Name: Kromatin Regülatörleri ve Devletlerinde genom Anlık Ksenopus Embriyolar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Keşfedin ChIP-Seq yöntemiyle Xenopus embriyolarında kromatin düzenleyicilerinin genom çapında haritalanmasını. Bu protokol erken embriyonik gelişimde gen düzenlemesini anlamak için değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

X. tropicalis genomunu (xenTro2, xenTro2r) HOMER'a ve dizileme sonrası analiz üzerine tartışmalar için Gilchrist laboratuvarına uyguladığı için Chris Benner'a teşekkür ederiz. I.P. GO terim analizine yardımcı oldu. G.E.G. ve J.C.S. Wellcome Trust tarafından desteklenmiştir ve şu anda Tıbbi Araştırma Konseyi (program numarası U117597140) tarafından desteklenmektedir.

<ol><li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo%3A+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li>
<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+evidence+that+histone+H4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li>
<li>Johnson, D., Mortazavi, A., Myers, R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li>
<li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).</li>
<li>Blythe, S. A., Reid, C. D., Kessler, D. S., Klein, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+in+early+Xenopus+laevis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation in early Xenopus laevis embryos.</a> Dev Dyn. 238 (6), 1422-1432 (2009).</li>
<li>Gentsch, G. E., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+physical+chromatin+associations+across+the+Xenopus+genome+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Investigating physical chromatin associations across the Xenopus genome by chromatin immunoprecipitation.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), (2014).</li>
<li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J Embryol Exp Morphol. 77, 15-37 (1983).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Brief Bioinform. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
<li>Imoto, S., Nolan, J., Bioinformatics Miyano, S. 20 (9), 1453-1454 (2004).</li>
<li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%2B%3A+architecture+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BLAST+: architecture and applications.</a> BMC Bioinformatics. 10, 421(2009).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blast2GO%3A+a+universal+tool+for+annotation%2C+visualization+and+analysis+in+functional+genomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research.</a> Bioinformatics. 21 (18), 3674-3676 (2005).</li>
<li>Sive, H., Grainger, R., Harland, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+H+%22Early+development+of+Xenopus+laevis%3A+A+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2000).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+factors+influencing+ChIP-seq+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of factors influencing ChIP-seq fidelity.</a> Nat Methods. 9 (6), 609-614 (2012).</li>
<li>Sharov, A. A., Ko, M. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exhaustive+search+for+over-represented+DNA+sequence+motifs+with+CisFinder%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Exhaustive search for over-represented DNA sequence motifs with CisFinder.</a> DNA Res. 16 (5), 261-273 (2009).</li>
<li>Bailey, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEME+SUITE%3A+tools+for+motif+discovery+and+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MEME SUITE: tools for motif discovery and searching.</a> Nucl Acids Res. 37 (2), W202-W208 (2009).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Gentsch, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+T-box+transcription+factor+profiling+reveals+joint+regulation+of+embryonic+neuromesodermal+bipotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In vivo T-box transcription factor profiling reveals joint regulation of embryonic neuromesodermal bipotency.</a> Cell Rep. 4 (6), 1185-1196 (2013).</li>
<li>Barabasi, A. L., Oltvai, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+biology%3A+understanding+the+cell%27s+functional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Network biology: understanding the cell's functional organization.</a> Nat Rev Genet. 5 (2), 101-113 (2004).</li>
<li>Biggin, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+transcription+networks+as+highly+connected%2C+quantitative+continua%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Animal transcription networks as highly connected, quantitative continua.</a> Dev Cell. 21 (4), 611-626 (2011).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland. New York & London. (1994).</li>
<li>Akkers, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchy+of+H3K4me3+and+H3K27me3+acquisition+in+spatial+gene+regulation+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A hierarchy of H3K4me3 and H3K27me3 acquisition in spatial gene regulation in Xenopus embryos.</a> Dev Cell. 17 (3), 425-434 (2009).</li>
<li>Yoon, S. J., Wills, A. E., Chuong, E., Gupta, R., Baker, J. C. HEB and E2A function as SMAD/FOXH1 cofactors. Genes Dev. 25 (15), 1654-1661 (2011).</li>
<li>Jallow, Z., Jacobi, U. G., Weeks, D. L., Dawid, I. B., Veenstra, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+and+redundant+roles+of+TBP+and+a+vertebrate-specific+TBP+paralog+in+embryonic+gene+regulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Specialized and redundant roles of TBP and a vertebrate-specific TBP paralog in embryonic gene regulation in Xenopus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (37), 13525(2004).</li>
<li>Buchholz, D. R., Paul, B. D., Shi, Y. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-specific+changes+in+promoter+occupancy+by+thyroid+hormone+receptor+during+frog+metamorphosis.+Implications+for+developmental+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gene-specific changes in promoter occupancy by thyroid hormone receptor during frog metamorphosis. Implications for developmental gene regulation.</a> J Biol Chem. 280 (50), 41222-41228 (2005).</li>
<li>Wills, A. E., Guptaa, R., Chuonga, E., Baker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+and+deep+sequencing+in+Xenopus+tropicalis+and+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation and deep sequencing in Xenopus tropicalis and Xenopus laevis.</a> Methods. 66 (3), 410-421 (2014).</li>
<li>Metz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+formaldehyde-induced+modifications+in+proteins%3A+reactions+with+model+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactions with model peptides.</a> J Biol Chem. 279 (8), 6235-6243 (2004).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-based+mapping+of+developmental+transcriptional+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs.</a> Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).</li>
<li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+gene+expression+and+chromatin+profiling+of+individual+cell+types+within+a+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue.</a> Dev Cell. 18 (6), 1030-1040 (2010).</li>
<li>Bonn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44 (2), 148-156 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bizim protokol yapmak ve Xenopus embriyolar genom kromatin profillerini analiz nasıl özetliyor. Bu silico zenginleştirilmiş genomik siteleri temsil okur milyonlarca işlem, in vivo olarak, endojen mahallere çapraz bağlama proteinlerinden her adımı kapsar. Genom taslaklarının artan sayıda mevcut olduğundan, bu protokol diğer model olan ve olmayan model organizmalar için geçerli olmalıdır. Önceki çalışma 8,31,33,34 dışında bu protokol belirler en önemli deney bölümünde, çapraz-bağlanmış çekirdekleri elde etmek sonrası tespit işlemdir. Verimli kromatin çözünmesini ve kesme ve kolay upscaling kolaylaştırır. Birlikte kütüphane hazırlık geliştirilmiş verimlilik ile bu protokol yarısından itibaren faiz kromatin-ilişkili epitopu ifade iki milyona hücrelerine yüksek karmaşıklık ChIP-Seq kütüphaneler yapıyı sağlar. ChIP-QPCR deneyler için, bu hücrelerin birkaç on bin normal olarak yeterlibelki altı farklı genomik DNA loci zenginleştirme kontrol etmek için. Bu numaralar tahminlerdir, ancak protein ifadesi seviyesi, antikor kalitesine bağlı olarak etkinliği ve epitop ulaşmak çapraz bağlama olarak değişiklik gösterebilir. Bir rehber olarak, tek bir Xenopus embriyo orta Blastula aşama (Nieuwkoop ve Faber 29 den sonra 8.5) yaklaşık 4000 hücreleri içeren geç gastrula aşama (12) de 40,000 hücre ve erken tailbud aşama (20) de 100.000 hücre. etkin immüno-çökeltme için kesin sabitleme süresi ChIP-qPCR (bölüm 10) tarafından empirik olarak tespit edilmesi gerekmektedir. Deney X içeriyorsa Genel olarak, uzun tespit süreleri gereklidir embriyolar, erken gelişim aşamalarını ve zayıf (ya da dolaylı) DNA bağlama özelliklerini laevis. Bununla birlikte, kromatin kesme daha az etkili hale gelir, 40 dakikadan daha uzun bir Xenopus embriyolar sabitleme ya da belirtilmedikçe, (bölüm 3) daha fazla embriyolar işlem tavsiye edilmez. Bu önemli değildirçok zor sarısı zengin embriyolardan nükleer çıkarma yapabilir formaldehit söndürülmesi için bu ortak adım olarak tespit sonrasında herhangi bir glisin kullanmak için. Şu anda, bunun nedeni bilinmemektedir. Formaldehit-glisin ilave maddesi, ayrıca aşağıdaki amino grupları ya da arginin artığını 35 N-terminali ile reaksiyona düşünülebilir. Antikor herhangi bir çip deney anahtarıdır ve yeteri kadar kontrol (Landt ve ark. 36 ile kılavuza bakınız) ilgi epitopu için spesifikliğini göstermek amacıyla gerekmektedir. Hiçbir ChIP dereceli antikor varsa bu proteinler işgal endojen bağlayıcı siteleri 37 gibi, epitop füzyon proteinleri karşılık gelen giriş meşru bir alternatif olabilir. Bu durumda, enjeksiyon yapılmamış embriyolar bir negatif kontrol yerine non-spesifik serum ile bir çip olarak kullanmak en iyisidir. İlgi dahilindeki protein Enri zayıf kazanımı ile sonuçlanan, düşük seviyelerde ifade edilir, bu strateji de tatbik edilebilirched DNA. Çünkü kullanımda DNA düşük miktarda ChIP-Seq kütüphaneler, yapım gelince, bu temizlik adımların sayısını azaltmak ve en azından DNA kaybı tutmak tepkileri birleştirmek işlemleri için tercih edilmesi önerilir. adaptörleri ve primerler (Belirli Malzemeleri / Ekipman Tabloya bakınız) multipleks sıralama ve NGS platformu ile uyumlu olması gerekir. (Uzun tek sarmallı silah içeren) Y-adaptörler kullanarak, bu boyut seçerek DNA ekler önce PCR 3-5 mermi ile ön yükseltmek kütüphane için kritik (örn., 100 bp 300) jel elektroforezi ile. Tek iplikli uçları, DNA fragmanları, heterojen geçirilecek neden olur. Deneme PCR döngüsü sayısını belirlemek için tavsiye edilir giriş DNA (örneğin, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10 ve 20 ng) farklı miktarlarda (daha az veya 18 döngü eşit) bir boyuta getirmek için gerekli olan 100 ila 200 ng -seçilmiş kütüphanesi. PCR döngü sayısını azaltmak Redu sekanslanmasını vermektedirndant daha az olasıdır okur. Katı faz geri dönüşümlü immobilizasyon boncuklar verimli ilgi DNA kurtarmak ve güvenilir ligasyon ve PCR reaksiyonları herhangi bir serbest adaptörleri ve dimerlerini kaldırmak için reaktifler temizlik iyi. Sayı, tip ve uzunluk açısından civarında 20-30.000.000 tek uç 36 bp yeterli derinliğe sahip tüm Xenopus genomunu kapsayacak şekilde en ChIP-Seq deneyler için yeterli okur, okur. En yaygın NGS makineleri bu kriterleri karşılama rutin yeteneğine sahiptir. Bununla birlikte, okuma geniş bir dağılımı beklenen ise okur oldukça keskin yükselme daha histon modifikasyonları ile gözlemlendiği üzere, sayısını artırmak için yararlı olabilir. Birçok ChIP-Dizi deneyler için, 4-5 farklı dizin kütüphaneleri birleştirilebiliyor ve yüksek performanslı NGS makinesi kullanılarak bir akış hücresi şeritte dizilenmiştir. Bazen w mappability artırmak için okuma uzunluğu ve diziyi DNA örneğinin iki ucu (paired-end) genişletmek için de tavsiye edilirtekrarlayan genomik bölgelerde kromatin tavuk analiz. Bu protokol, kopyalama faktörleri, bu sinyal aracı ve post-translasyonel modifikasyonları histon olarak kromatin özelliğin çok çeşitli başarı ile uygulanmıştır. Onlar geliştirmek ve kromatin profilleri yorumlamak zor hale Ancak, embriyolar hücresel heterojenite artan derecesi elde. Ümitli adımlar hücre tipine özgü çekirdek 38,39 ayıklanması doku-spesifik profil kromatin manzara Arabidopsis ve Drosophila yapılmıştır. Bizim protokol, diğer embriyolar doku-spesifik ChIP-Sek için önünü açabilecek bir nükleer çıkarma adımı içerir.

