Hematopoetik Hücre Otomatik Ölçümü - undekalsifiye Kemik histolojik Görüntüler stromal hücre etkileşimleri
8 Nisan 2015
Kemik iliğindeki histolojik verileri kantitatif olarak analiz etmek için bir strateji sunulmuştur. Doku kesitlerindeki floresan etiketli hücrelerin konfokal mikroskobu, otomatik olarak analiz edilen 2 boyutlu görüntülerle sonuçlanır. Farklı hücre tiplerinin birlikte lokalizasyon analizleri, simüle edilmiş görüntülerden elde edilen verilerle karşılaştırılarak hücresel etkileşimler hakkında nicel bilgiler verilir.
Bu prosedürün genel amacı, kemik iliğindeki spesifik hücre alt kümeleri arasındaki ilişkileri ölçmektir. Bu, önce fare femur tümörlerinden histolojik kriyo kesitlerinin toplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, immünofloresan analizi için kesitler boyanır ve konfokal görüntüler elde edilir.
Görüntüler daha sonra dijital olarak analiz edilir. Sonuç olarak, farklı hücre tiplerinin konumları, ilgilenilen spesifik immünolojik hücreler ile mikro çevreleri arasındaki temas oranlarını ve sıklığını hesaplamak için simüle edilebilir. Bu yöntem için ilk olarak kemik iliğindeki uzun ömürlü plazma hücreleri için mikroçevresel nişleri analiz ederken aklımıza geldi ve kemik iliği dokusu içindeki hücresel ilişkileri açık bir şekilde ölçmek için bir yönteme ihtiyacımız vardı.
RA Maya sizin için prosedürü gösterecek: Yetişkin bir fareden femur kemiklerini kriyo ile emmek. İlk olarak, sert doku bıçağı ile donatılmış standart bir mikrotomun numune ve bıçak sıcaklığını eksi 24 santigrat dereceye ayarlayın. 15 dakikalık bir alışma işleminden sonra.
Kriyo gömme ortamı ile metal numune tutucuya bir numune bloğu sabitleyin ve bloğun yönünü gerektiği gibi ayarlayın. Kemik tamamen açılana ve ilik görünene kadar numuneyi kesin. Ardından bir kesit kalınlığını yedi mikrona ayarlayın.
Ardından, sevgili bir deri kaplı tahta spatula kullanarak bir numune bloğunun üstüne yapışkan tarafı gelecek şekilde bir parça kawamoto yapışkan bandı sabitleyin ve numuneyi forseps kullanarak bölümlere ayırın. Bandı çevirin, böylece bölüm üst tarafa yerleştirildi. Ardından bandı bir cam mikroskop lamına aktarın.
Son kısım toplandığında bandı bantla cam kızağa sabitleyin. Numunelerin en az 30 dakika sürmesine izin verin ve slaytları eksi 80 santigrat derecede saklayın. İki kadın, örneklerin çözülmüş kriyo bölümlerini yaygın immünofloresan protokollerine göre boyadığını görüntülüyor.
Doku bütünlüğünü görselleştirmek için nükleer bir leke eklediğinizden emin olun. Bölümler boyandıktan sonra, her numuneye bir damla zemin montajı ekleyin, ardından lazer taramalı konfokal mikroskop üzerinde bir numaralı cam kapak kayması. 20x objektif lensi seçin ve 708 nokta 15 x 708 nokta 15 mikron alan görünümünü ayarlayın.
Ardından, sonuçları karşılaştırılabilir tutmak için örnekleri görüntü başına 2048 x 2048 piksel olacak şekilde birer birer görüntüleyin. Görüntülerin stromal yapıları görselleştirmek için bir kanala, çekirdekler için bir kanala ve gerektiğinde ilgilenilen hematopoetik hücreler için ek kanallara kaydedilmesi. Çizgi ortalamasını kullanarak görüntüleri kaydedin.
İdeal olarak, tüm femoral bölümü kaplamak için tek bitişik görüntüleri yakalar. Ardından görüntüleri bir mikroskopi görüntü dosyası biçiminde kaydedin. Ardından, görüntülenen her alan için kanal başına bir JPEG dosyasını dışa aktarın ve rastgele hücrenin simülasyonlarını yürütmeden önce görüntü segmentasyonunu, yerelleştirmenin nicelleştirilmesini ve komşuluk analizini gerçekleştirmek için bir görüntü analiz aracı kullanın.
Simüle edilecek her görüntü için analiz edilen kemik iliği görüntüleri üzerinde konumlandırma. Aşağıdaki dosyaları tek bir klasöre, hücre iletişim aracı tarafından sağlanan tek CSV dosyalarına yerleştirin. Tüm orijinal JPEG dosyalarını ve bunlara karşılık gelen tek CSV dosyalarını da şu anda başka bir klasöre aktarmak için tek bir femoral örnekten alınan görüntü dizisi üzerinde toplu simülasyonlar gerçekleştirmek için orijinal DPI kanalı JPEG dosyaları ve orijinal stromal kanal JPEG dosyaları.
