Name: Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Öğrenin bağırsak organoidlerinde lentiviral iletim yöntemini kullanarak genetik modifikasyon ve immunohistokimya analizi yapmayı. Bu protokol intestinal epitel biyolojisi çalışmaları için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J. Heijmans, Hollanda Kanser Vakfı'ndan (KFW) bir burs ile desteklenmektedir. G.R. van den Brink, Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013)/Avrupa Araştırma Konseyi hibe sözleşmesi numarası 241344 kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi tarafından sağlanan finansman ve Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü'nden (GvdB) bir VIDI hibesi ile desteklenmektedir.

Transfeksiyon Reaktif olarak polietilenimin (PEI) hazırlanması 1. <ol><li> H2O, 100 ml PEI&#39;nın yaklaşık 150 mg çözülür </li><li> Solüsyon berrak hale gelir ve tam olarak çözülene kadar karıştırın kadar HCI eklenerek pH 7.4 çözeltisi ayarlayın. Bu durum, 10 ila 60 dakika sürer ve 1 mg / ml bir son konsantrasyona kadar su ilave edilebilir. </li><li> Ne zaman açık, 5 ml hacimde ° C derin dondurucuda bir -80 steril 0.22 mikron filtre ve mağaza üzerinden PEI çözüm filtre. </li></ol> Lentiviral Parçacıkların 2. Üretim 1. Gün: <ol><li> 162 cm2 şişeye ya da hücre hattı kültürü ortamında büyük bir petri (% 10 FCS,% 1 penisilin / streptomisin ve 2 mM glutamin takviyesi ile desteklenmiş DMEM) içinde% 60 -80% konfluansa Split HEK293T hücreleri. </li></ol> Gün 2: <ol start="2"><li> Birlikte ekleyerek toplam plazmid DNA 45 ug içeren DNA transfeksiyon çözüm hazırlayınLentiviral ambalaj vektörleri (7 pVSVg ug, pRSV rev 5 ug; 13 pMDL ug) ilgi faiz veya shRNA genini kodlayan lentiviral plazmid ve 20 ug. DMEM ile 1 ml &#39;lik bir hacme kadar ayarlayın. </li><li> DMEM 930 ul 1 mg / ml bir PEI 90 ul ekleyerek PEI transfeksiyon çözelti hazırlanır ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir. </li><li> PEI solüsyonuna DNA transfeksiyon solüsyonu ekleyin. Vorteks birkaç kez ters çevirin ve DNA transfeksiyon çözelti elde etmek için, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe veya. </li><li> HEK293T hücrelerine, DNA transfeksiyon solüsyonu 2 ml damla ve 37 ° C nemlendirilmiş bir hücre kültürü kuluçka makinesi içinde, 4 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> 4 saat sonra, PEI çıkarmak için kültür ortamı yenileyin. Bu yeni orta eklemeden önce Hücreleri yıkamak için gerekli değildir. NOT: 4 saat daha uzun PEI olan sitotoksik ve inkübasyon süreleri HEK293T hücrelere zarar verebilir. </li></ol> 4. Gün: <ol start="7"><li> Supe değiştirinyeni kültür ortamı ile rnatant. Süpernatant (virüs içeren) tutun; Bu aşamada 2.10 kullanılacaktır. </li><li> 15 ml&#39;lik bir şişe içinde süpernatant koyun. 500 x g&#39;de 5 dakika boyunca ölü hücreleri, santrifüj kaldırın. </li><li> Büyük bir 60 ml şırınga kullanılarak 0.45 um filtre içinden yüzer itin. 4 ° C &#39;de bir gece boyunca muhafaza ediniz. </li></ol> 5. Gün: <ol start="10"><li> Süpernatant ikinci parti toplayın; adımlarda 2.8-2.9 gibi santrifüj ve filtre. </li><li> 90 dakika boyunca bir ultrasantrifüjdeki 50.000 x g&#39;de adımlar 2.9 ve ultrasantrifüjdeki tüpleri 2.10 ve santrifüj süpernatantlar Havuz. </li><li> Çok dikkatli ultrasantrifüjdeki tüpleri içeren kapsüller çıkarın ve santrifüj içinde tüp yönünü hatırlayarak, bir laminer akış kaputu koymak. </li><li> Topak, tüp üst tarafında olmasını sağlayacak bir şekilde, dikkatli bir ultra santrifüj tüpüne ve dökme sıvı ortam tutan açık kapsül. Viral pelet görselleştirmek için zor olabilir çünkü, üzerinde ne hatırlıyorumtüpün yan bir pelet oluşmuş olacaktır. Bir mikropipet alın ve ultrasantrifüjdeki tüpün alt tarafında görünür opak kahverengi pelet kışkırtmak dikkat çekerken orta son bit çıkarın. </li><li> 10 mM nikotinamid, 10 uM Chir99021, 10 uM Y27632 ve 8 ug / ml polibren ile takviye organoid kültür ortamında 500 ul bu pelletini. Yüksek titre virüs doğrudan organoids Transduct için kullanılan bu yana bu ortamda tabanda önemlidir. </li><li> İsteğe bağlı olarak: -80 ° C&#39;de 250 ul&#39;lik iki seri olarak alınmıştır, bu ortamda virüs dondurma. </li></ol> Organoids 3. lentiviral İletimi Gün 0: <ol><li> Yaklaşık 50 küçük organoids elde etmek amacıyla, yeni bir kuyunun içine transdüksiyon için iki gün önce organoids tam 0.95 cm 2 kuyu bölün. Daha önce yayınlanan bir protokolün 1 (Şekil 3A, B) işlemine göre organoids Böl. </li><li> Kistik aşırı çoğalma crypts (Şekil 3C) elde etmek için 10 uM Chir99021 ve 10 mM nikotinamid ile kültür ortamı Organoid Supplement. Not: taze bölme organoids Chir99021 varlığında büyütülür kistik kript iyi gelişir. </li></ol> Gün 2: <ol start="3"><li> Böylece P1000 mikropipet ile karışımı bozarak, yukarı pipetleme ve matrigel ve orta aşağı Hasat organoids. 