Protein-DNA etkileşimlerini in vivo olarak karakterize etmeye yönelik ilk girişimler, bakterilerde ve meyve sineğinde RNA polimeraz aracılı gen transkripsiyonunu anlamak amacıyla yaklaşık 30 yıl önce rapor edildi1,2. O zamandan beri, farklı kromatin özelliklerini (ChIP) zenginleştirmek için immünopresipitasyonun kullanılması, bağlanma olaylarını ve kromatin durumlarını yüksek verimlilikle yakalamak için yaygın olarak benimsenmiştir3. Daha sonra, güçlü mikroarray teknolojilerinin ortaya çıkmasıyla birlikte, bu yöntem genom çapında kromatin manzaralarının karakterizasyonuna yol açtı4. Daha yakın zamanlarda, kromatin profillemesi daha kapsamlı ve yüksek çözünürlüklü hale geldi, çünkü milyonlarca ko-immünopresipite DNA şablonu artık paralel olarak dizilenebiliyor ve genoma eşlenebiliyor (ChIP-Seq)5. Artan sayıda genom düzeneği mevcut olduğundan, ChIP-Seq, biyolojik süreçlerin altında yatan genom düzenlemesi hakkında daha fazla bilgi edinmek için çekici bir yaklaşımdır. 
Burada, kurbağa Xenopus'unki gibi yumurta sarısı açısından zengin embriyolar üzerinde ChIP-Seq gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Yaygın olarak kullanılan Xenopus türlerinin (X. tropicalis ve X. laevis) genomlarının taslakları, Uluslararası Xenopus Genom Konsorsiyumu6 tarafından yayınlandı. Xenopus türlerinin embriyoları, çok sayıda yüksek kaliteli embriyonun üretimi, embriyoların kendilerinin büyük boyutu ve dış gelişimleri dahil olmak üzere, genom çapında kromatin çalışmalarının yorumlanmasını kolaylaştıran ve buna izin veren birçok arzu edilen özelliği paylaşır. Ek olarak, embriyolar, hücre soy izleme, tam montajlı in situ hibridizasyon, RNA aşırı ekspresyonu ve TALEN / CRISPR aracılı nakavt teknolojisi gibi klasik ve yeni manipülasyonlara uygundur.
Aşağıdaki protokol Lee ve ark., Blythe ve ark. ve Gentsch et al. 7-9. Kısaca, Xenopus embriyoları, proteinleri ilişkili genomik DNA'larına kovalent olarak bağlamak (çapraz bağlamak) için ilgilenilen gelişim aşamasında formaldehit ile sabitlenir. Nükleer ekstraksiyondan sonra, çapraz bağlı kromatin, sonraki dizilemeyi spesifik genomik bağlanma veya modifikasyon bölgelerine odaklamak ve yan DNA dizilerinin katkılarını en aza indirmek için parçalanır. Daha sonra, kromatin fragmanları, ilgilenilen proteini içerenleri zenginleştirmek için ChIP dereceli bir antikor ile immünopresipite edilir. Ko-immünopresipite edilmiş DNA, proteinden sıyrılır ve yeni nesil dizileme (NGS) için indekslenmiş (eşleştirilmiş uçlu) bir kütüphane oluşturmadan önce saflaştırılır. Sonunda, ChIP-Seq verilerinin sıralama sonrası analizi için basit komut satırları sunulmaktadır.

