Türler özgü Algılama Loop-aracılı İzotermal Amplifikasyon (LAMP) Tahliller

Bu prosedürün genel amacı, bir tavuk veya tavuk sürüsünde I myea türü parazitlerin oluşumunu teşhis etmektir. Bu, önce reaktiflerin döngü aracılı izotermal amplifikasyon veya lamba reaksiyonu için hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, toplam genomik DNA, ölüm sonrası bir veya daha fazla bağırsak bölgesinden hazırlanır.

Daha sonra genomik DNA, lamba ana karışımına eklenir ve inkübe edilir. Son olarak, lamba testinin sonucu değerlendirilir. Sonuç olarak, LAMP, stok yönetimini iyileştirmek ve hastalık teşhisi için bir araç olarak belirli I miria türlerinin oluşumunu belirlemek için kullanılır.

Bu nedenle, bu tekniğin morfolojik mikroskopi veya PCR gibi geleneksel yöntemlere göre ana avantajı, daha az öznel olması ve pahalı laboratuvar olanakları gerektirmemesidir. Bu yaklaşımın kullanılması, Arian enfeksiyonunun teşhisini iyileştirerek tavuk sağlığını ve refahını iyileştirebilir. Erea lambası ase için şablonu hazırlamak için, test edilecek bağırsak bölümünü seçin.

Bu tabloyu, yer seçimini ve mevcut olma olasılığı en yüksek olan eria türlerini örneklemek için bir kılavuz olarak kullanın. Bu çok önemlidir, çünkü tavukları enfekte eden her tür, steril makas veya neşter kullanarak hedeflediği bağırsak bölgesi tarafından tanımlanır. Eria'yı test etmek için seçilen bağırsak bölümlerinin beş santimetre veya daha uzun uzunluklarını kesin.

Numuneyi uzunlamasına kesin. Bağırsak içeriğinin çoğunu çıkarın ve steril bir cam mikroskobun kenarını kullanın. Hücreleri mukozal tabakadan kazıyarak çıkarmak için makas bıçağını kaydırın veya sterilize edin.

Kazınmış malzemeyi% 10 ağırlığında 100 mikrolitre steril TE içeren steril 1.5 mililitrelik vidalı mikro santrifüj tüpüne koyun, ancak hacim hücresi X 100 reçine ve üstüne sıkıca vidalayın. Numuneleri bir dakika kuvvetlice çalkalayın, ardından 10 dakika kaynar su banyosunda inkübe edin. Kaynattıktan sonra, her numunenin ortam sıcaklığında bir ila iki dakika soğumasına izin verin.

100 tahlil için yeterli I miria lamba astar stoklarını hazırlamak için şablon olarak kullanılacak lamba tahlili başına iki mikrolitre süpernatan toplamadan önce numuneleri bir dakika boyunca 10.000 kez G'de santrifüjleyin. Her bir liyofilize I miria lamba astarını, 100 mikromolar pipet, 60 mikrolitre moleküler dereceli su konsantrasyonuna moleküler dereceli su ekleyerek, her bir iria türü için ayrı bir 0.5 mililitre kapaklı mikro santrifüj tüpüne yeniden sulandırın. Bu tabloda gösterilen hacmi kullanarak.

Suya hedef eria türüne özgü primerler, F-I-P-B-I-P-F, üç, B, üç, LF ve LB ekleyin. Yedi türe özgü astar karışımından oluşan bir seri oluşturmak. Karıştırmak için astar çözeltilerini kısaca ters çevirin, mikro fuge darbesi alın ve gerekene kadar dondurun.

Bu tabloda listelenen hacimleri ve metin protokolündeki yönergeleri kullanarak, lamba tahlilini gerçekleştirmek için tahlil edilecek her iria türü için bir lamba reaksiyonu ana karışımı hazırlayın 23 mikrolitre IEA türüne özgü B-S-G-D-N-A polimeraz lamba ana karışımını 0,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin. Pozitif bir kontrol olarak 25 mikrolitrelik bir son reaksiyon hacmi elde etmek için önceden hazırlanmış DNA şablonundan iki mikrolitre ekleyin. Bir reaksiyona iki mikrolitre eria türüne özgü genomik DNA ekleyin.

Negatif kontrol olarak bir reaksiyona iki mikrolitre moleküler dereceli su ekleyin, bir su banyosunu veya ısı bloğunu 62 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İsteğe bağlı olarak B-S-T-D-N-A polimerazı 10 dakika boyunca 80 santigrat dereceye ısıtarak devre dışı bırakın. Reaksiyon, iç mekan ışığı altında inkübasyonun sonunda hemen okunmayacaksa, her reaksiyonun rengini gözle değerlendirin.

Negatif sonuçlar pembe ila mor renkte görünecek ve pozitif sonuçlar görünecektir. İsteğe bağlı olarak gök mavisi. Lamba tahlili sonucunu doğrulamak için, beş mikrolitre lamba reaksiyon ürününü bir mikrolitre DNA jel yükleme tamponu ile karıştırın ve önceden boyanmış %2 ARO jeli üzerinde çalıştırın.

Parça boyutunu belirlemek için bir öldürücü baz moleküler boyutlu DNA merdiveni kullanın, test üç. Bir gözetim programının bir parçası olarak ABD'deki bir piliç çiftliğinden toplanan kuşlar: Burada gösterildiği gibi üç set bağırsak örneği verdi. Türe özgü lamba tahlillerinin hedefe yönelik uygulanması ve her I miria için tercih edilen bağırsak bölgelerinin önceliklendirilmesi.

Türler, gösterge olarak hidroksi natal mavisi kullanılarak test edilen tüm kuşlarda bir irian enfeksiyonunun görsel olarak tanımlanmasına izin verdi. Hidroksi kullanıldığında negatif bir lamba reaksiyonu ile elde edilen renk, menekşe ile pembe arasında değişebilir, ancak her zaman pozitif bir sonuçla elde edilen maviden farklıdır. Aose jel elektroforezi ile doğrulama, burada gösterildiği gibi karşılaştırılabilir sonuçlar sağlamıştır.

Spesifik bağırsak bölgelerinin her birinden toplanan materyali temsil eden ve yedi lamba testinin tümü ile test edilen kuş başına çekilen bir numuneden DNA'nın hazırlanması, her bir bağırsak bölgesinin ayrı ayrı işlendiği durumla aynı sonucu verdi. Genel bağırsak sağlığını değerlendirmek için lezyon skorlaması gibi diğer teknikler de uygulanabilir.