15 ml&#39;lik bir tüp içinde karışımın yerleştirin. </li><li> Distal açıklık eritilerek azalmış olan Pasteur pipeti kullanılarak daha bozabilir. Santrifüj organoids 100 x g&#39;de 5 dakika boyunca pelet için. NOT: santrifüj büyüklüğüne bağlı olarak, farklı bir santrifüj hızı kullanın. Bu organoids karışımdan ayrılır bozulduğu olan tam hız bulmak için gereklidir. </li><li> Süpernatantı ve (% 0.25 tripsin benzeri) önceden ısıtılmış 1x tripsin 500 ul ekleyin. Tripsin içinde organoids yeniden süspanse ve inkübe37 ° C&#39;lik bir su banyosu içerisinde 3 dakika. </li><li> Hücre hattı kültürü ortamı içinde 3.5 ml tripsin inaktive (DMEM,% 10 FCS,% 1 penisilin / streptomisin ve glutamin ile takviye edilmiş). 500 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje. </li><li> Orta yaklaşık 20 ul pelet bırakmak süpernatantı. Bir 48-kuyu plaka üzerinde kuyuya ortamının bu son küçük miktarda organoids aktarın. </li><li> Adım 2.14, tekrar süspansiyon tarif edilir ve 3.10: adım olarak iletim ortamı içinde yüksek titre lentivirüs ekleyin. Düşük transdüksiyon etkinliğini karşılaşmak, 3.9 eklenebilir adım. Not: etkin iletimi için, tipik olarak organoids bir oyuğuna yüksek titre lentivirüs 250 ul bir kısım ilave edin. Bu protokolün adım 2&#39;de tarif edildiği gibi, tek bir üretim Hasat lentivirüs% 50&#39;sini oluşturur. </li><li> İsteğe bağlı olarak: 32 ile ilgili, bir önceden ısıtılmış bir santrifüj içinde 48 gözenekli plaka ihtiva organoids koyarak spinoculation yerine, transdüksiyon etkinliğinin arttırılması için6, C ve 1 saat süre ile 600 x g&#39;de döndürün. </li><li> Kültürü inkübatöründe organoid-virüs konacak ve transdüksiyonunu izin vermek için bir kültürü inkübatöründe 37 ° C&#39;de 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> İsteğe bağlı olarak: bundan başka, iletim etkinliğini geliştirmek kültür inkübatörü içinde 37 ° C&#39;de 3 saat daha organoids kuluçkalanması. </li><li> Organoids peletleştirmek için 850 x g&#39;de 5 dakika boyunca bir mikrosantrifüj içinde bir mikrosantrifüj tüpü ve santrifüj içine transfer organoid kültür ortamının 1 ml ilave edilir ve organoid-virüs karışımı tekrar süspansiyon. </li><li> Süpernatantı ve buz-soğuk matrigel 20 ul pelletini. Daha sıcak olduğunda malzeme katılaşır beri, birkaç kez soğuk PBS yukarı pipetleme ve buz aşağı soğutulmuş olan pipet uçları kullanın. </li><li> 48 kuyu plakasında iyi olarak ortasında damlacık koyun ve katılaşmaya 15 dakika için 37 ° C &#39;de kültür inkübatörü içinde inkübe edilir. </li><li> 15 dakika sonra, dikkatli bir şekilde ilave edilmiş organoid kültür ortamında 250 ul10 mM nikotinamid, 10 uM Chir99021 ve 10 uM Y27632. Küçük kesintiye organoid parçaları 24 saat içinde küçük kistik organoids içine oluşturacak. </li></ol> 5. Gün: <ol start="16"><li> Orta yenileme ve bir seçim antibiyotiği ile ek (puromisin için, 4 ug / ml kullanımı). </li></ol> Gün 7: <ol start="17"><li> Seçim antibiyotik ile desteklenmiş standart organoid kültür ortamı için orta değiştirin. Not: geliştirici Chir99021 çekilmesinden sonra 2-3 hafta tamamlanır. Seçimden sonra, organoids seçimi antibiyotiksiz yetiştirilebilir. </li></ol> Kantitatif RT-PCR veya Mikrodizi 4. organoid RNA Preparasyonu <ol><li> RNA preparasyonu için, üreticinin protokolüne göre, ticari bir kit kullanılır. Organoids orta çıkarın ve düz matrigel içeren organoids kubbesi üzerindeki β-mercaptoethanol ile takviye tampon RLT 350 ul ekleyin. Materyali yeniden süspanseP1000 mikropipet kullanarak pipetleme RLT al. </li><li> Üreticinin protokolüne göre başka bir RNA hazırlık yapın. </li><li> İsteğe bağlı olarak: üreticinin protokolüne uygun olarak 50 ug toplam RNA, ilk giriş gerektiren Ovation Pico WTA sistemi kullanılarak