Name: Kültürlü HL-1 Atriyal miyositlerdeki Monolayer Gerilim ve Kalsiyum Çift Kanal Optik Haritalama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Öğrenin, HL-1 atriyal hücre monolayerlerinde kalsiyum ve voltaj boyaları kullanarak çift kanallı optik haritalama tekniğini. Bu yöntem, kardiyak hücrelerin elektrofizyolojik özelliklerini detaylı analiz etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz HL-1 hücreleri ve ayrıntılı bakım protokolü sağlamak için Dr. Claycomb teşekkür etmek istiyorum. Biz de bizim çift kanal optik haritalama sistemi için bazı aksesuarlar yapım ile yaptığı yardım için hücre film ve Sayın Pete Caron üreten ile yardım için Bayan Elena Carrillo ve Dr Seth Robia teşekkür etmek istiyorum. Bu eser (XA 10GRNT3770030 &amp; 12GRNT12050478) Amerikan Kalp Derneği, Ulusal Sağlık Enstitüleri (XA HL113640), ve (XA) Loyola Üniversitesi Araştırma Geliştirme Fonu tarafından desteklenmiştir.

1. Çözüm hazırlanması <ol><li> Norepinefrin (NP) çözeltisi <ol><li> . Saflaştınlmış Milli-Q (MQ), 25 ml su içinde, 30 mM askorbik asit (0,1475 g askorbik asit, 25 ml içine NP 40 mg çözülür norepinefrin (NP) ışığa duyarlı olduğu için bu çözüm hazırlanması sırasında doğrudan ışığa maruz kaçının. </li><li> 0.22 mikron şırınga filtresi ile NP çözüm Filtre. -20 ° C&#39;de 1 ml steril mikrotüpler içine çözeltisi ve mağaza alikosu. Dondurulmuş sonra, NP, bir ay boyunca stabildir. </li></ol></li><li> Tümlenmiş Yıkama ve Son Claycomb medya <ol><li> Claycomb ortamının 43.5 ml ile başlar ve fetal sığır serumu (FBS), 5 ml, penisilin / streptomisin, 0.5 ml, NP, 0.5 ml, 1 ile ek: son takviye Claycomb ortamı 50 ml yapmak için L-glutamin seyreltildi 100. Claycomb orta ışığa duyarlı olduğundan bu çözüm hazırlanması sırasında doğrudan ışık maruz kalmaktan kaçının. </li><li> Sup aynı tarifi kullanarak yıkayın Claycomb orta hazırlayınhariç eklentilerle Claycomb ortamı% 5 FBS ekleyebilir ve NP ve L-glutamin bileşenleri ihmal. NOT: Doğrudan ışığa maruz kalmadan 4 ° C&#39;de saklandığında takviye Final ve Yıkama Claycomb medya iki hafta için iyi. </li></ol></li><li> Soya fasulyesi tripsin önleyici çözelti <ol><li> Ca-içermeyen ve Mg-içermeyen Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su, 100 ml (PBS) içine soya fasulyesi tripsin inhibitörü, 25 mg eritin. </li><li> 0.22 mikron şırınga filtre kullanarak çözüm Filtre. Not: 4 ° C&#39;de depolandığında steril çözelti, bir ay boyunca stabildir. </li></ol></li><li> Jelatin / Fibronektin çanak kaplama çözümü <ol><li> % 0.02 jelatin yapmak için MQ 500 ml su içine jelatin ve 0.1 g. </li><li> Otoklav, ardından% 0.02 jelatin 199 ml fibronektin 1 ml sulandırmak ve hafifçe karıştırın. </li><li> Kısım, -20 ° C&#39;de jelatin ayrı tüplere çözeltisi ve deposunun 6 mi. </li></ol></li><li> Hanks tuz çözeltisi <ol><li> Bir heyecan kullanmalevha, NaCl (136.9), KCI (5,366), KH 2 PO 4 (0,4409) NaH 2 PO 4 (0,4000), MgSO 4 (0,8142), D-GLC MQ su (mg / L) içinde, aşağıdaki tuzlar eritildi (5,051), NaHCO 3 (4,162), HEPES (5,042), CaCl2 (1,261). </li></ol></li><li> Kalsiyum duyarlı bir boya (Rhod2) çözeltisi <ol><li> Bir Rhod2 -20 ° C &#39;de stok çözeltisi ve mağaza boya için DMSO içinde% 20, Pluronic F-127 400 ul Rhod2 kuru tozun, 1 mg seyreltin. </li><li> Deneye başlamadan önce, son çalışma çözeltisi için 1.000 Hanks tuz çözeltisi ile: bu stok çözeltisi 1 seyreltin. </li></ol></li><li> Voltaja duyarlı bir boya (Rh237) çözeltisi <ol><li> -20 ° C de stok çözeltisi ve depolayın DMSO 2 ml Rh237 5 mg seyreltin. Deneye başlamadan önce son bir çalışma çözüm yapmak için 1.000 Hanks &#39;Tuz çözeltisi ile: stok solüsyonu 1 sulandırınız. </li></ol></li></ol> &amp; #160; Not: 4/1 çözüm küçük değişiklikler ile Claycomb HL-1 hücre kültürü protokolüne dayanmaktadır. 