein oryantasyonunu belirlemek için kullanılabilir. Bir GFP füzyonu ile N-terminalleri veya C-terminalleri üzerinde etiketlenen membran proteinleri, deterjan digitonini kullanılarak seçici geçirgenleştirmeye tabi tutulan ilgili bir hücrede ifade edilir. Digitonin, hücre içi organelleri sağlam bırakırken plazma zarına nüfuz etme yeteneğine sahiptir. Sitozole maruz kalan GFP kısımları, proteaz uygulaması yoluyla seçici olarak bozunabilirken, organellerin lümeninde bulunan GFP kısımları proteazdan korunur ve bozulmadan kalır. FPP testi basittir ve sonuçlar hızlı bir şekilde elde edilebilir.

Plazma Membran Permeabilization Etkin plazma membran geçirgenleştirilmesi çözünür floresan protein (örneğin, GFP, DsRed) (Basamak 4) kullanılması ile tespit edilir. Bu proteinler, hücrelerde ifade edildiğinde, sitozol içinde dağıtmak için serbesttir ve plazma membranı (Şekil 2) digitonin ile geçirgenleştirildi zaman kaybolur. Floresan sinyalinin bir tamamen yok dijitonin uygulama 10-60 saniye içinde gerçekleşmelidir. Ilgili protein, hücre içi organellerin i...

Burada, canlı hücrelerdeki integral zar proteinlerinin oryantasyonunu ve topolojisini belirlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu basit protokol, ilgilenilen protein ile GFP arasındaki kimeraların seçici proteaz duyarlılığına dayanır.

Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Bu prosedürün genel amacı, integral membran proteinlerinin topolojisini belirlemektir. Bu, hücrelerde hedeflenen proteinin, yeşil floresan protein (GFP) ile membran proteininin amino veya karboksil uçları arasına eklenerek eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir. Kontrol amaçlı olarak, RFP gibi çözünür floresan proteinler eksprese edilebilir.Ardından, plazma membranı seçici geçirgenliğe tabi tutulur. Deterjan dig kullanılarak, çözünür floresan proteinler hücreden çıkarken, membrana bağlı floresan proteinler hücre içinde tutulur. Son adım, geçirgenleştirilmiş hücrelere bir proteaz uygulanması ve floresan sinyalinin korunup korunmadığının veya kaybedilip kaybedilmediğinin belirlenmesidir.Nihayetinde, floresan mikroskopi görüntüleme kullanılarak gözlemlenen floresan yoğunluğundaki değişiklikler, integral membran proteinlerinin topolojisini ve oryantasyonunu göstermek için kullanılır. Bu tekniğin epitop haritalama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, prosedürün çok fazla özel ekipman veya temini zor olabilecek çeşitli reaktifler gerektirmemesidir. Bu yöntem, bir integral membran proteininin hangi domenlerinin sitozolde, hangi domenlerinin ise endoplazmik retikulum veya endozomlar gibi organellerin lümeninde yer alabileceği gibi membran proteini biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı şekilde floresan protein KY'nin üretimi ve doğrulanması ile başlayın. Ardından, geçici veya stabil ekspresyon oluşturmak için lipid, viral veya elektroporasyon tabanlı teknolojiler dahil herhangi bir standart yüksek verimli, düşük toksisiteye sahip transfeksiyon yöntemi kullanarak floresan protein KY'yi insan embriyonik böbrek hücrelerine veya HEK 2 93 hücrelerine transfekte edin; ardından hücreleri polilizin kaplı lameller üzerine ekimleyin. Hücreleri, karbondioksit kapasiteli bir doku kültürü inkübatöründe, 37 °C'de, uygun doku kültürü ortamında beş ila 48 saat boyunca muhafaza edin.Epi floresan mikroskopi kullanarak hücrelerdeki GFP füzyon proteini ekspresyonunu izleyin; GFP'nin doğal floresan sinyali genellikle transfeksiyondan sonra 24 ila 72 saat içinde maksimuma ulaşır. Hücreleri, floresan sinyal maksimum seviyeye ulaştığında kullanın. Protein ekspresyonu, ilgilenilen proteine veya GFP kısmına yönelik antikorlar kullanılarak immünoblot analizi ile de izlenebilir.Hücreleri işleme tabi tutmak için yer çekimi destekli perfüzyon sisteminin kurulumunu gerçekleştirerek başlayın. Bağımsız rezervuarlara ve banyoda tek bir çıkışı olan bir manifolda bağlı polietilen tüpler içeren, solüsyonlar için 50 mililitrelik şırıngalar hazırlayın. Sabit banyo hacmini korumak ve plazma membranı permeasyonu için perfüzyon rezervuarları arasında manuel olarak geçiş yaparak solüsyon değişimini sağlamak amacıyla bir vakum pipeti yerleştirin.İlk olarak, hücre kültür besiyerini hücrelerden uzaklaştırın. Hücreleri birer dakika süreyle üç kez yıkayın. KHM tamponu içerisinde, lamelleri bir floresan mikroskobu tablasına yerleştirin ve plazma membranını seçici olarak permeabilize etmeden önceki kontrol geçirimsiz görüntüyü temsil eden ilk görüntüyü kaydedin.KHM tamponu içindeki digitonin'i hücrelere ekleyin ve hücreleri, dakikada beş mililitre hızla 10 ila 60 saniye boyunca tampon artı digitonin ile perfüze edin. Plazma membranının yeterince geçirgen olduğunun doğrulanması, membran geçirgenleşmesinin ardından hücreden kolayca difüze olacak çözünür bir GFP veya RFP molekülünün ekspresyonu ile kolayca gerçekleştirilir. Ardından, digitonin ve plazma membranının geçirgenleşmesinin ardından floresan sinyalinin hücrede tutulduğunu doğrulayarak, ilgilenilen GFP protein kimerinin membrana entegre olduğunu teyit edin.Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi mitokondriyal protein gibi organele özgü bir floresan protein eksprese edin. Optimal ekspresyon koşullarını daha önce olduğu gibi belirleyin. Hücre içi organellerin morfolojisinin uzun süreli maruziyette sabit kaldığından emin olarak, kullanılan hücre tipi için konsantrasyonun ve dozun uygun olduğunu doğrulayın.Detaylandırmak gerekirse; hücreler KHM tamponu ile yıkandıktan sonra, proteaz doğrudan hücrelerin üzerine eklenir. Hazırlığı sürekli olarak yıkamak için yerçekimi destekli bir perfüzyon sistemi kullanılarak, hücreler dakikada beş mililitre akış hızında perfüze edilir.Ardından, floresan sinyalinin kalıcı olup olmadığını veya azalıp azalmadığını belirleyin. Bilgisayar kontrollü bir floresan mikroskobun video görüntü yakalama fonksiyonunu kullanarak, uygun filtre setleri altında floresan mikroskopi görüntüleri toplayın. Floresan sinyal yoğunluklarını, inkübasyon koşulunun bir fonksiyonu olarak nicelendirin.Tek bir hücreyi çevreleyen bir ilgi alanı (ROI) içindeki ortalama piksel yoğunluğunu belirleyin. 30 ila 60 saniye boyunca başlangıç sinyal yoğunluğunda %90'tan fazla bir kayıp olması, GFP proteini ky'nin proteolitik degradasyonu ile uyumludur. Çözünür floresan sinyalin tamamen kaybolması, digitonin uygulamasından sonraki 10 ila 60 saniye içinde gerçekleşmelidir.İlgilenilen proteinin hücre içi organellerle ilişkili olduğunun onayı, dijitasyon ve permeasyon sonrası floresan sinyalin korunmasının gözlemlenmesiyle sağlanır. Membran çapalı kinaz LTK2'nin karboksil kuyruğu GFP ile füzyonlanmış ve geçici olarak floresan LTK2 şeklinde eksprese edilmiştir. Proteinaz K eklenmesinin ardından LTK2 GFP sinyali hızla kaybolmuştur; bu durum, LTK2'nin karboksil terminusünün sitozolde yer aldığını göstermektedir.Cavi ve GFP, sitozolik domaine bağlı bir GFP moyetisi içeren bir plazma membranı proteinidir. LTK two'da olduğu gibi, cavi ve GFP'den gelen sinyal digitonin'e karşı duyarsızdır, ancak digitonin permeasyonunun yanı sıra proteinaz K eklenmesinin ardından proteaz eklenmesine karşı duyarlıdır. DS red mito, sitokrom C oksidazdan gelen mitokondriyal hedefleme dizisine füzyonlanmış kırmızı floresan proteini kodlar. DS red mito ile ilişkili floresans stabil kalır. Bu durum, Fluor four'un sitozole maruz kalmadığı mitokondrilerde bulunmasıyla uyumludur.Sarı floresan proteine bağlı GPI demirli prion proteini örneğinde olduğu gibi, bir membran proteinine bağlı floresan grup hücre dışına dönük olduğunda, beklendiği üzere önceden dijitonin ile membran geçirgenliği sağlamaya gerek kalmadan proteinaz işlemi floresan sinyali hızla söndürmelidir. Proteinaz işlemini takiben, bu konstrüktü eksprese eden hücreler için hücre dışı floresan sinyali hızla kaybolmuştur.Bu teknikte uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde işlem bir ila iki saat içinde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, ilgilendiğiniz membran proteininin topolojisini nasıl belirleyeceğiniz konusunda daha kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

determining-membrane-protein-topology-using-fluorescence-protease

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz tek hücreleri üzerinde floresan kullanarak yapı değişiklikleri siteye özgü analizi ile birlikte membran proteinlerinin iyon taşıma kinetiği ölçen bir yöntem anlatacağım. Bu teknik, iyon kanalları ve iyon pompaları uyarlanabilir ve protein altbirimden arasındaki mesafe sınırlamaları belirlemek için kullanılabilir.

