Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Bu prosedürün genel amacı, bağırsak organoidlerinin aşağı akış analizi için birincil fare bağırsak epitelinden stabil bir şekilde dönüştürülmüş organoidler üretmektir. Bu, ilk olarak HEC 2 93 T hücrelerinin lentiviral paketleme vektörleri ve lentiviral plazmid ile kesilmesi ve yüksek titreli lentiviral partiküller üretmek için ilgilenilen geni kodlamasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, kistik hiper proliferatif kriptler elde etmek için kültürlenmiş fare bağırsak organoidlerini bir dizi büyüme faktörü ile ön işlemden geçirmektir.

Daha sonra, organoidleri yüksek titreli lentivirüs ile transdüksiyon yapın ve transdüksiyonlu organoidleri matrigel içinde inkübe edin. Son adım, aşağı akış immünohistokimya analizi için tam büyümüş dönüştürülmüş organoidleri parafine gömmektir. Sonuç olarak, lentiviral organoid transdüksiyonu, bağırsak epitelinin güvenilir, tekrarlanabilir ve hızlı bir in vitro modelinde genetik değişiklikler oluşturmak için kullanılır.

Bu tekniğin kanser hücre dizileri gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, organoidlerin mutasyona uğramamış yer değiştirmiş kök hücre hiyerarşisi olmasıdır. Metin hücresel polarizasyonunda, ince bağırsak epitelinin tüm farklı hücre tiplerine farklılaşabilir. Ek olarak, dönüştürülmüş organoidler, belirli genetik elementleri incelemek için kullanılabilir, böylece transgenik farelerin kullanımından ve maliyet ve hız fasetlerinden daha ağır basar.

Lentiviral partiküllerin üretimi, hücre kültürü ortamında 162 santimetrekarelik bir şişede HEC 2 93 T hücrelerinin %60 ila 80 co akıcılığına bölünmesiyle başlayan beş günlük bir protokoldür. Hücreleri, ertesi gün 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübe edin. DNA transfeksiyon solüsyonunu ve polietilen amin veya PEI transfeksiyon solüsyonunu protokol metninde açıklandığı gibi hazırlayın.

DNA transfeksiyon çözeltisini PEI çözeltisi girdabına ekleyin veya birkaç kez ters çevirin ve beş dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında. HEC 2 93 T hücrelerine iki mililitre DNA TRANSFECTION artı PEI çözeltisi damlatın ve dört saat sonra 37 santigrat derecede dört saat inkübe edin.

Kültür ortamını yenileyin. PEI'yi çıkarmak için, hücreleri dördüncü günde 37 santigrat derecede iki gün boyunca inkübe edin, süpernatanı 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. Hücrelere yeni kültür ortamı ekleyin ve şişeyi inkübatöre geri koyun, toplanan süpernatanı beş dakika boyunca 500 Gs'de santrifüjleyin.

Ölü hücreleri çıkarmak için, SUPERNAT'ı 0,45 mikrometrelik bir filtreden geçirmek için 60 mililitrelik büyük bir şırınga kullanın. Filtrelenmiş süpernatı ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Santrifüjleyin ve ikinci süpernatan partisini ilk parti için gösterildiği gibi filtreleyin.

İki süpernatan partisini ultra santrifüj tüplerinde toplayın. 90 dakika boyunca 50.000 GS'de santrifüjleyin. Santrifüjleme tamamlandığında, çok dikkatli bir şekilde, ultra santrifüj tüplerini içeren kapsülleri çıkarın ve bunları bir laminer akış başlığına koyun.

Ultra santrifüj tüpünü tutan kapsülü açın ve tüpün üst tarafındaki pelet ile ortamı dikkatlice boşaltın. Viral peletlerin görselleştirilmesi zor olabileceğinden, tüp temyizinin hangi tarafının oluşacağını hatırlamak önemlidir. Ardından, ultrasantrifüj tüpünün alt tarafında görünen opak kahverengi peleti çalkalamamaya dikkat ederken, ortamın son parçasını çıkarmak için bir mikro pipet kullanın.

Bu peleti, nikotinamid kinaz inhibitörleri ve poli beyin resüsiti ile desteklenmiş 500 mikrolitre organoid kültür ortamında yeniden askıya alın. Bu besiyerinde süspansiyon önemlidir, çünkü yüksek titre virüsü, transdüksiyondan iki gün önce organoidlerin transdüksiyonu için doğrudan kullanılacaktır. Tam 0.95 santimetre karelik bir organoid kuyusunu 48 oyuklu bir plakanın yeni bir kuyusuna bölün.

Daha önce yayınlanmış bir protokolü takiben. Organoid kültüründe yaklaşık 50 küçük organoid elde etmeyi hedefleyin. Bir glikojen sentaz kinaz inhibitörü ve nikotinamid ile desteklenmiş ortam.

Kistik hiper proliferatif kriptler elde etmek için. Organoidleri transdüksiyon gününde iki gün boyunca inkübe edin, organoidleri bir P 1000 mikro pipet ile hasat edin. Matra jeli ve ortamı yukarı ve aşağı pipetleyin, böylece karışımı bozun.