2. Pasajlanması ve Kültürleme HL-1 Atriyal miyositlerde lameller üzerine NOT: HL-1 hücreleri, Dr. Claycomb (Louisiana Eyalet Üniversitesi) elde edilebilir. <ol><li> T25 şişelerinde HL-1 hücrelerinin büyümeye ve günlük takviye Claycomb 5 ml ortam ile beslenir. Geçiş T25 hücreleri Claycomb HL-1 hücre kültürü protokolü (aşağıda tarif edilen), 10 göre, her beş günde şişeleri. </li><li> 24 saat T25 şişesi içinde hücreler önce 12 gözlü kültür levhaları içerisine Mermiyi lamelleri (20 mm çapında) pasajlandı ve daha sonra gece boyunca 37 ° C&#39;de jelatin / fibronektin ile lamelleri kapak için tamamen birleşir ve hazır. </li><li> Sonraki gün, aspirat ve kültür plakalarından jelatin / fibronektin atmak ve de her takviye Nihai Claycomb ortamı, 1.5 ml ile değiştirin. </li><li> Bir T25 Kültür Split hücreleraspire birleşik kültürü içeren T25 şişesi ortamı ve 37 ° C &#39;de PBS ile kısa süreli bir kültür durulama 5. günde tam kaynaşmaya eriştikten sonra E şişe. </li><li> PBS aspire ve hücreler ile doğrudan temasını engellemek için T25 şişesi alt üzerine tripsin / EDTA ile pipetleme 37 ° C&#39;de, 3 ml% 0.05 tripsin / EDTA ilave edin. 1 dakika için 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Aspirasyon ile tripsin / EDTA çıkarın ve T25 şişesi başına başka tripsin 1.3 ml / EDTA ekleyin. 1 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. Bir mikroskop altında incelemek ve hücreler hala balona bağlı ise, tam kalan hücreleri çıkarmak için dokunun. </li><li> 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içine şişeden hücreler ve transfer hücrelere soya fasulyesi tripsin inhibitörü, 1.3 ml ilave edilir. Yıkama Claycomb 5 ml ortam ile boş bir şişe durulayın. 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içinde hücrelere durulama ekleyin. 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Yavaşça süpernatant aspire ve santrifüj sonra hücre pelet yeniden askıyatakviye Nihai Claycomb ortamı 6 ml. </li><li> Hücre pasajlayarak hücre süspansiyonu, 0.5 ml, 12-çukurlu bir levhanın her çukuruna Tohum. Günlük taze katkılı Final Claycomb ortamı ile hücreleri besleyin. NOT: yakından hücrelerinin büyümesini izlemek, tipik hücre tek tabakaları günde 4 birleşen durumunu ulaşmak ve spontan aktiviteler görünür kalır. Ardından, kültürlü tek tabakalı günde 4-5 optik haritalama için hazır olacak. </li></ol> Hücreler 3. yükleme kalsiyum ve Voltaja duyarlı boyalar <ol><li> Optik haritalama çalışmaları için, hafifçe 12-yuvalı hücre kültürü plakasının lamel çıkarın ve Hanks tuz çözeltisi ile yıkayın. </li><li> Ca duyarlı bir boya Rhod2 ile hücreleri boyamak için, 3 ml lamel, hücre tekli tabakası inkübe oksijen, 30 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de Rhod2 çalışma çözeltisi (% 5 CO 2/95% O 2 gaz kabarcıkları) . </li><li> V m duyarlı boya hücreleri boyamak içinRh237, başka bir 15 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C&#39;de oksijenlenmiş Rh237 hazır çözelti 3 ml Rhod2 yüklü hücre tek tabaka bırakın. </li></ol> 4. Çift Kanallı Optik Haritalama <ol><li> Bir ters floresan mikroskop üzerinde bir sirkülasyon odasına, V m ve Ca boyalarla çift lekeli hücre tek tabaka, yerleştirin. 35 ± 1 ° C&#39;de hücre odasının sıcaklığı tutmak için ısıtmalı sirkülasyon sistemi kullanın. Dikkatle bölmesi üzerinde fazla 0.3 ° C kadar bir gradyan önlemek için bölme içinde dolaşan akım hızını ayarlayarak perfüzat sıcaklığı kontrol eder. <ol><li> V m / Ca sinyallerini kaydetmeye önce, önceki boyama aşamalarına kalan boyayı çıkarmak için yaklaşık 5 dakika boyunca, taze Hanks çözeltisi ile hücre mono tabakasının yıkayın. </li></ol></li><li> Hanks tuz çözeltisi ve bir SILV dolu bir cam pipet oluşan iki kutuplu bir elektrot kullanarak Pace sağlıklı hücre mono tabakalarıer daha önce olduğu gibi pipet sarılı tel 12,17 nitelendirdi. </li><li> Yaklaşık 1 mV bir pacing eşiği bekliyor 2 msn 200-500 milisaniye ve darbe genişliği bir döngü uzunluğunda hızı sağlıklı hücre tek tabakaları. Not: kültüre edilmiş mono tabakaların her parti için, en az iki muamele edilmemiş tek tabakalar, hücre toplu durumunu test etmek için kullanılır. Sağlıklı kontrol mono tabakaları 200-500 msn çevrim uzunlukları elektrik pili tarafından yakalanan gerekir. Kontrol mono tabakalar elektrik tempolu olması halinde, bu, tüm hücre yığın optik haritalama deneyleri için uygun olmayabilir göstermektedir. </li><li> V m ve Ca duyarlı boyalar, her iki tahrik