Aynı Sunucu Türlerin Antikorlar ile İmmünohistokimya ve Çoklu Etiketleme Yetişkin hipokampal nöron Eğitim için

Bu prosedürün genel amacı, nöral progenitör hücreleri incelemek için dolaylı immünofloresan sınırlamalarını atlamaktır. Uygun olduğunda, farklı konakçı türlerden primer antikorlar mevcut değildir. Başlangıçta, bölünen hücreleri etiketlemek için bir timidin analoğu enjekte edilir, ardından doku hasat edilir, işlenir ve kriyo bölümlerine dilimlenir.

Daha sonra başlamak için sıralı çoklu immünofloresan yapılır. Etiketlenmemiş bir birincil antikor uygulanır ve daha sonra floresan etiketli bir ikincil antikor ile bağlanır. Daha sonra, birinci sekonder antikor üzerindeki açık perikoplar, primer antikor türlerinden serum ile bloke edilir ve ikinci sekonder antikor tarafından tanınabilen tüm immünoglobulinler, konjuge olmayan fab fragmanları ile kaplanır.

Bu, dokunun farklı bir ikincil antikor tarafından etiketlenebilen ikinci bir birincil antikor ile tedavi edilmesine izin verir. Sonuç olarak, bölümlerin görüntüleri, belirli uyaranlara yanıt olarak nöral progenitör hücrelerin gelişimini ve düzenlenmesini ve bunların belirli beyin işlevlerine katılımını incelemek için kullanılır. Bu tekniğin eşzamanlı çoklu immünofloresan gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, genellikle aynı konakçı türde ortaya çıkan primer antikorların kullanılması ihtiyacından kaynaklanan sorunları ortadan kaldırmasıdır.

Bu yöntem, fizyolojik veya farmakolojik uyaranlara, beyin patolojilerine veya yaşlanmaya yanıt olarak hipokampal progenitör alt kümelerinin çoğalması gibi yetişkin nörojenezi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü aynı konakçı türden birincil antikorlarla çoklu etiketleme, yeterli bloklama olmadan istenmeyen antikor çapraz aktivitelerine yol açabilir. İlk olarak, enjekte edilecek hayvanları tartın ve enjeksiyon için mililitre timidin analog stok çözeltisi başına 10 miligram taze bir stok çözeltisi hazırlayın.

Çözelti hazır olduğunda, 30 gauge iğne ile ince bir dozaj şırıngasında ağırlık ayarlı bir doz hazırlayın. Daha sonra fareyi tırnağından tutun ve istenen zaman noktasında timidin analog intraperitoneal enjekte edin, fareyi ve trans kardiyoyu derinlemesine uyuşturun. 10 mililitre buz gibi soğuk PBS, ardından 40 mililitre taze buz gibi soğuk formaldehit çözeltisi ile perfüze edin.

Daha sonra beyni inceleyin ve yayınlayın, fiksasyonu takiben aynı fiksatifte düzeltin. Toplanan beyinleri dört santigrat derecede% 10 sükroz içinde 24 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, beyinleri% 30 sükroza aktarın ve 48 saat daha kuluçkaya yatırın.

Beyinler kriyo koruması için hazır olduğunda, onları eksi 25 santigrat derece isop pentan içinde dondurun. Daha sonra, uzun süreli depolama için 40 mikron koronal bölümleri kesmek için bir kriyostat kullanın. Bölümleri bir antifriz çözeltisine aktarın ve eksi 20 santigrat derecede tutun.

Antifriz çözeltisinden bölümlerin ince bir fırça yardımıyla TBS'ye aktarılmasıyla başlayın. Bölümleri iyice durulayın, dört santigrat derecede bir gece yıkamadan başlayarak, ardından oda sıcaklığında 10 dakikalık beş yıkama yapın. Tüm bu inkübasyonlar sürekli hafif ajitasyon ile yapılmalıdır.

İlgilenilen antijenlerden biri bir timidin analoğu ise, bu noktada bir hidroklorik asit denatürasyon aşaması uygulanmalı, ardından delik tamponunda bir nötralizasyon aşaması uygulanmalıdır. TBS plus'ta spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerinin geçirgen ve bloke edilmesi ile devam edin. Bu inkübasyonun oda sıcaklığında bir saat sürmesine izin verin, daha sonra TBS'de seyreltilmiş ilk primer antikorda inkübe edin ve ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Bölümleri TBS'de üç kez ve TBST'de bir kez yıkayın. Her banyonun 10 dakika gitmesine izin verin. Daha sonra ilk florokrom konjuge ikincil antikorda oda sıcaklığında üç saat inkübe edin.

