Yüksek frekanslı Ultrason Kullanımı Fare Embriyolar Kontrast Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, kontrastla güçlendirilmiş ultrason görüntüleme için izole edilmiş canlı fare embriyolarına mikrokabarcıklar enjekte etmektir. Bu işlem, öncelikle gebe bir fareden canlı E 16.5 veya E 17.5 embriyolarının toplanmasıyla gerçekleştirilir.

Hedefleme yapan mikrobaloncuklar hazırlandıktan sonra, bu mikrobaloncuklar plasental vasküler ağ aracılığıyla canlı embriyoya enjekte edilir. Son adım, mikrobaloncukların ultrason görüntüleme kullanılarak görüntülenmesidir. Nihayetinde, vasküler perfüzyon parametrelerini ölçmek ve embriyolarda hedeflenmiş mikrobaloncuk bağlanmasını değerlendirmek için kontrastla güçlendirilmiş ultrason görüntüleme kullanılabilir.

Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, başarılı bir deney için gerekli olan iğne ve pens baskılarını uygulama konusunda yeterli pratik yapana kadar protokolün embriyo manipülasyonu ve enjeksiyon kısımlarında zorlanacaklardır; prosedürü uygulamak için laboratuvarımızdan stajyer öğrenci Brian Nixon gösterim yapacaktır. Hedef hazır flakonları yeniden çözmek için 20 µg antikor çözeltisini bir mL'lik nihai hacimde salin ile seyrelterek başlayın. Flakonları buz üzerinde tutun. Ardından, bir şırıngayı bir mL salin ile doldurun.

Tüm hava kabarcıkları giderilir. 21 gauge bir iğne takılır ve solüsyon mikro kabarcık flakonuna yavaşça enjekte edilir. Piston yavaşça geri çekilerek bir mililitre hava alınır ve ardından iğne çıkarılır.

Viyali nazikçe çalkalayın ve beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Beş dakika sonra, yeni bir şırıngayı antikor dilüsyonu ile doldurun ve uygun viyala ekleyin. Çalkaladıktan sonra, karışımı nazikçe toplam iki mililitre olacak şekilde tamamlayın.

Buz üzerinde 10 dakika bekletin. Hedeflenmemiş vialleri yeniden çözmek için, bir şırıngayı bir mililitre salin ile doldurun. Tüm hava kabarcıklarını giderin.

21 gauge bir iğne takın ve çözeltiyi yeni bir mikrobaloncuk flakonuna yavaşça enjekte edin. Pistonu yavaşça geri çekerek bir mililitre hava boşluğu oluşturun ve ardından iğneyi çıkarın. Nazikçe çalkalayın ve beş dakika boyunca bekletin.

Hacmi 2 mL'ye tamamlamak için ek olarak 1 mL salin ekledikten sonra nazikçe karıştırın ve buz üzerinde 10 dakika bekletin. İstenilen mikrobaloncuk flakonunu nazikçe çalkaladıktan sonra, çözeltiden yaklaşık 50 µL çekmek için 1 mL'lik bir şırınga üzerinde 21 gauge iğne kullanın. Ardından mikrobaloncukları boş bir 2 mL'lik mikro santrifüj tüpüne enjekte edin.

Ardından, 10 µL'lik bir Mikro kabarcık stok çözelti örneğini 10 mL dilüent içine pipetleyin. Nazikçe karıştırdıktan sonra, mikro kabarcık popülasyonunun konsantrasyonunu ve boyut dağılımlarını değerlendirmek için Coulter sayımı yapın. Şişe başına örnek için en az üç adet 50 µL'lik ölçüm gerçekleştirin.

30 mikrometrelik bir açıklık kullanılarak. Bu adım, mikrokabarcıkların embriyolara enjeksiyonu ile paralel olarak gerçekleştirilir. Cerrah embriyolara enjeksiyon yaparken, asistan, cerrahın enjekte edilen kabarcığın türünü bilmemesini sağlamak için bir sonraki enjeksiyonu hazırlar.

400 µL hacimde mililitre başına 100 milyon mikrokabarcık nihai konsantrasyonu elde etmek için gereken stok kabarcık çözeltisi hacmini belirleyin. Karşılık gelen hacimdeki salini boş bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Seçilen mikrokabarcık flakonunu nazikçe çalkaladıktan sonra, çözeltiden fazla bir hacim çekmek için 21 gauge iğneli bir mL şırınga kullanın.

Ardından mikrobaloncukları boş bir mikrosantrifüj tüpüne enjekte edin. Sonrasında, gerekli hacimdeki Mikrobaloncuk stok çözeltisini pipetleyin ve salin alikuotuna ekleyin. Pipet ucuyla nazikçe karıştırarak harmanlayın.

Ardından, seyreltilmiş mikrobaloncuk solüsyonunu temiz bir şırıngaya çekmek için 21 gauge bir iğne kullanın. İğneyi çıkardıktan sonra, şırıngadaki tüm hava kabarcıklarını giderin ve luer konnektörü ile tüpü takın. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek, solüsyonu yavaşça tüpün ucuna kadar itin.

Son olarak, şırıngayı mikro kabarcıkları dakika başına 20 µL hızla verecek şekilde ayarlanmış bir şırınga infüzyon pompasına yerleştirin. Toplam 20 µL hacim için, tüpün ucuna çekilmiş bir cam iğne takın. Pompayı enjeksiyon aşamasına yakın bir konuma getirin.