Karışımı 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Distal açıklığın eritilerek azaltıldığı bir PE pipeti kullanarak karışımı daha da bozun: Organoidleri beş dakika boyunca 100 Gs'de santrifüjleyerek pelet haline getirin. Daha sonra süpernatanı 500 mikrolitre ön ısıtmada çıkarın, bir x tripsin ve organoidleri yeniden süspanse edin, üç dakika inkübe edin.

37 santigrat derecelik bir su banyosunda, beş dakika boyunca 3.5 mililitre hücre hattı kültürü ortam santrifüjü ekleyerek tripsini inaktive edin. 500 Gs'de.Peleti yaklaşık 20 mikrolitre ortamda bırakmak için süper natanı çıkarın. Bu son küçük miktardaki ortamdaki organoidleri bir kuyuya aktarın.

48 oyuklu bir plaka üzerinde. Transdüksiyon ortamında önceden hazırlanmış yüksek titreli lentivirüsü organoidlere ekleyin ve yeniden süspanse edin. Organoid virüs karışımını, bir saat sonra transdüksiyona izin vermek için bir kültür inkübatöründe 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin, organoid virüs karışımına bir mililitre organoid kültür, ortam ekleyin, yeniden süspanse edin ve karışımı beş dakika boyunca 850 GS'de bir mikro santrifüj tüpü santrifüjüne aktarın.

Organoidleri peletlemek için, süpernatanı çıkarın ve peleti yeniden süspanse edin. 20 mikrolitre buz gibi matra jeli içinde, damlacığı bir kuyunun ortasına koyun. 48 oyuklu bir plakada ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Damlacığın 15 dakika sonra katılaşması için. Dikkatlice 250 mikrolitre organoid kültürü ekleyin. Nikotinamid ve kinaz inhibitörleri ile desteklenmiş ortam.

Parafini sıvı tutmak için bir alüminyum bloğu bir inkübatörde 70 santigrat derecede önceden ısıtın. Ortamı, gömülü organoidleri olduğu gibi bırakarak tam büyümüş organoidlerle tek bir kuyudan çıkarın ve PBS'ye doğrudan kuyuya bir mililitre% 4 Paraform aldehit ekleyin. Paraform aldehiti bir mililitre PBS ile değiştirin.

PBS'deki sabit organoidleri yeniden askıya alın ve bir cam şişeye aktarın. Organoidlerin bir dakika boyunca dibe batmasına izin verin. Ardından, PBS'yi pipetleyin ve içinde birkaç damla eoin çözeltisinin çözüldüğü %70 etanol ile değiştirin.

Gömme işlemi boyunca organoidlerin görselleştirilmesini sağlamak için, organoidleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %70 etanol içinde bırakın. Dikkatlice pipetleyerek %70 etanolü çıkarın. Organoidler, pembemsi eoin rengi nedeniyle gözle görüntülenebilir.

Gömme solüsyonunu %96 etanol ile değiştirin ve bu şekilde oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Daha sonra organoidleri %70 etanol, %90 etanol, %96 etanol, %100 etanol, %100 etanol, ksilen ve ksilenden geçirin. Son ksilen yıkamasını boşaltın ve parafini cam şişeye dökün.

Şişeyi hemen 30 dakika boyunca 70 santigrat derecede ön ısıtma alüminyum bloğuna koyun. 30 dakika sonra, parafini bir ön ısıtma, PE veya pipet ile yeni temiz parafin ile değiştirin. Parafini dökün ve organoidleri parafin blok kalıbına bir sıvı parafin tabakası halinde pipetlemek için önceden ısıtılmış bir haşere veya geniş bir açıklığa sahip pipet kullanın.

Bir diseksiyon iğnesini bunsen brülörü ile ısıtın ve tüm organoidleri mümkün olduğunca parafin blok kalıbının merkezine doğru manipüle edin. Kalıptaki organoidlerin lokalizasyonu tatmin edici olduğunda, parafin tabakasını katılaştırmak için kalıbı hafifçe soğutun. Üstüne daha fazla parafin dökerek bloğu bitirin ve standart bir histolojik gömme kaseti ekleyin.

Bu protokolde intestinal epitel organoidleri lentivirüsler ile transdüksiyona tabi tutulmuştur. Normal organoidler, paylaşılan bir villus alanından çıkan bir dizi kript ile K kript villöz yapıları olarak büyür. Bu organoidlerin GSK üç B inhibitörü CHIR 9 9 0 21 ile tedavi edilmesi üzerine, organoid transdüksiyonundan sonra proliferasyon artar ve kriptler kistik hale gelir.

Organoidler, lentiviral EGFP aşırı ekspresyonunu kullanarak, aşılama veya uzun süreli viral inkübasyon gibi transdüksiyon etkinliği düşük olduğunda gerçekleştirilebilecek floresan EGFP transdüksiyon geliştirme adımlarını eksprese eder, çünkü bu adımlar zaten yüksek olan etkinliği artırmayacaktır. Daha sonra, bu organoidler RNA teknikleri ve immünohistokimya için işlenir. Bu temsili görüntü, fiksasyondan bir saat önce BRDU ile inkübasyondan sonra BRDU için boyanmış bir fare bağırsak organoidinin bir bölümüdür.

Bu videoyu izledikten sonra, lentiviral veya retroviral partiküller kullanarak organoidlerin birincil bağırsak epitelinden nasıl dönüştürüleceğini iyi anlamış olmalısınız.