amplifikasyon RNA verimi artar. </li><li> İsteğe bağlı olarak: RNA, mikrodizi önce kalite kontrolü için, üreticinin protokolüne uygun olarak 8.5 ya da daha çok (Şekil 5) bir RNA bütünlüğü numarası (RIN) hedefleyen bir ökaryot toplam RNA, nano çipini kullanan bir 2100 Bioanalyzer çalışacak örnekleri. </li></ol> Parafin Yerleştirilmiş ve İmmünohistokimya için 5. İşleme Organoids <ol><li> Önceki gömme organoid başlamasından parafin sıvı tutmak için 70 ° C &#39;de delikli inkübatör bağlantı 12 mm çaplı cam tüpler bir alüminyum blok önceden ısıtın. </li><li> Bozulmamış gömülü organoids bırakarak, tam yetiştirilen organoids tek bir kuyu alın ve orta kaldırmak. </li><li> 1 ml ilave edilir% 4 paraformaldehid, PBS içinde düz iyi ve 1 saat her yerde, 4 ° C&#39;de gece boyunca sabitlemek. </li><li> Buz soğukluğunda PBS, 1 ml paraformaldehid yerine. İsteğe bağlı olarak: bu aşamadan sonra, 4 ° C&#39;de 1 hafta kadar PBS içinde sabit organoids tutun. </li><li> 1 ml PBS içinde yeniden süspanse edin ve sabit organoids bir cam şişe içine koyun. </li><li> , Organoids 1 dakika boyunca dibine çöker olsun PBS süzün ve eozin çözeltisinin damlacıklarının bir çift gömme işlemi boyunca organoids görselleştirme sağlamak için çözülmüş olan% 70 etanol ile değiştirin. </li><li> Oda sıcaklığında% 70 etanol içinde organoids bırakın. 30 dakika sonra, dikkatli bir şekilde, çünkü hafif pembe eozin renk gözle organoids görselleştirmek için güçlü olmak, boşaltılarak% 70 etanol çıkarın. % 96 etanol ile gömme çözüm değiştirin. </li><li> Adımı yineleyin 5.7, yanında bir gömme çözüm yerini her zaman. % 70 etanol,% 90 etanol,% 96 etanol,% 100 etano: daha sonra, aşağıdaki çözeltiler ile organoids geçirinmetanol,% 100 etanol, ksilen, ksilen. </li><li> Son ksilen yıkama Durusu ve tüpe parafin dökün. 30 dakika boyunca 70 ° C&#39;de önceden ısıtılmış alüminyum bloğunun Tüp hemen koyun ve yeni, temiz parafin ile parafin değiştirin. </li><li> Geniş açıklığı bulunan bir önceden ısıtılmış Pasteur pipet kullanarak parafin blok kalıp içine kapalı parafin ve pipet organoids dökün. Bunsen beki kullanarak Pasteur pipet sıcak tutun. Sıvı parafin, küçük bir tabaka halinde parafin blok kalıp tüm organoids yerleştirin. </li><li> Mümkün olduğunca, bir ısıtılmış diseksiyon iğne kullanılarak parafin blok kalıp merkezine doğru tüm organoids işlemek için deneyin. Bunsen beki kullanarak diseksiyon iğne sıcak tutun. </li><li> Kalıptaki organoids lokalizasyonu tatmin edici olduğunda, soğuk kalıp biraz parafin tabakası katılaşmaya. </li><li> Üst daha fazla parafin dökülerek blok bitirin ve bir standart histolojik gömme kaseti ekleyin. </li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+on+cell+proliferation+of+the+gastrointestinal+mucosa+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv.+B%2C+Cell+Pathology+Including+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).</li>
<li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin1%2C+a+novel+intestinotrophic+mitogen%2C+ameliorates+experimental+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+transgenic+epithelial+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC transgenic epithelial organoids.</a> PLoS One. 8 (10), e76871(2013).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li>
<li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li>
<li>Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+murine+leukemia+virus+DNA+depends+on+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis.</a> The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).</li>
<li>Bahnson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+enhancement+of+retroviral+mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer.</a> Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Mevcut video protokolü primer bağırsak epiteli ve kantitatif RNA teknikleri ve immünohistokimya kullanılarak, bu organoids aşağı doğru analizden organoids lentiviral iletimini tarif etmektedir. Lentiviral transdüksiyon genellikle kültür plakaları içinde yapışık veya yüzen hücrelerin içinde gerçekleştirilir. Organoids bölgesinin üç boyutlu yapısı, viral parçacıklar tarafından nüfuz onları zor hale yana etkinliğini artırmak için bir dizi yöntem kullanılır. Chir99021 kullanılarak organoids ön i...