etmek için, bir uyarım filtre (510 nm / 40) ve bir dikroik ayna (561 nm) ile bağlanmış bir LED ışık kaynağını (520 nm dalga boyu) kullanın. <ol><li> V m bileşenine bir dikroik ayna (594 mil) ve bir Ca bileşeni ile 40X objektif ve bölünme yoluyla hücreler tarafından yayılan flüoresans sinyallerini toplamak.Bir bant geçiren filtre ile Ca kanal uzun geçiş filtresi (700 nm) ve yayılan ışık V m kanal yayılan ışığı Filtre (585/40 nm). </li><li> İki CCD kameralar (; redshirt Görüntüleme 80 x 80 piksel, 1,000 fps) kullanarak filtre floresan ışığı toplayın. </li><li> Boya photobleaching önlemek için, ışığa maruz kalma süresini sınırlamak için görüş her alanda en az 2 saniye kayıt olun. Burada, tipik görüntü her tek tabaka için dört farklı alanlarda. </li></ol></li></ol> V m veya Ca Recordings 5. Veri İşleme <ol><li> Hem V m ve Ca sinyalleri (80 x 80 piksel) için, arka plan gürültüsünü azaltmak için farklı kayıt süresi noktalarında bir yoğunluk değerine yoğunluğu yirmi beş (5 x 5) değerleri komşu pikselleri ortalama. NOT: veri ortalamaya sonra, bir bireysel eylem potansiyeli veya Ca geçici her kayıt süresi noktası ortalama x 16 16 yoğunluk değerleri ortalama içeren bir veri matrisi (verir50 um bir mekansal çözünürlükte veri kanalları). </li><li> Kaydedilen V m veya Ca sinyallerinin aktivasyon süresi (AT) tanımlayın. <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi tek başına bir eylem potansiyeli veya Ca geçici bir aktivasyon süresi (AT) tanımlamak için, V m veya ısmarlama MATLAB dayalı bir algoritmayı kullanarak Ca sinyallerin tepe genlik% 50 süresini hesaplamak. 12 </li><li> Manuel Program analizi sırasında oluşabilecek hataları ortadan kaldırmak için analiz ATS tashih. </li><li> Matrisin AT tanımlanan depolamak kullanılan yazılım, sırasıyla kaydedilen aksiyon potansiyeli ve kalsiyum geçici, (16 x 16 veri kanalları ortalama). </li></ol></li><li> Daha önce küçük değişiklikler 12,18 ile açıklandığı gibi vektör alanı analizi yöntemi kullanılarak AT matrisi üzerinde aksiyon potansiyeli veya kalsiyum geçici iletim hızı (CV) vektörleri hesaplayın. <ol><li> (5 × onun veri noktaları AT çevredeki bir veri kanalı akrabası CV vektör hesaplayın; 5 komşu MATLAB programı 12,18 içinde en az kare algoritması kullanarak) yüzeye AT aktivasyon süreleri (bir düz polinom yüzeyi simüle etmek) veri kanalları ortalama. </li><li> Aşağıdaki formüller kullanılarak iletim vektör hesaplayın Formül 1: <img alt="Denklem 1" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52542/52542eq1.jpg" /> Formül 2: θ = arctan [(dy / dt) / (dx / dt)] NOT: Ve x- ve y-eksenleri olarak tahmin CV vektörü; dx / dt x ekseninde CV vektör projeksiyonu; dy / dt y-ekseninde CV vektör projeksiyonu. T AT yüzey; x, y koordinatları 2-D bakın; T, x = ∂T / ∂X x göre T kısmi türevi olduğu; T y = ∂T / ∂y y ile ilgili T kısmi türevi olduğu; θ CV vektörü son yönü. </li><li> Pusula on derece sektörünü kapsayan her biri 36 yollara AT matris Grubu, tüm vektörler. &lt;/ Li&gt; <li> 36 iletim yollarının arasında CV vektörlerin en büyük nüfusa içeren yolunu seçin. Tek tabaka CV temsil etmek, bu yolun ortalama CV hesaplayın. </li></ol></li></ol> Wave Front Yayılma 6. Görselleştirme <ol><li> MATLAB kullanarak pik değerine bağlı olarak farklı kayıt zaman noktalarında bağımsız bir aksiyon potansiyelinin veya Ca geçici sinyal şiddetini normalize. </li><li> Geçici kullanılan MATLAB yazılımı 16 x 16 yoğunluk matris içine kaydedilen her zaman noktasında normalleştirilmiş yoğunluk verileri depolamak. </li><li> Surf.m fonksiyonunu kullanarak her kayıt süresi noktasının saklanan yoğunluğu matris bir renk kodlu yoğunluk haritası Construct. NOT: yoğunluk haritasında, kırmızı V m veya Ca sinyallerinin yüksek yoğunluğunu temsil eder ve mavi floresan sinyalleri düşük yoğunluğunu yansıtır. </li><li> Avifile.m işlevini kullanarak bir .avi dosyası oluşturun. </li><li> Tüm i kaydetaddframe.m işlevini kullanarak aksiyon potansiyeli veya Ca geçici farklı kayıt süresi noktalarında ntensity haritalar. NOT: Bu noktada, V m ve Ca yayılma iki ayrı avi dosyaları oluşturulur. </li></ol>

