Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

Bu prosedürün genel amacı, numunelerin RNA bütünlüğünü korurken, lazer yakalama mikro diseksiyonu veya LCM ile izole edilen bir fare beyin hücresi popülasyonunun hızlı immüno etiketlemesinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermektir. Bu, önce diseke edilen beyin dokusunun hızlı bir şekilde dondurulmasıyla gerçekleştirilir. Beyin daha sonra RNA içermeyen cam mikroskop slaytları üzerine ince kesitler halinde kesilir ve hızlı bir immünoboyama ile tedavi edilir.

Son olarak, ilgilenilen hücre popülasyonu LCM kullanılarak izole edilir. Sonuç olarak, hızlı boyama ve ardından lazer yakalama mikrodiseksiyonu, deneysel hücre örneğinde ilgilenilen genin ifadesindeki değişikliklerin tanımlanmasına izin verir. Bu tekniğin floresanla aktive edilmiş hücre sıralama gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, tekniğimizle, çevredeki dokudan spesifik ES hücresinin çözümüne izin verecek şekilde uzamsal çözünürlüğün korunmasıdır.

Genel olarak, bu smith hücresine yeni olan insanlar daire çizer, çünkü bu prosedür, örneklerdeki RNA bütünlüğünü korumak için hızlı bir şekilde çalışmayı gerektiren birkaç kritik adım içerir. Numuneleri kesit almaya hazırlamak için, doğum sonrası farelerin birinci gününden itibaren beyinleri kurban edildikten sonraki iki dakika içinde buz gibi soğuk L 15 besiyerinde inceleyin. Daha sonra beyinleri, bölümlere ayırmak için uygun yönde gömme kalıplarına yerleştirin ve kalıpları donmuş doku ile doldurun, ortamı gömün.

Daha sonra numuneleri hemen sıvı nitrojen içinde dondurun ve donduktan sonraki 30 saniye içinde eksi 80 santigrat derecede saklayın. Şimdi, eser miktarda RNA'yı gidermek için membran kaplı cam slaytları yüzey RNA dekontaminasyonu ile işlemden geçirin. Bunları DEPC suyunda durulayın ve slaytlar kuruduğunda kurumaya bırakın.

Kriyostat odası sıcaklığını eksi 20 santigrat dereceye ayarlayın ve donmuş numuneyi kriyostata aktarın. Her numune için, donmuş bloğu numune kelepçesine monte edin ve numuneleri 10 mikron kalınlığında dilimleyin, bölümleri membran kaplı slaytlar üzerinde toplayın. Bölümleri en az 10 dakika kurumaya bıraktıktan sonra, dokuları çevrelemek için hidrofobik bir bariyer kalem kullanın.

Yaklaşık 10 saniye sonra, slaytları eksi 20 santigrat derecede en fazla beş dakika boyunca taze hazırlanmış soğuk fiksatif solüsyona yerleştirin. Şimdi slaytları, yüzey RNA dekontaminasyon solüsyonu ile önceden işlenmiş temiz bir tepsiye aktarın. İlk olarak, fazla sabitleyicileri çıkarmak için slaytları bir kez sallayın ve altı ila sekiz hızlı daldırmayla yıkayın D-E-P-C-P-B-S'de slaytları hafifçe vurun.

Fazla D-E-P-C-P-B-S'yi çıkarmak için, her bölüme 200 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika sonra, slaytları D-E-P-C-P-B-S'ye üç hızlı daldırma ile yıkayın ve fazla yıkama solüsyonunu çıkarmak için bir kez hafifçe vurun. Daha sonra numuneleri altı dakika sonra oda sıcaklığında 200 mikrolitre ikincil antikor çözeltisinde inkübe edin.

Slaytları az önce gösterildiği gibi D-E-P-C-P-B-S'de yıkayın ve başka bir hızlı D-E-P-C-P-B-S yıkamasından sonra dört dakika boyunca taze hazırlanmış bir BC solüsyonunda inkübe edin, 196 mikrolitre taze hazırlanmış DAB'yi dört mikrolitre RNA inhibitörü ile karıştırın. Solüsyonu bölüme eklemeden hemen önce, DAB'ın bir ila iki dakika gelişmesine izin verin, ardından A-D-E-P-C-P-P-B-S yıkayın. Daha sonra bölümleri mutlak etanol içinde birkaç saniye inkübasyon ile kurutun ve LCM'ye ilerlemek için slaytları kurulayın.

Daha sonra, bir RNA ekstraksiyon kitinden toplama tüpü kapağına 50 mikrolitre lizis tamponu. Ardından, numune tarafı kapağa bakacak şekilde mikroskobun altına bir slayt yerleştirin. Örnek için en iyi büyütmeyi seçin ve ilgilenilen hücreleri görmek için odağı ayarlayın.

Ardından kesim alanını tanımlayın ve lazerle kesmeye başlayın. Diseke edilen materyalin toplama tüpü kapağında toplanması, toplanan hücreleri 42 santigrat derecede 30 dakika boyunca yatırın. Bu süre zarfında, 250 mikrolitre koşullandırma tamponu ile RNA ekstraksiyon kitinden bir RNA saflaştırma kolonunu ön koşullandırın.

Daha sonra kolon üzerindeki parçalanmış hücrelere 50 mikrolitre etanol yükleyin ve kolonu 16.000 Gs ve oda sıcaklığında iki dakika santrifüjleyin, ardından yıkama tamponu ile iki durulama yapın. Son olarak, RNA'nın kalitesini test etmek için iki mikrolitreyi bir kenara bırakarak RNA'yı önerilen minimum hacim olan 11 mikrolitre RNA içermeyen suda elüte edin. Bu hızlı immüno-etiketleme prosedürü, deneysel RNA bütünlüğünü korurken ilgilenilen hücrelerin görselleştirilmesine izin verir.

Deneye bağlı olarak, LCM, tek hücreleri veya daha büyük ilgi alanlarını izole etmek için gösterildiği gibi kullanılabilir. Bozulmuş RNA, aşağı akış analizinin kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Bu nedenle her numune, az önce gösterildiği gibi izole edilmiş RNA'nın bütünlüğünün ölçülmesine ve doğrulanmasına izin vermek için mikroakışkan X tabanlı bir platform biyoanalizörü üzerinde daha fazla işlenir.

Örneğin, burada, hem bozulmuş hem de iyi kalitede tipik biyoanalizör sonuçları. RNA örnekleri gösterilmiştir. Gerçekten de, dijital jel ve elektroferogramlar, RNA'yı korumak için her çözeltide bir rase inhibitörü kullanmanın önemini göstermektedir Bu prosedürü takiben, yüksek kaliteli RNA, RNA dizileme MİKROARRAY veya Q-R-D-P-C-R dahil olmak üzere sonraki uygulamalar için daha fazla işlenebilir, örneğin, bu grafiklerde, orta beyin bölümlerine göre mikro diseke edilen numunedeki TH ve A DC gen ekspresyonu için ortalama zenginleşmenin 170 kattan fazla olduğu belirlendi.

Bu prosedürü denerken, çok hızlı bir şekilde ve RNA'lardan arındırılmış materyalle çalışmayı hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, belirli bir hücre popülasyonunu herhangi bir dokudan nasıl izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.