Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

Bu prosedürün genel amacı, integral membran proteinlerinin topolojisini belirlemektir. Bu, efüzyonun, yeşil floresan proteini veya GFP arasındaki proteinin ve zarın amino veya karboksil kuyruklarının ekspresyonu ile elde edilir. Hücrelerde kontrol amaçlı ilgilenilen protein, RFP gibi çözünür floresan proteinler ile ifade edilebilir.

Daha sonra, plazma zarı seçici geçirgenliğe tabi tutulur. Deterjan kazısını kullanarak, çözünür floresan proteinler hücreden çıkarken, zara bağlı floresan proteinler hücre içinde tutulacaktır. Son adım, perme hücrelerine bir proteaz uygulanması ve floresan sinyalinin tutulmasının veya kaybının belirlenmesidir.

Sonuç olarak, floresan mikroskobu görüntüleme kullanılarak gözlemlenen floresan yoğunluğundaki değişiklikler, integral membran proteinlerinin topolojisini ve yönünü göstermek için kullanılır. Bu tekniğin epitop haritalama gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, prosedürün çok sayıda özel ekipman veya gelmesi zor olabilecek çeşitli reaktifler gerektirmemesidir. Bu yöntem, zar proteini biyolojisinde, bütünleyici bir zar proteininin hangi alanlarının sitozol içinde yer alabileceği ve endoplazmik retikulum altın G veya endozomlar gibi organellerin lümeni içinde hangi alanların bulunabileceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi floresan protein KY'nin üretilmesi ve doğrulanması ile başlayın. Daha sonra, geçici veya kararlı ekspresyon oluşturmak için lipid, viral veya elektroporasyon tabanlı teknolojiler dahil olmak üzere herhangi bir standart yüksek verimli, düşük toksisiteli transfeksiyon yöntemini kullanarak floresan protein KY'yi insan embriyonik böbrek hücrelerine veya HEK 2 93 hücrelerine aktarın, hücreler daha sonra polilisin kaplı örtü fişleri üzerine kaplanır. Hücreleri, karbondioksit özellikli bir doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede uygun doku kültürü ortamında beş ila 48 saat koruyun.

Epi floresan mikroskobu kullanarak GFP füzyon proteininin ekspresyonu için hücreleri izleyin ve GFP floresan sinyalinin içsel floresan sinyali genellikle 24 ila 72 saat içinde maksimuma ulaşır. Transfeksiyonu takiben. Floresan sinyali maksimum seviyeye ulaştığında hücreleri kullanın, protein ekspresyonu, ilgilenilen proteine veya GFP kısmına karşı yönlendirilmiş antikorlar kullanılarak immüno-blot analizi ile de izlenebilir.

Başlamak için, hücreleri tedavi etmek için yerçekimi beslemeli perfüzyon sistemini kurun. Bağımsız rezervuarlara ve banyoda tek bir çıkışı olan bir manifolda bağlı polietilen borulu çözeltiler için 50 mililitrelik şırıngalar hazırlayın. Sabit bir banyo hacmini korumak için bir emme pipeti yerleştirin ve plazma membranı geçirgenliği için perfüzyon rezervuarları arasında manuel olarak geçiş yaparak çözelti değişimi elde edin.

İlk olarak, hücre kültürü ortamını hücrelerden çıkarın. Hücreleri her biri bir dakika boyunca üç kez yıkayın. KHM tamponunda, kapak fişlerini bir floresan mikroskobu aşamasına yerleştirin ve plazma zarına seçici olarak nüfuz etmek için kontrol geçirgen olmayan görüntüyü temsil eden ilk görüntüyü toplayın.

