Name: Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Keşfedin hastalık vektörü sivrisinek larvalarında kitosan/RNA nanopartiküllerle gen susturma yöntemini. Bu teknik gelişim biyolojisi ve gen fonksiyonu çalışmaları için yüksek verimli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kansas Tarımsal Deney İstasyonu ve K-State Eklembacaklı Genomik Merkezi'nden KYZ'ye sağlanan finansman, A. gambiae19'da kitosan/dsRNA aracılı gen susturmanın orijinal gelişimini destekledi. Burada tarif edilen A. gambiae çalışması, kısmen NIH / NIAID'den KM'ye R01-AI095842 tarafından desteklenmiştir. A. aegypti20,21'de kitosan / siRNA aracılı gen susturmanın geliştirilmesi, MDS'ye NIH / NIAID Ödülü R01-AI081795 ile desteklenmiştir. Bu çalışmanın içeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

1. Sivrisinek Türlerinin ve Yetiştirme <ol><li> A. koruyun gambiae G3 ve A. aegypti Liverpool IB12 (aşağıda temsili çalışmalarda kullanılan) suşları veya standart laboratuar uygulamaları ya da daha önce 23,24 açıklandığı gibi uygun diğer ilgi suşları. </li></ol> 2. dsRNA&#39;nın ve siRNA Tasarım ve Üretimi <ol><li> Tasarım primerler ilgi konusu gen için özel uzun dsRNA şablonlar oluşturmak için yerleştirildi. E-RNAi aracını 25 kullanın. Gibi bir seçim ya da yöntemine göre dsRNA üretmek önce 19 tanımladı. <ol><li> Negatif bir kontrol olarak, yeşil flüoresan proteini (GFP), β-galaktosidaz (β-gal) veya sivrisinek ifade edilmeyen başka bir gen sekansına karşılık gelen dsRNA 19 sentezler. Bu şekilde istenmesi halinde, aşağıda temsil sonuçları üretmek için kullanılan dsRNA 19, bir pozitif kontrol olarak kullanılabilir. Mağaza dsRNA&#39;nın -80 ° &#39;de RNAse içermeyen su içinde çözüldüC kadar gerekli. </li></ol></li><li> Seçenek olarak ise, tasarım gene özel siRNA standart laboratuar uygulamaya göre ya da daha önce tarif edilen, 10. Sivrisinek genine karşılık negatif kontrol siRNA tasarımı için portatif siRNA dizisini karıştırmak. Saygın satıcıları bir numara ile mevcut özel siRNA&#39;ları, satın alın. <ol><li> Bu şekilde istenmesi halinde, aşağıda temsil sonuçları elde etmek için kullanılan siRNA&#39;lar 20,21 pozitif kontrol olarak da kullanılabilir. Gerekli olana kadar mağazası siRNA -80 ° C RNAse içermeyen su içinde çözülmüştür. </li></ol></li></ol> 3. RNA Nanopartiküller müdahale / Chitosan Hazırlama <ol><li> Önceden yapılan RT 100 mM sodyum sülfat toplamak (deiyonize H 2 O 100 mM Na 2SO 4) ve 0.1 M sodyum asetat (deiyonize H 2 O 0.1 M, NAC 2H 3 O 2 -0.1 M asetik asit, pH 4.5) tamponlar. </li><li> Kitosan çözülür (≥75%deasetillenmiş), 0.1 M sodyum asetat tampon maddesi içinde () ağırlık / hacim çalışma çözeltisi% 0.02 yapmak ve kullanılmadan önce oda sıcaklığında çözelti tutun. </li><li> H2O deiyonize 50 ul dsRNA veya siRNA çözülür ve 50 mM sodyum sülfat, 100 ul başına dsRNA / siRNA 32 ug 100 ul solüsyon yapmak için, 100 mM sodyum sülfat tamponu ekleyin. </li><li> DsRNA&#39;nın / siRNA çözeltisine çitosan solüsyonu, 100 ul ilave edin ve daha sonra 1 dakika boyunca 55 ° C&#39;de bir su banyosunda karışım ısı. Kitosan çözeltisinin 100 ul 50 mM sodyum sülfat 100 ul ekleyerek bir denetim kurmak ve aynı prosedürü izleyin. </li><li> Nanopartiküllerin oluşumunu kolaylaştırmak için oda sıcaklığında yüksek hızlı bir girdaplama ile 30 saniye için hemen çözüm karıştırın. </li><li> Pelet görünür olmalıdır, bu süreden sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 13,000 x g&#39;de santrifüjleyin karışımı. Yeni 1.5 ml tüp süpernatant aktarın. Sivrisinek yemek hazırlamak için kullanmadan önce oda sıcaklığında ≈10 dakika pelet Hava kurulayın. </li><li> Msüpernatant kaldı DsRNA / siRNA&#39;nın toplam miktarını hesaplamak için boş olarak kontrol (3.5 bakınız) süpernatant kullanarak süpernatanda DsRNA / siRNA&#39;nın konsantrasyonunu gözetim kuruluşunun onayını almıştır. Başlangıç ​​dsRNA&#39;nın / siRNA&#39;nın miktarlarda ve nanopartiküller içinde sıkışıp kalan DsRNA / siRNA&#39;nın yüzdesini hesaplamak için Süpernatantları kalan tutarları arasındaki farkı kullanın. Bu yükleme verimliliği normalde% 90 üzerindedir. </li><li> Daha fazla nanopartiküller gerekirse aynı işlemi tekrarlayın. Hemen kurutuldu nano-tanecikleri kullanın. kullanımdan önce parçacıkların soğuk depolama etkisi değerlendirilmemiştir. </li></ol> 4. Sivrisinek Gıda RNA Nanopartiküller müdahale / Chitosan içeren Hazırlanması <ol><li> Iyonu giderilmiş su içinde, agaroz eriyik (ağırlık / hacim),% 2 agaroz çözeltisi 1 ml hazırlayın ve kullanımdan önce bir 55 ° su banyosu içinde eritilmiş agaroz çözüm tutmak. </li><li> Balık gevreği karıştırın (% 47 ham protein, dk. Ham yağ% 10, maks. Ham lif% 3) en ve kuru maya(ağırlık / ağırlık) 1: 2 oranı. Bir havan ve tokmak (No 50 ABD standart test elek boyunca yeterli) küçük parçacıklara mikserden. Ya hemen, kahverengimsi renkte olmalıdır zemin yiyecek, kullanın ya da birkaç hafta boyunca 4 ˚C de kapalı bir kapta saklayın. </li><li> 1.5 ml bir tüp içinde, bir kürdan ile Bölüm 3.7 kurutulmuş nanopartiküller ile yer gıda 6 mg karıştırın. </li><li> Gıda nanopartikül karışımı,% 2, önceden eritilmiş agaroz jel çözeltisi 30 ul ilave et; Bir kürdan veya pipet ucu ile hemen ve iyice karıştırın. </li><li> Hemen sivrisinek larvaları beslemek için yiyecek ve nanopartiküller içeren jel kullanın. Jel tamamen oda sıcaklığında katılaşan bir kez, alternatif olarak, 4 ° C&#39;de jel depolama ve kullanma ertesi gün ya da daha sonra kullanmak için -80 ° C &#39;de. </li></ol> 5. Gıda RNA Nanopartiküller müdahale / Chitosan İçeren ile Sivrisinek Larva Besleme <ol><li> Besleme A. gambiae sivrisinek larvaları: <ol><li> Bir si kaldırBir kürdan kullanarak ve temiz bir jilet veya diş çekme kullanarak 6 eşit dilimler halinde kesilmiş 1.5 ml tüp ngle jel pelet. </li><li> Iyonu giderilmiş su, 100 ml içeren 500 ml&#39;lik bir Petri tabağına