<table><tbody><tr><td>1/16 inç konik mikro uç</td><td>Qsonica</td><td>4417</td><td>Bu mikro uç, Misonix'ten Sonicator 3000 ve Qsonica'dan Q500/700 ile uyumludur.</td></tr><tr><td>8 ml kapaklı cam numune şişesi</td><td>Wheaton</td><td>224884</td><td>15-425 boyutunda fenolik kauçuk kaplı vidalı kapaklı sulu numuneler için 8 ml şeffaf cam numune şişesi.</td></tr><tr><td>Adaptör</td><td>, örneğin IDT veya Sigma</td><td>NA</td><td>TruSeq evrensel adaptör, 
AATGATACGGCGACCACCGAG 
ATCTACACTCTTTCCCTACAC 
GACGCTCTTCCGATC*T. TruSeq indeksli adaptör, 
P-GATCGGAAGAGCACACGTC 
TGAACTCCAGTCAC &#8208; NNNNNN&#8208; 
ATCTCGTATGCCGTCT TCTGCTT*G. *, 5''da fosforotiyoat bağfosfat grubu; son. NNNNNN, indeks (DNA dizisi için TruSeq ChIP Numune Hazırlama Kılavuzuna bakınız). Sipariş adaptörleri HPLC saflaştırılmış. Adaptörler, eşmolar miktarların birleştirilmesiyle hazırlanabilir (her biri 100 &#181; M) üniversal ve indekslenmiş adaptörün ve bunları 95 & # 176'dan yavaşça soğutmak; C'den oda sıcaklığına. Giriş DNA'sının ng'si başına 1.5 pmol kullanın. -20 &# 176;C'de saklayın.</td></tr><tr><td>b2g4pipe (yazılım)</td><td>Blast2GO</td><td>ticari olmayan</td><td>http://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip</td></tr><tr><td>BLAST+ (yazılım)</td><td>Camacho et al.</td><td>ticari olmayan</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs&amp; DOC_TYPE=Download</td></tr><tr><td>Bowtie (yazılım)</td><td>Langmead et al.</td><td>ticari olmayan</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml</td></tr><tr><td>cisFinder (yazılım)</td><td>Sharov et al.</td><td>ticari olmayan</td><td>http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/</td></tr> <tr><td>Kılcal elektroforez için çip</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td>Bu çipi 1 & mikro ile yükleyin; l Kütüphane kalite kontrolü için DNA. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Çip tabanlı kılcal elektroforez sistemi</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td>Agilent 2100 BioAnalyzer, ChIP-Seq kütüphanelerinin kalitesini kontrol etmek için kullanılır. Reaktifleri 4 ° C'de tutun.</td></tr><tr><td>ChIP-Seq kütüphane hazırlama kiti (KAPA Hiper Hazırlık Kiti)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK8504</td><td>Kiti, KAPA uç onarımı ve A-kuyruk enzim karışımı, uç Onarım ve A-kuyruk tamponu, DNA ligaz, ligasyon tamponu, KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) ve KAPA kütüphanesi amplifikasyon primer karışımı (10X) içerir (ayrıca bkz. PCR primerleri). Adaptörler dahil değildir. -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>ChIP-Seq kütüphane hazırlama kiti (alternatif, ThruPLEX-FD Hazırlık Kiti)</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R40048</td><td>Kit, kendi kök döngü adaptörlerini ve primerlerini kullanır. Bu kit, ara saflaştırma adımlarını ortadan kaldırır ve KAPA Hiper Hazırlık Kiti kadar hassastır. -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Cluster3 (yazılım)</td><td>de Hoon et al.</td><td>ticari olmayan</td><td>http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster</td></tr><tr><td>FastQC (yazılım)</td><td>Simon Andrews</td><td>ticari olmayan</td><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</td></tr><tr><td>Florometre</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>Q32866</td><td>Qubit 2.0 Florometre</td></tr><tr><td>Florometre reaktifleri</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>Q32851</td><td>Kit, Qubit florometre için konsantre tahlil reaktifi, seyreltme tamponu ve önceden seyreltilmiş DNA standartları sağlar. DNA standartlarını 4 derecede saklayın; C, tampon ve oda sıcaklığında boya.</td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Sigma</td><td>F8775-4X25ML</td><td>Moleküler biyoloji için formaldehit çözeltisi, H2O içinde %36,5-38, %10-15 metanol ile stabilize edilmiştir. Oda sıcaklığında saklayın. DİKKAT: Formaldehit aşındırıcıdır ve oldukça toksiktir.</td></tr><tr><td>Jel (E-Gel EX agaroz, %2)</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>G4010</td><td>11 oyuklu, açılabilir formatlı prekast jel. Çapraz kontaminasyonu önlemek için merdiven ve kütüphane arasındaki bir şeridi boş bırakın. Jelleri oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>Jel elektroforezi sistem</td><td>ömrü teknolojileri</td>, boyut seçimi için <td>G6465</td><td>E-Gel iBase ve E-Gel Safe Imager birleşik kiti, ChIP-Seq kitaplıkları.</td></tr><tr><td>Jel ekstraksiyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>Tüm reaktifleri oda sıcaklığında saklayın. 500 ve mikro kullanın; DNA'yı çıkarmak için 100 mg %2 agaroz jel dilimi başına l QG tamponu. DNA'yı iki kez elüte etmek için MinElute sütunlarını (MinElute PCR saflaştırma kitinden) kullanın.</td></tr><tr><td>HOMER (yazılım)</td><td>Chris Benner</td><td>ticari olmayan</td><td>http://homer.salk.edu/homer/index.html</td></tr><tr><td>Hibridizasyon fırını</td><td>Techne</td><td>FHB1D</td><td>Hibridizatör HB-1D</td></tr><tr><td>IGV (yazılım)</td><td>Robinson et al.</td><td>ticari olmayan</td><td>http://www.broadinstitute.org/igv/home</td></tr><tr><td>Illumina CASAVA-1.8 kalite filtresi (yazılım)</td><td>Assaf Gordon</td><td>ticari olmayan</td><td>http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter</td></tr><tr><td>Java TreeView (yazılım)</td><td>Alok Saldanha</td><td>ticari olmayan</td><td>http://jtreeview.sourceforge.net</td></tr><tr><td>Laboratuvar jakı</td><td>Edu-Lab</td><td>CH0642</td><td>Bu jak, sonikasyon için ses muhafazasındaki örneği yükseltmek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Merdiven, 100 bp</td><td>New England BioLabs</td><td>N3231</td><td>1x çözeltisini oda sıcaklığında tutun. Stoku -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Merdiven, 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232</td><td>1x çözeltiyi oda sıcaklığında tutun. Stoku -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Düşük retansiyonlu 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>AM12450</td><td>yapışmaz, RNaz içermeyen mikrofüj tüpleri, 1.5 ml</td></tr><tr><td>MACS2 (yazılım)</td><td>Tao Liu</td><td>ticari olmayan</td><td>https://github.com/taoliu/MACS</td></tr><tr><td>Manyetik boncuklar</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>11201D</td><td>Bu Dynabeads, boncuk yüzeyine kovalent olarak bağlanmış afiniteye sahip saflaştırılmış poliklonal koyun anti-fare IgG'ye sahip süperparamanyetik boncuklardır. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Manyetik boncuklar</td>, <td>yaşam teknolojileri</td>, <td>11203D</td><td>Bu Dynabeads, boncuk yüzeyine kovalent olarak bağlanmış, afiniteye sahip, saflaştırılmış poliklonal koyun, anti-tavşan, IgG, süperparamanyetik boncuklardır. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Manyetik boncuklar</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>10001D</td><td>Bu Dynabead'lar, boncuk yüzeyine kovalent olarak bağlı rekombinant protein A'ya sahip süperparamanyetik boncuklardır. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Manyetik boncuklar</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>10003D</td><td>Bu Dynabead'lar, boncuk yüzeyine kovalent olarak bağlanmış rekombinant protein G'ye sahip süperparamanyetik boncuklardır. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Manyetik raf</td><td>ömrü teknolojileri:</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2 mıknatıs</td></tr>, <tr><td>MEME</td>, <td>Bailey ve diğerleri.</td><td>ticari olmayan</td><td>http://meme.nbcr.net/meme/</td></tr> <tr><td>Na3VO4</td><td>New England BioLabs</td><td>P0758</td><td>Sodyum ortovanadat (100 mM), protein fosfotirozil fosfatazlar için yaygın olarak kullanılan genel bir inhibitördür. -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>NaF</td><td>New England BioLabs</td><td>P0759</td><td>Sodyum florür (500 mM), fosfoseril ve fosfotreonil fosfatazların genel inhibitörü olarak yaygın olarak kullanılır. -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>NGS makinesi</td><td>Illumina</td><td>SY-301-1301</td><td>Genom Analiz Cihazı IIx</td></tr><tr><td>NGS makinesi (yüksek performans)</td> <td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td>HiSeq</td></tr><tr><td>Normal serum (antikor kontrolü)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2028</td><td>ChIP-qPCR deneylerinde keçi poliklonal IgG antikorları için kontrol olarak kullanın. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Normal serum (antikor kontrolü)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td>ChIP-qPCR deneylerinde fare poliklonal IgG antikorları için kontrol olarak kullanın. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Normal serum (antikor kontrolü)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2027</td><td>ChIP-qPCR deneylerinde tavşan poliklonal IgG antikorları için kontrol olarak kullanın. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Nükleik asit boyama çözeltisi</td><td>iNtRON</td><td>21141</td><td>1: 50.000'de RedSafe nükleik asit boyama çözeltisi kullanın. Oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>Turuncu G</td><td>Sigma</td><td>O3756-25G</td><td>1-Fenilazo-2-naftol-6,8-disülfonik asit disodyum tuzu. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>PCR primerleri</td>, örneğin, adaptör bağlı DNA fragmanlarını PCR ile zenginleştirmek için <td>IDT veya Sigma</td><td></td><td>Primerleri: AATGATACGGCGACCACCGA*G ve CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G, fosforotiyoat bağı. Ethan Ford tarafından tasarlanan astarlar. Astarları 5 & mikro'da birleştirin; Her biri M. 5 ve mikro kullanın; 50 & mikroda l; l PCR reaksiyonu. -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>MinElute PCR saflaştırma kiti&nbsp;</td>ChIP-qPCR saflaştırılması ve kesme testi numuneleri için <td>Qiagen</td><td>28006</td><td>. MinElute döndürme sütunlarını 4 > C, diğer tüm tamponlar ve toplama tüpleri oda sıcaklığında.</td></tr><tr><td>Fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1, pH 7.9)</td> <td>yaşam teknolojileri</td><td>AM9730</td><td>Fenol: Kloroform: IAA (25: 24: 1) önceden karıştırılır ve pH 6.6'da sağlanır. PH'ı 7.9'a yükseltmek için sağlanan Tris alkalin tamponunu kullanın. DİKKAT: fenol: kloroform: izoamil alkol aşındırıcı, oldukça toksik ve yanıcıdır.</td></tr><tr><td>Primer3 (yazılım)</td><td>Steve Rozen & Helen Skaletsky</td><td>ticari olmayan</td><td>http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitör tabletleri</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>cOmplete, Mini, EDTA içermez. 10 ml başına 1 tablet kullanın. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü tabletler</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>cOmplete, EDTA içermez. 50 ml başına 1 tablet kullanın. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>AM2548</td><td>proteinaz K çözeltisi (20 & mikro; g/&mikro; l). -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>12091-039</td><td>RNase A (20 & mikro; g/&mikro; l). Oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>Döndürücü</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td>Döndürücü SB3</td></tr><tr><td>SAMtools (yazılım)</td><td>Li et al.</td><td>ticari olmayan</td><td>http://samtools.sourceforge.neta</td></tr><tr><td>Katı faz geri dönüşümlü immobilizasyon boncukları</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>Agencourt AMPure XP boncukları, ChIP-Seq kitaplıklarında adaptör dimer kontaminasyonunu en aza indirmek için kullanılır. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Sonicator 3000</td><td>Misonix / Qsonica</td><td></td><td>Artık daha yeni modeller mevcuttur. Q125, Q500 veya Q700'ün tümü çapraz bağlı kromatini kesmek için uygundur.</td></tr><tr><td>Ses muhafazası</td><td>Misonix/Qsonica</td><td></td><td>isteğe bağlı: doğru ses muhafazasını elde etmek için üreticinin tavsiyesine uyun.</td></tr><tr><td>Termomikser</td><td>eppendorf</td><td>22670000</td><td>24 x 1,5 mL tüpler için termomikser. 4 ° C'den hassas sıcaklık kontrolü; Oda sıcaklığının üzerinde 99 ° C'ye kadar C.</td></tr></tbody></table>

