Bir Kolorimetrik Altın Nanopartikül Testi Uygulanan Yapı-anahtarlama aptamers seçilmesi için bir yöntem
February 28th, 2015
Ayarlanabilir sıkılık manyetik boncuk seçim yöntemine dayalı olarak küçük moleküllü hedefler için yapı anahtarlamalı aptamerleri seçmek için bir protokol sağlanır. Yapı değiştirme özelliklerine sahip olarak seçilen aptamerler, tarif edilen altın nanopartikül tahlili gibi bir hedefin varlığını işaret etmek için konformasyonel bir değişiklik gerektiren tahliller için faydalıdır.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, hedef bağlanması üzerine aptamer onayında bir değişikliği işaret ederek işlev gören algılama platformlarında tanıma öğeleri olarak entegrasyon için yapı anahtarlama apti oluşturmaktır. Bu, boncuk yüzeyindeki DNA kütüphanesini hareketsiz hale getirmek için strep tabin kaplı manyetik boncuklara biyotinile edilmiş bir yakalama probu ve tamamlayıcı DNA kütüphanesi eklenerek elde edilir. Daha sonra, boncuklar üzerinde kalan bağlayıcı olmayan dizilerden bağlanma dizilerini bölmek için çözeltiye bir mıknatıs uygulanır.
Tutulan diziler daha sonra saflaştırılır ve bir sonraki seçim turu için çoğaltılır. Birkaç tur seçimden sonra, işleme negatif bir seçim adımı eklenir. Birkaç seçim turundan sonra, seçilen aptr, bir altın nanoparçacık hedef tespit testine dayalı olarak hedef bağlama üzerine yapısal bir değişiklik gösterir.
Bu tekniğin, çözelti bazlı hücre X gibi mevcut tekniklere göre avantajı, hedefi sağlam bir desteğe hareketsiz hale getirmemiz gerekmemesidir. Dolayısıyla, bu tekniğin sonuçları, bir bireyin fizyolojik durumunun risk değerlendirmesindedir ve bu, kortizolün stresin bir göstergesi olduğu gerçeğinden kaynaklanmaktadır, bu da sağlık sorunlarının değerlendirilmesine yol açabilir. Bu protokol için, özellikle hedef ve kontrol için her zaman taze hazırlanmış DNA solüsyonları kullanın.
DNA'nın hazırlanması özel dikkat gerektirir. DNA kütüphanesinin 100 mikrolitrelik bir alikotunu bir termosikler tüpüne aktarın ve bir termo karıştırıcıda beş dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın. Daha sonra, bu DNA'yı kullanmadan önce ihtiyaç duyulana kadar tüpü buza aktarın, bir spektrofotometrede tam konsantrasyonunu belirleyin.
Daha sonra manyetik boncukları hazırlayın, strept kodlu manyetik boncukları girdap haline getirin ve 400 mikrolitresini yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Bu tüpü iki dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin ve süpernatanı çıkarın, ardından boncukları yıkayın. 400 mikrolitre bağlayıcı tampon ekleyin ve yıkamayı tamamlamak için girdaplayın.
Boncukları ayırmak ve süpernatanı atmak için bir mıknatıs kullanın. Bu yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Ardından, yakalama probunu manyetik boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirin.
Resus'un boncukları ve 400 mikrolitre bağlama tamponunu 50 mikromolar yakalama probu ile askıya almasıyla başlayın. Daha sonra boncukları oda sıcaklığında hafif çalkalama ile 10 dakika inkübe edin. Serbest yakalama probunu çıkarmak için, yıkama başına 400 mikrolitre bağlayıcı tampon kullanarak boncukları daha önce olduğu gibi üç kez daha yıkayın.
Üç yıkamadan sonra, 400 mikrolitre daha tampon ekleyin ve kalan adımlar için 100 mikrolitre boncuk çözeltisi toplayın ve kalanını dört santigrat derecede tasarruf edin. Geri kalan, üç haftaya kadar sonraki seçim turları için kullanılabilir. Daha fazla boncuk gerektiğinde, bu seçim şemasında daha fazla sıkılık için daha uzun problarla hazırlanabilirler.
Örneğin, 13. turdan sonra daha uzun problar kullanıldı ve bu noktada diğer teller kullanılarak önemli bir zenginleştirme elde edildi. Depodan alınan boncukları kullanırken, çalışma alikotunu yıkama başına 200 mikrolitre bağlayıcı tampon kullanarak iki kez yıkayarak başlayın. Aksi takdirde, taze yapılmış boncuklar zaten temizdir.