bağırsak epitel kanser ve kök hücreleri üzerinde araştırma geniş ilgi çekmek için neden olmuştur en hızlı çoğalan vücut dokuları biridir. 2009 yılında bir teknik 3 boyutlu bir yapı 1 korunması, matrigel küçük bağırsak kript uzun ömürlü kültürlerini oluşturmak için yayınlandı. Bu yapılar, bağırsak organoids orta BMP-sinyal yolu önleyicisi Noggin (Nog) de dahil olmak üzere tanımlanmış bir büyüme faktörü, bir dizi ile takviye çevreleyen, standart teknikler kullanılarak kültür edilebilir olarak adlandırılan 1 (Rspo1) rspondin Wnt-sinyal yolu güçlendirici ve epidermal büyüme faktörü (EGF) tüm bağırsak proliferasyonunu 2-4 arttırdığı bulunmuştur. Organoids, kök hücre hiyerarşi korumuştur, bunlar olmayan mutasyona olduğunu yönleriyle geleneksel kanser hücre hatları aşmak doğmakta olan küçük int bulunan tüm hücre soylarının içine sağlam hücresel kutuplaşma ve sergi farklılaşmasını görüntülerestinal epitel. Bunlar transgenlerin taşımak için aktarılacak olan veya RNA interferans 5 oluşturur olduğundan, eksiksiz ve hız yönü de, transjenik fareler kullanılarak deneyler outweighing, spesifik genetik elemanları incelemek için kullanılır. Organoids transjenik ifadesi sıçangil retroviral veya lentiviral vektörler 6,7 kullanarak gerçekleştirilebilir. Nedeniyle mitotik hücre özel olarak 8 transduse edebildiği sıçangil retrovirüslerin sınırlamaları, lentiviral transdüksiyon daha sık örneğin organoids olarak enfekte zor olan hücreler için kullanılır. Viral transdüksiyonlu ve stabil bir şekilde eksprese eden transgenik organoids analiz eder ve immünohistokimya kantitatif RNA dahil olmak üzere, akış aşağı analizler çok sayıda için kullanılabilir. Birlikte ele alındığında, primer intestinal epitel hücrelerinden organoids kültürü özel laboratuvar şartlarına olmadan uygulanması kolay bir rutin tekniği haline gelmiştir, ve ce roman standart haline gelmiştirbağırsak epiteli üzerinde araştırma ll kültürü. Viral iletimi ve organoids sonraki mansap analiz teknikleri gerçekleştirmek ve kültürlü organoids lentiviral transdüksiyon için yöntemler göstererek, bu video protokolü oluşturulan organoid deneyler yardım için sıkıcı bulunmaktadır. Biz ayrıca verimi artırmak ve dolayısıyla RNA teknikleri veya immunhistokimya kullanan alt analiz performansını artırabilirsiniz ne kadar doğru işlem organoids arasında gösteriyor. Tarif edilen teknikler de kolon organoids tatbik edilebilir, ancak protokol, ince bağırsak kript türetilen organoids sadece kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Polietilen imine</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ortamı</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>matrigel</td><td>BD</td><td>BD 356231</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Canlandırıcı</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Canlandırıcı</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-asetil sistein</td><td>Sigma</td><td>A9165-1G</td><td></td></tr><tr><td>fare Egf Canlandırıcı</td><td></td><td>PMG8045</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>Canlandırıcı</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>glutamax 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Akson</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Y27632 &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td>polibren</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>nikotinamid</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Lonza</td><td>BE02-007E</td><td></td></tr><tr><td>puromisin</td><td>Sigma</td><td>P 7255</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr> <tr><td>& # 946; -merkaptoetanol</td><td>Merck</td><td>8,057,400,250</td><td></td></tr><tr><td>Ovation Pico WTA sistemi</td><td>NuGen</td><td>3300-12</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>cam flakon konik 12&nbsp; mm x 75&nbsp; mm 5&nbsp; ml</td><td>VWR</td><td>LSUKM12</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Sarımsı</td><td>VWR</td><td>1.159.350.025</td><td></td></tr></tbody></table>