kromatin regülatörleri ve devletleri&#39;nde genom anlık<em&gt; ksenopus</emchip-sıra tarafından&gt; embriyolar

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Kromatin düzenleyicilerin işe alınması ve kromatin durumlarının spesifik genomik lokuslara atanması, gelişim sırasında hücre kaderi kararları ve doku ve organ oluşumu için çok önemlidir. Bu tür kromatin özelliklerinin in vivo olarak yerlerinin ve seviyelerinin belirlenmesi, genomik elementlerin uzaysal-zamansal regülasyonu hakkında değerli bilgiler sağlayacak ve in vitro embriyonik doku gelişimini taklit etme isteklerini destekleyecektir. Genom çapında ve yüksek çözünürlüklü profilleme için en yaygın kullanılan yöntem kromatin immünopresipitasyondur ve bunu yeni nesil dizileme (ChIP-Seq) takip eder. Bu protokol, kurbağa Xenopus'unki gibi yumurta sarısı açısından zengin embriyoların ChIP-Seq deneyleri için nasıl işlenebileceğini ana hatlarıyla belirtir ve dizileme sonrası analiz için basit komut satırları sunar. Protokolün formaldehitle sabitlenmiş dokudan çekirdekleri çıkardığı yüksek verimlilik nedeniyle, yöntem, genom çapında profilleme için yeterli ChIP materyali elde etmek için kolay yükseltmeye izin verir. Protokolümüz, transkripsiyon faktörleri, sinyal aracıları, transkripsiyon mekanizmasının bileşenleri, kromatin değiştiriciler ve translasyon sonrası histon modifikasyonları gibi çeşitli DNA bağlayıcı proteinleri haritalamak ve bunun için embriyogenezin çeşitli aşamalarında yapılması için başarıyla kullanılmıştır. Son olarak, bu protokol, giderek daha fazla genom düzeneği kullanılabilir hale geldikçe, diğer model ve model olmayan organizmalara geniş çapta uygulanabilir olmalıdır.

