Name: Bir Fare Modeli Doku mühendisliği Kapların Üretimi ve Tırnak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Öğrenin fare modelinde doku mühendisliği damar greftleri üretmeyi; PiPSC'lerin çift tohumlanması ve biyoreaktör kullanımıyla fonksiyonel greftler geliştirilir. Bu yöntem rejeneratif tıpta vasküler onarım için umut vadeder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma The British Heart Foundation ve The Oak Foundation tarafından desteklenmiştir.

Laboratuvar Hayvanları Kullanımı ve Bakımı Kurumsal Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre tüm hayvan deneyleri. Kültür Medya 1. Hazırlık <ol><li> F-12K ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 100 U / ml penisilin ve streptomisin: insan fibroblast hücre çizgisi CCL-153 kültür ortamı olun. </li><li> PiPSC üretimi için yeniden programlanması Ortamın: Nakavt Dulbecco modifiye kartal ortamı (DMEM)% 20 Nakavt serum değiştirilmesi, 0.1 mM β-merkaptoetanol, 0.1 mM Minimum Esansiyel Medium (MEM) Aslî Olmayan Amino Asitler, 10 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü 2 (bFGF-2) ve 100 U / ml penisilin ve streptomisin üzerine yayıldı. Medyayı kullanmadan önce bFGF-2 taze her zaman ekleyin. </li><li> Düz kas hücresi uyarılması için Farklılaşma Ortamı (DM) olun (SMC) farklılaşması:% 10 FBS, 0.1 mM β-merkaptoetanol, 100 U / ml penisilin ve streptomisin ve 25 ng / ml Platelet Derive Büyüme Faktörü içeren medya-MEM α(PDGF-ββ). </li><li> Yap Endotel Farklılaşma Ortam endotel hücre (AK) farklılaşmasını uyarması (AT-DM): Endotel Büyüme ortamı-2 (EGM-2), 50 ng içeren ortam / ml Vasküler Endotel Büyüme Faktörü (VEGF) ve 100 U / ml penisilin ve streptomisin üzerine yayıldı. </li></ol> Kısmen kaynaklı Pluripotent Kök Hücre içine 2. yeniden programlanması İnsan Fibroblastlar (PiPSC) <ol><li> Kültür ortamı içinde,% 0.04 jelatin çözeltisi kaplamalı şişeler Kültür insan fibroblast hücre çizgisi CCL-153. </li><li> Geçiş hücreleri 1 arasında bir oranda her 3 günde bir, 6. PiPSC kuşak en yüksek verimlilik için geçit 9 önce hücrelerin kullanın. % 90 ortak akışkanlığa - Hücreler 80 ulaştıktan sonra transfeksiyon için hazırdır. </li><li> 4 yeniden programlama faktörleri içeren polisistronik plazmid pCAG2LMKOSimO linearize oktamer bağlayıcı transkripsiyon faktörü 4 (Oct4), Sox2 Kruppel benzeri faktör 4 (Klf4) ve c-myc (pCAG-OSKM). 37 ° C&#39;de 3 saat Pvu I kısıtlama enzimi 5 adet olan plazmid 5 ug Digest. Arındırmaküreticinin protokolüne göre, ticari bir kit kullanılarak plazmid. </li><li> Transfekte üreticinin protokolüne uygun olarak insan deri fibroblast (NHDF) nucleofection kiti ile elektroporasyon yoluyla doğrusallaştırılmış pCAG-OSKM plazmid 4 ug 2 x 10 6, insan fibroblast. Yavaşça önceden ısıtılmış yeniden programlanması Medya 5 ml ihtiva eden ön% 0.04 jelatin kaplı T25 şişesi üzerine transfekte edilmiş hücreleri, tohum. </li><li> 24 saat sonra, transfekte edilen hücrelerin saf popülasyonu seçmek için 25 ug / ml neomisin ve ek orta değiştirin. </li><li> 4 gün kadar her gün orta değiştirin. Not: İnsan fibroblastları yeniden programlama 4 gün sonra PiPSC olur. </li></ol> Endotel ve düz kas hücrelerinin içine PiPSC 3. Farklılaşma <ol><li> 4 gün boyunca DM içeren kolajen IV önceden kaplanmış yemekleri Tohum PiPSC SMC&#39;ler içine farklılaşmayı teşvik etmek. 4 gün kadar her gün orta değiştirin. </li><li> Kolajen IV önceden kaplanmış yemekleri c Tohum PiPSC6 gün süre ile endotelyal-DM ontaining endotel hücrelerine farklılaşmasını uyarması. 6 gün kadar her gün orta değiştirin. </li></ol> 4. decellularized Aort Greft Hazırlanması Not: Tüm çözümler ve ekipman steril olmalıdır. <ol><li> Servikal dislokasyon ile fare Kurban ve diseksiyon mikroskop altında yatar pozisyonda fare sabitleyin. </li><li> Göğüs boşluğu açmak için sternum üzerinden ve göğüs kafesi etrafında kesin. Aorta maruz kalp, akciğerler ve yemek borusu çıkarın. Yavaşça forseps ile peri-aort yağ çıkarmak. </li><li> Makasla ön ucundan aort kesin ve hafifçe künt forseps ile sona tutun. Künt diseksiyon ile arkasında omurga sütununda aort ayırın. Dikkatle bipolar elektrokoagulatör ile ligasyonu ile aort tüm dallanma arterlerin kapatın ve makas ile ligasyon uzak ucundan kesim. </li><li> 3 m ile aort lümeni temizlemek için bir 5 ml şırınga kullanınkan