Tam İkili Gill Denervasyonun ile birleştiğinde A Time Diferansiyel Boyama Tekniği Balık Ionocytes Eğitim için

Bu prosedürün genel amacı, dışsal innervasyondan yoksun olan akvaryum balıklarının solungaçlarında brakiyal sitlerin çoğalmasını araştırmaktır. Bu, önceden var olan mitokondriyi, zengin brakiyal sitleri lekelemek için önce balığın mitokondriye özgü bir boya banyosuna yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, solungaçların tam iki taraflı denervasyonunu gerçekleştirmektir.

Daha sonra balıklara ötenazi yapılır. Solungaçlar hasat edilir. Bir sit, TPA'larda sodyum potasyuma karşı bir antikor kullanılarak etiketlenir.

Daha sonra son adım, önceden var olan ve yeni farklılaşan sitleri görüntülemek ve saymaktır. Sonuç olarak, bu kez merkezi sinir sisteminden herhangi bir sinirsel girdi olmaksızın akvaryum balıklarında solungaç sitlerinin çoğalmasını ve dağılımını göstermek için bilateral lonca denervasyonu ile diferansiyel boyama tekniği kullanılmıştır. Bu nedenle, bu tekniğin temel avantajı, iyonların dinamik alımını anlamak ve balıkların GI epitelinde sitlerin yeniden dağılımını incelemek için kullanılabilmesidir.

İlk olarak, 50 mikrogramı 94 mikrolitre dimetil sülfoksit içinde çözerek bir milimolar mitral izleyici kırmızı stok çözeltisi hazırlayın ve ışıktan koruyun. Ardından, maksimum 600 mililitre hacimli üç ila altı karanlık kutu hazırlayın. Her kutuyu 400 mililitre sistem suyu ile doldurun ve bir oksijen kaynağı sağlamak için her birine bir hava taşı yerleştirin.

Kutulara 30 ila 40 gram ağırlığındaki Japon balıklarını yerleştirin. 30 dakika sonra, tam konsantrasyonda 0.1 mikromolar boya ve% 0.01 DMSO elde etmek için Gönye izleyici solüsyonunu ekleyin. Balıkları dört saat boyunca yıkayın.

Dört saat sonra, kutulara giden su akışını açın ve boyanın dışarı akmasına izin verin. Bunlar kontrol hayvanları ise, balıkları üç ila beş gün boyunca kurtarın, daha sonra immünohistokimyaya geçin, aksi takdirde tam iki taraflı denervasyon prosedürüne devam edin. İlk olarak, balığı havalandırmalı bir benzokain su banyosuna koyarak balığı uyuşturun.

Solunum durduktan sonra, balığı bir ameliyat masasına koyun ve bukkal boşluğa bir tüp yerleştirin Solungaçları gazlı anestezik solüsyonla sulamak için, balığı, dördüncü solungaç kemerinin arkasındaki alana daha iyi erişim sağlamak için baş hafifçe aşağı doğru eğilecek şekilde konumlandırın. Operculom'u düz bir standart desen forseps ile nazikçe kaldırın, ve daha sonra operkülom ile başın içi arasına doku ekartörleri yerleştirin. Operkülomu kafadan uzak tutmak ve solungaçları açıkta tutmak için doku ekartörlerini dikkatlice açın.

Dört solungaç kemerinin tümüne erişim sağlamak için ekartör kollarını başın yanında dinlendirin. Anestezik solüsyonun solungaçları suladığını kontrol edin ve dördüncü solungaç kemeri ile başın arkası arasına kavisli veya düz standart desenli forsepsler yerleştirin. Bağda gerginlik oluşturmak için forsepsleri yavaşça açın.

Dördüncü solungaç kemerini bir çift beş numaralı forseps ile kafaya takmak. Solungaç kemerlerinin dorsal ucunu kulak boşluğuna bağlayarak epiteli delerek iki ila üç milimetrelik bir açıklık oluşturun. Çok derine girmemeye dikkat edin çünkü büyük bir kan damarına zarar verme riski vardır.

Daha sonra, beş numaralı forsepsli küçük bir pamuklu çubuk tutun ve dokuzuncu ve 10. sinirleri ortaya çıkarmak için kesiyi dikkatlice genişletmek için kullanın. Beş numaralı forseps kullanarak sinirleri herhangi bir bağ dokusundan kurtarın. Yine kan damarlarına zarar vermemeye özen gösterin.

Sinirler açığa çıktıktan ve tanımlandıktan sonra, kesiyi tutarken sinirleri dikkatlice kesmek için kavisli yaylı makası kullanın. Düz standart şekil forseps ile açın. Sinirleri kestikten sonra, kavisli forsepsleri nazikçe geri çekin ve dokuyu çıkarın.

Ekartör dikişlerine gerek yoktur çünkü kesi 24 ila 48 saat içinde kendi kendine kapanmalıdır. Başın diğer tarafındaki prosedürü tekrarladıktan sonra, solungaçların irrigasyonunu anestezikten taze gazlı suya geçirin ve balığın anesteziden kurtulmasına izin verin. Kulak hareketleri yeniden başladığında, balıkları en az 24 saat iyileşmeleri için deney tanklarına taşıyın.