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li>
<li>Salama, G., Hwang, S. M., et al. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSalama%2C+G+%22Current+protocols+in+cytometry+%2F+editorial+board%2C+J.+Paul+Robinson%2C+managing+editor+...+%5Bet+al.%5D%22">Current protocols in cytometry / editorial board, J. Paul Robinson, managing editor ... [et al.]</a>. 12 (Unit 12 17), (2009).</li>
<li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li>
<li>Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+optical+imaging+of+membrane+potential+and+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electrocardiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous optical imaging of membrane potential and intracellular calcium.</a> J Electrocardiol. 38 (4 Suppl), 107-112 (2005).</li>
<li>Sowell, B., Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mechanism+of+shock-induced+arrhythmias%3A+role+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Ionic mechanism of shock-induced arrhythmias: role of intracellular calcium.</a> Heart Rhythm. 9 (1), 96-104 (2012).</li>
<li>Fast, V. G., Kleber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+conduction+in+cultured+strands+of+neonatal+rat+heart+cells+measured+with+voltage-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Microscopic conduction in cultured strands of neonatal rat heart cells measured with voltage-sensitive dyes.</a> Circ Res. 73 (5), 914-925 (1993).</li>
<li>Hou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+role+for+HERG+in+determining+frequency+of+reentry+in+neonatal+rat+ventricular+myocyte+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer.</a> Circ Res. 107 (12), 1503-1511 (2010).</li>
<li>Beauchamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+contributions+of+connexins+40+and+43+to+atrial+impulse+propagation+in+synthetic+strands+of+neonatal+and+fetal+murine+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Relative contributions of connexins 40 and 43 to atrial impulse propagation in synthetic strands of neonatal and fetal murine cardiomyocytes.</a> Circ Res. 99 (11), 1216-1224 (2006).</li>
<li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+L-+and+T-type+Ca2%2B+channels+in+murine+HL-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Functional expression of L- and T-type Ca2+ channels in murine HL-1 cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 36 (1), 111-119 (2004).</li>
<li>Claycomb, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HL-1+cells%3A+a+cardiac+muscle+cell+line+that+contracts+and+retains+phenotypic+characteristics+of+the+adult+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).</li>
<li>Fahrenbach, J. P., Ai, X., Banach, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+intercellular+coupling+improves+the+function+of+cardiac+pacemakers+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Decreased intercellular coupling improves the function of cardiac pacemakers derived from mouse embryonic stem cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 45 (5), 642-649 (2008).</li>
<li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Jun+N-terminal+kinase+activation+contributes+to+reduced+connexin43+and+development+of+atrial+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 97 (3), 589-597 (2013).</li>
<li>White, S. M., Constantin, P. E., Claycomb, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+physiology+at+the+cellular+level%3A+use+of+cultured+HL-1+cardiomyocytes+for+studies+of+cardiac+muscle+cell+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H823-H829 (2004).</li>
<li>Yang, Z., Shen, W., Rottman, J. N., Wikswo, J. P., Murray, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+stimulation+causes+electrical+remodeling+in+cultured+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes.</a> J Mol Cell Cardiol. 38 (2), 299-308 (2005).</li>
<li>Brundel, B. J., Kampinga, H. H., Henning, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain+inhibition+prevents+pacing-induced+cellular+remodeling+in+a+HL-1+myocyte+model+for+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation.</a> Cardiovasc Res. 62 (3), 521-528 (2004).</li>
<li>Umapathy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrogram+fractionation+in+murine+HL-1+atrial+monolayer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Electrogram fractionation in murine HL-1 atrial monolayer model.</a> Heart Rhythm. 5 (7), 1029-1035 (2008).</li>
<li>Fast, V. G., Cheek, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+arrhythmias+induced+by+strong+electrical+shocks+in+myocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of arrhythmias induced by strong electrical shocks in myocyte cultures.</a> Circ Res. 90 (6), 664-670 (2002).</li>
<li>Bayly, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+conduction+velocity+vector+fields+from+epicardial+mapping+data%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Estimation of conduction velocity vector fields from epicardial mapping data.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 45 (5), 563-571 (1998).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Bu makalede, kalsiyum ve gerilim duyarlı floresan boyalar ile boyanmış bir kültür HL-1 atriyal miyosit tek tabaka optik haritalama kilit yönlerini açıklar. Bu, optimal HL-1 hücre tek tabaka, haritalama ekipman kurulumu kültürleme bir kültür tek tabaka eşleme ve veri analizi içerir. Başarıyla kültür hücreleri eşleştirmek için, anahtar düzgün yayılı hücre tek tabaka hazırlamaktır. Lamelleri üzerine hücreleri ekim yaparken, eşit hücrelerini dağıtmak için emin olun. Bu en iyi elektriksel atışı c...

