Name: Aynı Sunucu Türlerin Antikorlar ile İmmünohistokimya ve Çoklu Etiketleme Yetişkin hipokampal nöron Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Öğrenin, yetişkin hipokampal nörogenez evrelerini aynı doku kesitinde saptamak için ardışık çoklu immünofloresan yöntemini. Bu teknik, farklı konak türlerinden antikor bulunamadığında çapraz reaktivite sorunlarını aşar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar mükemmel teknik yardım için S. Tausch'a teşekkür eder. Çalışma BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) ve DFG (FOR1738) tarafından desteklenmiştir.

NOT: yaşayan hayvanları kapsayan tüm işlemler EC direktifi 86/609 / EEC sayılı laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı ile ilgili kurallar ve yerel etik kurul (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz) tarafından onaylanan uygun olarak yapılmıştır. Timidin Analoglarının 1. periton içine enjeksiyon <ol><li> Enjeksiyondan önce hayvanlar gün tartılır. Bir sonraki gün aynı zamanda, bir 10 mg / ml stok çözeltisi, bireysel ağırlığa göre ayarlanmış enjeksiyon hacimleri planlanan tüm enjeksiyonlar için gereken timidin analoğu miktarını hesaplayın. </li><li> 10 mg / ml timidin stok çözelti hazırlayın. (DİKKAT! Thymidine benzerleri zehirlidir. Bir kimyasal davlumbaz kullanmak, yani, tedarikçiler tarafından sağlanan özel Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) izleyin laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek). <ol><li> Dondurucudan timidin analog alın ve yaklaşık RT getirmek. 21 ° C. 10 mg tartılır ve ekleyinveya 0.04 N NaOH (BrdU ve CldU için) steril tuzlu su (steril tuzlu su içinde, IDU için), vorteks. Bir 50 ° C su banyosu ve girdap içinde, 15 dakika, her - 2 - tozu çözmek üzere 3 dk için en az 10 yerleştirin. Not: en fazla 24 saat için kullanımlar çözeltileri, oda sıcaklığında ve -20 ° C de bir kaç hafta içinde saklanabilir. Işık (alüminyum folyo ile kapak) çözümler koruyun. Her zaman çökeltilerin kontrol ve gerekirse-çözülür yeniden. </li></ol></li><li> Ense fare kısıtlamaktadır ve periton içine, 30 G iğne ile ince bir dozaj şırıngası kullanılarak (oda sıcaklığında) stok çözeltisi, uygun bir, ağırlığa göre ayarlanmış hacim enjekte edilir. Not: durumda CldU ve Idu, aynı hayvanda sıralı olarak uygulanabilir gerekir eşit mol konsantrasyonları enjekte düşünün (örn, 50 mg / kg BrdU uygun 42.5 mg / kg CldU ve 57.5 mg / kg Idu). Bu nedenle, buna uygun olarak, 10 mg / ml&#39;lik stok çözeltiler enjeksiyon hacimlerini ayarlamak. </li></ol> 2. Doku Hazırlanması <ol><li> Prepaperfüzyon bir gün önce 0.1 M fosfat tamponu pH 7.4 içinde% 4 formaldehit yeniden. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Transkardiyal 40 ml buz gibi soğuk formaldehid (akış oranı 5 mL / dakika) ile daha sonra 10 ml buz gibi soğuk PBS ile sol ventrikil yoluyla derin anestezi altındaki farelerin (% 3.5 izofluran) serpmek. 4 ° C&#39;de 24 saat boyunca aynı sabitleyici beyin ve sonrası düzeltme ayır. </li><li> Arka arkaya, 10% (4 ° C&#39;de 24 saat) ve% 30 sakaroz (beyin lavabolar kadar, yakl. 48 saat) içine beyin aktarın. Kabarcıklar doku ortaya kadar donma için, yavaş yavaş -25 ° C izopentan içine Kriyo-korumalı beyinleri daldırın. -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Bir dondurma mikrotomda 40 mikron kalınlığında koronal bölümleri kesin (-25 blok sıcaklığı -16 ° C). Bir 24-yuvalı hücre kültürü plakasının oyuklarına içeren antifriz solüsyonu içine Sıralı aktarım bölümleri (Şekil 1 e bakınız). -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol><img alt = &quot;Şekil 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.551 / 52551fig1.jpg&quot; /&gt; 24-plaka içine microtome dilim aktarılması Şekil 1. şematik gösterimi. A1 başlayın ve A6 vb sonraki satır B gidin ve sonra, satır A içine sonraki dilimlerini yerleştirin. D6 ulaşan yaparken, A1 geri dönmek ve devam edin. Dilimlerin Bu düzenleme tüm beyin bölümlerinde inci her n ölçülmesini sağlar. Yenidoğan hücrelerin ölçümü için immünoflüoresans feno (tek sütun 2 alternatif satır içeriği eşdeğer) her 12 inci bölüm alır, (tek sütun içeriğine eşdeğeri) beyin bölümünde inci her 6 alır. 3. immün Not: Bölüm 6 oyuklu plakalar bir taşıyıcı plaka ile donatılmış uçları örgü genellikle, serbest yüzer işlenir. Bir istisna olarak, antikor inkubasyon ABC Reaksiyon örgü uçlar (a başına 0,5-1 mi olmadan 12 veya 24 oyuklu plakalar içinde yapılır engellemeell) lekeli gereken dilim sayısına bağlı olarak yeterlidir. Bu adımlar sırasında, ince bir fırça yardımıyla (her yeni çözümü ile durulayın) ile bölümleri aktarmak. Bütün inkübasyonlar, sürekli çalkalama (en fazla 150 rpm) ile yapılır. <ol><li> İmmünohistokimya (ABC yöntemi) <ol><li> Tamamen antifriz çıkarmak için (10 dakika her biri için oda sıcaklığında, 5 kez, 4 ° C&#39;de bir kez O / N), TBS içinde antifriz kesitler aktarın ve iyice yıkayın. </li><li> Endojen peroksidaz aktivitesi söndürmek için TBS-T içinde% 1.5 H2O 2 30 dakika boyunca inkübe edin. Köpüren dikkat ve gerekirse bölümleri-daldırın yeniden. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın. </li><li> İsteğe bağlı: Bu arada, bir ısıtma kabini ve 37 ° C&#39;de 2 N HCI ısıtın. DNA&#39;yı denatüre etmek için 2 N HCI içinde 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca bölümler inkübe edin. Bir fırça yardımıyla hafifçe ayrı bölümler. </li><li> İsteğe bağlı: 0.1 M borat tamponu pH 10 dakika boyunca bölümler nötralize8.5, RT. Transfer ederken, kısaca HCI artıkları çıkarmak için kağıt havlu üzerine bölümleri içeren örgü ekler çubukla. 15 dakika her biri için TBS 2 kez durulayın. </li><li> Doku geçirgenliği ve spesifik bir antikor bağlayıcı siteler, oda sıcaklığında 1 saat bloke TBSplus inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de TBSplus O / N seyreltilmiş primer antikor içinde inkübe edin. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın. </li><li> TBSplus, oda sıcaklığında 3 saat içinde seyreltilmiş biyotinlenmiş sekonder antikor olarak inkübe edin. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın. Bu arada ... </li><li> Üreticinin protokolü (TBS-T içinde% 1 a + 1,% B) işlemine göre, ABC kompleksi hazırlanır. Kullanmadan önce, oda sıcaklığında 30 dakika için beklemeye bırakın. Oda sıcaklığında 1 saat için AB reaktif bölümleri inkübe edin. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın. </li><li> Sırasıyla iki yarım ve pipet 4 ml ya da 2 ml oyuk başına bölünmüş, 6 ya da 12 oyuklu plaka başına, TBS-T içinde 50 mi, 0.5 mg / ml DAB hazırlayın. DAB çözeltisi (DİKKAT içine Transferi bölümler! DAB toksiktir. Specifi izleyinc yani, laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek, tedarikçi tarafından sağlanan MSDS) kimyasal davlumbaz kullanın. </li><li> Iyi peroksidaz reaksiyonu başlatmak için her yukarıdaki gibi, geriye kalan 25 ml DAB çözeltisine 0.5 ml% 1 H 2 O 2 ekleyin karıştırın ve pipet eşdeğer birimler. 12 dakika boyunca inkübe edin. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın. </li><li> Jelatin slaytlar Mount bölümleri, hava kuru O / N. Kalıcı montaj orta ile lamel. </li><li> İsteğe bağlı: lamel yerleştirmeden önce Counterstain (bakınız bölüm 3.5). Not: bir sinyal-gürültü oranı olduğundan, yüksek bir arka plan ve düşük ise, AB reaktifi (aşama 3.1.8) ile inkübasyondan sonra H2O 2 tedavi tekrarlayın. </li></ol></li><li> Çoklu-immunofloresans <ol><li> Tek veya aynı anda çoklu immunofloresans <ol><li> TBS içinde antifriz kesitler aktarın ve iyice yıkayın (4 ° C&#39;de bir kez O / N, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 5 kez her biri) tamamen bir kaldırmatifreeze. </li><li> İsteğe bağlı: 3.1.3 adımları olarak - 3.1.4. </li><li> Spesifik olmayan antikor bağlayıcı siteler, oda sıcaklığında 1 saat doku geçirgenliği ve engellemek için TBSplus inkübe edin. </li><li> Birincil antikor kokteyli inkübe (örneğin, sıçan α-BrdU, kobay-DCX α, keçi α-GFP), 4 ° C&#39;de TBSplus O / N seyreltilmiştir. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın. </li><li> Florokrom-konjuge sekonder antikor kokteyli inkübe (örneğin, Rodamin Kırmızı α-sıçan, Alexa-647 α-kobay, Alexa-488 α-keçi, tüm eşek türetilmiş), TBSplus içinde seyreltilmiş 3 saat RT veya O / N at 4 ° C&#39;de ilave edildi. Şu andan itibaren ışıktan korumak bölümleri. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın. </li><li> Jelatin slaytlar Mount bölümleri, hava kuru O / N. Sulu yapıştırma vasatı ile lamel. </li></ol></li><li> Aynı konak türünden primer antikorlar ile sıralı çoklu immunofloresans <ol><li> 3.2.1.3 - 3.2.1.1 adımları gibi. </li><li> Fi inkübeilk birincil antikor (ör tavşan α-antijen A), O / N 4 ° C&#39;de ilave edildi. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. </li><li> İlk florokrom-konjuge sekonder antikor (örneğin, Rodamin kırmızı geçidi. Eşek α-tavşan), 3 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Şu andan itibaren ışıktan korumak bölümleri. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. </li><li> İlk ikincil antikor açık paratoplar doyurmak için 3 saat oda sıcaklığında birincil antikorlar aynı ana (örneğin, tavşan serumu) den% 10 normal serum içinde inkübe. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. </li><li> 50 ug (örn α-tavşan IgG (H + L)), ikinci ikincil antikor, O / N oranında tarafından kabul edilebilir epitoplarını kapsayan birincil antikor konak karşı / ml birleşmemiş tek değerli Fab fragmanları ile TBSplus inkübe 4 ° C. </li><li> 10 dakika her biri için TBS-T içinde en az 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. Transfer ederken, kısaca swab kağıt havlu üzerine bölümleri içeren örgü ekler herhangi Fab artıkları çıkarmak için. </li><li> 4 ° C &#39;de, ikinci birincil antikor (ör tavşan α-antijen B) O / N inkübe edin. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. </li><li> İkinci florokrom-konjuge sekonder antikor (örneğin, Alexa 488-geçidi. Eşek α-tavşan), 3 saat oda sıcaklığında inkübe edin. 15 dakika her biri için TBS 3 kez durulayın monte ve yukarıdaki gibi lamel. NOT: Farklı konak türler ekleyebilirsiniz gelen antikorlar ile antijenleri etiketlemek için 3.2.2.2 adıma ve ilgili ikincil antikorlar 3.2.2.3 adıma. </li></ol></li><li> Primer antikor olarak aynı türden ikincil antikor bir NOT: Bu protokol, GFAP, Nestin-GFP ve DCX birlikte BrdU veya Ki67 karşı dörtlü-boyama için uygundur. <ol><li> 3.2.1.5 - 3.2.1.1 izleyin kesinlikle protokol adımları. Bu noktaya kadar TBSplus tek eşek serumu kullanın. </li><li> T inkübeOda sıcaklığında 1 saat süre ile% 3 keçi serumu ihtiva eden BSplus. Bu α-keçi sekonder antikor açık paratoplar kapsar. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. </li><li> AMCA-conj inkübe edin. TBSplus, 3 saat oda sıcaklığında veya O / N 4 ° C&#39;de seyreltilmiş keçi α-tavşan. 15 dakika her biri için TBS içinde üç kez yıkayın monte ve yukarıdaki gibi lamel. </li></ol></li><li> CldU, DUK ortak boyama <ol><li> , Durulayın denatüre ve bölüm 3.2.1 de açıklandığı gibi bölümleri nötralize (- 3.2.1.2 3.2.1.1 adımları). </li><li> Α-fare TBSplus IgG (H + L), oda sıcaklığında 1 saat 20 ug / ml birleşmemiş Fab fragmanları kuluçkalayın. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 4 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. </li><li> 4 ° C&#39;de TBSplus O / N sulandırılmış ve fare α-BrdU (350 1); (IgG2 arıtıldı 400 1), sıçan α-BrdU içeren birincil antikor kokteyli içinde inkübe edin. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. </li><li> Biyotinlenmiş eşek içeren ikincil antikor kokteyli inkübe α-sıçan (1: 500) ve FITC-geçidi. eşek α-fare Fab fragmanları (1: 100). 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. </li><li> Rodamin Kırmızı conj inkübe edin. Streptavidin, oda sıcaklığında 2 saat. 15 dakika her biri için TBS 3 kez durulayın monte ve yukarıdaki gibi lamel. </li></ol></li><li> Nestin-GFP farelerde, floresan sinyalinin amplifıkasyonu <ol><li> Primer antikor kokteyli keçi α-GFP ekleyin. </li><li> (. Bu tür Alexa 488 conj olarak α-keçi eşek) GFP benzer spektral özelliklere sahip bir florokrom konjuge sekonder antikor ekle ikincil antikor kokteyl. </li></ol></li></ol></li><li> Epitop alma <ol><li> Antifriz dışarı durulama sonra epitop alma yürütmek. 99 ° C (yaklaşık 25 dakika) - 0.1 M sitrat tamponu pH 6,0-95 içeren 6- veya 12-yuvalı plakalar ile ön ısıtma gemi. </li><li> (30 dakika boyunca sıcak sitrat tamponu ve buhar haline bölümleri transfer plastik l alüminyum folyo ile plakaları kaplamakkimlikleri ısıya dayanıklı değildir). </li><li> Hemen soğumaya bir buz banyosu içinde plaka yerleştirin. Bu doğum sonrası hayvanların beyin kesitleri ile çalışırken özellikle önemli olan doku morfolojisi, korumaya yardımcı olur. </li><li> Yıkayın ve sitrat nötralize ve boyama devam etmek 10 dakika her TBS 3 kez durulayın. </li></ol></li><li> Fare fare doku üzerinde antikorların <ol><li> -Α fare IgG 20 ug / ml tek değerli Fab fragmanları ekleyin (H + L ikincil antikor ile aynı ana-türleri), ilk blokaj aşama (örneğin, aşama 3.1.5 ya da 3.2.1.3). </li><li> 10 dakika her biri için TBS-T içinde 4 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın ve ilgili protokol ile devam edin. </li></ol></li><li> Cresyl menekşe counterstaining <ol><li> (Cam kavanoz içinde) 60 ° C&#39;ye kadar ön ısıtma kresil menekşe rengi solüsyon. 3 dakika boyunca sıcak çözeltiye slaytlar inkübe edin. </li><li> Sulu içinde durulayın. dest. ve% 70 oranında 1 dakika her biri,% 96 ve% 100 izopropanol 2 kez kurutmak. </li&gt; <li> 6 ksilen dakika veya uyumlu kalıcı montaj ortamı ile bir ksilen yerine ve lamel - 5 için Clear. </li></ol></li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> Kıvrımlarının tüm rostro ölçüde boyunca her 6 th bölümünde peroksidaz lekeli yenidoğan hücreleri saymak. 400X büyütmede ışık mikroskobu kullanın. </li><li> Yenidoğan hücrelerin toplam sayısının bir tahmin elde etmek kavşak aralığı ile sonuçlanan hücre sayıları çarpın. </li><li> Görüntü floresan uygun lazerler ve filtre sistemleri ile donatılmış bir konfokal lazer mikroskobu ile bölümleri etiketli. 400X büyütmede kıvrımlarının tüm genişliği boyunca herhangi bir konumda görüntü yığınlarını alın ve diğer belirteçler ile birlikte etiketleme için, hemisfer başına ilgi dahilindeki en az 50 rastgele seçilmiş hücrelerin analiz eder. </li><li> Mutlak hesaplamak için yeni doğan hücrelerin toplam sayısı ile birlikte etiketlenmiş hücreler (/% 100) elde edilen yüzdeler çarpınBelirli yenidoğan hücre popülasyonlarının sayıları. </li></ol>