Son olarak, balığa ötenazi yapmadan önce sinirleri kesmeden dördüncü solungaç kemerinin arkasındaki epiteli delerek ayrı bir balık seti üzerinde sahte bir prosedür uygulayın. Üç ila dört mililitre% 4 PFA'yı bir parıldama şişesine yerleştirin. Solungaç kemeri başına bir şişe kullanın.

Ek olarak, küçük bir peynir altı suyu teknesi alın ve bir XPBS ile doldurun. Bu, eksize edildikten sonra dokuyu yıkamak için kullanılacaktır. Tüm çözeltileri buz üzerinde tutun.

Balığa aşırı dozda benzokain ile ötenazi yaptıktan sonra, başın bir tarafındaki permayı kaldırmak için künt forseps ve brakiyal solungaç sepetinin her iki ucunu kesmek için kavisli makas kullanın. Ardından, solungacı Rackers tarafından dikkatlice almak ve kulak boşluğundan çıkarmak için künt forseps kullanın. Fazla benzen ve kanı çıkarmak için solungacı hemen buz gibi soğuk bir XPBS'de yıkayın ve eksize edilen solungacı %4 PFA ile dolu bir şişeye yerleştirin, eksize edilen tüm solungaçları fiksasyondan sonra gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyin.

X-S-P-F-A'yı bir XPBS'de yıkayın ve dokuyu 1,5 mililitre% 1 Tritton x ile doldurulmuş iki mililitrelik bir mermi tüpüne yerleştirin. Mermi tüplerini oda sıcaklığında altı saat veya gece boyunca dört santigrat derecede bir çalkalayıcıya yerleştirin. Dokuya nüfuz etmek için, hem NKA hem de ZN 12 primer antikorunun dört mikrolitresini bir XPBS'nin 992 mikrolitresine ekleyerek her bir primer antikorun bir ila 250 seyreltmesini hazırlayın.

Her iki birincil antikorun da aynı konakta yükseltildiğinden emin olun. Triton X solüsyonunu ve önce dokuyu ve birincil antikor solüsyonunu yıkamadan aspire edin ve oda sıcaklığında altı saat veya gece boyunca dört santigrat derecede bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. İnkübasyonun ardından, birincil antikor çözeltisini aspire edin ve birincil antikoru her biri üç dakika boyunca üç kez yıkayın.

Bir XPBS kullanarak. Beş mikrolitre stok ikincil antikoru 995 mikrolitre bir XPBS'ye karıştırarak ikincil antikoru bir ila 200 seyreltmede hazırlayın. Son yıkamadan PBS'yi aspire ettikten sonra, ikincil antikoru uygulayın ve oda sıcaklığında altı saat veya gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin.

Son olarak, dokuyu daha önce olduğu gibi her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayarak fazla ikincil antikoru çıkarın, yıkamalar dokuyu monte ettikten sonra, önce düz bir mikroskop lamı üzerine 200 mikrolitrelik bir XPBS damlasına bir solungaç yerleştirerek dokuyu monte edin. Dokunun kurumamasını sağlamak için. Solungaç hemi Brinks'i kavisli mikro makasla ayırın.

Ardından, içbükey bir sürgünün girintisine bir damla XPBS ve bir damla montaj ortamı yerleştirin. Ayrılmış yarım kalıpları, filamentin ön kenarı yukarı bakacak şekilde içbükey sürgüye yerleştirin ve bir örtü ile örtün, örtü kaymasının kenarlarını oje ile silin. Kapak kaymasının hareket etmesini ve dokunun yerini almasını önlemek için, görüntülemeden önce dokunun 10 ila 15 dakika boyunca içbükey lamın dibine çökmesine izin verin.

Her solungaç kemeri için, solungaç kemeri başına altı görüntü üreten görüntüleme için rastgele altı solungaç filamenti seçin. Bir ila üç mikrometre optik kesitler alarak dokuyu görüntülemek için geleneksel konfokal mikroskopi kullanın Aşağıdaki görüntülerde, ok uçları ile gösterilen sitler alfa beş antikoru ile boyandı ve oklarla gösterilen sinirler ZN 12 antikoru ile boyandı. Bir kontrol balığından alınan bir solungaç filamentinin bu konfokal görüntüsü, muhtemelen ekteki görüntüde görüldüğü gibi dokuzuncu ve 10. sinirlerden kaynaklanan, merkezi bir sinir demetinin geniş lamel dallanması ile dışsal innervasyonu gösterir.

Belirtilen sitlerin bazıları da innerve edilmiştir. Bu görüntü, tam bilateral denervasyondan iki gün sonra bir solungaç filamentini göstermektedir. Santral sinir demetinde bir azalma olurken, laminer innervasyon büyük ölçüde sağlam görünüyordu.

Burada, tam bilateral denervasyondan beş gün sonra gösterilen bir solungaç filamenti, ekstrinsik innervasyonun artık büyük ölçüde olmadığını göstermektedir. Kalitatif analiz, tam bilateral denervasyonun, solungaç filamenti içindeki hücre gövdeleri ile sinirleri korurken, filament boyunca ve topal içine doğru bir sinir ağı oluştururken, ekstrinsik solungaç innervasyonunun bozulmasına neden olduğunu göstermektedir. Bu prosedür, ek araştırma sorularını yanıtlamak için iyon akılarının ölçülmesi, sodyum 22 gibi radyoaktif iyonların kullanılması gibi diğer yöntemlerle birleştirilebilir.