HiPSC Sinir Lineage Özgül Knockin Muhabirleri Verimli Nesil kullanma CRISPR / Cas9 ve Cas9 Çift Nickase Sistemi

Bu prosedürün genel amacı, CRISPR Cas dokuz aracılı homolog rekombinasyon kullanarak soya özgü insan kaynaklı pluripotent kök hücre veya H-I-P-S-C knockin raportörleri üretmektir. Bu, önce hedefleme vektörlerinin tasarlanması ve oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, CRISPR Cas dokuz sistemi veya CAS dokuz N çift Nick kasa sistemi için tek kılavuz RNA'ları tasarlamak ve inşa etmektir.

2 93 FT. Hücreler daha sonra tek kılavuz RNA'lar ve CAS dokuz ekspresyon vektörü ile manşon transfekte edilir ve DNA, bir T yedi ENDONÜKLEAZ bir test ile değerlendirilmek üzere ekstrakte edilir ve amplifiye edilir. Son adım, potansiyel hedef dışı sitelerin in silico tahminini gerçekleştirmektir. Site. Sonuç olarak, HI PSC'ler, nöral soy knockin raportör hücre hatları oluşturmak için hedefleme vektörü ve CRISPR Cas dokuz sistem bileşeni ile transfekte edilecektir.

Bu tekniğin geleneksel homolog rekombinasyon gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı. Bunun yerine, CRISPR cast dokuz aracılı gen hedeflemesi çok daha yüksek bir hedefleme verimliliğine sahiptir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü tek GA rna'yı tasarlamak biraz pratik gerektirebilir.

Bu yöntemin görsel gösterimi, tek kılavuzlu RA tasarımı için adımların öğrenilmesi ve hedef dışı bölgelerin sical tahmininde bulunması zor olduğundan, CRISPR Cas nine konseptinin gen düzenleme için yakın zamanda tanıtılması ve yeni çevrimiçi kaynak araçlarının kullanılması nedeniyle kritik öneme sahiptir. Genin genomik dizisini bulun ve homoloji kollarını buna göre tasarlayın. Bu örnekte A LDH bir L bir genomik lokus kullanılmıştır.

Hedefleme yapısı, iki A peptit dizisinin kendi kendine parçalanmasıyla bağlanan durdurma kodundan hemen önce genomik dizinin aşağı akışında GFP'nin alt klonlanmasıyla yapılır, raportörün aşağı akışında bir F eritilmiş neomisin kaseti gibi pozitif bir seçim kaseti ekleyin, örneğin üç ana homoloji kolunun dışında timidin kinaz dahil edin. Bu prosedüre, raporlayıcıyı A LDH yapmak için hedeflenecek kökene özgü işaretçiyi belirleyerek başlayın, bu gösteride L bir tane kullanılır. CDNA dizisini NCBI veritabanından kopyalayın.

Genomik DNA hizalaması elde etmek için insan blatt aramasına gidin. Görünüm sekmesi altında genin montajını görüntülemek için tarayıcı sekmesine tıklayın. Tam genomik DNA dizisini hızlı bir formatta elde etmek için DNA'ya tıklayın.

İki yönlü dizinin ve raportör kasetinin etiketleneceği DNA dizisi içindeki durdurma kodunu bulun. Uygun NGG dizisini bulmak için her iki teli de tarayın, durdurma kodunun yakınında proto ara parçalayıcıyı, bitişik motifi veya örneğin NGG'yi arayın. 20 temelinin sırasını NGG'nin hemen yukarısına kopyalayın ve web'e yapıştırın Tasarım aracı Z fit tasarım oligoları, çıkıntılarla MLM 3 6 3 6 ile uyumludur.

U altı promotörü olan insan GRNA ekspresyon vektörü. Hem ileri hem de geri oligolar sentezlendikten sonra, 50 mikrolitrelik bir reaksiyon için çift sarmallı tek kılavuz RNA yapmaya devam edin. Sırasıyla 22.5 mikrolitre ileri ve geri oligo ve beş mikrolitre Anne diz çökme tamponu ekleyin, her iki oligoları 70 santigrat derecede 15 dakika denatüre edin ve yavaş yavaş oda sıcaklığına soğutun.

Daha sonra oligoları BSMB ile karıştırın ve bir sindirilmiş MLM 3 6 3 6 ile bağlayın. 20 mikrolitrelik bir reaksiyon için, bir mikrolitre oligo, 100 nanogram MLM 3 6 3 6 ve bir mikrolitre T ekleyin, ertesi gün gece boyunca oda sıcaklığında dört ligaz inkübe edin, DH beş alfa bileşen hücresini bir ligasyon ürünü ile 42 santigrat derecede 30 saniye boyunca ısı şokuyla dönüştürün. Bakterileri bir LB burgu ampisilin plakasında gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün.