aktarın 20 üçüncü instar larvaları. </li><li> Petri kabı bir kez, dört gün boyunca, günde jel pellet (ince küçük parçalar halinde kesilmiş) bir dilim ekleyerek sivrisinek larvaları besleyin. Önemli ölçüde küçültülür veya ertesi gün tamamen yok edilmelidir pelet, üzerinde larva besleme gözlemlemek için emin olun. Süre sonra, sivrisinekler geç dördüncü evre larvaları dönüşecek. </li><li> Deney sırasında herhangi bir görünür fenotipik değişiklikleri kaydedin. Dört günlük sürenin sonunda 6. bölümde tartışıldığı gibi transkript düzeyleri ve diğer fenotipik değişiklikleri incelemek. </li></ol></li><li> Besleme A. aegypti sivrisinek larvaları: <ol><li> Temiz bir jilet veya kürdan kullanarak 6 eşit dilimler halinde jel pelet kesin. </li><li> Yumurta kuluçka fi sonra 50 yaş senkronize 24 saat yerleştirindeiyonize su ≈40 ml bir petri çanağı içine ilk instar larvaları. </li><li> Günün geri kalanı için 1 zemin balık yiyecek gevreği ve kuru maya: sonra 2 normal larva diyetine geri larvaları transfer 4 saat / gün petri başına larva bir dilim besleyin. Günde dört larva dönemi boyunca prosedürü tekrarlayın. </li><li> Istenen gelişimsel zaman noktalarında bölüm 6&#39;da anlatıldığı gibi transkript düzeyleri ve diğer fenotipik değişiklikleri incelemek. </li></ol></li></ol> Gen demonte 6. Onay <ol><li> A. Mah-PCR ile Bağıl transkript ölçümü aegypti ve A. gambiae larvaları. <ol><li> Gerçekleştirin ve 11,19,20 tarif, ya da standart laboratuar prosedüre göre deney larva vs en az 10 havuza kontrol üç biyolojik çoğaltır ile Mah-PCR deneyleri analiz. Örnek sonuçlar aşağıda yer almaktadır. </li><li> Özel bir doku tipi / gövde parçası (örn. Beyin veya anten), perfo analizi içinÇevrede bulunan doku kurtarma 6.1.1 aşağıdaki diseksiyon tarif edildiği gibi rm QRT-PCR (örneğin, bakınız Mysore ve ark. 21). </li></ol></li><li> In situ olarak melezleşme ile demonte teyidi <ol><li> Dioksijenin-etiketli antisens sentez ve standart laboratuar uygulamaları ya da 26 anlatıldığı gibi uygun kontrol riboprobes seziyorum. </li><li> Daha önce 11,20 açıklandığı ve aşağıda temsilcisi sonuç bölümünde tartışıldığı gibi demonte teyidi için Haugen ark. 27 protokol başına in situ hibridizasyon yürütün. </li></ol></li><li> Immünohistokimyasal olarak demonte Onayı <ol><li> Hedeflenmiş genin protein ürünü karşı antikorların mevcut ise, daha önce tarif edildiği gibi 28, representati örneklendiği gibi fenotip analizi 20 demonte büyük seviyeleri olan bireylerin belirlenmesi kolaylaştıran, immünohistokimya gerçekleştirmekAşağıdaki sonuçlar bölümünde ettik. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Malaria. , World Health Organization. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/topics/malaria/en">http://www.who.int/topics/malaria/en</a> (2014).</li>
<li>Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/dengue/">http://www.cdc.gov/dengue/</a> (2014).</li>
<li>Knipling, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+insects+of+public+health+importance%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Genetic control of insects of public health importance.</a> Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).</li>
<li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female-specific+flightless+phenotype+for+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Female-specific flightless phenotype for mosquito control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).</li>
<li>Wise de Valdez, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+elimination+of+dengue+vector+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic elimination of dengue vector mosquitoes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).</li>
<li>Harris, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+suppression+of+a+field+mosquito+population+by+sustained+release+of+engineered+male+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+dsRNA+for+RNAi+in+insects%3A+an+overview+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+science%22%5BJournal%5D)">Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions.</a> Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).</li>
<li>Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limitation+and+possible+solutions+of+RNAi-based+technology+for+insect+pest+control%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+science%22%5BJournal%5D)">limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control.</a> Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).</li>
<li>Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+genes+in+Aedes+aegypti+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).</li>
<li>Clemons, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-mediated+gene+targeting+in+Aedes+aegypti+embryos+reveals+that+frazzled+regulates+vector+mosquito+CNS+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development.</a> PLoS One. 6 (1), e16730(2011).</li>
<li>Haugen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin-1a+is+required+for+Aedes+aegypti+embryonic+nerve+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development.</a> PLoS One. 6 (6), e21694(2011).</li>
<li>Nguyen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetic+characterization+of+salivary+gland+development+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti.</a> EvoDevo. 4 (1), 9(2013).</li>
<li>Sarro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+commissureless2+function+during+dipteran+insect+nerve+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).</li>
<li>Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+delivery+of+double-stranded+RNA+in+larvae+of+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%3A+implications+for+pest+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control.</a> J Insect Sci. 13, 69(2013).</li>