lentiviral İletim ve bağırsak organoids mansabında analizi için protokol

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Organoidler olarak adlandırılan bağırsak kript-villus yapıları, uygun büyüme faktörleri ile desteklendiğinde üç boyutlu olarak sürekli kültürde tutulabilir. Organoidler, homeostatik kök hücre farklılaşması, hücre polaritesi ve erişkin bağırsak epiteli tarafından bilinen tüm terminal olarak farklılaşmış hücre tiplerinin varlığı açısından orijinal dokuya oldukça benzer olduklarından, epitel ile ilgili deneysel araştırmalarda önemli bir kaynak olarak hizmet ederler. Organoidlerde lentiviral veya retroviral vektörler kullanarak transgenleri veya enterferans yapan RNA'yı eksprese etme olasılığı, bağırsak epitelinin ve bağırsak kök hücrelerinin fonksiyonel analizi için fırsatları artırmış, hız ve maliyet açısından geleneksel fare transgeniklerini geride bırakmıştır. Mevcut video protokolünde, aşırı ekspresyon veya gen yıkımı için doksisilin ile indüklenebilir transgenler veya IPTG ile indüklenebilir kısa firkete RNA'sı kullanılarak gösterilen lentiviral vektörlerle ince bağırsak organoidlerinin transdüksiyonunun nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca, organoid kültürünün, deneysel tedaviyle bile azaltılabilecek çok küçük hücre sayıları verdiği göz önüne alındığında, kantitatif RT-PCR, RNA-mikroarray ve immünohistokimyayı hedefleyen aşağı akış analizi için organoidlerin nasıl işleneceğini açıklıyoruz. Bağırsak organoidlerinde transgen ekspresyonunu ve gen yıkımını sağlayan teknikler, bu bağırsak epitel yapılarının sahip olduğu araştırma potansiyeline katkıda bulunur ve organoid kültürü hücre kültüründe yeni bir standart haline getirir.

Organoid lentiviral transdüksiyon Lentiviral parçacıklar kullanılarak organoid iletimi tekniği öncesi ve transdüksiyon sırasında organoids doğru kullanımı bağlıdır. Organoids (Şekil 3A) kültürlenmiştir ve bir kript (Şekil 3B) içine dağıtıldı. Daha önce belirtildiği gibi, GSK3 inhibitörü Chir99021 mevcudiyetinde kültürlenmiş, bu tek kript kistik crypts 9 (Şekil 3C) olmuştur. Daha sonra organoids tek hücrelere virüs parçacı...

Bu video protokolünde, primer intestinal epitel organoidlerinde lentiviral transdüksiyonun ve bu kültürlerin kantitatif RT-PCR, RNA-mikroarray ve immünohistokimya ile işlenmesi ve aşağı akış analizinin adım adım açıklamasını veriyoruz.