Hücrelere KHM tamponunda rakam toin ekleyin, hücreleri 10 ila 60 saniye boyunca dakikada beş mililitre hızında tampon artı rakam toin ile perfüze edin. Plazma zarının yeterince nüfuz ettiğinin doğrulanması, zarı takip eden hücreden kolayca yayılacak olan çözünür bir GFP veya RFP molekülünün ekspresyonu ile kolayca gerçekleştirilir. Geçirgenlik daha sonra, plazma zarının digon ve nüfuzunu takiben floresan sinyalinin hücresel tutulmasını doğrulayarak, ilgilenilen GFP protein kimerinin zarla entegre olduğunu doğrular.

Ardından, metin protokolünde atıfta bulunulduğu gibi mitokondriyal protein gibi organal spesifik bir floresan proteini ifade edin. Daha önce olduğu gibi en uygun ifade koşullarını belirleyin. Hücre içi organ kanallarının morfolojisinin uzun süreli maruz kalma sırasında sabit kalmasını sağlayarak kazma ve konsantrasyonun kullanılan hücre tipi için uygun olduğunu onaylayın.

Kazmak için. Hücreleri KHM tamponunda yıkadıktan sonra, proteazı doğrudan hücrelerin üzerine ekleyin. Preparatı sürekli olarak yıkamak için yerçekimi beslemeli bir perfüzyon sistemi kullanarak hücreleri dakikada beş mililitrelik bir akış hızında inceleyin.

Ardından, floresan sinyalin devam edip etmediğini veya bozulup bozulmadığını belirleyin. Bilgisayar kontrollü bir floresan mikroskobunda video görüntü yakalama işlevini kullanarak floresan mikroskopi görüntülerini uygun filtre setleri altında toplayın. Kuluçka koşulunun bir fonksiyonu olarak floresan sinyal yoğunluklarını ölçün.

Tek bir hücreyi çevreleyen bir ilgi alanı içindeki ortalama piksel yoğunluğunu elde edin. 30 ila 60 saniye boyunca ilk sinyal yoğunluğunun %90'ından daha fazla bir kayıp, GFP proteini ky'nin proteolitik bozunması ile tutarlıdır. Çözünür floresan sinyalinin tamamen kaybolması, rakam toin uygulamasından sonraki 10 ila 60 saniye içinde meydana gelmelidir.

İlgilenilen proteinin hücre içi organellerle ilişkili olduğunun doğrulanması, digon ve geçirgenliği takiben floresan sinyalin tutulmasına dikkat edilerek elde edilir. Membran ankrajlı kinaz LTK iki'nin karboksil kuyruğu GFP'ye kaynaştırıldı ve geçici olarak floresan ltk eksprese edildi. Proteinaz K ilavesini takiben iki GFP sinyali hızla kayboldu, bu da ltk iki'nin karboksil terminalinin yerinin sitozol içinde olduğunu gösteriyor.

Cavi ve GFP, sitozolik alana bağlı bir GFP parçasına sahip bir plazma zarı proteinidir. LTK ikide olduğu gibi, cavi ve GFP'den gelen sinyal rakama duyarsızdır, ancak daha sonra proteaz DS kırmızı mito ilavesine duyarlıdır, digon geçirgenliğini takiben sitokrom C oksidazdan mitokondriyal hedefleme dizisine kaynaşmış kırmızı floresan proteini kodlar ve ayrıca proteinaz K ilavesi. Bu, Fluor dörtlüsünün sitozole maruz kalmadığı mitokondride olması ile tutarlıdır.

Bir zar proteinine bağlı floresan kısım, sarı floresan proteinine bağlı GPI bağlantılı prion proteininde olduğu gibi hücre dışına baktığında. Proteinaz tedavisi, beklendiği gibi kazma imp geçirgenliğine önceden ihtiyaç duymadan floresan sinyalini hızla söndürmelidir. Proteinaz tedavisini takiben, bu yapıyı ifade eden hücreler için hücre dışı floresan sinyali hızla kayboldu.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir ila iki saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, ilgilendiğiniz zar proteininin topolojisini nasıl belirleyeceğinizi daha iyi anlamış olmalısınız.