<li>Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rehydration+driven+RNAi%3A+a+novel+approach+for+effectively+delivering+dsRNA+to+mosquito+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medical+entomology%22%5BJournal%5D)">Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae.</a> Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).</li>
<li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+insect+physiology%22%5BJournal%5D)">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).</li>
<li>Coy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+adult+Aedes+aegypti+mosquitoes+through+oral+delivery+of+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Entomol%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA.</a> J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%2Fdouble-stranded+RNA+nanoparticle-mediated+RNA+interference+to+silence+chitin+synthase+genes+through+larval+feeding+in+the+African+malaria+mosquito+%28Anopheles+gambiae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae).</a> Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).</li>
<li>Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Aedes+aegypti+olfactory+system+development+through+chitosan%2FsiRNA+nanoparticle+targeting+of+semaphorin-1a%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+neglected+tropical+diseases%22%5BJournal%5D)">Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a.</a> PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215(2013).</li>
<li>Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%2FsiRNA+nanoparticle+targeting+demonstrates+a+requirement+for+single-minded+during+larval+and+pupal+olfactory+system+development+of+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti.</a> BMC developmental biology. 14 (1), 9(2014).</li>
<li>Dass, C. R., Choong, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan-mediated+orally+delivered+nucleic+acids%3A+a+gutful+of+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+drug+targeting%22%5BJournal%5D)">Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy.</a> Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).</li>
<li>An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+regulatory+unit+that+controls+melanization+and+affects+longevity+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+life+sciences+%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes.</a> Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).</li>
<li>Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClemons%2C+A+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22">Cold Spring Harb Protoc</a>. 2010 (10), (2010).</li>
<li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-RNAi%3A+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).</li>
<li>Patel, N. H. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatel%2C+NH+%22A+laboratory+guide+to+RNA%3A+Isolation%2C+Analysis%2C+and+Synthesis%22">A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis</a>. PA, K. rieg , Wiley-Liss. (1996).</li>
<li>Haugen, M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugen%2C+M+%22Whole-mount+in+situ+hybridization+for+analysis+of+gene+expression+during+Aedes+aegypti+development%22">Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development</a>. 2010 (10), Cold Spring Harb Protoc. (2010).</li>
<li>Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+analysis+of+protein+expression+during+Aedes+aegypti+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).</li>
<li>Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+of+diel+and+circadian+gene+expression+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li>
<li>Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+Aedes+aegypti+using+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs.</a> Methods. 69 (1), 38-45 (2014).</li>
<li>Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+administration+of+bacterially+expressed+VP28dsRNA+to+protect+Penaeus+monodon+from+white+spot+syndrome+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus.</a> Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).</li>
<li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+nanoparticle+delivered+dsRNA+toward+genetic+control+of+insect+pests%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests).</a> Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).</li>
<li>Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+with+polyvalent+siRNA-nanoparticle+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).</li>
<li>Davis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+RNAi+in+humans+from+systemically+administered+siRNA+via+targeted+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles.</a> Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).</li>
<li>Molinaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine+and+chitosan+carriers+for+the+delivery+of+RNA+interference+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+delivery%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors.</a> Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).</li>
<li>Singha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymers+in+small-interfering+RNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acid+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Polymers in small-interfering RNA delivery.</a> Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada tarif edilen çitosan / müdahale edici RNA nanopartikül yöntem etkili bir şekilde A. larva gelişimi sırasında hedef genlere kullanılmıştır gambiae (Şekil 2, 3) ve A. aegypti (Şekiller 4, 5, 6, Tablolar 1, 2). Kitosan nanopartiküller olarak burada tarif edilen sonuçları ile kanıtlandığı gibi, sivrisinek olarak başarılı bir şekilde kullanılmıştır, her ikisi de uzun dsRNA veya siRNA, ya da hazırlanabilir. DsRNA&#39;nın Sentezi siRNA satın daha az pahalı, am...