Benzersiz kalsiyum (Ca) ve gerilim (V m) çift kanal optik haritalama tekniği 1-5 eşzamanlı sağlam kalpleri ve kültürlü hücre tek tabakalarında hem de V m ve Ca sinyallerini kaydetmek için etkili bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Bu teknik sayesinde daha iyi kardiyak aritmilerin yatan elektrofizyolojik mekanizmaları anlamak için kalsiyum geçici ve aksiyon potansiyellerinin arasındaki ilişki ile ilgili güçlü bilgi edinmek için yapar. Kültürlenmiş hücre tekli katmanları, kardiyak elektrofizyoloji ve aritmiler altında yatan mekanizma üzerinde çalışmak için yararlı bir hücre modeli olduğunu kanıtlamıştır. 4,6-8 HL-1 hücreleri, iyi karakterize edilmiş atriyal miyosit kültür çizgisidir. HL-1 hücreleri de morfolojik, elektrofizyolojik ve yetişkin atriyal miyositlerin farmakolojik özelliklerini içeren benzersiz farklılaşmış genotip ve fenotip korumak. Bu hücreler importa dahil olmak üzere kalp genleri ve proteinleri ekspresent kardiyak iyon kanalları (örneğin, L- ve T-tipi kalsiyum kanalları) 9 ve sarkomerik kontraktil proteinlerin olgun izoformları normal diğerleri gibi yetişkin atriyal miyositlerde bulunan ve daha önce de bildirilmiştir. 10-13 Buna ek olarak, HL-1 hücreleri olabilir 2-boyutlu (2-D), miyosit mono-katman oluşturmak için kültürlendi. Bu nedenle, kültürlenmiş HL-1 tek tabakaları kullanılmasının avantajları şunlardır: 1) göreceli olarak düşük bir maliyet ve kolay bir izole edilmesi ve birincil yenidoğan miyositleri kültür daha miyosit kültür satır elde etmek için; 2) hücrelerinin konfluent tek tabaka kalbin 3-B yapısından kaynaklanan yapısal karmaşıklığı azaltır; 3) Bir hücre tek tabaka sağlam kalbinde meydana interstisyel fibrozis girişim ortadan kaldırabilir. Bu fibroblast ve arası matris müdahalesi olmadan miyositler bir grup özel elektrofizyolojik fonksiyonlarını incelemek için de kullanılabilir; Cul farmakolojik veya genetik manipülasyon fonksiyonel sonuçları 4) değerlendirilmesiYapılandırılmış hücre mono tabakaları etkili bir şekilde elde edilebilir. Bu nedenle, HL-1 hücreleri miyosit fizyolojisi farklı yönlerini yanı sıra pili kaynaklı anormal elektriksel faaliyetleri incelemek için yaygın olarak kullanılan hücresel model haline gelmiş. Harici cevap 13-16 Ancak, özel işlem ve bakım kültürü için gerekli sağlıklı hücre tek tabakaları Optik haritalama çalışmaları için elektrik pili. Buna ek olarak, ikili floresan boya boyama işlemi kolayca kültüre karışan hücre monokatmanlarından bütünlüğünü zarar verebilir. Böylece, kültürlü HL-1 mono tabakaları performans V m / CA çift kanallı optik haritalama büyük bir mücadele olmuştur. Bu yöntemin amacı, başarılı bir şekilde kültür HL-1 tek katmanlarda çift kanal optik eşleme gerçekleştirmek için temel aşamalarının temin edilmesidir. Burada HL-1 hücre tek tabaka hazırlanması, bir kültür hücre tek tabaka çift kanal optik haritalama ve haritalama veri işleme için optimize edilmiş protokol kapsamlı detaylar sağladı.