Tüm dosyalar bir araya getirildiğinde, simülasyon aracını başlatın. Ardından görüntü verilerini otomatik yükle kutusunu işaretleyin. Bu seçenek işaretlendiğinde, analiz edilen görüntülere karşılık gelen CSV dosyaları otomatik olarak açılır.
Ardından, CSV dosyaları için ortak etiketi ve toplu mod simülasyonu için kullanılması gereken görüntü kümelerinin sayısını girin. Ardından, DPI kanalı için maskeyi oluşturmak üzere S stroma kanalından oluşturulan J peg dosyasını üç ile biten bir dosya adıyla yükleyin. Maske uygula kutusunu işaretleyin ve DPI görüntüsünü ikili maskeye dönüştürme eşiğini 10 olarak ayarlayın.
Sekiz bit ve genişletme kutularını işaretleyin ve genişleme derecesini beş piksel olarak ayarlayın. Ardından genişlik erozyonu kutusunu kontrol edin. Ardından, simüle edilmiş görüntülerin analizi için kullanılan çevre yarıçapı için istenen değeri girin ve hematopoietik hücreler için stromal yapıların otomatik olarak algılanması için OSU algoritmasını kullanmak üzere OSU kullan kutusunu işaretleyin.
Dairesel şekiller olarak simüle edilmiştir. Analiz edilen hücre tiplerinin hücre boyutu dağılımını, uygun nesne segmentasyon fonksiyonlarını içeren herhangi bir görüntü analiz yazılımı ile ölçün ve bu ölçümlerden tüm hematopoetik tipler için sigmayı belirleyin. Görüntü analiz aracı tarafından hala tam hücre olarak tanınan en küçük nesneyi tanımlayan piksel cinsinden çap olan hücre boyutu kesme değeri belirlenebilir.
Ardından, kırmızı, yeşil ve mavi hücreler için hücre boyutu dağılımının simülasyonu için hücre boyutu sınırını ve sigmayı piksel cinsinden girin. Daha sonra hücreler ve maske sekmesinde, maskenin girilmeyen bir alanı içinde en az bir pikselle çakışan bir hücre için programın yeni bir konum seçmesine izin vermek için sil kutusunu işaretleyin. Hücre dışlama sekmesi altında, hücre çakışmasını önleme kutusunu da işaretleyin.
Ardından, iki hücrenin merkezleri arasındaki izin verilen minimum mesafeyi piksel cinsinden girin. Örtüşme, bir hücrenin merkezinden diğerinin merkezine olan minimum mesafe ile tanımlanıyorsa, maksimum örtüşme alanını şu şekilde ayarlayın: %100Ardından simülasyon aracını 1000 tekrara ayarlayın. Ardından, partinin her bir görüntüsünün tüm tekrarları için simüle edilmiş nesnelerin koordinatlarını metin biçiminde enkaz dosyaları olarak kaydetmek için satışları otomatik kaydet kutusunu işaretleyin.
Kaydedilen dosyalar için de ortak bir etiket girin. Son olarak, simülasyonu çalıştır'a tıklayın ve kaydedilen her görüntüye karşılık gelen 1000 simüle edilmiş görüntü setinin ortalama temas ve çevre frekanslarını belirleyin. Bu bölme için, ortalama temas ve çevre, görüntü başına kaydedilen hücre sayısına göre sayılır ve frekansları, kaydedilen görüntünün otomatik kolokalizasyon analizinin sonuçlarıyla karşılaştırır.
Bu şekilde, eozinofillerin, plazma hücrelerinin ve B hücrelerinin floresan kimerik kemik iliği ile stromal hücre mikroçevresi ile bir lokalizasyon analizi sunulmaktadır. Hücre iletişim ve çevre araçları tarafından oluşturulan CSV dosyaları, kişi veya çevre sayılarının yanı sıra piksel cinsinden her hücre popülasyonu için hücre sayısını ve toplam alanı içerir. Rastgele hücre konumlandırmasının bir simülasyonunu gerçekleştirmeden önce, hücre boyutu dağılımını bir Gauss dağılımı olarak tanımlayan parametrelerin bu simülasyonda belirlenmesi gerekir, üç hücre popülasyonu için ölçülen sigmanın göreceli değerleri korunmuştur.
Piksel cinsinden tanımlanan Sigma değerleri, hücrelerin yerleştirilebileceği alanları tanımlamak için kaydedilen hücrelerin görsel görünümüyle eşleşecek şekilde ayarlanırken, DAPI kanalından bir maske oluşturuldu. Daha sonra ikili görüntüleri oluşturmak için en uygun yoğunluk eşiği olarak 10 değeri belirlendi. Plazma hücrelerinin, eozinofillerin veya B hücrelerinin stromal hücrelerle temaslarının ilgisi daha sonra beklendiği gibi test edildi.