Anopheline türü ve aedine cins Kan besleme vektör sivrisinek insanlığın en kötü bela birkaç sorumlu hastalığa neden olan ajanlar iletir. Tahminen 3,4 milyar insan yılda dünya çapında üzerinden bir buçuk milyon kişinin ölümünden sorumlu olan sıtma, sözleşme için risk altındadır. Plasmodium sp enfeksiyonundan Sıtma sonuçları. Başlıca Afrika vektörü Anopheles gambiae (dahil Anopheles cinsi sivrisineklerin enfekte, ısırıkları ile insanlara iletilir parazitler, <a href="http://www.who.int/topics/malaria/en/">http://www.who.int/topics/malaria/en/</a> , 2014) 1. Aedes aegypti dang ateşi, dünyanın en yaygın ve önemli arboviral hastalıktır nonspesifik ateşli hastalığa neden dang virüsü, birincil sivrisinek vektör. Dang virüsü yıllık inciden ile, halen tropik&gt; 2,5 milyar kişiye bir tehdittir24.000 ölüm yıl ~ sonuçlanan yaklaşık 50 milyon olgunun ce ( <a href="http://www.cdc.gov/dengue/">http://www.cdc.gov/dengue/</a> , 2014) 2. Insan sağlığı üzerindeki sivrisinek yoluyla bulaşan hastalıkların yıkıcı küresel etkilerine rağmen, önlenmesi ve bu hastalıkların tedavisinde etkili aracı eksiktir. Sivrisinek kontrolü halen hastalığın önlenmesi en iyi yöntemdir. Vektör böceklerin genetik manipülasyon yoluyla Artropod kaynaklı hastalıkların kontrolü için potansiyeli dört yılı aşkın bir süredir 3 için kabul edilmiştir. A. Transgenik soylar Son zamanlarda transgenik vektör kontrol stratejileri gerçeğe 4-6 kullanarak potansiyelini yaptık aegypti bir bastırılabilir kadın-özel uçamayan fenotip sahip tasarlanmış. Bu gelişmeler vektör kontrolü ve vektör sivrisinek gen fonksiyonunu manipüle ek araçları için yeni genetik hedefler belirlemek için araştırmacılar meydan var. Gen ifadesi d Tadilatınakadın-uçamayan sivrisinekler 4 yılında olduğu gibi uring geliştirme, yeni vektör kontrol stratejilerinin açıklanmasını teşvik edebilir. Ancak, büyük ölçüde teknik zorluklar, çok az genlerin fonksiyonları A. geliştirilmesi sırasında karakterize edilmiştir gambiae, A. aegypti veya diğer sivrisinek türleridir. C yılında keşfedilmesinden bu yana elegans 7, hayvanlar, bitkiler ve mikroorganizmalar muhafaza edilir, RNA interferans (RNAi), yaygın olarak böcekler 8,9 dahil olmak üzere, geniş bir organizma, çeşitli işlevsel genetik çalışmalar için kullanılmıştır. RNAi yolu diziye özgü müdahale RNA olarak işlev kısa 20-25 nükleotid uzunluğundaki siRNA&#39;lar içine Dicer bölünen uzun dsRNA ile başlatılır. transkript ciro, bölünme ve çeviri 9 bozulması teşvik ederek sırayla tamamlayıcı siRNA&#39;lar sessizlik genler. Bir Particula hedefleme uzun dsRNA molekülleri (tipik olarak 300-600 bp) ya da özel siRNA&#39;larR dizisi, ilgi konusu herhangi bir gen susturma araştırma laboratuarda kullanılabilir. RNA teslim edilir müdahale sırasında yöneterek, araştırmacılar hangi gen de inisiyelere susturulması zaman kontrol edebilirsiniz. Bu üretim ve kalıtsal mutasyonlar, henüz tüm böcek türlerinin mevcut değildir pahalı ve emek-yoğun bir süreç taşıyan suşların bakım engelleyebilir gibi gelişimsel öldürücülüğü veya kısırlık gibi zorlukların üstesinden gelmek için kullanılabildiği gibi bu avantaj yararlıdır. RNAi, gen susturma derecesi hayvana geni, dokuya doku ve hayvan geninin arasında değişebilir, ancak, RNAi yaygın sivrisinek ve diğer böcekler 8,9 genlerin işlevsel analiz için kullanılmaktadır. Üç müdahale RNA teslim stratejileri sivrisinekler kullanılmıştır: mikroenjeksiyon, iliklerine / topikal uygulama, ve yenmesi. Detaylı bir tarih ve böcekler bu üç teknikler kullanılarak Karşılaştırma için, Yu ve arkadaşları 8 bakınız. WE başarılı bir şekilde A. gelişim hedef genlere siRNA&#39;lar vermek için bir araç olarak mikroenjeksiyon 10 kullandık aegypti embriyolar, larva, pupa ve 11-14. Ancak, bu emek-yoğun teslimat strateji mikroenjeksiyon kurulum ve yetenekli bir el hem de gerektirir. Ayrıca, mikroenjeksiyon davranışsal fenotipleri değerlendirilecek, özellikle organizma, bir karıştırıcı faktör streslidir. Son olarak, mikro-enjeksiyon aktarım vektörü kontrol alanına uzatılamaz. Bu uygundur ve küçük ekipman veya emek gerektirir bir alternatif olarak, RNA çözümü müdahale organizmayı iliklerine de, gen susturulması tetikleme popüler bir araç haline gelmiştir. Islatma öncelikle böcek hücre hattında uygulanmaktadır 8 çalışmaları, ancak son çalışmada, Knockdown A&#39;da elde edildi aegypti larva hayvanlar sindirerek ortaya çıktı dsRNA 15, ihtiva eden bir çözeltiye batırılır. Bununla birlikte, birden fazla experimenta analizini kapsayan çalışmalar içinL grubu veya fenotipleri, ıslatma oldukça maliyetlidir. Lopez-Martinez ve diğ. 16 RNAi, engelleyen RNA ihtiva eden tek bir su damlası ile tuzlu su çözeltisi ve rehidrasyon dehidratasyon içeren RNA teslim müdahale için yeni bir yaklaşım tahrik rehidrasyon tarif. Bu yaklaşım, tüm hayvan daldırma ile ilişkili maliyetlerini düşürmek, ancak mikroenjeksiyon daha pahalı ve yüksek ozmotik basınçları tolere edebilir türlere uygulanması sınırlı edilebilir değildir. Ayrıca, daldırma ya da dehidrasyon / rehidrasyon daldırma yöntemi alanında vektör kontrolü için uyarlanabilir nasıl tasavvur etmek zordur. Bu nedenlerden dolayı, post-embriyonik çalışmalar için alınan gıda ile müdahaleci RNA teslim uygun bir alternatif bir stratejidir. Yenmesi-tabanlı stratejiler, tüm böcek türleri, belki de en önemlisi Drosophila melanogaster çalışmıyor rağmen, gıda ile karışık RNA müdahale oral teslim gen si terfi ettiBöceklerin 8,17 çeşitli lencing, aşağıdakileri içeren A. aegypti yetişkin 18. Bu A&#39;da kitosan nanopartikül aracılı RNAi tarif gambiae larva 19 ve başarılı bir şekilde A. gen ekspresyonunun azaltılması için, bu yaklaşım uyguladık aegypti larvaları 20,21. Burada, polimer kitosan ile RNA müdahale sürüklenmemesine içerir bu RNAi prosedürü, metodolojisi, ayrıntılı. Kitosan / müdahale edici RNA nanopartiküller çitosan amino gruplarının pozitif yüklerin ve RNA 19 müdahale omurgasında fosfat grupları tarafından taşınan negatif yük arasındaki elektrostatik kuvvetler aracılığıyla müdahaleci RNA ile polikatyonlar kendini düzenlemesinden oluşur. açıklanan prosedür uzun dsRNA moleküllerinin (bundan sonra siRNA olarak anılacaktır) siRNA şeritli (bundan sonra dsRNA olarak anılacaktır) ya da çift ile uyumludur. Aşağıdaki sentez, çitosan / müdahale edici RNA nanopartiküller Konukçu ile karıştırıldı ve teslim edilirOral yoldan alım yoluyla larva. Bu metodoloji, nispeten ucuz küçük ekipman ve emek gerektirir 19, ve davranışların 20,21 analizi de dahil olmak üzere çok sayıda fenotip, yüksek verimlilik analizini kolaylaştırır. Diğer hastalık vektörleri ve böcek tarım haşere de dahil olmak üzere diğer böcekler, gen susturma çalışmaları için adapte edilebilir Bu metodoloji, potansiyel olarak diğer hayvan türlerinin çeşitli gen susturma için kullanılabilir. Ayrıca, çitosan, ucuz, toksik olmayan ve biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer 22, potansiyel olarak türe özgü sivrisinek kontrolü için alanda kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>0.02 ml pipetteman</td><td>Rainin</td><td>PR20</td><td>enterferans yapan RNA'nın resüspansiyonu için</td></tr><tr><td>0.2 ml pipetteman</td><td>Rainin</td><td>PR200</td><td>interferans yapan RNA'nın resüspansiyonu ve enterferans yapan RNA/nanopartiküllerin hazırlanması için</td></tr><tr><td>0.5 ml dereceli tüp&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-408-120</td>, <td>yeniden süspanse edilmiş enterferans yapan RNA'nın alikote edilmesi</td></tr><tr>için<td>1 ml pipetteman</td>, <td>enterferans yapan RNA'nın yeniden süspansiyonu ve enterferans yapan RNA/nanopartiküllerin hazırlanması için</td><td>Rainin</td><td>PR1000</td></tr>, <tr><td>1.5 ml dereceli tüp&nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-408-046</td>, <td>enterferans yapan RNA/nanopartiküllerin hazırlanması için</td></tr><tr><td>1M Sodyum Asetat, pH 4.5</td><td>TEKnova</td><td>S0299</td>, <td>sodyum asetat tamponu</td></tr><tr><td>hazırlamak için, Asetik Asit, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Sınıf</td><td>BDH</td><td>VWR BDH3092-500MLP</td>, <td>sodyum asetat tamponu hazırlamak için</td></tr><tr><td>Agaroz Genetik Teknoloji Sınıfı</td><td>MP Biyomedikal LLC.</td><td></td><td>Hazırlanan enterferans yapan RNA/nanopartikülleri kaplamak için</td></tr><tr><td>800668 Santrifüj</td><td>Eppendorf AG</td><td>5415D</td><td>enterferans yapan RNA/nanopartikülleri peletlemek için</td></tr><tr><td>Chitosan, karides kabuklarından</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3646-25G</td>, <td>enterferans yapan RNA/nanopartiküllerin hazırlanması için enterferans yapan RNA ile birleştirmek için</td></tr><tr><td>Dry Yeast</td><td>Universal Food Corp</td><td>NA</td><td>, enterferans yapan RNA ile sivrisinek larva yemi hazırlamak için/ nanopartiküller</td></tr><tr><td>E-RNAi aracı</td><td>Alman Kanser Araştırma Merkezi</td><td></td><td>dsRNA tasarımı için NA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//</td></tr> <tr><td>Japon balığı yemi</td><td>Wardley</td><td>Japon balığı FLAKE FOOD</td>, <td>enterferans yapan RNA/nanopartiküller içeren sivrisinek larva yemi hazırlamak için</td></tr><tr><td>Isıtılmış su banyosu</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221048</td>, <td>enterferans yapan RNA/nanopartikülleri 55oC'de ısıtır</td></tr><tr><td>Buz</td><td>uygulanamaz</td>, <td>enterferans yapan RNA'nın çözülmesi ve enterferans yapan RNA/nanopartiküllerin</td><td></td></tr><tr> hazırlanması için geçerli değildir<td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Buz kovası</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-591-44</td><td>işlem sırasında kullanılan buzun saklanması için</td></tr><tr><td>karaciğer tozu</td><td>MP Biomedicals LLC.</td><td></td><td>Parazit sonrası sivrisinek larvaları 900396 beslenir RNA/nanopartikül tedavisi sonrası</td></tr><tr><td>Mikrodalga fırın</td> % <td>2 agaroz çözeltisi hazırlamak için</td><td>geçerli olmayan</td><td>çeşitli satıcılar</td></tr><tr><td>petrik (100 x 15 mm)</td><td>Fischer Scientific</td><td>875713</td><td>larvalar için enterferans yapan RNA/nanopartikül besleme odası</td></tr><tr><td>pH metre</td><td>Tamponların hazırlanması için</td><td>Mettler Toledo</td><td>S220</td></tr><tr><td>Jiletli bıçak</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-640</td>, <td>beslemeler için enterferans yapan RNA/nanopartikül peletini bölmek için</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Thermo Scientific/Dharmacon</td><td>siRNA/nanopartiküllerin hazırlanması için</td><td>özel</td></tr><tr><td>Sodyum Sülfat, Susuz (Na2SO4)</td><td>BDH/VWR</td><td>VWR BDH0302-500G</td> tarafından dağıtılarak <td>enterferans yapan RNA'nın olacağı 50 mM sodyum sülfat çözeltisi hazırlamak için su</td></tr><tr><td>banyosu sıcaklığını ölçmek için</td>yeniden askıya alınmış<td>Termometre</td><td>VWR</td><td>61066-046</td></tr><tr><td>Kürdanlar</td><td>VWR</td><td>470146-908</td>, <td>enterferans yapan RNA/nanopartikül gıda hazırlama ve jel peletlerini kesme sırasında karıştırma için</td></tr><tr><td>Ultra düşük dondurucu</td><td>Enterferans yapan RNA alikotlarının ve enterferans yapan RNA/nanopartiküllerin -80oC'de depolanması için</td> <td>geçerli olmayan</td><td>çeşitli satıcılar</td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-216-108</td>, <td>kitosan/enterferans yapan RNA'nın hazırlanması için</td></tr><tr><td>Ağırlık kağıdı</td><td>Fischer Scientific</td><td>NC9798735</td>, <td>beslemeler için enterferans yapan RNA/nanopartikül peletini bölmek için</td></tr></tbody></table>

