Hematopoetik Hücre Otomatik Ölçümü - undekalsifiye Kemik histolojik Görüntüler stromal hücre etkileşimleri

Bu prosedürün genel amacı, kemik iliğindeki belirli hücre alt kümeleri arasındaki ilişkileri nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle fare femur tümörlerinden histolojik kriyoseksiyonların toplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, kesitler immünofloresan analiz için boyanır ve konfokal görüntüler elde edilir.

Ardından görüntüler dijital olarak analiz edilir. Nihayetinde, ilgilenilen spesifik immünolojik hücreler ile bunların mikroçevresi arasındaki temas oranları ve frekansını hesaplamak için farklı hücre tiplerinin konumları simüle edilebilir. Bu yöntem fikri ilk olarak, kemik iliğindeki uzun ömürlü plazma hücreleri için mikroçevresel nişleri analiz ederken ve kemik iliği dokusu içindeki hücresel ilişkileri kesin olarak nicelleştirecek bir yönteme ihtiyaç duyduğumuzda ortaya çıkmıştır.

RA Maya, yetişkin bir fareden femoral kemiklerin kriyoseksiyon prosedürünü size gösterecek. Öncelikle, sert doku bıçağı ile donatılmış standart bir mikrotomun numune ve bıçak sıcaklığını -24 °C'ye ayarlayın. 15 dakikalık bir alıştırma süresinden sonra.

Bir numune bloğunu, kriyojenik gömme ortamı kullanarak metal numune tutucuya sabitleyin ve bloğun yönlendirmesini gerektiği şekilde ayarlayın. Kemik tamamen açılıp iliği görünür hale gelene kadar numuneyi tıraşlayın. Ardından, kesit kalınlığını yedi mikron olarak ayarlayın.

Ardından, bir parça kawamoto yapışkan bandı, yapışkan yüzeyi yukarı gelecek şekilde bir numune bloğunun üzerine deri kaplı ahşap bir spatula yardımıyla sabitleyin. Numuneden kesit alın ve pens kullanarak bandı, kesitin üst yüzeyde kalacağı şekilde çevirin. Daha sonra bandı bir cam mikroskop lamına aktarın.

Son kesit toplandığında, bandı cam slayda şeffaf bantla sabitleyin. Numunelerin en az 30 dakika boyunca kurumasına izin verin ve slaytları -80 °C'de saklayın. Çözülmüş kriyoseksiyonları yaygın immünofloresan protokollerine göre boyayıp görüntüleyin.

Doku bütünlüğünü görselleştirmek için nükleer boyama eklendiğinden emin olun. Kesitler boyandıktan sonra, her örneğe bir damla flor montaj medyumu ekleyin ve ardından lazer taramalı konfokal mikroskopta bir numara cam kapatma lamı kapatın. 20 x objektif lensini seçin ve 708,15 x 708,15 mikronluk bir görüş alanı ayarlayın.

Ardından, sonuçların karşılaştırılabilir kalmasını sağlamak için örnekleri her görüntüde 2048 x 2048 piksel çözünürlükte tek tek görüntüleyin. Görüntüleri, stromal yapıları görselleştirmek için bir kanalda, çekirdekler için bir kanalda ve gerektiğinde ilgilenilen hematopoetik hücreler için ek kanallarda kaydedin. Görüntüleri çizgi ortalama (line averaging) kullanarak kaydedin.

İdeal olarak, tüm femoral kesiti kapsayacak şekilde ardışık tekil görüntüler yakalanır. Ardından görüntüler bir mikroskopi görüntü dosyası formatında kaydedilir. Daha sonra görüntülenen her alan için kanal başına bir JPEG dosyası dışa aktarılır ve rastgele hücre simülasyonlarını yürütmeden önce, görüntü segmentasyonu, kolokalizasyon kantifikasyonu ve komşuluk analizi gerçekleştirmek için bir görüntü analiz aracı kullanılır.

Simüle edilecek her bir görüntü için analiz edilen kemik iliği görüntüleri üzerindeki konumlandırma. Hücre temas aracı tarafından sağlanan tekil CSV dosyalarını tek bir klasöre yerleştirin. Tek bir femoral örnekten alınan görüntü serileri üzerinde toplu simülasyonlar gerçekleştirmek için orijinal DPI kanalı JPEG dosyalarını ve orijinal stromal kanal JPEG dosyalarını, aynı zamanda tüm orijinal JPEG dosyalarını ve bunlara karşılık gelen tekil CSV dosyalarını başka bir klasöre aktarın.

Tüm dosyalar bir araya getirildiğinde, simülasyon aracını başlatın. Ardından "auto load image data" kutucuğunu işaretleyin. Bu seçenek işaretlendiğinde, analiz edilen görüntülere karşılık gelen CSV dosyaları otomatik olarak açılır.

Ardından, CSV dosyaları için ortak etiketi ve toplu mod simülasyonu için kullanılması gereken görüntü seti sayısını girin. Daha sonra, DPI kanalı için maske oluşturmak amacıyla, S stroma kanalından üretilen ve dosya adı üç ile biten JPEG dosyasını yükleyin. Maskeyi uygula kutucuğunu işaretleyin ve DPI görüntüsünü ikili bir maskeye dönüştürmek için eşik değerini 10 olarak ayarlayın.

Sekiz bit (eight bit) ve genişlet (dilate) kutucuklarını işaretleyin ve genişletme derecesini beş piksel olarak ayarlayın. Ardından genişlik aşındırma (width erosion) kutucuğunu işaretleyin. Daha sonra simüle edilmiş görüntülerin analizi için kullanılacak yakınlık yarıçapı (vicinity radius) için istenen değeri girin ve hematopoetik hücreler için stromal yapıların otomatik tespiti amacıyla OSU algoritmasını kullanmak için OSU'yu kullan (use OSU) kutucuğunu işaretleyin.

Dairesel şekiller olarak simüle edilmiştir. Analiz edilen hücre tiplerinin hücre boyut dağılımını, uygun nesne segmentasyon fonksiyonlarını içeren herhangi bir görüntü analiz yazılımıyla ölçün ve bu ölçümlerden tüm hematopoetik tipler için sigma değerini belirleyin. Görüntü analiz aracı tarafından hala tam bir hücre olarak tanınan en küçük nesneyi tanımlayan piksel cinsinden çap olan hücre boyutu kesme değeri belirlenebilir.

Ardından, kırmızı, yeşil ve mavi hücrelerin hücre boyutu dağılım simülasyonu için hücre boyutu kesme değerini ve piksel cinsinden sigma değerini girin. Sonra, hücreler ve maske (cells and mask) sekmesinde, bir hücrenin maskenin yasaklı bir alanı içindeki en az bir pikselle örtüşmesi durumunda programın hücre için yeni bir konum seçmesine izin vermek amacıyla sil (delete) kutucuğunu işaretleyin. Hücre dışlama (cell exclusion) sekmesi altında, hücre örtüşmesini önle (avoid cell overlap) kutucuğunu da işaretleyin.

Ardından, iki hücrenin merkezleri arasındaki izin verilen minimum mesafeyi piksel cinsinden girin. Eğer örtüşme, bir hücrenin merkezinden diğerinin merkezine olan minimum mesafe ile tanımlanmışsa, maksimum örtüşme alanını %100 olarak ayarlayın. Sonra simülasyon aracını 1000 tekrara ayarlayın. Ardından, her bir görüntünün tüm tekrarları için simüle edilen nesnelerin koordinatlarını metin formatındaki dosyalar olarak kaydetmek için otomatik kaydet kutucuğunu işaretleyin.

Kaydedilen dosyalar için ortak bir etiket girin. Son olarak, simülasyonu çalıştır düğmesine tıklayın ve kaydedilen her bir görüntüye karşılık gelen 1000 simüle edilmiş görüntü setinin ortalama temas ve yakınlık frekanslarını belirleyin. Bunun için, ortalama temas ve yakınlık sayılarını görüntü başına kaydedilen hücre sayısına bölün ve elde edilen frekansları, kaydedilen görüntünün otomatik kolokalizasyon analizi sonuçlarıyla karşılaştırın.

Bu şekilde, floresan kimerik kemik iliği ile stromal hücre mikroçevresine göre eozinofillerin, plazma hücrelerinin ve B hücrelerinin lokalizasyon analizi sunulmuştur. Hücre teması ve yakınlık araçları tarafından oluşturulan CSV dosyaları, her bir hücre popülasyonu için piksel cinsinden hücre sayısını ve toplam alanı ile temas veya yakınlık sayılarını içerir. Rastgele hücre yerleşimi simülasyonu gerçekleştirilmeden önce, hücre boyut dağılımını Gauss dağılımı olarak tanımlayan parametrelerin bu simülasyonda belirlenmesi gerekir; üç hücre popülasyonu için ölçülen sigma değerlerinin göreceli değerleri korunmuştur.

Hücrelerin yerleştirilebileceği alanları tanımlamak için piksel cinsinden tanımlanan Sigma değerleri, kaydedilen hücrelerin görsel görünümüne uygun şekilde ayarlanırken, DAPI kanalından bir maske oluşturulmuştur. Ardından, ikili görüntülerin oluşturulması için optimal yoğunluk eşiğinin 10 değeri olduğu belirlenmiştir. Daha sonra, plazma hücrelerinin, eozinofillerin veya B hücrelerinin stromal hücrelerle olan temaslarının ilgisi beklendiği üzere test edilmiştir.

Bu analizler, plazma hücreleri ve B hücreleri için kaydedilen görüntülerdeki temas oranlarının simülasyona kıyasla anlamlı derecede daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Buna karşın, eozinofil stromal hücre teması için belirgin bir fark gözlemlenmemiştir. Bu yöntem; immünoloji, hematoloji, patoloji veya kök hücre biyolojisi gibi kemik iliğinin karmaşık doku yapısının analizini gerektiren her alanda temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.