Şimdi boncuklara 100 mikrolitre çıtçıtlı soğuk DNA ekleyin ve hafif çalkalama ile oda sıcaklığında yarım saat inkübe edin. Kuluçkadan sonra, süpernatanı atmadan önce boncukları izole edin. Boncuklara ne kadar DNA bağlı olduğunu belirlemek için içerdiği DNA konsantrasyonunu hesaplayın.
Daha sonra, boncukları 200 mikrolitre bağlayıcı tampon ile üç kez yıkayın. Bağlayıcı tamponun boncukları her seferinde beş dakika boyunca hafif çalkalayarak yıkamasına izin verin. Daha sonra hedef molekülü 100 mikromolar'da bağlayıcı tamponda hazırlayın ve boncukları bu preparatın 200 mikrolitresinde, hedef molekülde yeniden süspanse edin.
Bu durumda, kortizol tipik olarak ilk seçim turunda oldukça konsantredir. Ortam koşullarında hafif çalkalama ile boncukları hedefle yarım saat inkübe edin. Kuluçkadan sonra, hedef ima edilen dizileri içeren snat'ı kaydedin.
Her iki zenginleştirme turundan sonra, izleme sürecini izlemek için son süpernatanttan bir numune alın. Diyaliz ile kortizolü süpernatandan çıkarın. Hedef molekül, her turdan sonra 260 nanometrede DNA absorbansının ölçülmesine müdahale etmezse, pozitif seçim adımından toplanan süpernatanı bir şablon olarak kullanarak hedef bağlayıcı DNA'yı PCR ile amplifiye ederse, bu atlanabilir.
Optimal amplifikasyon sayısını belirlemek için önceden her zaman küçük bir test PCR çalıştırın. Her döngüden sonra 10 mikrolitre numune alın ve numuneleri 25 baz çifti merdivenle karşılaştırın. Burada, kütüphane 10. döngüden sonra görülen amplifiye ürünler üzerinde 85 baz çiftinde çalışmalıdır, bu nedenle daha az döngü kullanılmalıdır.
Bu sonuç turdan tura değişebilir, bu nedenle her zaman bir test çalıştırması gereklidir. Ardından, sekiz şerit tüp kullanarak seçilen döngü sayısını kullanarak büyük ölçekli bir PCR gerçekleştirin. Bir ila 2.5 nanomol DNA arasında olan bir sonraki seçim turu için gerekli amplikon miktarını elde etmek için altı ila sekiz mililitre reaksiyon karışımını çoğaltın.
Bir jel kullanarak PCR ürünlerinin bir örneğini iki kez kontrol edin. Daha sonra ürünlerin büyük kısmını manyetik olmayan strept kaplı boncuklar kullanarak tek sarmallı DNA'ya dönüştürün. Fritz tarafından engellenen küçük bir sütuna 300 mikrolitre boncuk yükleyin.
Daha sonra bir yem kilit şırıngası kullanarak, boncukları beş mililitre bağlama tamponu ile nazikçe yıkayın. Sütunu yıkamak için çözeltiyi değiştirirken, şırıngayı sütundan çıkarın ve pistonu şırıngadan çıkarın. Bu, boncukların gereksiz yere rahatsız edilmesini önler.
Sütun başına bir mililitre PCR ürünü için yeterli boncuk sütunu oluşturun ve yıkayın. Hafif bir basınç kullanarak bir PCR ürününü kolonlardan geçirin. DNA ürünleri, antisens iplikleri tarafından tutturulmuş boncuklar tarafından tutulacaktır.
Daha sonra, tüm PCR bileşenlerini çıkarmak için DNA'ya bağlı kolonları beş mililitre bağlayıcı tampon ile yıkayın, DNA'yı kolondan de hibritleştirmek için sadece bağlanma havuzu DNA'sını bırakın, 0.5 mililitre 0.2 molar sodyum hidroksit ekleyin. Daha sonra, nükleaz içermeyen su ile hazırlanan bir tuzdan arındırma sütunu kullanarak eit'deki tek sarmallı DNA'yı tuzdan arındırın. İlk 0,5 mililitre akışı atın.