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Bu prosedürün genel amacı, intestinal organoidlerin ileri analizleri için primer fare intestinal epitelinden stabil olarak transdukt edilmiş organoidler üretmektir. Bu, öncelikle yüksek titreli lentiviral partiküller üretmek için HEC 2 93 T hücrelerinin lentiviral paketleme vektörleri ve ilgilenilen geni kodlayan lentiviral plazmid ile transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, kistik hiper proliferatif kriptler elde etmek için kültürlenmiş fare intestinal organoidlerinin bir dizi büyüme faktörü ile ön işlemden geçirilmesidir.Ardından, organoidleri yüksek titreli lentivirüs ile transduse edin ve transduse edilmiş organoidleri matrigel içinde inkübe edin. Son adım, tamamen büyümüş transduse organoidlerin aşağı akış immünohistokimya analizi için parafine gömülmesidir. Nihayetinde, lentiviral organoid transduksiyonu; güvenilir, tekrarlanabilir ve hızlı bir intestinal epitel in vitro modeli oluşturmak amacıyla genetik değişiklikler meydana getirmek için kullanılır.Bu tekniğin kanser hücre hatları gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, organoidlerin mutasyona uğramamış yer değiştirmiş kök hücre hiyerarşisi olmasıdır. Hücresel polarizasyon metni içerisinde, küçük bağırsak epitelyumunun tüm farklı hücre tiplerine farklılaşabilir. Ayrıca, transdükte edilmiş organoidler belirli genetik elementleri incelemek için kullanılabilir ve böylece transgenik fare kullanımına kıyasla maliyet ve hız açısından avantaj sağlar.Lentiviral partikül üretimi, HEC 2 93 T hücrelerinin hücre kültür ortamındaki 162 santimetrekarelik bir flaskta %60 ila %80 konfluensle pasajlanmasıyla başlayan beş günlük bir protokoldür. Hücreleri ertesi güne kadar 37 °C'de, nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Protokol metninde açıklandığı şekilde DNA transfeksiyon çözeltisini ve polietilen imin veya PEI transfeksiyon çözeltisini hazırlayın.DNA transfeksiyon solüsyonunu PEI solüsyonuna ekleyin, vorteksleyin veya birkaç kez altüst edin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. DNA TRANSFEKSIYON artı PEI solüsyonundan iki mililitreyi HEC 2 93 T hücrelerinin üzerine damlatın ve 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin.Kültür ortamını yenileyin. PEI'yi uzaklaştırmak için hücreleri iki gün boyunca 37 °C'de inkübe edin; dördüncü günde süpernatanı 50 mL'lik bir tüpe toplayın. Hücrelere yeni kültür ortamı ekleyin ve flaskı inkübatöre geri yerleştirin; toplanan süpernatanı 500 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Ölü hücreleri uzaklaştırmak için, 60 mL'lik büyük bir şırınga kullanarak SUPERNAT'ı 0,45 µm'lik bir filtreden geçirin. Filtrelenmiş supernat'i bir gece boyunca 4 °C'de saklayın. İkinci supernat grubunu, ilk grup için gösterildiği gibi santrifüjleyip filtreleyerek toplayın.İki grup süpernatantı ultra santrifüj tüplerinde birleştirin. 50,000 GS hızında 90 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işlemi tamamlandığında, ultra santrifüj tüplerini içeren kapsülleri çok dikkatli bir şekilde çıkarın ve laminer akışlı kabine yerleştirin.Ultrasantrifüj tüpünü tutan kapsülü açın ve tüpün üst kısmında yer alan peleti dikkatlice koruyarak besiyerini boşaltın. Viral peletlerin görselleştirilmesi zor olabileceğinden, tüpün hangi tarafında pelet oluştuğunu hatırlamak önemlidir. Ardından, ultrasantrifüj tüpünün alt kısmının yan tarafında görünen opak kahverengi peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek, son kalan besiyerini bir mikropipet yardımıyla uzaklaştırın.Bu peleti, nikotinamid kinaz inhibitörleri ve poly brain resus ile desteklenmiş 500 µL organoid kültür ortamında yeniden süspanse edin. Organoidlerin transduksiyonundan iki gün önce yüksek titreli virüs doğrudan kullanılacağı için bu ortamda süspansiyon yapılması önemlidir. 