hastalık vektör sivrisinek larva içinde kitosan / müdahale rna nanopartikül aracılı gen susturma

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Vektör Sivrisinek başka bir organizma daha çok insan acı indirebilmek - ve bir milyondan fazla insanı her yıl öldürmek. Sivrisinek genom projeleri birincil Afrika sıtma vektörü Anopheles gambiae ve dang ve sarı humma vektör Aedes aegypti fonksiyonel genetik çalışmalar da dahil olmak üzere sivrisinek biyoloji yeni yönleriyle, araştırma kolaylaştırdı. RNA parazitsiz (RNAi-) aracılık ettiği gen susması, bu hastalık taşıyıcıları sivrisinek türlerinin her ikisi de ilgi genleri hedef olarak kullanılmaktadır. Burada, gıda ile birlikte ve larvaları tarafından sindirilen RNA nano-tanecikleri müdahale / çitosan hazırlanması için bir prosedür tarif eder. Uzun çift kollu RNA (dsRNA), ya da küçük müdahale edici RNA (siRNA) molekülleri ile uyumlu olan bu teknik basit, yüksek hacimli, ve nispeten pahalı olmayan bir yöntem, A. farklı geninin başarılı bir şekilde demonte kullanılmaktadır gambiae ve A. aegyptiMah-PCR ile veya in situ hibridizasyon doğrulandı larva. larva beslenmeye ardından, demonte, en azından geç pupa aşamasından devam edebilirsiniz. Bu yöntem, bir sivrisinek ve tarımsal zararlıların da dahil olmak üzere diğer böcek türleri, çok çeşitli, hem de diğer olmayan modeli organizmalar için de geçerli olabilir. Araştırma laboratuarında de yararlı ek olarak, gelecekte, çitosan, ucuz, toksik olmayan ve biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer içinde, potansiyel alanında kullanılabilir.