Protokol de idam eğer burada sunulan eşdeğer sonuçlar beklenmektedir ve kullanım antikor ChIP dereceli kalitesi (tartışma) biridir. Bu protokol formaldehit sabit Xenopus embriyolar çekirdeklerin çıkarma ve sonikasyon ile kromatin verimli kesme (Şekil 1A-C) izin verir. Kesilmiş kromatin esas olarak 100 ila 1000 bp arasında değişen ve bp (Şekil 1C) 300 ila 500 zirve DNA fragmanlarının asimetrik dağılımı gösterilmektedir. Çökeltilir DNA minimal 50 pg başarıyla benzer büyüklükteki DNA ekler (Şekil 2A) ile bir dizine eşleştirilmiş-uç ChIP-Sıra kütüphane yapmakla yükümlüdür. Kütüphane, yaklaşık 120 bp Elektroforegramda görülebilir adaptör dimerlerinin, büyük ölçüde yoksun olmalıdır. Sekanslama-sentez sırasında, okuma ön işlemden genom (Şekil 2B, C) ​​eşleştirilir. Başarılı bir deneyde In <em&gt; X. tropicalis embriyolar, tek sonu normalde 50 ila 70% maksimum iki uyumsuzlukları ile V7.1 genom düzeneğine benzersiz eşlenebilir 40 bp okur. Giriş genomu boyunca oldukça eşit hizaya okur iken, ChIP hizalama ilgi kromatin özelliğini kanadını iplikçik özgü zenginleşme sonuçları okur. Bütün parçalar 5 &#39;ucuna (Şekil 2C) 25 dizilenmiştir olmasıdır. Ortalama fragman büyüklüğü yön okuma uyum uzatılması gibi transkripsiyon faktörü bağlayıcı olaylar gibi tek kromatin özellikleri doğru profiller üretmektedir. IGV veya başka bir uyumlu genom tarayıcıda görüntülendi zaman bu DNA doluluk zirveleri olarak görünür. MACS gibi Tepe arayanlar bu zirveleri (Şekil 3A) konumunu belirlemek için kullanılır. Onlarca bağlayıcı sitelerin binlerce Bu şekilde X tespit edilmiştir tropicalis genom gibi vegt 26 gibi T-box transkripsiyon faktörleri. ChIP-qPCR deneyrından ChIP-Sek (Şekil 3B) tarafından bulundu yerel zenginleştirme teyit etmelidir. ChIP-Seq deneyler kromatin özellikleri genom özelliklerini keşfetmek izin. Örneğin, transkripsiyon başlangıç ​​ve sonlandırma siteleri gibi genomik elemanları üzerinde okuma dağılımı hesaplanırken genlerin etrafında herhangi bir mekansal bağlama tercihleri ​​(Şekil 3C) vurgulamak olabilir. Benzer şekilde, tepe yerlerde okuma dağıtımları bir heatmap bir genom ölçeğinde (Şekil 3D) farklı kromatin özelliklerini karşılaştırmak için kullanılır. Bazı transkripsiyon faktörleri potansiyel eş-faktörler (Şekil 3E) eş-zenginleştirilmiş motifler içeren bu tür bilgileri alabilirsiniz genomik DNA yatan zirveleri DNA dizisi-özellikle. De novo motifi analizini bağlamak. hedef genlerin büyük bir çoğunluğu DNA düşük doluluk ziyade yüksek düzeyde (Şekil 3F) gösterir. Bu ölçek serbest özelliği tr arasında oldukça yaygın gibi görünüyoranscription faktörleri ve hedef genlerin yalnızca küçük bir bölümünün doğrudan biyolojik uygunluğu 27,28 düzenlenmiştir olduğunu göstermektedir. Böyle daha Xenopus embriyo (Şekil 3G) kromatin özelliğinin biyolojik fonksiyonu anlayışlar ortaya çıkarabilir hedef genlerin diferansiyel ifadesi olarak zenginleştirilmiş GO açısından veya diğer niteliklerin analizi. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52535/52535fig1highres.jpg" /> Xenopus embriyolar 1. Kromatin immüno-çökeltmesi prosedürü Şekil. (A) Embriyolar formaldehit-sabit kovalent bağlama (cross-link) ilgi genomik DNA ile ilişkili herhangi bir proteinlerin gelişimsel aşamadadır. Nükleer ekstraksiyon (B) üzerine, çapraz bağlı kromatin bağlayıcı genomik DNA veya yan DN minimize ederek kromatin modifikasyon siteleri daraltmak için parçalanmışBir dizi (° C). Daha sonra, kromatin fragmanları ilgi (D) epitop ihtiva eden ettirecek bir çip dereceli antikoru ile imüno-çökeltilir. ko-immunoprecipitated DNA protein sıyrıldı ve NGS (Şekil 2) için ChIP fragmanı kütüphane oluşturmadan önce (E) arıtılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52535/52535fig2highres.jpg" /> Şekil 2. ChIP-Sıra kütüphane hazırlık, sıralama-sentez, haritalama ve pik arama. (A) &#39;elektroferogramıdır 250 bp 450 DNA şablonları ile iyi talaş-Dizi kütüphane gösterir. Bu şablonlar evrensel (58 bp) tarafından çevrili ilgi DNA insert ve dövize endeksli (63 bp) adaptörü gerektirir. (B) </aynı şablonları içeren her küme kümelerin strong&gt; Milyonlarca, geri dönüşümlü, farklı floroforu ve aynı sonlandırma özelliklere sahip dört nükleotidin varlığında tabanı tarafından sıralı taban vardır. Floresan görüntüleri okur içine sonuçta monte karşılık gelen bazlar, aramak için gerçek zamanlı olarak işlenir. (C) Sadece benzersiz Ksenopus genomuna haritası tutulmasını okur. Bütün parçalar 5 &#39;ucundan dizilenmiştir gibi, yonga eşleme ilgi kromatin özelliği kuşatan şerit spesifik pikler okur. Böylece, pik arayanlar doğru kromatin özelliklerini lokalize bir ortalama fragman uzunluğu okur immunoprecipitation kaynaklanan ve genişletmek zenginleştirme tespit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt = &quot;Şekil 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.535 / 52535fig3highres.jpg&quot; /&gt; Şekil 3. Zigotik T-box transkripsiyon faktörü vegt (zVegT). Hepsi burada gösterilen sayıları 10 milyona normalize olan okuma benzersiz haritalanmış ve olmayan gereksiz okur. (A) alıntı vasıtasıyla sonrası dizi analizi ve veri görselleştirme örneği zVegT genom profil X. bağlanma (Nieuwkoop ve Faber 29 sonra 12.5 sahne 11) Tropicalis gastrula embriyolar. Her tepe, genişletilmiş okur yığılma, tek bir bağlanma yeri temsil eder. Bu doruklarına% 1&#39;den daha az bir yanlış keşif oranı (FDR) ile MACS2 tarafından denir. Her MESP gen bağlanma oldukça yakın ve üst baş zVegT gösterir, ancak MESPA ve mespb Bu aşamada (RNA&#39;ya Dizi verileri 30) ile ifade edilir. (B) &#39;zVegT DNA doluluk seviyeleri birkaç loci talaş-qPCR tarafından (bir non içeren kb yukarısında β aktin arasında TT-bağlı bölgesi 0.5) konfiChIP-Sıra tarafından bulunan özel zenginleştirme rm. (A) (kırmızı çubuk) olarak adlandırılan tepe MESPA sonuçları karşılaştırın. DNA doluluk seviyesi hem de giriş yüzdesi, vegt antikor (IgG izotipinin tavşan poliklonal) ve antikor kontrolü (normal tavşan IgG) ile ChIP ile ChIP olarak görüntülenmiştir. Hata çubukları iki biyolojik çoğaltır standart sapmasını yansıtır. (C) Metagene analizi etrafında başka genomik bölge ve gen organları içinde promotör göreceli bağlama tercihli zVegT (etiketler 25 bp üzerinde binned) gösterir. (D) Heatmap k-ortalama gösterir kümelenmiş (k = 5), DNA doluluk seviyeleri gastrula aşamasında tüm zVegT bağlı bölgelere zVegT ve Smad2 / Smad3 (ChIP-Dizi veriler 31) göreceli (etiketler 25 bp üzerinde binned). heatmap De novo motif analizi zVegT-% 38&#39;inde motifi bağlayıcı kanonik T-box transkripsiyon faktörü keşfeder 2 tabanlı ve bp başına 5 etiketleri merkezli. (E) logaltta yatan motifi mı arka dizileri,% 5 bulma oranı normalize ise, bağlı bölgeleri. kanonik Smad2 / Smad3 bağlayıcı motifi pek zenginleştirilmiş ise yoğunluk haritası, zVegT bağlanma sitelerin merkezinde T-box motifi için en yüksek zenginleştirme gösterir. (F) Histogram, her hedef genin hesaplanır zVegT DNA doluluk seviyelerini gösterir [-] tüm zirveleri (+/- 200 bp) 5 kb yukarı arasından. transkripsiyon başlangıç ​​siteleri gelen ve 1 kb mansap [+] (G) yüksek DNA doluluk içinde -5 kb düzeyleri ve 1 kb with Top 300 genlerin Erken embriyonik gelişim biyolojik süreçleri için zenginleştirilmiş. Bu terimler zVegT varsayımsal fonksiyonu ile uyumludur GO. FDR iki kuyruklu Fisher testine göre ve çoklu test için düzeltilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

nasıl kromatin düzenleyiciler ve kromatin devletlerin soru in vivo genom hücre kaderi kararları gelişen embriyonun yapılır ne kadar erken anlayışımıza önemli olduğunu etkileyebilir. ChIP-Seq-küresel düzey bir Xenopus embriyolar için burada özetlenen kromotin özelliklerini araştırmak için en popüler yaklaşım.