<table><tbody><tr><td>Rhod2 kuru toz</td><td>AAT Bioquest</td><td>21062</td><td></td></tr><tr><td>çoğul</td><td>AAT Bioquest</td><td>20050</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Rh237</td><td>Invitrogen</td><td>S-1109</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>HEPE'ler</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr></tbody></table>

kültürlü hl-1 atriyal miyositlerdeki monolayer gerilim ve kalsiyum Çift kanal optik haritalama

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optik haritalama kalpleri ex vivo hem sağlam ve kültürlü miyosit mono tabakaları kardiyak elektriksel aktiviteyi tespit etmek için değerli bir teknik olduğu kanıtlanmıştır. HL-1 hücreleri, yaygın olarak kalp fizyolojisi çeşitli yönlerini incelemek için bir 2-boyutlu hücresel bir model olarak kullanılmıştır. Ancak, bir kültür HL-1 atriyal hücre tek tabaka içinde aynı görüş alanında aynı anda optik haritası kalsiyum (Ca) geçici ve aksiyon potansiyelleri büyük bir sorun olmuştur. Özel kullanım ve bakım elektriksel yakalanan ve optik eşlenebilir sağlıklı hücreleri hazırlamak için gerekli olmasıdır. Bu nedenle, biz çift kanallı optik haritalama için optimal çalışma protokolü geliştirdik. Bu yazıda, çift kanallı optik haritalama deneyi gerçekleştirmek için nasıl ayrıntılı olarak tarif var. Bu protokol aritmi gelişiminde aksiyon potansiyeli yayılması ve Ca kinetik anlayışı geliştirmek için bir araçtır.

Film 1 gösterildiği gibi bir kültür birleşik tek tabaka düzenli bir içsel ritmi sergiler. Biz o zaman tam konfluent HL-1 tek tabaka V m / Ca çift kanallı optik haritalama gerçekleştirdi. Şekil 1A kaydedilmiş bir tek V m ve Ca sinyallerinin örnek izlerini göstermektedir yendi. Eşit yayılır V m ve çift kanallı optik haritalama sistemi kullanılarak, Ca sinyallerinin Örnek eş zaman haritaları Şekil 1B ve 1C&#39;de gösterilmi...

Bu makale, kültürlenmiş HL-1 atriyal hücre tek katmanlarında çift kanallı optik haritalama gerçekleştirmek için kullanılan tekniği açıklamaktadır. Bu benzersiz protokol, kültür tek katmanlarının elektrofizyolojik özelliklerinin ayrıntılı tespiti ve analizi için aynı alanda hem kalsiyum (Ca) hem de voltaj (Vm) aktivitesinin aynı anda görselleştirilmesine olanak tanır.

Kültürlü HL-1 Atriyal miyositlerdeki Monolayer Gerilim ve Kalsiyum Çift Kanal Optik Haritalama