<ol><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).</li>
<li>Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+integration+and+plasticity+of+new+neurons+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus.</a> J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).</li>
<li>Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+period+for+enhanced+synaptic+plasticity+in+newly+generated+neurons+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain.</a> Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).</li>
<li>Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+is+adult+hippocampal+neurogenesis+necessary+for+learning%3F+evidence+from+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research.</a> Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).</li>
<li>Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+and+new+memories%3A+how+does+adult+hippocampal+neurogenesis+affect+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).</li>
<li>Encinas, J. M., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+quantitating+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain.</a> Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).</li>
<li>Burns, K. A., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+doses+of+bromo-+and+iododeoxyuridine+produce+near-saturation+labeling+of+adult+proliferative+populations+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus.</a> Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).</li>
<li>Cameron, H. A., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+produces+a+large+pool+of+new+granule+cells+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus.</a> J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).</li>
<li>Vega, C. J., Peterson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+proliferative+history+in+tissue+revealed+by+temporal+halogenated+thymidine+analog+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination.</a> Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+from+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).</li>
<li>Brown, D. C., Gatter, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki67+protein%3A+the+immaculate+deception%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Ki67 protein: the immaculate deception.</a> Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).</li>
<li>Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+neurogenesis+in+the+central+nervous+system+using+nestin+promoter-GFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice.</a> Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).</li>
<li>Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+hippocampal+neurons+in+adult+mice+living+in+an+enriched+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment.</a> Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).</li>
<li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+D2+is+an+FSH-responsive+gene+involved+in+gonadal+cell+proliferation+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis.</a> Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).</li>
<li>Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+kinetics+of+dentate+gyrus+neurogenesis+in+the+absence+of+cyclin+D2%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2.</a> BMC Neurosci. 13, 46(2012).</li>
<li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis%3A+paradigms%2C+pitfalls%2C+limitations%2C+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).</li>
<li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li>
<li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+for+immunocytochemistry%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).</li>
<li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+%28CldU+and+IdU%29+in+primary+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).</li>
<li>Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+epitope+retrieval+in+diagnostic+immunohistochemistry%3A+a+concise+review+with+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Immunohistochem.+Mol+Morphol%22%5BJournal%5D)">Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations.</a> Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Kantifikasyon ve yenidoğan hücrelerin alt popülasyonlarının belirlenmesi yetişkin nöron araştırma merkezi konudur. Yetişkin nöron spesifik aşamalarında ifade proteinlere karşı çoğalma belirteçleri ve antikorlar birleştiren bu alt popülasyonlar immünohistokimyasal algılanmasını sağlar. Antikorlar ya da antikor kombinasyonlarının bazı spesifik boyama koşulları gerektirir. Sentetik timidin analogları ile hücrelerin bölünmesi Etiketleme hala yetişkin hipokampal nöron eğitimi için altın standartt...