Ertesi gün, plazmit hazırlığı için üç ila beş koloni seçin. Daha sonra, plazmit DNA'sı ticari dizileme ile doğrulanır ve doğru plazmit, bu prosedüre başlamak için standart bir maxi hazırlık protokolü kullanılarak hazırlanır, bir çift çentikli durum CAS dokuz ND 10 bir vektör elde edin CRISPR Cas dokuz sistemi için gösterilen aynı prosedürü izleyerek her hedefleme lokusu için bir çift ileri ve geri oligo tasarlayın. A: LDH, bir, L, biri yine burada örnek olacaktır.

NGG'nin hemen yukarısındaki 20 bazlık diziyi kopyalayın ve web'e yapıştırın. Vektör ile uyumlu oligolar elde etmek için Z fit aracının tasarlanması. Z fit tasarım aracı tarafından gösterilen hem ileri hem de geri oligoların ilk tabanını ve son tabanını çıkarın.

İleri ve geri oligoları sentezleyin ve aşağıdaki gibi adlandırın. Küçük harf FN, büyük harf F ve küçük harf FN büyük harf R Hedef sitenin bir tarafındaki PAM'ler için ve küçük harf R ve büyük harf F ve küçük harf R ve büyük harf R Bu N'lerin hedef sitesinin diğer tarafındaki PAM'ler için, farklı PAM'leri belirtmek için kullanılan sayıdır, küçük f ve r harfi PAM'lerin anlam veya antisens iplikçikteki konumunu temsil eder ve büyük harf f ve r ileri ve ters oligolar. T seven E bir tahlil kullanarak CAS dokuz n için kullanılacak optimize edilmiş tek kılavuz RNA çiftini belirledikten sonra, 50 mikrolitrelik bir reaksiyon için çift sarmallı tek kılavuz RNA yapmaya devam edin, sırasıyla 22.5 mikrolitre ileri ve geri oligo ve beş mikrolitre diz çökmüş bir tampon ekleyin.

Her iki oligoları da 70 santigrat derecede 15 dakika denatüre edin ve yavaş yavaş oda sıcaklığına soğutun. Oligoları bbbs ile karıştırın ve bağlayın. Bir sindirilmiş çift naz CAS dokuz ND 10 bir vektör.

20 mikrolitrelik bir reaksiyon için, bir mikrolitre tek kılavuz RNA, 100 nanogram bbb, bir sindirilmiş vektör ve bir mikrolitre T ekleyin, dört ligaz gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin, DH beş alfa bileşen hücresini bir ligasyon ürünü ile 42 santigrat derecede 30 saniye boyunca ısı şoku ile dönüştürün. Bakterileri lb agar ampisilin içinde gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Ertesi gün, plazmit hazırlığı için üç ila beş koloni seçin.

Daha sonra, plazmit DNA'sı ticari bir dizileme satıcısı tarafından doğrulanır ve bu teste başlamak için standart bir maksi hazırlık protokolü kullanılarak doğru plazmit hazırlanır. Hücrelere 0.5 mikrogram tek kılavuz RNA vektörü, 0.5 mikrogram CAS dokuz ekspresyon vektörü ve 1.5 mikrolitre lipektomi 2000'de tek kılavuz RNA plazmidi ve CAS dokuz ekspresyon vektörü ile 2 93 ft hücreyi birlikte geçirin. Hücreleri 72 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

72 saat sonra, kültür ortamını her bir oyuktan çıkararak hücreleri hasat edin. 100 mikrolitre DNA hızlı ekstraksiyon tamponu ve trier derecesi ekleyerek, hücreleri kuvvetli bir şekilde tüplere aktarın. Karışımı 68 santigrat derece 15 dakika, ardından sekiz dakika 95 santigrat derece inkübe edin.

Bu, sonraki PCR deneyleri için şablondur. Proto ara parça bitişik motifi çevreleyen diziyi yükseltmek için PCR'yi ayarlayın. 50 mikrolitrelik bir reaksiyon için, şablonun bir mikrolitresini, 0.5 mikrolitre Herkül, iki 0.5 mikrolitre DMSO'yu 10 mikrolitre beş x tamponunu, 0.5 mikrolitre ADNTP karışımını ve bir mikrolitre ileri ve geri astar karışımını birleştirin.