Ardından, tuzdan arındırılmış DNA'yı toplamak için kolondan bir mililitre nükleaz içermeyen su geçirin. Toplanan DNA'nın emilimini ölçün ve bir sonraki seçim turu için hazırlayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi, toplanan tek sarmallı DNA şimdi yakalama probu ile hazırlanan yeni hazırlanmış bir boncuk alikotuna geri eklenir.
İkinci seçim turu, daha düşük bir kortizol konsantrasyonu kullanılan birinciye benzer. Ancak, üçüncü turdan başlayarak, pozitif seçimden önce bir negatif seçim adımı ekleyin. Negatif seçimin ilk turu için, boncuklara bağlayıcı tamponda 200 mikrolitre bir mikromolar progesteron ekleyin.
Yapısal olarak benzerdir ancak kortizolden farklıdır. Sonraki turlarda, karışımı oda sıcaklığında yarım saat hafifçe çalkaladıktan sonra progesteron konsantrasyonunu arttırın. Supinatı atın ve 200 mikrolitre bağlayıcı tampon kullanarak boncukları iki kez yıkayın.
Ardından pozitif seçimle devam edin. Daha önce açıklandığı gibi, turlar ilerledikçe, substratın konsantrasyonu, seçim sürecinin sıkılığını etkileyecek şekilde değişmiştir. Detaylar metin protokolünde ele alınmıştır.
Ardından, kortizol tespiti için altın nanopartikül testini gerçekleştirmek için metin protokolünü izleyin. Bu hızlı ve basit renk metriği okuması, hedef bağlanma üzerine aptamerin yapısal bir değişikliğine dayanır. Bu nedenle, yöntemin yapı anahtarlama özelliklerine sahip aberleri seçme yeteneğini değerlendirmek için bir metrik sağlar.
Altın nanopartikül tahlilinin bir başka avantajı, küçük moleküller için ortak olan bir mikromolar afinite aptamerinin, ayrışma sabitinden daha düşük seviyelerde, büyüklük sıralarında tespit edilebileceği şekilde bir sinyali yükseltmesidir. Kortizole özgü aberleri izole etmek için aşağıdaki seçim protokolü kullanıldı. Diyaliz ve zenginleştirme izleme, daha sonraki seçim adımlarından sonra hedef molekülün artan elüsyonu göstermek için kullanıldı.
Son adımlarda daha az hedef molekül ve daha uzun yakalama probları kullanıldığında elüsyonda bir azalma gözlendi. Birkaç farklı turdan sonra kaçan DNA'yı analiz etmek için yeni nesil dizileme kullanıldı. Altıncı seçim turundan hemen sonra, dizilerin düşük bir yüzdesi, 13 turdan sonra 20 kutuya sıralanan kopya sayısını artırdı.
Aberlerin çok daha büyük bir yüzdesi yüksek kopya sayısına sahipti. Ardından seçim sürecini daha sıkı hale getirerek. 14. ve 15. turlarda, seçilen aperlerin neredeyse yarısı kopya sayısı sıklığının ilk sırasındaydı.
Bu noktada 30.000 çalışmada yaklaşık 3000 benzersiz dizi vardı. Seçilen AP, altın nanopartiküller ile inkübe edildi, ardından hedef eklendi veya karşılaştırma kontrol substratları için yapıldı. Bu test, AP'nin kortizole kolik asitten daha fazla özgüllüğe sahip olduğunu veya bu prosedürü denerken gösterdi.
Her turda seçimin sıkılığını kontrol etmenin yanı sıra PCR döngülerinin sayısını optimize etmek önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, bir yapı anahtarlama AP'sinin nasıl seçileceğini ve bir altın nanoparçacık algılama testinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Genel Bakış
Bu makale, manyetik boncuk seçim yöntemi kullanarak küçük molekül hedefleri için yapı-değiştirici aptamerlerin seçilmesi için bir protokol sunmaktadır. Seçilen aptamerler, hedefe bağlandığında konformasyonel değişiklikler gösterir ve bu da tespit analizleri için avantajlıdır.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Moleküler Biyoloji
- Analitik Kimya
Arka Plan
- Aptamerler, belirli hedeflere bağlanabilen kısa, tek sarmallı DNA veya RNA molekülleridir.
- Yapı-değiştirici aptamerler, hedefe bağlandığında konformasyon değiştirerek tespit kabiliyetini artırır.
- Altın nanopartikül analizleri, bu konformasyonel değişiklikleri sinyal vermek için kullanır.
- Bu yöntem, hedefi immobilize etmeden küçük moleküllerin tespit edilmesini sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Yapı-değiştirici aptamerlerin seçilmesi için bir protokol geliştirmek.