İki beyin bölgeleri kurucu yaşam boyunca yeni nöronlar oluşturmak, lateral ventriküllerin subventriküler bölge ve hipokampusün (DG) subgranular bölge (SGZ). Yeni doğan nöronlar nöral progenitör hücrelerden elde ve olgunluğa 1,2 ulaşmadan önce morfolojik ve fizyolojik gelişimin farklı aşamalarında gitmek. Yavaş bölünmesi radyal glia-benzeri kök hücre (tip 1) transit ardışık aşamaları ara progenitör hücrelerin ortaya yükselterek. daha farklılaşmamış alt tipi (Tip 2a ve tip 2b) kısa teğet süreçleri ile düzensiz bir şekle sahiptir. Onlar (dendritler moleküler tabakası doğru genişletilmiş) ile giderek olgunlaşmamış nöronların olmak için hücre döngüsünü çıkmak ve nihayet hipokampal ağ gibi olgun granül hücreleri içine entegre Nöroblastlar (tip 3) oluşturur. Dolayı özellikle fizyolojik özellikleri bu hücreler gelişmiş plastisite 3 sugges ile devreyi sağlamakting hipokampustaki benzersiz bir rolü. Aslında, son on çalışmaları yetişkin nöron mekansal bellek, desen ayırma ve duygusal davranış 4,5 katkıda önemli kanıtlar oluşturdu. Yetişkin nöron farklı yaklaşımlar kullanılarak incelenebilir. Timidin analogları hücre döngüsünün S-fazında DNA içine dahil ve yeni doğan hücrelerin 6-8 doğum partner, miktar ve kader analizi sağlar. Farklı timidin analogları (örneğin, CldU, edu veya DUK) sıralı uygulama hücre yenileme ya da bir deney 9 sırasında farklı zaman noktalarında doğan hücre popülasyonlarının incelemek için kullanılabilir. Bir alternatif olarak, hücre proliferasyonu için endojen işaretleyici Ki67 olup. Hücre döngüsü (G1, S, G2, E) dinlenme aşamasında dışında (G0) ve G1 10,11 başında her safhasında hücrelerin bölünmesi ile ifade edilir. Yetişkin dentat yenidoğan hücre popülasyonlarının fenotipi analiz etmekE girus çeşitli safha spesifik moleküler markörler GFAP, Nestin, DCX ve neuN 1,6 olarak kullanılabilir. GFAP erişkin astrositlerin bir göstergesi, aynı zamanda, yetişkin önbeyin radyal glial benzeri hücrelerde ifade edilir. Nestin radyal glia-benzeri hücreler ve erken orta projenitör hücrelere özgü bir ara filamenttir. DCX ara progenitörlerle nöroblast- ve olgun nöronlarda ifade edilen bir mikrotübüle bağlı bir proteindir. + Nestin - türü 2a (GFAP - tip 1 (GFAP + Nestin +, DCX): Bu üç işaretleri ve dört ayrı progenitör hücre alt tipleri tespit edilebilir etiketli hücrelerin morfolojik özellikleri (eş) ifadesi dayanarak , DCX -), tip 2b (GFAP -, Nestin +, DCX +) ve tip 3 (GFAP -, Nestin - DCX +) 1. Birlikte postmitotik nöronların ifade neun, ile DCX Eş-etiketleme immatür farklılaşmasını izin verire (DCX + neun +) ve olgun (DCX - neun +) granül nöronlar. Yukarıda belirtilen belirteçler sıklıkla yeni doğmuş hücrelerin sayısını ve kimliğini analiz etmek üzere immünoflüoresan ko-etiketleme ve daha sonra konfokal mikroskopi için kullanılır. Bu, tipik olarak, istenmeyen antikor çapraz reaktivite önlemek için farklı bir ev sahibi türünden antikorların gerektirir. Ancak nöron araştırma için uygun bir temel antikorların büyük bir kısmı ya da tavşanlar ya da fareler (örneğin, fare α-BrdU, fare α-neun, tavşan α Ki67, tavşan α-GFAP) yetiştirilir. Bu, tek bir dilim değerlendirilebilir antijenlerin sayısı ve kombinasyon halinde ciddi kısıtlamalara yol açar. Bu da birden fazla boyamaları girmelidirler gibi yalnızca boyama sarfedilen güç artar, ama aynı zamanda sonuçların güvenilirliğini tehlikeye atabilir. Bununla birlikte, bazı antijenler, formalin tespit kaynaklı epitop maskeleme (ör Ki67 duyarlıdırlar, Nestin). Biz burada klasik tek ve çoklu immün protokolleri değişiklikleri tanımlamak (örneğin, epitop alma, birden fazla sıralı immun, Nestin-GFP transgenik farelerin 12 kullanımı) bu sorunların çoğunun üstesinden. Özel olarak, sıralı çok sayıda imüno protokol antikorların bir kısmı da, ev sahibinden türemiş bile, dört farklı antijenlere karşı boyama sağlar. Bu aynı anda Tip 1, Tip 2a, tip 2b ve tip 3 projenitör hücrelerin saptanmasını, hem de tek bir bölüm içinde çoğalma aktivitesi sağlar.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Timidin analog uygulaması</td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime;-deoksiuridin, BrdU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285</td><td>toksik (mutajenik, teratojenik)</td></tr><tr><td>5-Kloro-2&prim;-deoksiuridin, CldU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6891</td><td>toksik (mutajenik, teratojenik)</td></tr><tr><td>5-Kloro-2&prim;-deoksiuridin, CldU</td><td>MP Biyomedikal</td><td>2105478</td><td>toksik (mutajenik, teratojenik)</td></tr><tr><td>5-İyodo-2&prim;-deoksiuridin, IdU</td><td>MP Biyomedikal</td><td>2100357</td><td>toksik (mutajenik, teratojenik)</td></tr><tr><td colspan="4">Doku hazırlama</td></tr><tr><td>İzofluran-Actavis</td><td>Piramal Sağlık 700211</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit tozu (PFA)</td><td>Riedel-De H&auml; EN</td><td>16005</td><td>Toksik, yanıcı</td></tr><tr><td>Perfüzyon pompası PD5206</td><td>Heidolph Instruments</td><td>523-52060-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Tygon laboratuvar hortumu, & Oslash; 0,8 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>06409-13</td><td></td></tr><tr><td>Besleme iğnesi, düz, 21 G, 1,75 mm zeytin ucu, 40 mm</td><td>Agnthos</td><td>1036</td><td></td></tr><tr><td>Donma mikrotomu Mikrom HM 400</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu Hücre kültürü çok kuyulu plakalar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Tefal vitacuisine