0,95 cm²'lik tam bir organoid kuyucuğunu, 48 kuyucuklu bir plakanın yeni bir kuyucuğuna bölün.Daha önce yayınlanmış bir protokol takip edilerek. Organoid kültüründe yaklaşık 50 küçük organoid elde etmeyi hedefleyin. Besiyeri, bir glikojen sentaz kinaz inhibitörü ve nikotinamid ile desteklenmiştir.Kistik hiperproliferatif kriptler elde etmek için, organoidleri transduksiyon gününden itibaren iki gün boyunca inkübe edin; organoidleri P 1000 mikro pipet ile hasat edin. Matrigel ve medyumu yukarı-aşağı pipetleyerek karışımı parçalayın.Karışımı 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Karışımı, uç açıklığı eritilerek küçültülmüş bir pipet yardımıyla daha fazla parçalayın. Organoidleri 100 Gs kuvvetinde beş dakika santrifüj ederek peletleyin. Ardından süpernatantı uzaklaştırın, 500 µL önceden ısıtılmış 1x tripsin ekleyin ve organoidleri yeniden süspanse ederek üç dakika inkübe edin.37 °C'lik bir su banyosunda, 3,5 mL hücre hattı kültür ortamı ekleyerek tripsini inaktive edin ve 500 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Pellet yaklaşık 20 µL ortamda kalacak şekilde süpernatantı uzaklaştırın. Bu son küçük miktar ortam içindeki organoidleri bir kuyuya aktarın.48 kuyucuklu bir plakaya, önceden hazırlanmış yüksek titreli lentivirüsü transdüksiyon ortamında organoidlere ekleyin ve yeniden süspande edin. Transdüksiyonun gerçekleşmesi için organoid-virüs karışımını bir kültür inkübatöründe 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin; bir saatin ardından, organoid-virüs karışımına bir mililitre organoid kültür ortamı ekleyin, yeniden süspande edin ve karışımı bir mikrosantrifüj tüpüne aktararak 850 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Organoidleri peletlemek için süpernatantı uzaklaştırın ve peleti yeniden süspande edin. 20 µL buz gibi soğuk matrigel içindeki damlacığı, 48 kuyucuklu plaka üzerindeki bir kuyucuğun ortasına yerleştirin ve 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.Damlacığın 15 dakika sonra katılaşması için, nikotinamid ve kinaz inhibitörleri ile takviye edilmiş 250 µL organoid kültür ortamını dikkatlice ekleyin.Parafinin sıvı kalmasını sağlamak için bir alüminyum bloğu inkübatörde 70 °C'de önceden ısıtın. Tam gelişmiş organoidlerin bulunduğu tek bir kuyucuktaki medyumu, gömülü organoidlere zarar vermeden uzaklaştırın ve doğrudan kuyucuğa 1 mL PBS içinde %4'lük paraformaldehit ekleyin. Paraformaldehidi 1 mL PBS ile değiştirin.Fikse edilmiş organoidleri PBS içinde yeniden süspande edin ve bir cam şişeye aktarın. Organoidlerin bir dakika boyunca dibe çökmesini bekleyin. Ardından, PBS'yi pipetle çekerek uzaklaştırın ve yerine içine birkaç damla eozin çözeltisi eklenmiş %70 etanol koyun.Gömme işlemi boyunca organoidlerin görselleştirilmesini sağlamak için, organoidleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %70 etanol içerisinde bekletin. %70 etanolü dikkatlice pipetleyerek uzaklaştırın. Pembemsi eozin rengi sayesinde organoidler gözle görülebilir.Gömme solüsyonunu %96 etanol ile değiştirin ve bu şekilde oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Ardından organoidleri sırasıyla %70 etanol, %90 etanol, %96 etanol, %100 etanol, %100 etanol, ksilen ve ksilen aşamalarından geçirin. Son ksilen yıkamasını dökün ve cam şişeye parafin doldurun.Flakonu derhal 70 °C'ye önceden ısıtılmış alüminyum bloğa yerleştirin ve 30 dakika bekletin. 30 dakika sonra, önceden ısıtılmış bir PE veya pipet kullanarak parafini yeni ve temiz parafinle değiştirin. Parafini dökün ve organoidleri sıvı parafin tabakası halindeki parafin bloğu kalıbına aktarmak için önceden ısıtılmış geniş ağızlı bir pest veya pipet kullanın.Bir diseksiyon iğnesini bunsen beki ile ısıtın ve tüm organoidleri mümkün olduğunca parafin blok kalıbının merkezine doğru yönlendirin. Organoidlerin kalıptaki konumlanması yeterli olduğunda, parafin tabakasını dondurmak için kalıbı hafifçe soğutun. Üzerine daha fazla parafin dökerek bloğu tamamlayın ve standart bir histolojik gömme kaseti ekleyin.Bu protokolde, intestinal epitel organoidleri lentivirüslerle transduse edilmiştir. Normal organoidler, ortak bir villus alanından çıkan bir dizi kript içeren K kript villus yapıları şeklinde büyürler. Bu organoidlerin GSK three B inhibitörü olan CHIR 9 9 0 21 ile tedavi edilmesi üzerine, proliferasyon artar ve organoid transdüksiyonundan sonra kriptler kistik hale gelir.Lentiviral EGFP aşırı ekspresyonu kullanılarak, organoidler floresan EGFP eksprese eder; transduksiyon etkinliğinin düşük olduğu durumlarda uygulanabilen inokülasyon veya uzatılmış viral inkübasyon gibi transduksiyon geliştirme adımlarına, bu adımların halihazırda yüksek olan etkinliği artırmayacak olması nedeniyle gerek yoktur. Ardından, bu organoidler RNA teknikleri ve immünohistokimya için işlenir. Bu temsili görüntü, fiksasyondan önce bir saat boyunca BRDU ile inkübe edilen ve ardından BRDU için boyanan bir fare intestinal organoid kesitidir.Bu videoyu izledikten sonra, lentiviral veya retroviral partiküller kullanarak primer intestinal epitelden elde edilen organoidlerin nasıl transduce edileceğine dair kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız.