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Test protein-protein etkileşim protein işlevsellik diseksiyon için vazgeçilmezdir. Burada, bir...

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

Bu videoda, deterjan çözünmesini takiben Escherichia coli'de yeşil floresan proteini (GFP) ile kaynaşmış membran proteini stabilitesini taramak için bir floresan algılama boyut dışlama kromatografisi tekniği gösteriyoruz. Boyut dışlama profilinde çok az veya hiç serbest GFP ile simetrik bir tepe sergileyen proteinler, daha sonra yapı-fonksiyon analizi için seçilebilen, minimum bozunma ve agregasyon ile saflaştırılmış proteinleri gösterir.

Floresan Algılama Boyut Dışlama Kromatografisi: Deterjan Çözündürmesi Üzerine Floresan Membran Proteinlerinin Bütünlüğünü Belirleme Tekniği

Bir yaklaşım, biyokimyasal zar proteinlerinin in vivo protein-protein etkileşimleri (PPI) tanımlamak için tarif edilmektedir. Yöntem, protein çapraz-bağlama, afinite arıtma ve kütle spektrometrisi birleştirir, ve hemen hemen herhangi bir hücre tipi ya da organizma için uyarlanabilir. Bu yaklaşımla, geçici PPI bile tespiti mümkün olur.

Membran-OMURGA: Membran Proteinleri protein-protein etkileşimleri belirlemek için bir Biyokimyasal Aracı In Vivo

Bu makale, lipid-proksimal bir ortamda çeşitli partner faktörlerle in vitro olarak integral membran proteinlerinin etkileşimlerini ve montajlarını değerlendirmek için bir yöntemi açıklamaktadır.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için İn Vitro

Burada, plazma zarı Derneği düzeyinin kantitatif analiz için periferik ilişkili protein fluorescently öğesini gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yöntemi membran Hesaplamalı ayrışma ve plazma zarı floresan marker ile etiketli hücrelerdeki gözlenen sinyal sitoplazmik bileşeni dayanmaktadır.

Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

Bu protokol, hücresel bir ortamda reseptörlere gerçek zamanlı olarak adenin nükleotid bağlanmasını ölçmek için bir yöntem sunar. Bağlanma, trinitrofenil nükleotid türevleri ile kanonik olmayan, floresan amino asit ile etiketlenmiş protein arasındaki Förster rezonans enerji transferi (FRET) olarak ölçülür.

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

Floresan sızıntı tahlili, peptit/membran etkileşimlerinin araştırılmasını sağlayan basit bir yöntemdir, böylece çeşitli biyolojik süreçlere dahil olmaları ve özellikle hücre nüfuz eden peptitlerin doğrudan hücresel translokasyon işlemi sırasında fosfolipid bilayerleri rahatsız etme yeteneği.

Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil

Bu protokol, aşağı akış fonksiyonel ve yapısal analizi için kalitelerini değerlendirmek üzere membran proteinleri üzerinde floresan boyut dışlama kromatografisi (FSEC) gerçekleştirmeye yönelik bir prosedürü açıklamaktadır. Deterjanda çözünür ve deterjansız koşullar altında çeşitli G-protein kuplajlı reseptörler (GPCR'ler) için toplanan temsili FSEC sonuçları sunulmuştur.

Floresan Boyut Dışlama Kromatografisi ile Membran Protein Kalitesinin Hızlı Değerlendirilmesi

Bu makale, katı destekli lipid çift katmanlarında tek protein izleme için örnekler nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Ayrıca, tek molekül hassasiyeti ve hızlı kare hızına sahip basit bir floresan mikroskobu da açıklar. Son olarak, tek protein yörüngelerinin çıkarılması prosedürünü özetliyoruz.

Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

Öğrenin membran protein topolojisini belirlemeyi canlı hücrelerde GFP kimeraları ve seçici proteaz duyarlılığı kullanarak. Bu yöntem integral membran proteinlerinin yönünü ve işlevini güvenilir şekilde analiz eder.

Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

Daha fazla video keşfet