buharlı pişirici</td><td>Tefal</td><td>VS 4001</td><td></td></tr><tr><td>Netwell 24 mm polyester örgü membran ekler</td><td>Corning</td><td>3479</td>, <td>6 oyuklu kültür plakalarına önceden yüklenmiş</td></tr><tr><td>Netwell 15 mm polyester örgü membran ekler</td><td>Corning</td><td>3477</td>, <td>12 oyuklu kültür plakalarına önceden yüklenmiş</td></tr><tr><td>Netwell plastik 6 kuyulu taşıyıcı kit</td><td>24 mm polyester örgü membran ekler için</td><td>Corning</td><td>3521</td></tr><tr><td>Netwell plastik 12 kuyulu taşıyıcı kit</td><td>Corning</td><td>3520</td>, <td>15 mm polyester örgü membran ekler için</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC kiti</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>DAB (3,3&prime;-Diaminobenzidin tetrahidroklorür hidrat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5637</td><td>kanserojen, ışığa duyarlı</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td>Tavşan IgG1 &><alfa;-Ki67</td><td>Novocastra/ Leica Biosystems</td><td>NCL-L-Ki67MM1</td><td>DAB 1:400/IF 1:100; epitop alımı gerektirir</td></tr><tr><td>Tavşan &alpha;-GFAP, AS-3-GF</td><td>Sinaptik Sistemler</td><td>173 002</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Keçi IgG (H+L) &alfa;-GFP</td><td>Acris Antikorları</td><td>R1091P</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Fare IgG1 &alpha;-nestin</td><td>Abcam</td><td>ab6142</td><td>1:200; epitop alımı gerektirir</td></tr><tr><td>Gine domuzu IgG (H + L) &alpha;-Doublecortin</td><td>Merck Millipore</td><td>AB2253</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Sıçan IgG2a &alpha;- BrdU'nun tespiti için BrdU (asitler)</td><td>AbD Serotec / Bio-Rad</td><td>OBT0030CX</td><td>; DAB 1:500/IF 1:400</td></tr><tr><td>Sıçan IgG2a &alpha;-BrdU (saflaştırılmış)</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030&nbsp; &nbsp;</td><td>CldU'nun tespiti için; DAB 1:500/IF 1:250-400</td></tr><tr><td>Fare IgG1 &alpha;-NeuN</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>fare IgG1&#954; &#945;-BrdU</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>IdU'nun tespiti için; DAB 1:500/IF 1:350</td></tr><tr><td colspan="4">İkincil antikorlar</td></tr><tr><td>Eşek &alfa;-kobay IgG (H+L)-Biotin</td><td>Dianova</td><td>711-065-152</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Eşek &alfa;-sıçan IgG (H+L)-Biotin</td><td>Dianova</td><td>712-065-150</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Eşek &alfa;-fare IgG (H+L)-Biotin</td><td>Dianova</td><td>715-065-151</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Keçi &alpha;-sıçan IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Moleküler Problar</td><td>A11006</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Eşek &alpha;-keçi IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Moleküler Problar</td><td>A11055</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Eşek &alpha;-fare IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment</td><td>Dianova</td><td>715-097-003</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Eşek &alpha;-fare IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>715-605-151</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Eşek &alpha;-kobay IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>706-605-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Eşek &alpha;-sıçan IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td><td>Dianova</td><td>712-295-150</td><td>1:250 Eşek</td></tr><tr><td>&alpha;-tavşan IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td><td>Dianova</td><td>711-295-152</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Eşek &alpha;-kobay IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td><td>Dianova</td><td>706-296-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Streptavidin-rhodamine Red-X</td><td>Dianova</td><td>016-290-084</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Keçi &alpha;-tavşan IgG (H+L)-AMCA</td><td>Dianova</td><td>111-155-144</td><td>1:250, yalnızca tavşan &alpha ile çalışır;-GFAP</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Moleküler Problar</td><td>H3570</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Moleküler Problar</td><td>D1306</td><td>1:1000</td></tr><tr><td colspan="4">Blocking </td></tr><tr><td>Fab-parça eşek &alpha;-fare IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>715-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Fab-parça eşek &alpha;-tavşan IgG (H+L)</td><td>Dianova</td><td>711-007-003</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Normal eşek serumu</td><td>Merck Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>Normal tavşan serumu</td><td>Dianova</td><td>011-000-010</td><td></td></tr><tr><td>Normal keçi serumu</td><td>Dianova</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Histology</td></tr><tr><td>Cresyl menekşe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>Neo-Clear</td><td>Merck Millipore</td><td>109843</td><td>toksik olmayan ksilen ikamesi</td></tr><tr><td>Neo-Mount</td><td>Merck Millipore</td><td>109016</td><td>kalıcı montaj ortamı</td></tr><tr><td colspan="4">Mikroskopi</td></tr><tr><td>Aksiyoskop 2</td><td>Carl Zeiss Mikroskobu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 710</td><td>Carl Zeiss Mikroskobu</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aynı sunucu türlerin antikorlar ile İmmünohistokimya ve Çoklu etiketleme yetişkin hipokampal nöron eğitim için