<html> A. gambiae: Kitosan / dsRNA&#39;nın nanopartiküller bağlı çitosan amino grupları ve dsRNA&#39;nın fosfat grupları arasındaki elektrostatik etkileşim oluşur. çözeltiden dsRNA&#39;nın azalması ile ölçülen nanopartiküller olarak dsRNA dahil verimliliği genellikle% 90 üzerindedir. Atomik kuvvet mikroskopisi görüntüler şunu gösterir ki, 100-200 nm&#39;de (Şekil 1) arasında değişen çap olarak kitosan-dsRNA parçacık boyutu ortalama 140 nm. <p cla...

Burada larvaları tarafından sindirilen RNA nano-tanecikleri / kitosan kullanımı yoluyla hastalık taşıyıcıları sivrisinek gen fonksiyonunun inhibe edilmesine müdahale için bir prosedür tarif eder.

Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Bu prosedürün genel amacı, gen susturma çalışmaları için tussinle etkileşime giren RNA nanopartikülleri tasarlamak ve bunları sivrisinek larvalarında kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle kitin ve etkileşime giren RNA'nın birleştirilmesi, ardından ısıtma, vorteksleme ve santrifüjleme yoluyla tussinle etkileşime giren RNA nanopartikülleri hazırlanarak gerçekleştirilir. Bir sonraki amaç, besin ve nanopartikül içeren jel peletleri hazırlamak için nanopartikülleri larva besini ve agar ile karıştırmaktır.Nanoparçacık içeren gıdalar sivrisinek larvalarına verilir ve peletle beslenen larvalar, nihayetinde kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile gen susturulmasının doğrulanmasını takiben gözlemlenir. Veya C'de iki hibridizasyon analizi yapılır. Fonksiyon kaybı fenotipleri incelenebilir.Bu yöntem, vektör sivrisinek araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, koku sisteminin, beyin orta bağırsağının ve vektör açısından önem taşıyan diğer dokuların gelişimi sırasında genlerin işlevlerini incelemek için bu yöntemi kullandık. Bu tekniğin temel avantajları; yüksek verimli olması, nispeten düşük maliyetli olması ve daha yüksek düzeyde beceri gerektiren ve sahada uygulanamayan mikroenjeksiyon yoluyla interfere eden RNA iletimine kıyasla organizma için daha az stresli olmasıdır.Doktora sonrası araştırmacı Ava Maur ile birlikte teknisyen Ping Lee prosedürü uygulamalı olarak gösterecektir. Başlamak için, %0,02'lik bir çalışma çözeltisi hazırlamak amacıyla tussin maddesini 0,1 molar sodyum asetat tamponunda çözün. Çözeltiyi kullanımdan önce oda sıcaklığında tutun. Ardından, bundan sonra girişimci RNA olarak adlandırılacak olan çift zincirli RNA'yı veya küçük girişimci RNA'yı 50 microliters deiyonize suda çözün.100 µL 50 mM sodyum sülfat içinde 32 µg nükleik asit içeren 100 µL'lik bir çözelti hazırlayın. Ardından, girişime neden olan RNA çözeltisine 100 µL tussin çözeltisi ekleyin. Karışımı bir su banyosunda 55 °C'de bir dakika boyunca ısıtın.100 µL 50 mM sodyum sülfatı, 100 µL Tustin çözeltisine ekleyerek bir kontrol grubu oluşturun ve ısıtma işleminin ardından aynı prosedürü uygulayın. Nanopartiküllerin oluşumunu kolaylaştırmak için çözeltileri oda sıcaklığında, yüksek hızda vorteksleyerek hemen 30 saniye boyunca karıştırın; ardından karışımı oda sıcaklığında 13.000 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin, bu işlemin sonunda bir pelet görünür olmalıdır. Süpernatantı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve peleti kullanmadan önce oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca havada kurutun.UV spektrofotometrisi kullanarak sivrisinek besini hazırlamak için, snat içerisinde kalan toplam interferans RNA miktarını hesaplamak amacıyla kontrol grubundan alınan S süpernatantını kör olarak kullanarak SNAT'taki interferans RNA konsantrasyonunu ölçün. Nanopartiküllere hapsolan interferans RNA yüzdesini hesaplamak için, başlangıçtaki interferans RNA miktarları ile süpernatantlarda kalan miktarlar arasındaki farkı kullanın. Bu yükleme verimliliği normalde %90'ın üzerindedir. Daha fazla nanopartiküle ihtiyaç duyulursa aynı prosedürü tekrarlayın.Kullanım öncesi partiküllerin soğuk depolama etkileri değerlendirilmediği için kurutulmuş nanopartikülleri hemen kullanın. Sivrisinek yemini formüle etmek için öncelikle deiyonize su içerisinde %2'lik bir agro çözeltisi hazırlayın ve agroyu eritin. Eritilmiş agro çözeltisini kullanmadan önce 55 °C'lik bir su banyosunda tutun.Ardından, balık yemi pulları ile kuru mayayı bir iki oranında karıştırın. Karışımı bir havan ve havan eli yardımıyla küçük parçacıklar haline gelene kadar öğütün. Öğütülen yem kahverengimsi bir renktedir.1,5 mililitrelik bir tüpte, öğütülmüş gıdayı kuru nanoparçacıklarla bir kürdan yardımıyla altı miligram olacak şekilde karıştırın. Ardından, gıda-nanoparçacık karışımına 30 mikrolitre %2'lik ön eritilmiş agros jel çözeltisi ekleyin. Bir kürdan veya pipet ucu kullanarak hemen ve iyice karıştırın.Besin ve nanoparçacıklar içeren jel, Anopheles gambiae sivrisinek larvalarının beslenmesi için artık hazırdır. Bir kürdan yardımıyla 1,5 mililitrelik tüpten tek bir jel pellet çıkarın ve temiz bir jilet veya kürdan kullanarak bunu dört eşit parçaya bölün. Ardından 3. gün larvalarını, 100 mililitre deiyonize su içeren bir Petri kabına aktarın.Her bir Petri kabına jel peletinden küçük parçalar halinde doğranmış bir dilim ekleyerek sivrisinek larvalarını besleyin. Dört gün boyunca günde bir kez, larvaların peleti yediğini gözlemlediğinizden emin olun; peletin boyutu bir sonraki güne kadar önemli ölçüde azalmış olmalı veya tamamen tükenmiş olmalıdır.Sivrisinekler larval aşamasında dördüncü evrenin sonuna kadar gelişecektir. Deney boyunca gözlemlenen tüm fenotipik değişiklikleri kaydedin. Seksen adet GTI sivrisinek larvasını beslemek için uygulanan dört günlük sürenin sonunda, metin protokolünde tartışıldığı üzere transkript seviyelerini ve diğer fenotipik değişiklikleri inceleyin.Daha önce olduğu gibi, temiz bir jilet veya kürdan kullanarak jel peletini dört eşit dilime bölün. Ardından, yumurta çıkışından 24 saat sonra senkronize edilmiş 50 h yıldız larvalarını bir Petri kabına yerleştirin.Yaklaşık 40 mililitre deiyonize su içerisinde. Larvaları, Petri kabı başına bir dilim olacak şekilde günde dört saat boyunca besleyin. Dilim, yine ince bir şekilde daha küçük parçalara bölünmelidir.Ardından larvaları, günün geri kalanı için ikiye bir oranında öğütülmüş balık yemi pulcukları ve kuru mayadan oluşan normal larval diyetiyle geri transfer edin. Bu prosedürü dört larval instar boyunca her gün tekrarlayın. İstenilen gelişim zamanında, metin protokolünde tartışıldığı üzere transkript seviyelerini ve diğer fenotipik değişiklikleri inceleyin.Burada gösterilen noktalar, beklendiği gibi normal görünen, kontrol grubuyla beslenmiş dördüncü instar Anis gambi larvalarıdır. Ancak, kitin sentaz 1'i hedefleyen kitin engelleyici RNA ile beslenen larvalarda, gastrik boşluğa sızan dekstrin mavisi ile kanıtlandığı üzere, paraatrofik matriks bozulmuştur. Kontrol grubuyla beslenmiş dördüncü instar Aedes aegypti larvalarının antenlerinde zorunlu koku reseptör ko-reseptörü orco'nun normal ekspresyonu gözlemlenmektedir.Buna karşılık, single-minded genini hedefleyen siRNA ile beslenen hayvanlarda, kontrol grubundaki hayvanlarla karşılaştırıldığında Orco ekspresyonu görülmemektedir. Single-minded nakavt edilen hayvanlar, defektif koku takip davranışı sergilemektedir. Bu videoyu izledikten sonra, vektör sivrisinek gelişimi sırasında genleri susturmak için siRNA nanopartiküllerinin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.Potansiyel olarak yetişkin sivrisineklerin veya diğer gelişmekte olan model organizmaların çalışılmasına genişletilebilecek olan bu teknik, araştırmacıların hastalık vektörü sivrisinek genom projelerinde tanımlanan genlerin işlevlerini keşfetmesinin yolunu açmıştır.