Kromatin Regülatörleri ve Devletleri&#39;nde genom Anlık<em&gt; Ksenopus</emChIP-Sıra tarafından&gt; Embriyolar

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Yaygın olarak ChIP-seq olarak bilinen, kromatin immünopresipitasyonunun kısaltması olan ve ardından yeni nesil dizileme olarak bilinen bu prosedürün amacı, opus embriyosundaki kromatin düzenleyicilerinin ve kromatin durumlarının genom çapındaki konumunu belirlemektir. Bu, önce zap embriyolarının sabitlenmesi ve böylece DNA ile ilişkili proteinlerin genoma kovalent olarak bağlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, çekirdekler ekstrakte edilir ve kromatinleri çözündürülür ve sonikasyon ile paylaşılır.Bu noktada, ilgilenilen DNA'ya bağlı protein, immünopresipitasyon ve kapsamlı yıkama ile saflaştırılır. Son adım, saflaştırılmış DNA parçalarından indekslenmiş bir ChIP-seq kütüphanesi oluşturmaktır. Nihayetinde, res adı verilen bu DNA fragmanlarının milyonlarcası paralel olarak dizilenir, genoma hizalanır ve ortalama parça uzunluğuna kadar uzatılır.Tepe noktaları olarak adlandırılan res zenginleştirme, ilgilenilen proteinin bölgeye özgü tüm DNA doluluklarını tanımlamak ve böylece genom çapında özelliklerinin çalışmasını genişletmek için belirlenir. Dolayısıyla bu protokol, emus embriyolarının genom çapında kromatin mimarisi hakkında ayrıntılı bilgiler sağlayabilir. Ayrıca potansiyel olarak dizilenmiş genomlara sahip diğer organizmalara da uygulanabilir.Tapu embriyoları ile başlayın. Bu noktaya kadar olan ayrıntılar metin protokolünde verilmiştir. Bunları sekiz mililitrelik bir cam şişeye aktarın ve 0.01 XMMR ile yıkayın.Yıkamadan sonra embriyoları %1 para formaldehit ve 0.01 XMMR ile sabitleyin. Düzeltmenin oda sıcaklığında en az 15 ila 40 dakikadan fazla olmamasına izin verin. Embriyoları soğuk 0.01 XMMR ile üç kez yıkayarak düzeltmeyi sonlandırın.Yüzey gerilimi yırtılmaya yol açacağından embriyoların solüsyonun yüzeyine temas etmesini önleyin. Fiksatif yıkandıktan sonra, mikro çöp tüplerinde 250 embriyonun alikotlarını yapın. Daha sonra mümkün olduğunca 0.01 XMMR'nin ağırlığını artırın ve duraklatmak için kromatin ekstraksiyonuna devam edin.Burada embriyoları 250 mikrolitre soğuk HEG tamponunda eşitleyin. Tampona yerleştirildikten sonra, embriyolar sıvı nitrojen içinde dondurulabilir ve eksi 80 santigrat derecede saklanabilir. Sabit embriyoları E bir tamponda homojenize ederek başlayın.Yükseltme ve tampon hazırlama ile ilgili ayrıntılar metin protokolünde verilmiştir. Sonraki santrifüj. Dört santigrat derecede homojenatlar, satımı aspire eder ve atar ve peletleri E bir'de yeniden süspanse eder.Yine, numuneyi 10 dakika buz üzerinde tutun. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve bu sefer Reese, paleti E ikide askıya alın. Homojenat buz üzerinde soğuyana kadar 10 dakika bekleyin.Ardından santrifüjlemeyi tekrarlayın ve Reese peleti E üçte askıya alın. Bu sefer, 10 dakika daha soğuduktan sonra, süspansiyon oldukça şeffaf görünmelidir, çünkü bu noktada onik deterjan kalan yumurta sarısı trombositlerinin çoğunu çözünür hale getirir. Şimdi santrifüjlemeyi tekrarlayın. Andre.Peletleri bir ila üç mililitre E üç içinde askıya alın. Gerekirse, tüm peletleri istenen çapraz bağlı çekirdeklerden ayırmak için son santrifüjleme adımını kullanın. Bu süspansiyon ayrıca pigment granülleri ve bazı kalıntı yumurta sarısı trombositleri içerir.Bu granüller ve yumurta sarısı trombositleri, santrifüjleme ile sonikasyondan sonra kromatinden ayrılacaktır. Şimdi numuneyi buz üzerinde tutun ve kromatin parçalanmasına devam edin. Alternatif olarak, geçici depolama için numuneyi dondurun.E üçteki numuneyi özel yapım bir polistiren tüpe aktararak başlayın. Sonikat için, tüpü kısa bir termometre kelepçesi kullanarak buzlu su ile 800 mililitrelik bir behere takın, böylece sonikasyon sırasında çağrılır. Beheri bir kriko üzerine yerleştirin ve jakı, sonikin ucu numunenin yaklaşık üçte ikisine daldırılacak şekilde ayarlayın.Sonikat ucu tüp duvarına temas etmemelidir. Toplamda yedi dakika süren bir adet 16. inç konik mikro uç sonikat ile donatılmış Sonic Sonicate 3000'imden üreticinin önerdiği parametrelerle başlayarak sonikasyonu optimize edin. Sonikasyon arasında bir seferde 30 saniye.Numuneyi bir dakika dinlendirin. Her sonikasyonu bir güçte başlatın ve kademeli olarak iki ile dört arasında artırın. Numune köpürmeye başlarsa, tüpü yeniden konumlandırın ve devam etmeden önce köpüğün dağılmasına izin verin Sonikasyondan sonra, kromatin çözündürülür ve kesilir.1,5 mililitrelik mikro atık tüplerine önceden soğutun ve tam hızda santrifüjleyin. Beş dakika boyunca dört santigrat derece boyunca SNA'yı toplayın ve ön soğutma tüplerine aktarın. Peleti atın.Parçalanmayı görsel olarak değerlendirmek için 50 mikrolitre SUP natant kullanın ve geri kalanını immünopresipitasyon için saklayın. 10 ila 30 mikrolitre she kromatin SUP'u bir giriş numunesi olarak hizmet etmek üzere yeni bir tüpe aktararak başlayın. Daha sonra kalan kromatine milyon hücre başına yaklaşık bir mikrogram çip dereceli antikor ekleyin.Kromatin antikor örneğini gece boyunca, yine dört santigrat derecede, ancak 10 RPM rotasyonla inkübe edin. Ertesi gün, antikor uyumlu manyetik boncukları E üç'te beş dakika dört santigrat derecede yıkayın. Üreticinin yıkanmış boncuklarda önerdiği boncuk konsantrasyonunu antikora kullanarak, önceden inkübe edilmiş kromatini dört santigrat derecede inkübe edin ve dört saat daha döndürün.Daha sonra soğutulmuş riper tamponu kullanarak boncukları 10 kez yıkayın. Yıkamalar arasında boncukları ayırmak için mıknatısı 20 ila 30 saniye kullanın. Çözüm açık olmalı.Riper tampon yıkamalarını soğuk 10 tampon kullanarak bir yıkama ile takip edin. Daha sonra boncukları 10 tamponluk küçük bir hacimde yeni bir tüpe aktarın. Boncukları ayırın ve kalan tamponu atın.İmmün çökeltilmiş kromatini ayırmak için. Reese, boncukları 50 ila 100 mikrolitre SDS çözelti tamponunda büktü ve tüpü bir termo karıştırıcı ile girdapladı. Daha sonra tüpü 30 saniye boyunca tam hızda santrifüjleyin ve immün çökeltilmiş kromatin elüat içeren snat'ı toplayın.SDS çözeltisini tekrarlayın, bir kez adım atın ve tüm elüatı birleştirin. Daha sonra DNA ekstraksiyonu, ChIP-seq, kütüphane hazırlığı ve metin protokolünde açıklandığı gibi yeni nesil dizileme ile devam edin Bu protokolü takip eden paylaşılan kromatin, esas olarak 100 ila 1000 baz çifti arasında değişen ve 300 ila 500 baz çifti arasında zirve yapan DNA parçalarının asimetrik bir dağılımını gösterir. Benzer büyüklükteki DNA ekleri ile indeks eşleştirilmiş bir N ChIP-seq kütüphanesini başarılı bir şekilde yapmak için en az 50 pikogram immüno-çökeltilmiş DNA gereklidir.Kütüphane, elektroferogramda yaklaşık 120 baz çiftinde görülebilen adaptör dimerlerinden büyük ölçüde yoksun olmalıdır. ChIP-seq kütüphanesinin dizilimi, okuma adı verilen milyonlarca kısa DNA dizisini azaltır. Bunlar genomla eşleştirilirken, girdi okumaları genom boyunca eşit şekilde hizalanır.Çip okumaları, ilgilenilen kromatin özelliğini çevreleyen ipliğe özgü zenginleştirmeleri gösterir. Okuma yönündeki hizalamayı ortalama bir parça boyutuna genişletmek, transkripsiyon faktörü bağlama olayları gibi tek kromatin özellikleri için doğru profilleri azaltır. Bunlar, Zeno'nun tropik embriyolarının gastro listesi aşamasında sebze çayı için burada gösterildiği gibi bir genom tarayıcısında zirveler olarak görünür.ChIP-seq deneyleri, burada gösterildiği gibi, piklerin altında yatan zenginleştirilmiş DNA dizisi motifleri veya gen hedeflerinin gen ontolojisi analizi gibi kromatin özelliklerinin genom çapında özelliklerinin araştırılmasına izin verir, haritalanmış tezgah TDNA etkileşimleri geliştirildikten sonra. Bu yöntem, araştırmacıların embriyonik kromatin manzarasını hem genom çapında hem de çok yüksek bir çözünürlükte keşfetmelerinin yolunu açıyor.