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Yetişkin nöron yeni nöronlar giderek kararlı ara progenitör alt tipleri ile aktive edilmiş bir nöral kök hücre elde edildiği yüksek ölçüde düzenlenmiş bir çok-aşamalı süreçtir. Bu alt-tiplerin her biri, birlikte, özel morfolojik kriterlere göre tespit edilmek için kullanılabilen spesifik moleküler markörlerin bir dizi ifade eder. Tipik haliyle, immünofloresan teknikler ekso- ya da endojen çoğalma işaretleri ile kombinasyon halinde alt tip-spesifik antikorlar içeren uygulanır. Biz burada yetişkin hipokampal nöron tüm aşamalarında saptanması ve ölçülmesi için yöntemler immün tarif. Bu timidin analogları, transcardial perfüzyon, doku işleme, ısı kaynaklı epitop alma, ABC immünohistokimya, çoklu dolaylı immunofloresan, konfokal mikroskopi ve hücre ölçümü uygulaması içermektedir. Ayrıca biz sorunları u circumvents sıralı birden immunofloresans protokolü sunuyoruzsually aynı konak türlerinde kaldırdı birincil antikorlar kullanılarak ihtiyacı doğan. Tek bir bölüm içinde bir çoğalma işareti ile birlikte tüm hipokampal progenitör alt tiplerinin doğru belirlenmesini sağlar. Bu teknikler paralel farklı progenitör alt tiplerinin düzenleme, beyin patolojileri katılımlarını ve spesifik beyin fonksiyonları rollerini incelemek için güçlü bir araçtır.