chitosaninterfering-rna-nanoparticle-mediated-gene-silencing-disease

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ters genetik yaklaşımlar sivrisinek vektör patojenler için hangi genlerin altta ya direncini belirlemek için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu video protokolü Dimopoulos laboratuar tarafından dsRNA Anofel gambiae sivrisinekler, sıtma paraziti limanın içine enjekte etmek için kullanılan bir yöntem gösteriyor. Enjeksiyon kurulum ve toraks içine enjekte dsRNA manipüle tekniği gösterilmiştir.

Yetişkin Sivrisinekler (A. gambiae) RNAi Tahliller için protokol

Bu protokolü biz bir ile RNAi-aracılı gen susturulması...

RNAi-aracılı Gene Nakavt ve<em&gt; In Vivo</emYetişkin Kadınlar&gt; diürez Testi<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Sivrisinekler

RNA girişimi (RNAi), gen fonksiyonunu ortaya çıkarmak için son derece değerli bir araçtır. Bununla birlikte, yetişkinlik öncesi aşamalarda RNAi kullanarak genleri hedefleme yeteneği, başlıca insan sıtma vektörü Anopheles gambiae'de sınırlıdır. Pupa gelişimi sırasında doğrudan enjeksiyon yoluyla gen fonksiyonunu azaltmak için bir RNAi protokolü tanımladık.

içine RNAi Tetik Teslimat<em&gt; Anofel gambiae</em&gt; Pupa

Arızalı rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo iletim sistemi geliştirmek için yapay bir intronic küçük RNA ifade strateji kullanarak rapor. İnşaat, ambalaj ve larva enfeksiyon gelince de rAaeDV vektörlerin kantitatif analiz için detaylı bir yordam açıklanır.

Sivrisinek larva genlerin fonksiyonel analiz için bir gen teslim vektör olarak rekombinant sivrisinek Densovirus kullanın

Bu el yazması Almanca hamamböceği lipozomlar içinde kapsüllü çift iplikçikli RNA'ın sözlü sindirim yoluyla gen ifadesinin içinde midgut tükenmesi gösterir.

RNA müdahale pratik kullanımı: lipozom taşıyıcıları hamamböceği için çift iplikçikli RNA'ın sözlü teslim

Bu makalede damar doku bitkiler için RNA müdahale (RNAi) böcekler besleme phloem sap ile çift iplikçikli RNA (dsRNA) oral teslimat için geliştirilen roman tekniklerini gösterir.

Phloem ve Hemipteran böcekler bitki su besleme RNA müdahale ikna etmek için çift iplikçikli RNA Oral teslim yöntemleri

Bu iletişim kuralı biz standart ve birkaç yıl boyunca belirli miktarda nükleik asitler, sivrisinekler ve evi sinekler hemolymph doğrudan teslim etmek için kullanılan bir mikroenjeksiyon metodoloji açıklar. Bu iletişim kuralı en az enjeksiyon mortalite sonuçları ve ilişkili doz ölçümleri verimlilik sağlar.

Tekrarlanabilir dsRNA mikroenjeksiyon ve Oviposition Bioassay sivrisinekler ve evi sinekler

Caenorhabditis elegans'ta rutin olarak kullanılan RNA girişimi (RNAi) için bir dağıtım yöntemi olan bakteriler tarafından üretilen dsRNA'nın oral yoldan uygulanması, burada yetişkin sivrisineklere başarıyla uygulanmıştır. Yöntemimiz, enjeksiyon kullanmadan sağlam ters genetik çalışmalarına ve iletimi engelleyen vektör çalışmalarına izin verir.

Yetişkin Anofeller gambiae Sivrisineklerine Etkili Oral RNA İnferferi (RNAi) Uygulaması

Burada sunulan, ipekböceği Bombyx mori larvalarında yutma yoluyla gen susturmayı indüklemek için kitosan/dsRNA nanopartikül dağıtımı için bir protokoldür.

İpekböceği Bombyx mori'de Chitosan/dsRNA Nanopartikül Dağıtımı ile Larva RNA Girişimi

Knock-down gen ekspresyonu için bir virüs kaynaklı gen susturulması (VIGS) yöntemi...

Virüs indüklenen gen susturma (VIGS) Nicotiana benthamiana Ve Domates

Keşfedin hastalık vektörü sivrisinek larvalarında kitosan/RNA nanopartiküllerle gen susturma yöntemini. Bu teknik gelişim biyolojisi ve gen fonksiyonu çalışmaları için yüksek verimli bir araç sunar.

Hastalık Vektör Sivrisinek Larva içinde Kitosan / Müdahale RNA Nanopartikül Aracılı gen susturma

Daha fazla video keşfet