a-protocol-for-lentiviral-transduction-downstream-analysis-intestinal

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Bu protokol ana Lgr5-pozitif yer alan organoid kültür ve Retroviral transdüksiyonun müteakip bir uygulama açıklanmaktadır. Bu in vitro olarak Organotipik bir roman içinde gerçekleştirilebilir fonksiyonel çalışmalar teslim transjenin uyarımlı Cre aşırı ekspresyonunu veya demonte sağlar ve sağlar   model sistem.

İlköğretim Bağırsak organoid Kültür Retrovirütik Enfeksiyon Bir Video Protokolü

Bağırsak organoid kültürler tüm kriptalarının kurulur ve kendini yenileme ve farklılaşma analizi bir hücre özgü biçimde izin vermez. Bu iletişim kuralı sulandırma sıralanmış kök (Lgr5+) açıklar ve neden olmaktadır organoids için onların önceki biyokimyasal ve genetik modifikasyon ve fonksiyonel analiz etkinleştirilirken (Paneth) hücreleri niş.

Fonksiyonel analiz bağırsak kök ve niş hücre Organoid sulandırma tahlil (ORA)

Biz adım adım talimatları tarif: 1) etkin bir şekilde bağırsak organoidleri Lenti-veya retroviral dönüştürücü için manyetik nano maddeler kullanarak mühendis ve 2) mühendislik organoidler dondurulmuş bölümler oluşturmak. Bu yaklaşım, akım etkilerinin incelenmesi için organoidlerde gen ifadesini verimli bir şekilde değiştirmek için güçlü bir araç sağlar.

Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma

Bu protokol, tek hücreli RNA dizileme (scRNAseq) teknolojisini kullanarak tek hücreli düzeyde konakçı/patojen etkileşimlerini karakterize etmek için insan bağırsak organoidlerinin apikal veya bazolateral tarafından nasıl enfekte olduğunu açıklar.

Gastrointestinal Organoidlerin Biyogüvenlik Seviye 3 (BSL-3) Koşullarında Patojen Enfeksiyonu ve Tek Hücre dizilimi için uyarlandırılması

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin murin ince bağırsak lamina propriasından izole edilmesi ve bağırsak epitel hücreleri ile tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücreler arasındaki çift yönlü etkileşimleri incelemek için her iki hücre tipi arasında 3 boyutlu (3D) ortak kültürlerin oluşturulması için ayrıntılı talimatlar sunmaktadır.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Burada, sıçan bağırsak organoidleri üretmek ve bunları birkaç aşağı akış uygulamasında kullanmak için bir protokol sunuyoruz. Sıçanlar genellikle tercih edilen bir klinik öncesi modeldir ve sağlam bağırsak organoid sistemi, in vivo çalışmalara eşlik edecek bir in vitro sistem ihtiyacını karşılar.

Sıçan Bağırsak Organoidlerinin Üretimi ve Manipülasyonu

Bu protokol, virüsle enfekte insan bağırsak organoidlerinde kalsiyum görüntüleme yapmak için bir yaklaşımı açıklar ve analize bir yaklaşım sunar.

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi

Protokol, daha önce keşfedilmemiş bağırsak biyolojisi hakkında önemli bilgiler sağlamak için insan bağırsak organoid teknolojisini tek hücreli transkriptomik analizle birleştirir.

Tek Hücreli Transkripsiyonel Seviyede İnce Bağırsak Epitelini Anlamak için İnsan Bağırsak Organoidlerini Kullanma

Bu makale, bir roman protokol ve reaktif bileşikler ve tedavilerin yüksek içerik analizi kullanarak nöronlar ve astrositler ortak kültürleri üzerinde nörotoksik etkileri hassas ölçümü için tasarlanmıştır ayarlamak açıklamaktadır. Sonuçlar yüksek bir içerik analizi nörotoksisite değerlendirmesi için heyecan verici yeni bir teknoloji temsil ettiğini göstermektedir.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

Öğrenin bağırsak organoidlerinde lentiviral iletim yöntemini kullanarak genetik modifikasyon ve immunohistokimya analizi yapmayı. Bu protokol intestinal epitel biyolojisi çalışmaları için güvenilir bir model sunar.

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Daha fazla video keşfet