Soğutulmuş besiyeri kabından rastgele bir embriyoyu seçip çıkarmak için delikli bir kaşık kullanın. Embriyoyu, stereoskop altındaki ultrason aşamasında bulunan bir diseksiyon kabına yerleştirin. Ardından, embriyonun en az vaskülarize görünümde olan tarafını belirleyin.

Burası, genellikle baş bölgesinin bitişiğinde bulunan düşük vaskülarizasyonlu bir alandır. Ardından, embriyoyu içeriden çıkarabilmek için vitellus kesesinin ve amniyotik membranların sadece yeterli kısmını kesmek veya yırtmak için ince pensler kullanın, ancak fazlasını yapmayın. Sonrasında, keseyi embriyonun etrafından nazikçe uzaklaştırın.

Ardından embriyoyu, plasenta ve göbek damarları öne gelecek şekilde yan tarafına yerleştirin. Diseksiyon kabını, vitellus kesesini ve plasentanın kenarlarını dört adet böcek iğnesiyle sabitleyerek plastikine parçalarıyla stabilize edin; bu sırada, önceden 45 °C'ye ısıtılmış sıvı içeren bir şırınga kullanarak ana damarların zarar görmesini önleyin.

Kanın embriyo içerisine aktığı görülene kadar embriyoyu PBS ile yıkayın. Göbek arteri, nabızla atan parlak kırmızı kan ile tanımlanır. Göbek venini ve buna bağlı vasküler ağı, plasenta tarafında genellikle göbek arterininkilerin üzerinde yer alan daha koyu renkli kan belirler.

Bu aşamada, enjeksiyonun rahatça yapılabilmesi için petri kabını konumlandırın. Embriyo canlandıktan sonra, plasentayı açıkta bırakacak şekilde embriyoyu örtün. Önceden ısıtılmış ultrason jeli kullanarak, embriyo çevresindeki hava kabarcıklarını ince pensle dikkatlice temizleyin ve prosedür boyunca petri kabını önceden ısıtılmış PBS ile tamamlayın.

PBS ve jel şırıngalarındaki solüsyon seviyesini takip edin ve gerektiğinde ısıtma beherinize yedek şırıngalar ekleyin. Ardından, cam iğneyi diseksiyon kabının kenarındaki büyük bir plastikine topuna sabitleyin ve iğnenin ucunu PBS'ye batırın. Plasental diskin koriyonik yüzeyinde, ana daldan mümkün olduğunca uzak bir ven seçin.

Ardından, iğne ucunu damar boyutuna uygun hale getirmek için makasla kesin. Ucu hafif bir açıyla kesin. Camdaki pürüzlü kenarları gidermek için yaylı makasın kenarını kullanın.

Şimdi, şırınga pompasını kullanarak, iğne ucundaki tüm hava tahliye edilene ve mikrobaloncukların PBS içine serbestçe aktığı görülene kadar mikrobaloncuk solüsyonunu cam iğneye dakikada 20 microliters hızla yavaşça enjekte edin. Pompayı durdurun ve 20 microliters enjeksiyon hacmi için yeniden ayarlayın. Embriyonun vasküler sistemine hava enjekte edilmesini önlemek için enjeksiyon iğnesine hava girmesine izin vermeyin.

Cam iğne ucunu plasentadaki seçilen vene nazikçe yerleştirin ve sabit olduğundan emin olun. Stereoskop başını kenara çekin ve ultrason transduserini, embriyo 6 ve 10 milimetrelik odakların arasında eşit şekilde yerleşecek şekilde konumlandırın. Ardından, görüntülemeyi başlatın ve mikrobaloncukların bolus enjeksiyonuna başlayın; bir dakika sonra enjeksiyon tamamlandığında, veri toplama adımı için zamanlayıcıyı başlatın.

Bu B modu ultrason görüntüsü, hedeflenmiş mikro kabarcıkların enjeksiyonundan hemen önceki eksterternalize edilmiş bir E 17.5 embriyosunu göstermektedir. Bu doğrusal olmayan kontrastlı ultrason görüntüsü, mikro kabarcıkların enjeksiyonundan önceki embriyoyu göstermekte olup, bu aşamada yumuşak dokulardan gelen sinyalin minimum düzeyde olduğu ve sadece kemik gibi güçlü yansıtıcı arayüzlerin görünür olduğu görülmektedir. Mikro kabarcıkların enjeksiyonu; vena cava inferior, kalp ve beyin dahil olmak üzere hayvanın genelinde kontrastı artırır.

Embriyonik beyindeki tek bir ilgi bölgesinde zamanın bir fonksiyonu olarak mikrobaloncukların yoğunluk grafiği; eğimle gösterilen tepe güçlenme veya pe wash in hızı ve tepe süresi veya TTP dahil olmak üzere çeşitli perfüzyon parametrelerinin belirlenmesine olanak tanır. Endoglin hedefli mikrobaloncuklardan elde edilen ortalama kontrast ortalama güç oranları, hedeflenmemiş mikrobaloncuklar için toplanan kontrol değerlerinden anlamlı derecede daha yüksekti. Ayrıca, endoglin hedefli mikrobaloncuk bağlanmasının ogly plus plus embriyolarda, ogly plus minus embriyolara kıyasla anlamlı derecede daha yüksek olduğu bulunmuştur.

Teknik doğru şekilde uygulandığında, uzmanlaşıldıktan sonra her embriyo 15 dakika içinde enjekte edilebilir ve görüntülemesi yapılabilir.