Biz ölçmek ve doğum sonrası ve yetişkin hipokampus yenidoğan hücreleri karakterize etmek yukarıda açıklanan yöntemleri uygulamalı. Bu nedenle, vahşi tip ve nöron-eksikli siklin D2 nöron oranı (yani, zenginleştirilmiş bir ortam, EE) 13,14 etkilediği bilinen koşullar altında muhafaza (Ccnd2 KO) fareler nakavt kullanılır. Ki67, BrdU, CldU veya DUK ya karşı immünohistokimyasal DAB boyama sürekli yabanitipte ve Ccnd2 KO farelerde (Şekil 3) 15 arasında yenidoğa...

Bu video makale, aynı doku kesitinde yetişkin hipokampal nörogenezin tüm aşamalarını tespit etmek ve ölçmek için kapsamlı bir protokolü göstermektedir. Farklı konakçı türlerden uygun antikorlar mevcut olmadığında ortaya çıkan dolaylı çoklu immünofloresan sınırlamalarının üstesinden gelmek için bir yöntem geliştirdik.

Aynı Sunucu Türlerin Antikorlar ile İmmünohistokimya ve Çoklu Etiketleme Yetişkin hipokampal nöron Eğitim için

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Bu prosedürün genel amacı, farklı konak türlerinden uygun primer antikorların mevcut olmadığı durumlarda, nöral progenitör hücreleri incelemek için indirekt immünofloresanın sınırlamalarını aşmaktır. Başlangıçta, bölünen hücreleri işaretlemek için bir timidin analoğu enjekte edilir; ardından doku toplanır, işlenir ve kriyoseksiyonlar şeklinde dilimlenir.Ardından, başlangıç olarak ardışık çoklu immünofloresan uygulanır. Önce işaretsiz bir primer antikor uygulanır ve ardından bu antikor floresan işaretli bir sekonder antikor ile bağlanır. Sonrasında, birinci sekonder antikordaki açık bölgeler primer antikor türünden alınan serumla bloke edilir ve ikinci sekonder antikor tarafından tanınabilecek tüm immünoglobulinler konjuge edilmemiş fab fragmentleri ile kapatılır.Bu işlem, dokunun farklı bir sekonder anti-antikor ile işaretlenebilen ikinci bir primer antikorla işlenmesine olanak tanır. Sonuç olarak, kesitlerin görüntüleri, belirli uyarılara yanıt olarak nöral progenitör hücrelerin gelişimini ve düzenlenmesini ve belirli beyin fonksiyonlarındaki rollerini incelemek için kullanılır. Bu tekniğin, eşzamanlı çoklu immunofloresans gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, genellikle aynı konak türde üretilmiş primer antikorları kullanma gereksiniminden kaynaklanan sorunları ortadan kaldırmasıdır.Bu yöntem, hipokampal progenitör alt kümelerinin fizyolojik veya farmakolojik stimülasyonlara, beyin patolojilerine veya yaşlanmaya yanıt olarak proliferasyonu gibi yetişkin nörojenez alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genellikle, bu yöntemi ilk kez uygulayan kişiler, aynı konakçı türden gelen primer antikorlarla yapılan çoklu işaretlemenin, yeterli bloklama yapılmadığında istenmeyen antikor çapraz aktivitelerine yol açabilmesi nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. İlk olarak, enjeksiyon yapılacak hayvanları tartın ve enjeksiyon için taze 10 mg/mL timidin analoğu stok çözeltisi hazırlayın.Çözelti hazır olduğunda, 30 gauge iğneli ince bir dozaj şırıngasında ağırlığa göre ayarlanmış dozu hazırlayın. Ardından fareyi ensesinden tutarak sabitleyin ve timidin analogunu istenen zaman noktasında intraperitonal olarak enjekte edin; fareyi derin şekilde anesteziye alın ve transkardiyal perfüzyon uygulayın. 10 mL buz gibi soğuk PBS'nin ardından 40 mL taze buz gibi soğuk formaldehit çözeltisi ile perfüzyon yapın.Ardından beyni ve postu diseke edin ve fiksasyon işlemini takiben aynı fiksatif içinde sabitleyin. Toplanan beyinleri dört derece Celsius'da %10 sükroz içerisinde 24 saat inkübe edin. Ertesi gün, beyinleri %30 sükroza aktarın ve 48 saat daha inkübe edin.Kriyokoruma işlemi tamamlanan beyinleri, -25 °C'deki izopentanda dondurun. Daha sonra, uzun süreli saklama için bir kriyostat kullanarak 40 mikron kalınlığında koronal kesitler alın. Kesitleri bir antifriz çözeltisine aktarın ve -20 °C'de muhafaza edin.Keserlerin antifriz solüsyonundan TBS'ye ince bir fırça yardımıyla aktarılmasıyla başlayın. Keserleri, önce dört °C'de gece boyu yıkama, ardından oda sıcaklığında beş kez 10 dakikalık yıkamalar şeklinde iyice durulayın. Tüm bu inkübasyonlar sürekli ve nazik bir ajitasyon altında gerçekleştirilmelidir.İlgilenilen antijenlerden biri bir timidun analoğu ise, bu aşamada bir hidroklorik asit denatürasyon adımı uygulanmalı ve ardından bor tamponu ile bir nötralizasyon adımı gerçekleştirilmelidir. TBS plus ile permeabilizasyon ve spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerinin bloklama işlemine geçiniz. Bu inkübasyonu oda sıcaklığında bir saat boyunca sürdürün, ardından ertesi gün, TBS plus içinde dilüe edilmiş ilk primer antikorda dört santigrat derecede gece boyunca inkübe edin.Kesitleri üç kez TBS ile ve bir kez TBST ile yıkayın. Her bir yıkama işlemini 10 dakika boyunca sürdürün. Ardından, ilk florokrom konjuge ikincil antikor ile oda sıcaklığında üç saat boyunca inkübe edin.Bundan sonra, kesitleri ışık maruziyetinden koruyun. Başka bir yıkama serisinin ardından, kesitleri iki primer antikorun üretildiği konak türden %10'luk serum çözeltisine aktarın. İlk sekonder antikor üzerindeki açık perifokusları doyurmak için kesitleri bu çözeltide üç saat boyunca inkübe edin.Daha sonra serumu uzaklaştırmak için üç kez TBS ve bir kez TBST ile durulayın. Ardından, primer antikorkun konakçı türüne karşı yöneltilmiş, mililitre başına 50 mikrogram konjuge edilmemiş monovalan fab fragmentleri içeren bir TBS artı çözeltisi hazırlayın. Bu işlem, aksi takdirde ikinci sekonder antikor tarafından tanınabilecek epitopları maskeler.Kesipleri bu çözeltiye aktarın ve dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından kesipleri en az üç kez TBS ve bir kez TBST ile yıkayın. Transferler sırasında, kalıntı fab kalıntılarını temizlemek için kesipleri içeren gözenekli insertleri bir kağıt havlu yardımıyla kurulayın.Şimdi kesitleri ikinci primer antikor ile dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Başka bir yıkama serisinden sonra, ikinci sekonder antikoru oda sıcaklığında üç saat boyunca uygulayın. Son olarak kesitleri üç kez TBS ile yıkayın ve kesitlerin jelatin ile kapatma işlemine geçin.Slaytları havada kurutun ve ANTIFA montaj medyumu kullanarak kapatma camı ile kapatın. Floresan işaretli kesitleri konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntüleyin. Dentat girusun tüm uzunluğu boyunca rastgele konumlardan 400 kat büyütmede görüntü istifleri (image stacks) alın.Farklı belirteçlerin ko-etiketlenmesini analiz etmek için her yarım küreden rastgele seçilmiş en az 50 hedef hücreyi inceleyin. Spesifik yeni doğmuş hücre popülasyonları için mutlak sayıları hesaplamak adına, ko-etiketli hücrelerin yüzdelerini DAB boyama analizinden tahmin edilen toplam yeni doğmuş hücre sayılarıyla çarpın. Açıklanan yöntemler, nörogenez eksikliği olan bir döngünün postnatal ve yetişkin hipokampüsündeki yeni doğmuş hücreleri nicelleştirmek ve karakterize etmek için kullanılmıştır.D iki nakavt fare modelinde, KI 67 veya BRDU gibi farklı proliferasyon belirteçlerine karşı yapılan DAB boyamaları, yaban tipi ve nakavt fareler arasındaki yeni doğmuş hücre sayılarında tutarlı farklılıklar ortaya koymuştur. BRDU ile işaretlenmiş yeni doğmuş hücreler, B-R-D-U-G-F-A-P nest in GFP ve double courtin karşıtı primer antikorların eş zamanlı uygulandığı geleneksel bir çoklu immünofloresan protokolü ile fenotipleştirilebilmiştir. Bu yöntem, tek bir örneklem içerisinde yeni doğmuş tip bir, tip iki A, tip iki B ve tip üç progenitör hücrelerin başarılı bir şekilde tanımlanmasını sağlamıştır.Alternatif olarak, BrdU enjeksiyonu ile hayvanın sakrifikasyonu arasında daha uzun zaman aralıkları olduğunda, yeni doğmuş nöronların nihai sayıları eş zamanlı BrdU yeni nöron immün boyaması ile analiz edilebilir. Sıralı immün etiketleme protokolü, kesitler önce tavşan anti-Ki67, keçi anti-GFP ve Gine dombezi anti-doublecortin antikorları ile eş zamanlı olarak inkübe edilip, ardından tavşan anti-GFAP antikoru ile inkübe edildiğinde mükemmel çalışmış, ancak bunun tersi durumda çalışmamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, aynı konakçıda üretilmiş primer antikorlar kullanarak tek bir doku kesitinde dört farklı antijene kadar nasıl görselleştirilebileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu prosedür uygulanırken, antikor çapraz reaksiyonu veya yalancı pozitiflik olasılığını ortadan kaldırmak için uygun kontrollerin dahil edilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Birincil antikor inkübasyonlarının sırasının, protokolün sonucunu güçlü bir şekilde etkileyebileceğinin farkında olun.

immunohistochemistry-multiple-labeling-with-antibodies-from-same-host

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Video, yetişkin hipokampusundaki nörojenezi incelemek için kullanılan bir immünofloresan boyama yöntemini göstermektedir. Başlangıçta, bir fare beyin bölümü, nöronal progenitör hücrelerde nörojenez ile ilişkili işaretleyici proteinlere yönelik birincil antikorlarla tedaviye tabi tutulur. Daha sonra, floroforlarla etiketlenmiş ikincil antikorlarla etiketlenir. Beyin bölümü daha sonra, işaretleyici proteinlerin farklı kombinasyonlarının ekspresyon modellerine dayalı olarak, progenitör hücrelerin...

Erişkin Hipokampal Nörojenezi Tespit Etmek için Bir İmmünofloresan Boyama Tekniği

Bu video, EdU dahil edilmesi kullanılarak beyin dokusu kesitlerinde yeni çoğalan nöral kök hücrelerin boyanması prosedürünü ve ardından spesifik proteinleri görselleştirmek için immünofloresan ile hücre dinamiklerinin ve proliferasyonunun anlaşılmasını geliştirme prosedürünü göstermektedir.

Fare Beyin Bölümlerinde Prolifere Nöral Kök Hücreleri Görselleştirmek için İmmünofloresan Boyama

Proteinlerin lokalizasyonu ve dağıtım onların hücresel fonksiyonları anlamak için önemli bilgiler sağlar. Elektron mikroskobu üstün çözünürlük uzaysal (EM), belirli bir antijen aşağıdaki immünohistokimya hücre içi lokalizasyonu belirlemek için kullanılabilir. Sürdürmek antijenite EM araştırmalarda özellikle zor olmuştur süre yapısal bütünlüğünü koruyarak merkezi sinir sistemi (MSS), dokular için. Burada, çalışma MSS yapılar ve antijenleri korumak ve sıçan hipokampal CA1 piramidal nöronlarda...

Hipokampal Dilim Kültürleri Synaptic Proteinler Post-gömme immunogold Etiketleme

Erişkin hipokampal nörogenez sırasında, hareketsiz bir nöral kök hücre sırayla ilerlediğinde ve devrede işlevsel olarak entegre bir nörona dönüştüğünde farklı bir genetik belirteç seti ifade edilir. Isı kaynaklı antijen alımı kullanılarak, aksi takdirde tespit edilmesi zor olan progenitör hücre tipleri, geliştirilmiş etkinlik ile tanımlanır.

Isı Kaynaklı Antijen Alımı: Yetişkin Hipokampal Nörojenez Sırasında Progenitör Hücre Tiplerini Tespit Etmek ve Tanımlamak İçin Etkili Bir Yöntem

Bu giriş seviyesi protokolü, örnek olarak mikroglia ve nöronal elementler için belirteçler kullanarak, kemirgen beyinlerinin immünohistokimyasal boyamasını tamamlamak için gereken reaktifleri, ekipmanı ve teknikleri açıklar.

Mikroglia ve nöronlar için örnek Boyama: Cryosectioned Rat Beyin Dokusu Üzerine İmmünohistokimya için Astar

Biz nörogelişimsel kökenli bilişsel bozuklukların ile karakterize bir fare modelinde bir mekansal öğrenme göreve maruz kaldıktan sonra hipokampal nöron aktivasyonu profilini incelemek için bir immünohistokimya protokol açıklar. Bu protokol bilişsel karakterize hem genetik ya da farmakolojik fare modellerine uygulanabilir.

Nörogelişimsel Bozukluklar Fare Modeli Mekansal Öğrenme ardından Hipokampal Nöron Faaliyet immünohistokimyasal Görselleştirme

Gen ekspresyonunu spesifik hücre tiplerine lokalize etmek, spesifik antikorların eksikliği nedeniyle zor olabilir. Burada, çift floresan RNA'nın yerinde hibridizasyonunun immün boyama ile birleştirilmesiyle gen ekspresyonunun eşzamanlı üçlü tespiti için bir protokol açıklıyoruz.

Çift Floresan birleştiren<em&gt; In Situ</em&gt; Fare Beyin Bölüm Üç Genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile Hibridizasyon

Bu protokolün amacı, belirli bir lokal nöral devrenin kemogenetik manipülasyonuna yanıt olarak yetişkin nöral kök/progenitor hücrelerin davranışını analiz etmek için bir yaklaşım tanımlamakta.

Yetişkin hipokampal sinirsel precursor hücrelerinin devre spesifik Yönetmeliği

Bu makale, sıçanlarda yetişkin nörogenezini ölçmek için BrdU pozitif hücrelerini görselleştirmek için en yaygın tekniklerden dördünü sunmaktadır. Bu çalışma, reaktif hazırlama, timidin analog uygulaması, transkardiyal perfüzyon, doku hazırlığı, peroksidaz immünohistokimyasal reaksiyonu, immünofloresan, sinyal amplifikasyonu, karşı boyama, mikroskopi görüntüleme ve hücre analizi için talimatları içerir.

Thymidine Analog BrdU Kullanarak Sıçanlarda Hücresel Proliferasyon ve Nörogenezi Analiz Etmek için İmmünohistokimya Teknikleri

Burada protokol, konak-patojen etkileşimlerini incelemek için aynı türde yetiştirilen birincil antikorları kullanarak çift etiketleme immünofluoresansının nasıl gerçekleştirildiğini açıklar. Ayrıca, bu protokole farklı bir konaktan gelen üçüncü antikorları da içerebilir. Bu yaklaşım herhangi bir hücre tipinde ve patojende yapılabilir.

Konak-Patojen Etkileşimlerini İncelemek için Aynı Türden Antikorlar Kullanarak Çift Etiketleme İmmünofluoresans

Burada, floresan ile aktive olmuş çekirdekler (FAN) sıralama yoluyla çoğu nöronu dışlayan fare dentat girusundan izole edilen tek çekirdekleri sıralamak için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaklaşım, yüksek kaliteli ekspresyon profilleri oluşturur ve nöral kök hücreler gibi kıt popülasyonlar da dahil olmak üzere niş içinde temsil edilen diğer hücre tiplerinin çoğunun incelenmesini kolaylaştırır.

Hipokampal Nörojenik Nişi İncelemek için Tek Çekirdekli RNA Dizilimi ile Birleştirilmiş Floresan Aktive Edilmiş Çekirdekler Negatif Nöronik Sıralama

Öğrenin, yetişkin hipokampal nörogenez evrelerini aynı doku kesitinde saptamak için ardışık çoklu immünofloresan yöntemini. Bu teknik, farklı konak türlerinden antikor bulunamadığında çapraz reaktivite sorunlarını aşar.

Aynı Sunucu Türlerin Antikorlar ile İmmünohistokimya ve Çoklu Etiketleme Yetişkin hipokampal nöron Eğitim için

Daha fazla video keşfet