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Bu prosedürün genel amacı, hem kalsiyum hem de voltaj boyalarıyla yüklenmiş HL1 atriyal tek tabakalarında transmembran potansiyellerini ve kalsiyum geçişlerini eş zamanlı olarak haritalandırmaktır. Bu işlem, öncelikle HL1 hücrelerinin bir lamel cam üzerinde uygun bir konfluan yoğunluğa ulaşana kadar kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, kalsiyum ve voltaja duyarlı boyaların hücrelere yüklenmesidir.Ardından, HL1 tek tabakası bipolar bir elektrotla uyarılır. Son adım, aksiyon potansiyelinin ve kalsiyum geçici sinyallerinin floresan mikroskobu ile kaydedilmesidir. Nihayetinde, aksiyon potansiyeli ve kalsiyum geçici izleri, sinyallerin konfluen tek tabaka boyunca zamanla yayılımını göstermek için derlenebilir.Bu yöntem, kalsiyumun, geçici değişimlerin ve aksiyon potansiyellerinin birbiriyle nasıl ilişkili olduğu gibi kardiyak elektrofizyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Çeşitli ilaç tedavilerine maruz bırakılan kültürlenmiş HL1 hücrelerinin elektrofizyolojik özelliklerinde, bu yöntem aksiyon potansiyeli ve kalsiyum geçiş yayılım modellerine mikroskobik düzeyde dair içgörü sağlayabilir. Ayrıca, patolojik olarak yeniden şekillenmiş insan kalpleri ve aritmojenik hayvan modelleri gibi biyolojik sistemlere de uygulanabilir.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, kalp mouse fenotiplerini koruyan HL-1 hücrelerinin kültürlenmesinin zor olması ve dikkatle optimize edilmeleri gerektiği için zorluk yaşarlar. Kültür pasajı ve stem monolayer için protokol gereklidir. Başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi deney için tüm stok çözeltileri hazırlayın, HL-1 hücrelerini T 25 flasklarda büyütün ve besiyerini her gün beş mililitre taze desteklenmiş Claycomb besiyeri ile değiştirin.Hücreler, HL-1 hücreleri konfluense ulaşmadan 24 saat öncesinde, 5. günde pasajlanmaya hazır olmalıdır. 12 kuyucuklu bir kültür plağının kuyucuklarına 20 mm çapında yuvarlak lameller yerleştirin. Lamelleri kaplamak için her kuyucuğa bir mililitre jelatin fibronektin çözeltisi ekleyin ve ardından plağı 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, kültür plağının kuyucuklarındaki jelatin fibronektin çözeltisini aspire edin ve ardından her kuyucuğa 1,5 mililitre takviye edilmiş final clay home medyumu ekleyin. Sonra, HL one hücrelerini içeren T 25 flaskındaki medyumu aspire edin ve ardından kültürü 37 °C'de PBS ile kısa süreliğine durulayın. Flasktaki PBS'yi aspire edin ve hücreleri rahatsız etmemek için T 25 flaskının tabanına üç mililitre tripsin EDTA çözeltisi ekleyin; flaskı nazikçe indirip döndürerek hücrelerin çözeltiyle kaplandığından emin olun ve ardından flaskı bir dakika boyunca 37 °C'de inkübatöre yerleştirin.Ardından, hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek tripsin EDTA çözeltisini kültürden dikkatlice aspire edin. Daha sonra flaska ek olarak 1,3 mL tripsin EDTA çözeltisi ekleyin. Flaskı oda sıcaklığında bir dakika daha inkübe edin.Hücrelerin balonun yüzeyinden ayrılıp ayrılmadıklarını belirlemek için mikroskop altında gözlemleyin. Yapışık kalan hücreleri yerinden oynatmak için balona hafifçe vurun. Tüm hücreler ayrıldıktan sonra, hücrelere 1,3 milliliters soy soya tripsin inhibitör çözeltisi ekleyin ve ardından hücreleri 15 milliliter'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.Boş erleni beş mililitre yıkama ortamı ile durulayın ve durulama sıvısını tüpteki hücrelerin üzerine ekleyin. Tüpü 500 ×g hızında beş dakika santrifüjleyin ve ardından hücre peletini bozmadan supernatantı aspire edin. Hücre peletini altı mililitre tamamlanmış ortamda nazikçe resüspande edin.Kültür plağının her kuyucuğuna 0,5 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Kültürler konfluen hale gelene kadar plakları 37 °C'de inkübe edin ve besiyerini günlük olarak değiştirin. Çalışma boya çözeltilerini hazırlamak için Rhodamine 123 ve RH 237 stok çözeltilerini Hank tuzlu çözeltisi ile 1:1000 oranında seyreltin.HL one hücrelerinin konfluens durumunu belirlemek için 12 kuyuklu kültür plakalarını mikroskop altında gözlemleyin. Genellikle ekimden dört gün sonra hücreler konfluens olduğunda, lamelini kuyucuktan nazikçe çıkarın ve lameli Hank tuz çözeltisi ile durulayın. Lameli, üç mililitre road two çalışma çözeltisi içeren 35 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin.Petri kabını 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve oksijenasyon için çözeltiden sürekli bir gaz akışı geçirin. Hücreleri kalsiyuma duyarlı boya ile boyamak için 30 dakika inkübe edin. Ardından lamel camı, üç mililitre oksijenle zenginleştirilmiş RH 2 37 çözeltisine aktarın ve 15 dakika inkübe edin.Hücre tek tabakası artık hem kalsiyum hem de voltaj duyarlı boyalarla boyanmış olmalıdır. Hücreleri görüntülemeye hazırlamak için, çift boyalı hücre tek tabakasının bulunduğu lamı, ters floresan mikroskobu üzerindeki bir sirkülasyon kamarasına yerleştirin. Kamara boyunca sıcaklık gradyanı 0,3 °C'yi geçmeyecek şekilde, sıcaklığı 35 °C'de tutmak için kamaradaki akış hızını ayarlayın.Fazla boyayı uzaklaştırmak için hücre monotabakası üzerinden beş dakika boyunca Hank tuzlu çözeltisi akıtın. Monotabakayı yıkadıktan sonra, bipolar bir elektrodu hücrelere değmeyecek şekilde, monotabakaya mümkün olduğunca yakın olacak şekilde çözeltinin içine yerleştirin. Monotabakanın sağlığını metin protokolüne göre test edin.Monotabakayı yapıştırmak için. Elektrodu, döngü başına 500 milisaniyeye kadar iki milisaniye genişliğinde darbeler verecek şekilde programlayın. Monotabakaya hız verme işlemi sırasında, kalsiyum ve voltaj duyarlı boyaları uyararak hücreleri 40x objektif ile görüntüleyin.Bir uyarım filtresi ve dikroik aynaya bağlı bir LED ışık kaynağı kullanarak, yayılan floresan ışığını kalsiyum ve voltaj duyarlı sinyalleri ayırmak için bir dikroik aynadan geçirin ve floresan sinyalleri iki CCD kamera ile ayrı ayrı toplayın. Tam kapsama sağlamak için monokatmanın dört farklı bölgesinin görüntüsünü alın ve fotobeyazlamayı önlemek için her alandaki sinyali iki saniyeden daha kısa sürede kaydetmeye dikkat edin.Konfluent bir HL one monokatmanı, elektrotla uyarılıp hızlandırıldığında düzenli bir kasılma ritmi sergiler. Voltaj ve kalsiyum sinyalleri, 500 milisaniyelik bir döngüde elektrikle hızlandırılmış tek bir HL one monokatmanı atımı için kaydedilmiştir; voltaj sinyalinin başlangıcı, kalsiyum geçişinden kısa süre önce gerçekleşir. Kalsiyum sinyali, voltaj sinyalinin yüzeyinden daha uzun süre devam eder.HL tek hücre monotabakası boyunca voltaj ve kalsiyum floresan sinyallerinden yoğunluk haritaları oluşturulmuştur. 200 milisaniyelik bir zaman seyri boyunca, mavi düşük sinyali, kırmızı ise yüksek sinyali belirtir. Her iki sinyal de monotabakasının solundan başlar ve monotabakası boyunca sağa doğru yayılır.Zamanla, aksiyon potansiyelleri kalsiyum sinyal kütlesinden çok daha hızlı bir şekilde yayılır ve bazal seviyeye döner. Bu haritalama prosedürü, düzgün bir şekilde uygulandığında bir saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, optimal yoğunluktaki hücrelerin kullanılmasına dikkat edilmesi ve tek tabakaya zarar vermemek için pacing elektrotlarının yerleştirilmesi sırasında dikkatli olunması önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, hem kalsiyum hem de voltaj duyarlı boyalar kullanarak, optik haritalama için HO bir atriyal hücre tek tabakası hazırlamanın nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