- Kortizol gibi küçük moleküller için tespit metodlarını iyileştirmek.
- Stres göstergeleri temelinde fizyolojik durumları değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Biyotinli yakalama probları ve tamamlayıcı bir DNA kütüphanesi manyetik boncuklarla birlikte kullanılır.
- Bağlayıcı dizileri, bağlanmayanlardan ayırmak için manyetik ayırma kullanılır.
- Arzu edilen aptamerleri zenginleştirmek için birden fazla seçim ve amplifikasyon turu gerçekleştirilir.
- Aptameri işlevselliğini göstermek için altın nanopartikül analizleri kullanılır.
Ana Sonuçlar
- Hedefe bağlandığında yapısal değişiklikler gösteren aptamerlerin başarılı seçimi.
- Stres göstergesi olarak kortisol tespitinin etkinliği gösterilmiştir.
- Protokol, optimal sonuçlar için taze hazırlanmış DNA çözeltilerinin kullanılmasına izin verir.
- Daha uzun problar ve artan sıkılıkla aptamerlerin zenginleştirilmesi artar.
Sonuçlar
- Protokol, yapı-değiştirici aptamerlerin seçilmesi için güvenilir bir yöntem sağlar.
- Bu aptamerler, küçük molekül tespiti için analizlerin hassasiyetini artırabilir.
- Yöntemin, stresle ilgili sağlık değerlendirmelerinde potansiyel uygulamaları vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables the selection of structure-switching aptamers for small molecule targets without target immobilization, supporting biosensor development for physiological biomarkers. The approach enhances predictive confidence in target validation by enriching aptamers that undergo conformational change upon binding, reducing false positives from non-specific bead interactions. It provides a reusable discovery workflow for assay development in early-stage drug discovery, particularly for targets like cortisol where rapid, colorimetric readout is valuable for decentralized testing. The protocol’s emphasis on negative selection and probe length extension improves stringency, aiding in lead identification by minimizing background sequences and enriching high-affinity binders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by selecting aptamers that undergo target-induced conformational change, providing functional validation of binding specificity.
- Operational Value: Eliminates need for target immobilization, simplifying workflow and reducing artifacts from surface-based interactions.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by enriching sequences with demonstrable structural switching, increasing confidence in target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates aptamers compatible with gold nanoparticle assays, enabling quantitative, colorimetric readout for high-throughput screening.
- Operational Value: Produces standardized binding pools through repeated selection and amplification, improving assay reproducibility across runs.
- Scalability: Extended capture probe length after enrichment increases stringency, supporting reuse of the selection platform for multiple targets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Selected aptamers demonstrate detection capability in buffer, providing a foundation for extension to physiological fluids like saliva or sweat.
- Biomarker Alignment: Cortisol detection aligns with stress-related biomarker monitoring, relevant for assessing physiological state in preclinical safety studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Enrichment monitoring via elution and sequencing allows go/no-go decisions based on aptamer specificity and copy number frequency.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling progression from aptamer selection to functional assay development for small molecule detection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating aptamers that reflect target-induced structural changes, clarifying binding mechanism and specificity.
- Screening: Delivers assay-ready aptamers with demonstrated performance in colorimetric formats, enabling reliable compound or ligand evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs via gold nanoparticle signal shift, allowing comparison of binding conditions and enrichment progress.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows through buffer-based proof-of-principle data, informing future adaptation to complex matrices.
- Enterprise Reuse: Magnetic bead selection with modifiable probe length creates a reusable platform for multiple small molecule targets, reducing redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by selecting aptamers with verifiable conformational switching, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through negative selection steps and defined washing protocols, minimizing batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by enabling early assessment of aptamer functionality, reducing investment in non-viable candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through enrichment tracking and sequencing data, informing advancement based on copy number dominance and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling, magnetic bead separation, and PCR optimization to avoid amplification bias.
- Dependent on magnetic separation equipment, thermocyclers, and spectrophotometry for DNA quantification and quality control.
- Necessitates cross-team standardization of binding buffer conditions and negative selection compounds (e.g., progesterone) to ensure reproducibility.
- Adaptation to physiological fluids may require optimization of salt concentration and temperature to maintain aptamer stability and target binding.
- Practical limitation: Partitioning efficiency is constrained by keeping melting temperature near room temperature, necessitating multiple selection rounds to reduce background.
