Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

Bu prosedürün genel amacı, örneklerin RNA bütünlüğünü korurken, lazer yakalama mikro diseksiyon (LCM) ile izole edilen bir fare beyin hücresi popülasyonunun hızlı immün işaretlemesinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermektir. Bu işlem, öncelikle diseke edilen beyin dokusunun hızla dondurulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından beyin, RNA içermeyen cam mikroskop lamları üzerine ince kesitler halinde kesilir ve hızlı bir immün boyama işlemine tabi tutulur.

Son olarak, ilgilenilen hücre popülasyonu LCM kullanılarak izole edilir. Nihayetinde, hızlı boyamayı takiben uygulanan lazer yakalama mikrodissection, deneysel hücre örneğindeki ilgili genin ekspresyonundaki değişikliklerin belirlenmesine olanak tanır. Bu tekniğin floresan aktive hücre seçme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tekniğimizle mekansal çözünürlüğün korunması ve böylece ES hücrelerinin çevre dokudan spesifik olarak ayrıştırılabilmesidir.

Genellikle, bu smith hücresini ilk kez kullanan kişiler zorlanabilmektedir; çünkü bu prosedür, örneklerdeki RNA bütünlüğünü korumak için hızlı çalışmayı gerektiren birkaç kritik adım içermektedir. Örnekleri kesime hazırlamak için, sakrifikasyon sonrası iki dakika içinde, doğum sonrası birinci gün farelerinin beyinlerini buz gibi soğuk L 15 ortamı içerisinde diseke edin. Ardından, beyinleri kesim için uygun yönelimde gömme kalıplarına yerleştirin ve kalıpları donmuş doku gömme ortamı ile doldurun.

Ardından numuneleri derhal sıvı azot içerisinde dondurun ve şok dondurmadan sonraki 30 saniye içinde -80 °C'de saklayın. Şimdi, eser miktardaki RNA'yı temizlemek için membran kaplı cam lamları yüzey RNA dekontaminasyonuna tabi tutun. Lamları DEPC su ile durulayın ve lamlar kuruduğunda havada kurumaya bırakın.

Kriyostat hazne sıcaklığını -20 °C'ye ayarlayın ve dondurulmuş örneği kriyostata aktarın. Her örnek için, dondurulmuş bloğu numune tutucuya sabitleyin ve kesitleri 10 µm kalınlığında dilimleyerek membran kaplı lamlar üzerine toplayın. Kesitlerin en az 10 dakika boyunca kurumasına izin verdikten sonra, dokuları çevrelemek için hidrofobik bariyer kalemi kullanın.

Yaklaşık 10 saniye sonra, lamları taze hazırlanmış soğuk tespit çözeltisine, minus 20 degrees Celsius sıcaklıkta beş dakikadan fazla olmayacak şekilde yerleştirin. Şimdi lamları, yüzey RNA dekontaminasyon çözeltisi ile ön işlem görmüş temiz bir tepsiye aktarın. Önce, fazla tespit çözeltisini uzaklaştırmak için lamları bir kez sallayın ve D-E-P-C-P-B-S içerisinde altı ila sekiz kez hızlıca daldırıp çıkararak yıkayın; lamları hafifçe silkeleyin.

Fazla D-E-P-C-P-B-S'yi uzaklaştırmak için her kesite 200 µL primer antikor çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika beklettikten sonra, lamları D-E-P-C-P-B-S içinde üç kez hızlıca daldırarak yıkayın ve fazla yıkama çözeltisini uzaklaştırmak için bir kez silkeleyin. Ardından örnekleri, altı dakika sonra oda sıcaklığında 200 µL sekonder antikor çözeltisi içinde inkübe edin.

Slaytları az önce gösterildiği gibi D-E-P-C-P-B-S ile yıkayın ve hızlı bir D-E-P-C-P-B-S yıkamasının ardından taze hazırlanmış BC çözeltisinde dört dakika inkübe edin; ardından 196 µL taze hazırlanmış DAB'ı dört µL RNA inhibitörü ile karıştırın. Çözeltiyi kesite eklemeden hemen önce, DAB'ın bir ila iki dakika boyunca gelişmesine izin verin ve ardından A-D-E-P-C-P-B-S ile yıkayın. Daha sonra kesitleri mutlak etanolde birkaç saniyelik inkübasyonlayeleterek dehidre edin ve LCM işlemine geçmek için slaytları sallayarak kurulayın.

Ardından, bir RNA ekstraksiyon kitinden 50 µL lizis tamponunu toplama tüpü kapağına ekleyin. Daha sonra, numune tarafı kapağa bakacak şekilde bir lamı mikroskobun altına yerleştirin. Numune için en uygun büyütmeyi seçin ve ilgilenilen hücreleri görmek için odağı ayarlayın.

Ardından kesim alanını belirleyin ve lazerle kesmeye başlayın. Diseke edilen materyali toplama tüpüne toplayın ve toplanan hücreleri 42 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu süre zarfında, RNA ekstraksiyon kitindeki bir RNA saflaştırma kolonunu 250 µL kondisyonlama tamponu ile ön koşullandırın.

Ardından, kolondaki lizize edilmiş hücrelerin üzerine 50 µL etanol ekleyin ve kolonu oda sıcaklığında, 16,000 G'de iki dakika boyunca santrifüj edin; bunu yıkama tamponu ile iki kez durulama işlemi izlesin. Son olarak, RNA'yı önerilen minimum hacim olan 11 µL RNA içermeyen su ile elüe edin ve RNA kalitesini test etmek için iki µL'yi kenara ayırın. Bu hızlı immün işaretleme prosedürü, deneysel RNA bütünlüğünü korurken ilgilenilen hücrelerin görselleştirilmesine olanak tanır.

Deneye bağlı olarak LCM, az önce gösterildiği gibi tekil hücreleri veya daha geniş ilgi bölgelerini izole etmek için kullanılabilir. Degrade olmuş RNA, sonraki analizlerin kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Bu nedenle, izole edilen RNA'nın bütünlüğünün doğrulanması ve miktarının belirlenmesi için her örnek, az önce gösterildiği gibi microfluid X tabanlı bir platform biyoanalizörde işleme tabi tutulur.

Örneğin burada, hem degrade olmuş hem de iyi kalitedeki RNA örneklerinin tipik bioanalyzer sonuçları gösterilmektedir. Nitekim, dijital jel ve elektroferogramlar, RNA'yı korumak için her solüsyonda bir RNaz inhibitörü kullanmanın önemini ortaya koymaktadır; bu prosedürün ardından elde edilen yüksek kaliteli RNA, RNA dizileme, mikroarray veya qRT-PCR dahil olmak üzere alt uygulamalar için daha ileri aşamalarda işlenebilir; örneğin, bu grafiklerde mikro-diseke edilen örnekteki TH ve AADC gen ekspresyonunun orta beyin kesitlerine göre ortalama zenginleşmesinin 170 kattan fazla olduğu belirlenmiştir.

Bu prosedürü uygularken, işlemlerin çok hızlı bir şekilde ve RNA'lardan arındırılmış materyallerle yürütülmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu videoyu izledikten sonra, herhangi bir dokudan belirli bir hücre popülasyonunun nasıl izole edileceği konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız.