ICPMS Numune Giriş için mikroakışkan Chip

Bu prosedürün genel amacı, I-C-P-M-S ile tek hücreler veya sulu çözeltiler içeren mono dağılmış mikro damlacıkların temel bileşimini oluşturmak ve kantitatif olarak analiz etmektir. Bu, önce PDMS ile replika kalıplama kullanılarak bir mikroakışkan çip üretilerek gerçekleştirilir. İkinci adım, şırınga pompalarını mikroakışkan çipe bağlamaktır.

Pompalar, sulu numuneyi ve yüksek derecede uçucu ve kabul edilebilir veya organik taşıyıcı faz PFH'yi sağlayacaktır. Şırınga pompası açıldığında, mikroakışkan çip, sulu numune çözeltisinin mono dağılmış damlacıklarını veya akış yoluyla bir hücre süspansiyonunu üretir, PFH ile odaklanır ve bu damlacıkları ek PFH ile çipten sıvı bir jet olarak çıkarır. Son adım, çipi, damlacıkları buharlaştıran bir kartuş ısıtıcı ve damlacık içeriğinin bir I-C-P-M-S ile iyonizasyonu ve tespitinden önce çözücüleri uzaklaştıran bir membran de salvatordan oluşan bir taşıma tertibatına yerleştirmektir.

Son olarak, kaydedilen sinyaller ve standart bir çözelti ile yapılan bir kalibrasyon ölçümü, numune çözeltisinin veya süspansiyondaki hücrelerin temel bileşimini belirlemek için kullanılır. Mikroakışkan tekniğimizin mevcut yöntemlere göre başlıca avantajları, ayarlanabilir damlacık boyutu, düşük numune tüketimi ve hücre süspansiyonları veya konsantre tuz çözeltileri ile çalışırken düşük nologging riskidir. Ayrıca, düşük maliyetli tek kullanımlık mikroakışkan çip, temizleme süresini önler ve çapraz kontaminasyonu ortadan kaldırır.

Prosedürü göstermek, Profesör GTAs Laboratuvarı'ndan bir doktora öğrencisi olan tüm vin sc ve laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Pascal Fabrica olacak. MİKROFABRİK işlemine başlamak için, büyük bir plastik tabakta 40 gram PDMS ve dört gram PDMS kürleme maddesi ölçün. Her iki parçayı da bir spatula ile eşit şekilde karıştırın ve karışımdaki tüm kabarcıkları gidermek için tabağı 20 ila 30 dakika vakumlu bir kurumaya koyun.

Gaz giderme sırasında. Mikro yapılı bir silikon gofretin üzerine bir döküm kalıbı yerleştirin ve düz bir silikon gofret üzerine yerine oturtmak için tasarımın etrafındaki kılavuz yapıyı kullanın. Üstüne başka bir döküm kalıbı serbestçe yerleştirin.

Her iki döküm kalıbına yaklaşık üç ila dört gram Degas PDMS karışımı dökün. Her iki silikon gofretleri de sıcak bir plakaya aktarın. PDMS'yi 150 santigrat derecede altı dakika sertleştirin ve ardından soğutun.

Metal bir spatula ile oda sıcaklığında tezgah üzerinde katılaşmış PDMS yapıları. Katı PDMS bloklarını kalıplardan dikkatlice ayırın. Her iki bloğun yapıştırma yüzeylerini partikül ve parmak izi kontaminasyonundan koruyun.

Bir kat şeffaf bant uygulanarak, PDMS parçaları artık makasla işlenebilir ve boyutlarına göre kesilebilir. Kırpma işleminden sonra, bandı mikro yapılı PDMS bloğundan çıkarın ve mikroakışkan giriş portlarını oluşturmak için bir biyopsi deliği zımbası kullanın. Bu, cihazın mikro yapılı yarısı için imalat sürecini tamamlar ve artık düz muadili ile yapıştırılmaya ve monte edilmeye hazırdır.

Hizmetleri PDMS'den PDMS'ye yapıştırma için hazırlamak için, kürleme maddesi hala ıslakken 30 saniye boyunca 6.000 RPM'de boş bir silikon gofret üzerine bir PDMS kürleme maddesi tabakasını sıkarak kaplayarak başlayın, mikro yapılı PDMS bloğunun yapıştırma arayüzünü gofret ile temas ettirin ve kabarcıklar olmadan kesintisiz bir sızdırmazlık oluşturmak için PDMS'nin üstüne hafifçe baskı uygulayın. Ayrı bir adımda, koruyucu bandı düz muadilinden çıkarın. Ardından mikro yapılı PDMS'yi silikon gofretten yavaşça ayırın.

İki PDMS parçasını dikkatlice hizalayın ve iki bağlantı arayüzünü temas ettirin. Arayüzey kabarcıklarını gidermek için iki bloğu hafifçe sıkın ve monte edilmiş PDMS çipini 24 saat boyunca sertleştirin Oda sıcaklığında bir maket bıçağı ve bir hizalama cihazı kullanarak, çıkış memesine dik gösterge çizgisi boyunca bir kesim yapın. Çipi, açıkta kalan çıkış ağzına bitişik düzeltme kusurları ve partikül kontaminasyonu açısından mikroskop altında inceleyin.

İmalat kalitesini değerlendirdikten sonra, PDMS mikro kanalının iç yüzeyleri silolanmaya hazırdır. Kimyasal bir başlıkta, bir kurt şişesinin bir ucunu kuru bir nitrojen kaynağına bağlayın ve şişenin diğer ucunu PDMS çipinin girişlerine bağlayın. Merkezi bir manifolda bağlı birden fazla tüp kullanarak, 50 mikrolitre selini kurt şişesine pipetleyin ve üst kapağı kapatın.

Nitrojen taşıyıcı akışını açın ve mikro kanalları saniyede yaklaşık bir mililitre akış hızında 20 dakika boyunca buhar içeren bir tuzlu su ile yıkayın. Son olarak, giriş borularını kurt şişesinden ayırın. Kaplanmış PDMS çipleri, tek hücreli kütle spektrometrisi ölçümleri için kütle spektrometrisi deneyleri için hazırdır.

İlk olarak, giriş numunesini, etkili hücresel konsantrasyon mililitre başına 10 milyon hücreden az olacak şekilde uygun bir tamponla seyreltin Kütle spektrometresine hazırlanırken, numune şırıngalarına boru takarak başlayın. PFH ile iki adet beş mililitrelik şırınga yükleyin ve giriş örneğini ayrı bir bir mililitrelik şırıngaya yükleyin. Şırıngaların ve boruların içinde sıkışan tüm kabarcıkları çıkarın ve iki şırıngayı bir şırınga pompasına yükleyin.

Taşıma borusunun doğru şekilde hizalandığından ve tüm gaz borularının bağlı olduğundan emin olun. Ardından, şırınga borularını PDMS çipinin giriş portlarına bağlayın ve şırınga pompasını üç ila beş dakika boyunca etkinleştirin. Bu akış stabilizasyon işlemi sırasında, çıkış portundaki fazla sıvıyı bir mendille çıkarın.

Sıvı çıkarsa, çip düz bir jet oluşturmaz. Beş dakika sonra, talaş çıkışındaki olası engelleri temiz bir mendille silmeye çalışın. Başarısız olursa, mevcut yongayı atın ve bağlantıyı yeni bir yonga ile değiştirin.

Fişi siklonik püskürtücü adaptöründen çıkarın ve akış stabilize PDMS çipini adaptöre dikkatlice yerleştirin. Akış hızını önerilen ayarlara göre değiştirin ve akışı iki ila beş dakika boyunca yeniden dengeleyin. Aynı zamanda, ilgilenilen analitin maksimum sinyal yoğunluğu elde edilene kadar tüm gazlar için akış hızlarını ayarlayın.

Ayrıca, sinyal optimizasyonu üzerine sinyal yoğunluğunu daha da artırmak için kütle spektrometresi üzerindeki plazma gücünü ve odaklama lensi voltajını ayarlayın. Kütle spektrometresini 10 milisaniyelik bir bekleme süresine ayarlayın ve veri toplamaya başlayın. Ölçümlerden sonra, ham verileri bir veri analiz programına aktarın.

Tipik bir veri analizi rutininde, tüm ölçümler önce her bir bölmenin 10 milisaniyelik bekleme süresi başına sayım sayısını temsil ettiği veri bölmelerine ayrılır, ardından tüm bölmeler için bir histogram grafiği oluşturulur ve Gauss dağılım fonksiyonu ile donatılır. Bireysel uyumların ortalaması ve yayılması, belirli bir kütle / yük oranındaki hem ortalama sinyal yoğunluğunu hem de standart sapmayı temsil eder. Kalibrasyon işlemine başlamak için önce numunenizle aynı akış hızında standart bir çözelti ölçün.

Damlacık üretimi için PDMS çipini kullanarak, PFH için iki adet beş mililitre şırınga ve standart çözelti için bir adet bir mililitre şırınga ayarlayın. Ardından, mikroskop örneği tutucusu olarak bir Petri kabı kullanarak, PDMS çipini Petri kabına yerleştirin ve önceki protokol adımlarını yansıtan düşük büyütme altında çipi odağa getirin. Yüksek hızlı bir kamera ile PDMS mikro kanalındaki damlacık oluşumunu üç ila beş dakika

Kayıtlardan ortalama damlacık çapını elde etmek için ikincil bağlantıdaki çip üzerinde sulu damlacık görüntülerini kaydetmeye başlayın. Özel bir damlacık morfu, optometri ve velo simetri paketine sahip bir görüntü analiz yazılımı kullanın. Her damlacığın küresel bir nesne olarak modellenebileceği varsayılarak, ortalama damlacık hacmi, yazılım tarafından elde edilen ortalama damlacık çapı kullanılarak tahmin edilebilir.

Daha sonra, bir damlacıkta bulunan analit kütlesini elde etmek için numunenin bilinen analit konsantrasyonunu ortalama damlacık hacmine bölün. Daha sonra elde edilen kütleyi atom sayısına dönüştürün. Son olarak, damlacık başına ölçülen iyon sayısını önceki sonuca bölerek genel algılama verimliliğini hesaplayın.

Bu algılama verimliliği artık bilinmeyen bir numunedeki atom sayısını belirlemek için bir kalibrasyon miktarı olarak kullanılabilir. Bir mikroakışkan damlacık üreteci kullanılarak, tek hücreler, ortalama 50 mikrondan daha küçük bir çapa sahip mono dağılmış sulu damlacıklar içinde kapsüllenebilir ve I-C-P-M-S ile analiz edilebilir. Sulu damlacığı çevreleyen organik PFH kılıfı, numune I-C-P-M-S dedektörüne ulaşmadan önce kolayca çıkarılabilir.

Çözeltileri ölçerken, yüksek damlacık mono dağılımı, belirli bir bekleme süresi içinde tek bir çift veya üçlü damlacık sayımından gelen sinyal grupları arasında düşük varyanslar olarak gözlemlenebilir. Uygun kalibrasyondan sonra, her biri tek damlacıklar halinde süspanse edilmiş tek sığır kırmızı kan hücresi topluluğundan elde edilen demir içeriği tespit edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, çok küçük numune hacimlerinin veya tek parçacıkların ve hücrelerin kantitatif element analizi için bu mikroakışkan çiplerin nasıl hazırlanacağını ve kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu çiplerin imalatı, düzgün bir şekilde iyi bir şekilde gerçekleştirilirse, çip başına 15 dakikadan daha az bir süre gerektirir. Ek olarak, değiştirilmesi kolay çipler, gelişmiş numune ön işlemi için daha fazla mikroakışkan modülün entegrasyonunu ve verimliliği ve numune verimini artırmak için numunelerin ve standartların aynı anda tanıtılmasını sağlar.