genome-wide-snapshot-chromatin-regulators-states-xenopus-embryos-chip

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

ESC farklılaşması, hücre türüne özgü yapısı değişiklikleri ve kromatin bileşimi ile çakışmaktadır. Bu değişikliklerin tespiti stemcellness ve hücre farklılaşması tanımlamak mekanizmaları içine değerli bilgiler sağlar. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) kök hücre farklılaşması altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için değerli bir yöntem temsil eder.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

Biz fare embriyonik doku doku-spesifik gen ekspresyonu başlangıcı sırasında veya sonrasında doku spesifik genlerin faktör etkileşimleri belirlemek için yöntem bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) göstermektedir. Bu protokol, normal embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan doku-spesifik gen aktivasyon çalışması için yaygın olarak uygulanabilir olmalıdır.

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Gen transkripsiyonu bir ince ayar düzenlemesi embriyonik hücre kaderi kararı temelini oluşturmaktadır. Bu yazıda, kök hücre ve fare embriyoları kalp gelişimi hem kalp farklılaşma epigenetik düzenleme araştırmak için kullanılan kromatin immünopresipitasyon analizler açıklanmaktadır.

Embriyonik Kök Hücre ve Doku Kardiyak Farklılaşma epigenetik Yönetmelik

Burada, Kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve ChIP-seq Kütüphane hazırlık Protokolü düşük-bereket tavuk embriyonik örnekleri küresel epigenomic profilleri oluşturmak için açıklar.

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Burada, bir en iyi duruma getirilmiş yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama Protokolü ve genom çapında Kromatin devlet desenlerini donmuş tümör doku ve hücre hatları belirlenmesi için hesaplama analizleri potansiyel açıklar.

Yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama tümör dokularda kullanarak genom geniş eşleme Kromatin devletler için entegre bir Platform

Bu eser bir protokolünü açıklar yüksek çözünürlüklü in situ Hi-C kitaplıklardan nesil sıkıca öncesi gastrulasyon Drosophila melanogaster sahnelenen için embriyo.

Genom çapında kromatin Conformation yakalama kitaplıklardan sıkıca aşamalı erken Drosophila embriyo nesil

Burada, biz ChIP-Seq gerçekleştirmek için yöntemleri tarif ve CARIP-yeni nesil sıralama, Kütüphane hazırlık dahil olmak üzere küresel epigenomic ve kromatin ilişkili RNA oluşturmak için Seq, ES hücrelerde eşler.

CARIP-Seq ve ChIP-Seq: kromatin ilişkili RNA ve Protein-DNA etkileşimleri embriyonik kök hücreleri tanımlamak için yöntemleri

Bu yöntem hücre hatlarında ÇHC2 aracılı kromatin etki alanlarının oluşumunu takip etmek için tasarlanmıştır ve yöntem diğer birçok sistemlere uyarlanabilir.

Kromatin Etki Alanlarının De novo Oluşumunu İnceleme Yöntemi

Genom genelinde protein bağlayıcı yerlerin kesin olarak belirlenmesi gen düzenlemesini anlamak için önemlidir. Burada kromatin-immünprecipitated DNA'yı exonuclease sindirimi (ChIP-exo) ve ardından yüksek verimli dizilim ile tedavi eden bir genomik haritalama yöntemini açıklıyoruz. Bu yöntem, memeli nöronlarında yakın baz çifti haritalama çözünürlüğü ve yüksek sinyal-gürültü oranı ile protein-DNA etkileşimlerini tespit eder.

Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo) Kullanılarak Fare Kök Hücre Türevi Nöronlarda Protein-DNA Etkileşimlerinin Yüksek Çözünürlüklü Haritalanması

Bu protokol, yeni ortaya çıkan geliştirici transkriptleri ölçmek için kolaylaştırılmış bir hesaplama hattı sağlar. Kromatin erişilebilirliğini, kromatin özelliğini ve transkripsiyonel verileri entegre ederek, karmaşık intragenik bölgelerdeki güçlendirici aktivitenin doğru tespitine ve ipliğe özgü analizine olanak tanırken, kapsamlı biyoinformatik eğitimi olmayan araştırmacılar için de erişilebilir olmaya devam eder.

Fare Embriyonik Kök Hücrelerinde İntergenik/İntojenik Güçlendirici RNA Miktar Tayini için Hesaplamalı Bir Boru Hattı

Burada, sadece 30 μL solucan pelleti kullanılarak L4-aşama Caenorhabditis elegans tüm solucanında uygulanacak hızlı ve basit bir ATAC-seq protokolünü sunuyoruz.

Bütün Caenorhabditis elegans L4 larvalarda kromatin erişilebilirlik profili

Keşfedin ChIP-Seq yöntemiyle Xenopus embriyolarında kromatin düzenleyicilerinin genom çapında haritalanmasını. Bu protokol erken embriyonik gelişimde gen düzenlemesini anlamak için değerli bilgiler sunar.

Kromatin Regülatörleri ve Devletleri'nde genom Anlık

Daha fazla video keşfet