ICPMS Numune Giriş için mikroakışkan Chip

Bu prosedürün genel amacı, tek hücreler veya sulu çözeltiler içeren mono-dispers mikro damlacıkların elementel kompozisyonunu I-C-P-M-S ile oluşturmak ve nicel olarak analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle PDMS ile replika kalıplama yöntemi kullanılarak bir mikroakışkan çip üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise şırınga pompalarının mikroakışkan çipe bağlanmasıdır.

Pompalara sulu numune ile yüksek uçuculuğa sahip olan ve kabul edilebilir olan veya organik taşıyıcı faz PFH sağlanacaktır. Şırınga pompası açıldığında, mikroakışkan çip, PFH ile akış odaklama yaparak sulu numune çözeltisinin veya bir hücre süspansiyonunun monodispers damlacıklarını oluşturur ve bu damlacıkları ek PFH ile sıvı bir jet olarak çipten dışarı atar. Son adım, çipin, damlacıkları buharlaştıran bir kartuş ısıtıcı ve damlacık içeriğinin bir I-C-P-M-S ile iyonizasyonu ve tespitinden önce solventleri uzaklaştıran bir membran desolvatörden oluşan bir taşıma düzeneğine yerleştirilmesidir.

Nihayetinde, kaydedilen sinyaller ve standart bir çözelti ile yapılan kalibrasyon ölçümü, numune çözeltisinin veya süspansiyondaki hücrelerin elementel kompozisyonunu belirlemek için kullanılır. Mikroakışkan tekniğimizin mevcut yöntemlere göre temel avantajları, ayarlanabilir damlacık boyutu, düşük numune tüketimi ve hücre süspansiyonları veya konsantre tuz çözeltileri ile çalışırken tıkanma riskinin düşük olmasıdır. Ayrıca, düşük maliyetli tek kullanımlık mikroakışkan çip, temizleme süresini ortadan kaldırır ve çapraz kontaminasyonu önler.

Prosedür, Profesör GTA'nın laboratuvarından doktora öğrencisi all vin sc ve benim laboratuvarımdan doktora öğrencisi Pascal Fabrica tarafından uygulamalı olarak gösterilecektir. MİKROFABRİKASYON işlemine başlamak için, büyük plastik bir kapta 40 gram PDMS ve dört gram PDMS kürleme ajanı ölçün. Her iki kısmı bir spatula ile eşit şekilde karıştırın ve karışımı tüm kabarcıklardan arındırmak (gaz gidermek) için kabı 20 ila 30 dakika boyunca bir vakum desikatörüne yerleştirin.

Gaz giderme işlemi sırasında, bir döküm kalıbını mikro yapılı bir silikon gofretin üzerine yerleştirin ve tasarımı çevreleyen kılavuz yapıyı kullanarak kalıbı düz bir silikon gofret üzerine oturtun. Üzerine serbestçe başka bir döküm kalıbı yerleştirin.

Yaklaşık üç ila dört gram Degas PDMS karışımını her iki döküm kalıbına dökün. Her iki silikon gofretini bir ısıtıcı tabla üzerine aktarın. PDMS'yi 150 °C'de altı dakika boyunca kürleyin ve ardından soğutun.

Oda sıcaklığında tezgah üzerindeki katılaşmış PDMS yapılarını metal bir spatula ile alın. Katı PDMS bloklarını kalıplardan dikkatlice ayırın. Her iki bloğun yapışma yüzeylerini partikül ve parmak izi kontaminasyonuna karşı koruyun.

Şeffaf bir scotch bant katmanı uygulayarak, PDMS parçalar artık tutulabilir ve makasla istenen boyuta göre kesilebilir. Kesme işleminden sonra, mikro yapılandırılmış PDMS bloktan bandı çıkarın ve mikroakışkan giriş portlarını oluşturmak için bir biyopsi delgeç kullanın. Bu işlem, cihazın mikro yapılandırılmış yarısının fabrikasyon sürecini tamamlar ve parça artık düz karşıt parçasıyla yapıştırılmaya ve birleştirilmeye hazırdır.