Şu andan itibaren, bölümleri ışığa maruz kalmaktan koruyun. Başka bir yıkama serisinden sonra, bölümleri, iki birincil antikorun yapıldığı %10'luk bir konakçı tür serum çözeltisine aktarın. Birinci ikincil antikor üzerindeki açık perikopları doyurmak için bu çözeltideki bölümleri üç saat inkübe edin.

Daha sonra serumu çıkarmak için TBS'de üç kez ve TBST'de bir kez durulayın. Daha sonra, birincil antikorun konakçı türüne karşı yönlendirilmiş mililitre başına 50 mikrogram konjuge olmayan monovalent fab fragmanları içeren bir TBS plus çözeltisi hazırlayın. Bu, aksi takdirde ikinci ikincil antikor tarafından tanınabilecek epitopları kapsar.

Bölümleri bu çözeltiye aktarın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bölümleri TBS'de en az üç kez ve TBST'de bir kez durulayın. Transferler sırasında, kalan fab kalıntılarını çıkarmak için bölümleri içeren ağ eklerini bir kağıt havlu üzerinde temizleyin.

Şimdi ikinci primer antikordaki bölümleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Başka bir yıkama serisinden sonra, ikinci ikincil antikoru oda sıcaklığında üç saat boyunca uygulayın. Son olarak, bölümleri TBS'de üç kez yıkayın ve bölümleri jelatin monte etmeye devam edin.

Slaytları havayla kurutun ve bir ANTIFA montaj ortamı görüntüsü kullanarak kapak kaymasını sağlayın. Floresan etiketli bölümler konfokal lazer tarama mikroskobu ile. 400 kat büyütme ile dentat girusun tüm kapsamı boyunca rastgele konumlarda görüntü yığınları alın.

Farklı belirteçlerin birlikte etiketlenmesi için yarım küre başına rastgele seçilen en az 50 ilgili hücreyi analiz edin. Belirli yenidoğan hücre popülasyonları için mutlak sayıları hesaplamak için, ortak etiketli hücrelerin yüzdelerini, DAB boyama analizinden tahmin edilen toplam yenidoğan hücre sayısı ile çarpın. Tarif edilen yöntemler, nörojenez eksikliği olan bir döngünün doğum sonrası ve yetişkin hipokampüsündeki yenidoğan hücrelerini ölçmek ve karakterize etmek için kullanıldı.

D iki nakavt fare modeli, KI 67 veya BRDU gibi farklı proliferasyon belirteçlerine karşı DAB boyama, vahşi tip ve nakavt fareler arasında yenidoğan hücre sayılarında sürekli olarak farklılıklar ortaya çıkardı. BRDU işaretli yenidoğan hücreleri, GFP ve çift kortinde B-R-D-U-G-F-A-P yuvasına karşı primer antikorların aynı anda uygulandığı geleneksel bir çoklu immünofloresan protokolü ile fenotiplendirilebilir. Bu, tek bir örnek içinde yenidoğan tip bir, tip iki A, tip iki B ve tip üç progenitör hücrelerin başarılı bir şekilde tanımlanmasına izin verdi.

Alternatif olarak, BRDU enjeksiyonu ile hayvanın kurban edilmesi arasında daha uzun zaman aralıkları ile, yenidoğan nöronlarının son sayıları eşzamanlı BRDU yeni n immün boyama ile analiz edilebilir. Sıralı immün etiketleme protokolü, bölümler ilk olarak tavşan anti KI 67, keçi anti GFP ve Gine domuzu anti çift kordon antikorları ile aynı anda inkübe edilirse ve ikinci olarak tavşan anti GFAP antikoru ile inkübe edilirse mükemmel bir şekilde çalıştı, ancak bunun tersi geçerli değildi. Bu videoyu izledikten sonra, aynı konakta ortaya çıkan primer antikorları kullanarak tek doku bölümünde dört farklı antijenin nasıl görselleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedürü denerken, antikor, çapraz reaktivite veya yanlış pozitifler olasılığını ortadan kaldırmak için uygun kontrolleri dahil etmeyi unutmamak önemlidir. Primer antikor inkübasyon sırasının protokolün sonucunu güçlü bir şekilde etkileyebileceğini unutmayın.