Bu analizler, plazma hücreleri ve B hücreleri için simülasyona kıyasla kaydedilen görüntülerde önemli ölçüde daha yüksek temas oranları ortaya çıkardı. Buna karşılık, eozinofil stromal hücre teması için net bir fark gözlenmedi. Bu yöntem, immünoloji, hematoloji, patoloji veya kök hücre biyolojisi gibi kemik iliğinin karmaşık doku yapısının analizini gerektiren herhangi bir alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, kemik iliğindeki histolojik verileri konfokal mikroskopi kullanarak nicel olarak analiz etmek için bir yöntem sunmaktadır. Teknik, doku kesitlerinin boyanması ve elde edilen görüntülerin dijital olarak analiz edilmesini içerir ve hücresel etkileşimleri değerlendirmek için kullanılır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Histoloji
Arka Plan
- Kemik iliğindeki hücresel etkileşimlerin anlaşılması, immünolojik araştırmalar için çok önemlidir.
- Histolojik kriyo kesitler, farklı hücre tiplerini görselleştirmek için kullanılır.
- Konfokal mikroskopi, boyanmış hücrelerin detaylı görüntülemesine izin verir.
- Bu etkileşimlerin nicel analizi, bağışıklık tepkileri hakkında bilgiler sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Kemik iliğindeki spesifik hücre alt grupları arasındaki ilişkileri nicellemek.
- Hücresel ilişkileri açıkça nicellemek için bir yöntem geliştirmek.
- İmmünolojik hücreler arasındaki temas oranlarını hesaplamak için hücre pozisyonlarını simüle etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Fare femurlarından histolojik kriyo kesitlerin toplanması.
- İmmünofloresan analiz için kesitlerin boyanması.
- Analiz için konfokal görüntülerin elde edilmesi.
- Hücresel etkileşimleri ve mikroçevre ilişkilerini belirlemek için dijital analiz.
Ana Sonuçlar
- Kemik iliğindeki hücresel ilişkilerin başarılı bir şekilde nicellenmesi.
- Spesifik immünolojik hücreler arasındaki temas oranlarının belirlenmesi.
- Simüle edilmiş görüntülerle karşılaştırmalar yoluyla yöntemin doğrulanması.
- Uzun ömürlü plazma hücreleri için mikroçevresel nişler hakkında bilgiler.
Sonuçlar
- Geliştirilen yöntem, hücresel etkileşimleri analiz etmek için sağlam bir yaklaşım sağlar.
- Nicel veriler, bağışıklık hücre dinamiği hakkındaki anlamayı artırabilir.
- Bu teknik, kemik iliği ve bağışıklık tepkilerini içeren çeşitli çalışmalara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantifying cellular co-localization in bone marrow addresses a critical challenge in immunology and hematology research: distinguishing true biological associations from random cell positioning. This method provides reproducible, quantitative analysis of hematopoietic-stromal interactions, reducing rater-dependent bias and enhancing interrater reliability. The approach supports target validation and mechanistic de-risking in preclinical discovery by enabling data-driven assessment of cellular microenvironment dynamics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying direct contacts between hematopoietic and stromal cells in complex tissues.
- Operational Value: Provides unbiased measurement of cellular associations, reducing variability from manual counting and improving assay reproducibility.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing preferential cell associations from random co-localization through statistical simulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized quantitative outputs (contact and vicinity frequencies) for hematopoietic cell subsets within the bone marrow microenvironment.
- Operational Value: Enables high-resolution image acquisition and digital analysis workflows compatible with confocal microscopy platforms.
- Scalability: Facilitates batch processing of multiple femoral sections via automated simulation tools for consistent data generation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase cellular interaction data to preclinical validation by characterizing microenvironmental niches for long-lived plasma cells and other immune subsets.
- Mechanistic De-risking: Uses simulation tools to test whether observed co-localization reflects biological preference versus random positioning, strengthening target confidence.
- Disease-Relevant System: Applicable to studies in immunology, hematology, pathology, and stem cell biology where bone marrow microenvironment analysis is critical.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical research, supporting hypothesis testing and biological de-risking in hematopoietic and stromal cell interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying cellular associations and microenvironmental context in bone marrow tissues.
- Screening: Enables assay readiness through standardized image acquisition, segmentation, and colocalization quantification workflows.
- Analytics: Delivers quantitative readouts (contact rates, vicinity frequencies) and simulation-based statistical comparison to assess biological significance.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by characterizing cellular niches relevant to immune cell function and persistence.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for quantitative histological analysis across multiple bone marrow studies and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by providing objective, simulation-backed quantification of cellular interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through automated image analysis and batch simulation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in cellular association data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on quantitatively validated microenvironmental interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, confocal microscopy, and digital image analysis for hematopoietic and stromal cell detection.
- Dependent on laser scanning confocal microscopy with appropriate objectives and line averaging for comparable image acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of image file formats, CSV data handling, and simulation tool parameters for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for different cell types and tissue sections, including cell size cutoff and sigma determination for accurate simulation.
- Practical limitation: Simulation accuracy depends on precise measurement of cell size distribution and mask generation from DAPI channel for stromal structure definition.