PDMS'den PDMS'ye yapıştırma işlemi için yüzeyleri hazırlamak amacıyla, öncelikle boş bir silikon gofret üzerine 6.000 RPM hızında 30 saniye boyunca bir katman PDMS kürleme ajanı spin coating yöntemiyle kaplayın; kürleme ajanı henüz ıslakken, mikro yapılandırılmış PDMS bloğunun yapıştırma arayüzünü gofret ile temas ettirin ve kabarcıksız, eksiz bir mühür oluşturmak için PDMS'nin üzerine hafifçe baskı uygulayın. Ayrı bir adımda, düz karşı parçadaki koruyucu bandı çıkarın. Ardından, mikro yapılandırılmış PDMS'yi silikon gofretten yavaşça ayırın.

İki PDMS parçayı dikkatlice hizalayın ve iki yapıştırma arayüzünü birbirine temas ettirin. Arayüzdeki hava kabarcıklarını gidermek için iki bloğu hafifçe sıkın ve monte edilmiş PDMS çipi oda sıcaklığında 24 saat boyunca kürleyin. Bir maket bıçağı ve bir hizalama cihazı kullanarak, çıkış nozülüne dik olan gösterge çizgisi boyunca bir kesik yapın. Çipi, açık çıkış nozülünün bitişiğinde kırpma kusurları ve partikül kontaminasyonu açısından mikroskop altında inceleyin.

Fabrikasyon kalitesi değerlendirildikten sonra, PDMS mikrokanalın iç yüzeyleri silanizasyona hazır hale gelir. Kimyasal çeker ocak içerisinde, bir wolf şişesinin bir ucunu kuru bir nitrojen kaynağına, şişenin diğer ucunu ise PDMS çipin girişlerine bağlayın. Merkezi bir manifolde bağlı çoklu tüpler kullanarak, wolf şişesine 50 µL silan pipetleyin ve üst kapağı sızdırmaz şekilde kapatın.

Azot taşıyıcı akışını açın ve mikro kanalları, saniyede yaklaşık bir mililitre akış hızında 20 dakika boyunca tuzlu su içeren buharla yıkayın. Son olarak, giriş tüplerini wolf şişesinden ayırın. Kaplanmış PDMS çipler, tek hücre kütle spektrometrisi ölçümleri için kütle spektrometresi deneylerine hazırdır.

İlk olarak, efektif hücre konsantrasyonu mililitre başına 10 milyon hücreden az olacak şekilde giriş örneğini uygun bir tamponla seyreltin. Kütle spektrometrisi hazırlığı için, önce numune şırıngalarına tüpleri takın. İki adet beş mililitrelik şırıngaya PFH yükleyin ve giriş örneğini ayrı bir bir mililitrelik şırıngaya yükleyin. Şırıngaların ve tüplerin içinde hapsolmuş tüm hava kabarcıklarını giderin ve iki şırıngayı bir şırınga pompasına yerleştirin.

Taşıma tüpünün düzgün şekilde hizalandığından ve tüm gaz borularının bağlı olduğundan emin olun. Ardından, şırınga borularını PDMS çipin giriş portlarına bağlayın ve şırınga pompasını üç ila beş dakika boyunca çalıştırın. Bu akış stabilizasyon işlemi sırasında, çıkış portundaki fazla sıvıyı bir mendil yardımıyla temizleyin.

Çipten çıkan sıvı düz bir jet oluşturmuyorsa, beş dakika sonra temiz bir mendille çip çıkışındaki olası tıkanıklıkları silmeye çalışın. Başarısız olunursa, mevcut çipi atın ve bağlantıyı yeni bir çip ile değiştirin.

Siklonik püskürtücü adaptöründeki tıpaları çıkarın ve akışı stabilize edilmiş PDMS çipi dikkatlice adaptöre yerleştirin. Akış hızını önerilen ayarlara göre değiştirin ve akışı iki ila beş dakika boyunca yeniden stabilize edin. Aynı zamanda, ilgilenilen analitin maksimum sinyal yoğunluğu elde edilene kadar tüm gazların akış hızlarını ayarlayın.