voltage-calcium-dual-channel-optical-mapping-cultured-hl-1-atrial

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, panoramik görüntüleme sistemi kullanılarak Langendorff perfüze tavşan kalbinde, optik haritalama deneylerini için temel prosedürleri ve ikili (voltaj ve kalsiyum) görüntüleme yöntemidir.

Çok parametreli Langendorff perfüze Tavşan Kalp Optik Haritalama

Bu kağıt sağlam izole Langendorff transmembran potansiyeli (Vm) ve geçici hücre içi kalsiyum (CAT) optik haritalama sırasında diseksiyon prosedürü, enstrümantal kurulum ve deneysel koşullar fare kalpleri perfüze.

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

Bu makalede, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde ayrıntılı protokol ve transmembran potansiyeli (V m) ikili optik haritalama ve ücretsiz içi sarkoplazmik retikulum (SR) için gerekli donanımın Ca 2+ açıklanır. Bu yöntem, sağlam kalbinde, doğrudan gözlem ve V m ölçümü ve SR Ca 2 + dinamikleri sağlar.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Bu iletişim kuralı ile yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüklü, membran gerilim çift kayıtları da dahil olmak üzere bir optik haritalama sistemi kullanan fare Kulakçık Elektrofizyolojik değerlendirme açıklar ve Ca2 + geçici altında programlanmış stimülasyon özel elektrot kateter aracılığıyla.

Yüksek çözünürlüklü optik eşleştirmenin fare Atria Elektrofizyolojik değerlendirme

Murine miyositlerin izolasyonu ve aynı anda gerilim veya kalsiyum izlerinin nasıl elde edilecegini, eşzamanlı dijital hücre geometrisi ölçümleri ile floresan fotometri kullanarak sarcomere kısaltma izleriyle birlikte saglamak için metodolojiyi savuruyoruz.

İzole Murine Ventriküler Miyositlerin Optik Görüntülemesi

Bu protokol, preklinik ilaç testi için insan kardiyak dilimlerinin kesilmesi ve kültüre edilmesi prosedürünü açıklar ve bu dilimlerden aynı anda transmembran voltajı ve hücre içi kalsiyum sinyallerini kaydetmek için optik haritalamanın kullanımını ayrıntılarıyla açıklar.

İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

Burada, yüksek hızlı modüler fotometri sistemi kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre türetilmiş kardiyomiyositlerden kaynaklanan eylem potansiyellerinin optik edinimi ve karakterizasyonu açıklanmaktadır.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Fare modelleri, aritmogenezin temel mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Bu amaçla, yama-kelepçe ölçümleri yapmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gereklidir. Burada, kalsiyum geçicilerinin ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümlerine izin veren retrograd enzim bazlı Langendorff perfüzyonu yoluyla murin atriyal ve ventriküler miyositleri izole etmek için bir yöntem tanımlanmıştır.

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Bu protokol, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip transmembran voltajının ve hücre içi Ca2+ geçici akımlarının elektrofizyolojik ölçümleri de dahil olmak üzere, katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardiden etkilenen vahşi tip ve knock-in hayvanlardan elde edilen fare kalplerinin çift boyutlu optik haritalamasını sunar.

Katekolaminerjik Polimorfik Ventriküler Taşikardi RyR2R2474S Knock-In Farelerinden Kalplerin Çift Boyutlu Optik Haritalaması

Kardiyak hücreleri ve dokuyu kontrol etmek için ışığın kullanılması, temassız stimülasyonu mümkün kılar, böylece hücrelerin doğal durumunu ve işlevini korur, bu da onu hem temel araştırma hem de terapötik uygulamalar için değerli bir yaklaşım haline getirir.

Genetik Olmayan Optik Stimülasyon Yoluyla Ca2+ Yayılımını İncelemek için Kardiyak Mikrofizyolojik Bir Sistem

Öğrenin, HL-1 atriyal hücre monolayerlerinde kalsiyum ve voltaj boyaları kullanarak çift kanallı optik haritalama tekniğini. Bu yöntem, kardiyak hücrelerin elektrofizyolojik özelliklerini detaylı analiz etmeyi sağlar.

Kültürlü HL-1 Atriyal miyositlerdeki Monolayer Gerilim ve Kalsiyum Çift Kanal Optik Haritalama

Daha fazla video keşfet