PCR tamamlandığında ve PCR ürünlerinin DNA konsantrasyonları 400 nanogram PCR ürününde iki mikrolitre sindirim tamponuna ölçüldüğünde protokolde açıklanan parametreleri izleyerek PCR'yi gerçekleştirin, son reaksiyona DD H2O EKLEYIN. 19 mikrolitre hacim kaynar suda beş dakika inkübe edilir. Reaksiyonu doğal olarak oda sıcaklığına soğutmak için 45 ila 60 dakika bankta bekletin.

Daha sonra, bir mikrolitre T yedi E bir ekleyin ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Altı XDNA yükleme boyası ile karıştırılmış iki mikrolitre 0.25 molar EDTA ekleyerek reaksiyonu durdurun. 20 mikrolitrelik reaksiyonun tamamını %2,5'lik bir AROS jeline yükleyin.

Jeli 30 dakika boyunca 100 ila 150 voltta çalıştırın. Tek kılavuz RNA aracılı bölünmeyi değerlendirmek için jeli UV ışığı altında inceleyin. Daha sonra, doğrusallaştırılmış bir hedefleme vektörü CAS 9 0 0 3 ekspresyon vektörü ve uygun tek kılavuz RNA vektörü veya vektörleri ile elektro insan kaynaklı pluripotent kök hücreler veya HI PSC'ler tarafından nöro soy raportörleri oluşturun Potansiyel hedef dışı siteler, inci tabanlı bir program olan CS ot adlı çevrimiçi bir açık kaynak aracı kullanılarak tahmin edilebilir.

Bir pencere sistemi için, CS OT programını ve insan genomu veritabanı dosyalarını yerel bir sabit sürücüye indirin. Tasarlanan tek kılavuz RNA'nın hedef dosyasını FASTA formatında hazırlayın. cas ot adlı dosyayı açın.

Bir komut penceresi görünecektir. Şimdilik olduğu gibi bırakın. Ardından, opt generator adlı dosyayı açın.

Bir seçenek dizesi oluşturmak için, hedef dosyanın yolunu ve adını eksi T veya eksi hedef seçeneğinin iletişim kutusuna yapıştırın. Genom dizisi dosyasının yolunu eksi G veya eksi genom seçeneğinin iletişim kutusuna yapıştırın. Seçenek dizesini kopyalayın ve CAS OT komut penceresine yapıştırın.

Daha önce gösterildiği gibi cas OT programının tamamlanmasında, çalıştırılan bir klasör oluşturulacaktır. Klasör içindeki CSV dosyasını bir elektronik tablo programıyla açın. Bu dosya, hedef dışı her bölge, kromozomal ve genomik konum için aşağıdaki bilgileri içerir.

Eşleşmeyen site tipinin sırası, eşleşmeyen bazların toplam sayısı ve transektasyondan önce hedef dışı bölgeyle ilgili ekzon bilgileri. MERHABA PSC'ler. Tek kılavuz RNA'lar, T yedi E bir tahlil ile 2 93 ft hücrede değerlendirilir.

Bu temsili sonuçta, tek kılavuz RNA'lar insan oli'sini hedeflemek için tasarlanmıştır. Bir ila üç arasındaki iki gen şeridi bir CAS dokuz ekspresyon vektörü ile transfekte edilir ve dört ila 11 arasındaki şeritler bir CAS dokuz N naz ekspresyon vektörü ile transfekte edilir. GFP bir kontrol olarak kullanılır.

İkinci şerit, oli için tek kılavuz RNA içerir. CAS dokuz şeritli beş kullanan iki hedefleme, yalnızca bağlayıcı duyu şeridi içerir. Altıncı şerit, yalnızca tek kılavuz RNA bağlayıcı antisens ipliği içerir ve dokuzuncu ve 10. şeritler, her iki DNA zinciri için bir çift tek kılavuz RNA içerir.

Sindirilmemiş PCR ürünü, ikinci şeritte yaklaşık 614 baz çiftidir. PCR ürünlerinin bir kısmı, şeridin dokuz ve 10'unda %33'lük bir ekleme ve silme yüzdesi ile yaklaşık 470 baz çifti ve 140 baz çiftinden oluşan iki banda sindirilir. Sindirilen iki bant, ekleme ve silme yüzdeleri üç ile %8 arasında olan yaklaşık 410 baz çifti ve 200 baz çiftidir. Vektörü ve tek kılavuzu ana aldıktan sonra yalnızca tasarım ve değerlendirme yaklaşık bir hafta içinde yapılabilir.

Geliştirildikten sonra düzgün bir şekilde gerçekleştirilir. Bu teknik, kök hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, insan sistemlerinde gelişim ve hastalıkta geniş gen işlevlerine sahip olmasının önünü açtı. Bu videoyu izledikten sonra, CRISPR Cas nine ve CAS nine N çift N sistemi için tek kılavuz dizilerinin nasıl tasarlanacağını ve oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.