Ayrıca, sinyal optimizasyonunun ardından sinyal yoğunluğunu daha da artırmak için kütle spektrometresindeki plazma gücünü ve odaklama lens voltajını ayarlayın. Kütle spektrometresini 10 milisaniyelik bir dwell süresine ayarlayın ve veri toplama işlemine başlayın. Ölçümlerden sonra, ham verileri bir veri analiz programına aktarın.

Tipik bir veri analiz rutini kapsamında, tüm ölçümler öncelikle her bir kutu (bin) 10 milisaniyelik bekleme süresi başına düşen sayım sayısını temsil edecek şekilde veri kutularına ayrılır, ardından tüm kutular için bir histogram grafiği oluşturulur ve Gaussian dağılım fonksiyonu ile uydurulur (fitted). Bireysel uydurmaların ortalaması ve yayılımı, belirli bir kütle şarj oranındaki ortalama sinyal yoğunluğunu ve standart sapmayı temsil eder. Kalibrasyon işlemine başlamak için, öncelikle standart bir çözeltiyi örneğinizle aynı akış hızında ölçün.

Damlacık üretimi için PDMS çipini kullanarak, PFH için iki adet beş mililitrelik şırınga ve standart çözelti için bir adet bir mililitrelik şırınga hazırlayın. Ardından, bir Petri kabını mikroskop numune tutucu olarak kullanarak, PDMS çipini Petri kabının içine yerleştirin ve önceki protokol adımlarını izleyerek çipi düşük büyütmede odaklayın. PDMS mikrokanalındaki damlacık üretimini, yüksek hızlı bir kamera ile üç ila beş dakika boyunca stabilize edin.

Kayıtlardan ortalama damlacık çapını elde etmek için, çip üzerindeki ikincil bağlantı noktasında sulu damlacıkların görüntülerini kaydetmeye başlayın. Özel bir damlacık morfolojisi, optometrisi ve velo simetrisi paketine sahip bir görüntü analiz yazılımı kullanın. Her bir damlacığın küresel bir nesne olarak modellenebileceği varsayıldığında, ortalama damlacık hacmi, yazılım tarafından elde edilen ortalama damlacık çapı kullanılarak tahmin edilebilir.

Ardından, bir damlada bulunan analit kütlesini elde etmek için numunenin bilinen analit konsantrasyonunu ortalama damlacık hacmine bölün. Daha sonra, elde edilen kütleyi atom sayısına dönüştürün. Son olarak, damlacık başına ölçülen iyon sayısını bir önceki sonuca bölerek genel tespit verimliliğini hesaplayın.

Bu tespit verimliliği, artık bilinmeyen bir numunedeki atom sayısını belirlemek için bir kalibrasyon miktarı olarak kullanılabilir. Bir mikroakışkan damlacık jeneratörü kullanılarak, tek hücreler ortalama 50 mikrondan daha küçük bir çapta monodispers sulu damlacıklar içine kapsüllenebilir ve I-C-P-M-S ile analiz edilebilir. Sulu damlacığı çevreleyen organik PFH kılıf, numune I-C-P-M-S dedektörüne ulaşmadan önce kolayca uzaklaştırılabilir.

Çözeltiler ölçülürken, yüksek damlacık monodispersitesi, belirli bir bekleme süresi boyunca tekli, ikili veya üçlü damlacık sayılarından gelen sinyal grupları arasındaki düşük varyanslar olarak gözlemlenebilir. Uygun kalibrasyonun ardından, her biri tekil damlacıklar içinde süspande edilmiş tekil sığır alyuvarlarından oluşan bir topluluktaki demir içeriği belirlenebilir. Bu videoyu izledikten sonra, çok küçük numune hacimlerinin veya tekil partikül ve hücrelerin kantitatif elementel analizi için bu mikroakışkan çiplerin nasıl hazırlanacağı ve kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu çiplerin üretimi, düzgün bir şekilde gerçekleştirildiğinde çip başına 15 dakikadan daha az aktif çalışma süresi gerektirir. Ayrıca, kolayca modifiye edilebilen çipler, gelişmiş numune ön işleme ve verimlilik ile numune çıktısını artırmak için numunelerin ve standartların eş zamanlı olarak verilmesini sağlayan ek mikroakışkan modüllerin entegrasyonuna olanak tanır.