pıhtılarının oluşumunu önlemek için, heparin, 100 U ihtiva eden tuz çözeltisi l. </li><li> Böbrek içine şube önce aort arka ucunu kesin. Aort bütünlüğünü tutulması tüm prosedür sırasında çok önemlidir. </li><li> Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde sulandırılmış% 0.075 sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisi, 5 ml ile aort lümeni yıkayın. </li><li> 10 cm Petri kabındaki 0.075% SDS çözeltisi içinde torasik aorta bekletin. Oda sıcaklığında 150 rpm&#39;de 2 saat boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde Petri tabağına yerleştirin. </li><li> PBS 5 ml aort lümeni yıkayın. </li><li> 10 cm Petri için PBS içinde aort bekletin. Oda sıcaklığında 150 rpm&#39;de 2 saat boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde Petri tabağına yerleştirin. PBS her 20 dakikada yenileyin. </li><li> PBS 5 ml aort lümeni yıkayın. </li><li> En fazla bir hafta boyunca 4 ° C&#39;de PBS içinde hücresizleştirilmiş aort greft tutun. </li></ol> PiPSC ve Biyoreaktör Havalandırma 5. Çift Tohumculuk Not: Tüm çözüms ve ekipmanlar steril olmalıdır. Bir doku kültürü kaputu tüm işlemleri gerçekleştirin. <ol><li> Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi. Biyoreaktör akış devreyi kurunuz boru ile kuluçka odasına, medya rezervuar, peristaltik pompa ve uyum odasını bağlayın. Dolaşımı için gerekli ortamın az hacmi 40 ml&#39;dir. </li><li> Ön-koşul, bir 10 cm Petri için DM ortamı aortu ıslatılması ile kültür ortamı ile hücresizleştirilmiş damar. Oda sıcaklığında 50 rpm&#39;de 1 saat boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde Petri tabağına yerleştirin. </li><li> Mikroskop altında decellularized kabın iki ucunda içine 1 cm uzunluğunda Naylon tüpleri (OD 0.9 mm, ID 0.75 mm) takın. Gemi ve 8-0 ipek dikişlerle tüpleri kravat. </li><li> Bölme duvar giriş ve çıkış portları (1/32 &quot;boru) ile Naylon tüpler bağlanarak kuluçka odasında decellularized aort greft birleştirin. Orta 5mls her seferinde inkübasyon odası koruyun. </li><li> Ekleyerek önceden ısıtılmış tarafından Trypsinize PiPSCtripsin kültür çanak kapağı ve hafifçe çanak 10 kez rock. Tripsin atın ve 2 inkübatör çanak bırakın - 3 dk. Tabak önceden ısıtılmış bir kültür ortamı ilave edin ve hücreleri ile orta karıştırın. </li><li> Hemasitometre kullanarak hücre sayısını sayın. Santrifüj 300 x g 5 dakika boyunca 5 x 10 5 hücre, her biri hücre süspansiyonları iki alikot. Tamamen süpernatant aspire. </li><li> Tamamen süpernatant aspire sonra, DM 50 ul pip hücre pelet 1 pelletini. Decellularized damar lümenine bu hücre süspansiyonu enjekte. </li><li> Ardından, Matrigel 100 ul diğer tırtıl hücre pelletini. Dikkatle decellularized aort greft üzerine karışımı pipetle. </li><li> Karışım damar dış yüzeyi etrafında sarar eşit bir jel gibi devlet dönüşür kadar 15 dakika - 10 için bekleyin. DM inkübasyon odası doldurun. </li><li> 37 ° C&#39;de bir% 5 CO2 inkübatörü içinde ayarını bütün biyoreaktör yerleştirin. Elle ilk 2 saat içinde decellularized greft boyuna ekseni her yarım saatte yaklaşık 90 ° döndürün. </li><li> Hücre yapışmasını sağlamak için 12 saat için statik kültür tutun. </li><li> Düz kas hücre değişimini etkileme peristaltik pompa ile lümen yoluyla DM verin. 5 ml / dakika ve 24 saat boyunca 20 ml / dakika için adım adım artış, başlangıç ​​akış hızını başlatın. </li><li> 24 saat süre ile 20 ml / dak dolaşım aracı, akış hızı tutun. </li><li> Orta akışını durdurun ve inkübatör dışına ayarı biyoreaktör taşımak. </li><li> Yeniden tohum PiPSC ile greft lümen. 5.6 - Trypsinize, adımlarda 5.5 olarak saymak ve santrifüj 1 x 10 6 PiPSC. 50 ng / ml VEGF ihtiva eden EGM-2 ortamında 50 ul içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Greft lümenine hücre karışımı enjekte edilir. </li><li> Endotel değişimi etkilemek için 50 ng / ml VEGF ihtiva eden EGM-2 ortamında inkübasyon odası ve bütün dolaşımda orta değiştirin. </li><li> Inci geri ayarı biyoreaktör TaşıE inkübatör. Manuel greft ilk 2 saat içinde 90 ° her 30 dk döndürmek ve daha sonra 12 saat için statik bir kültür tutun. </li><li> 5 ml / dakika ve 35 ml / dak kadar adım adım artış, akışı dolaşan başlatın. 5 gün boyunca 35 ml / dakika akış hızındaki tutun. Her gün dolaşan ve oda ortamı değiştirin. </li><li> Fare daha fazla aşılama için tasarlanmış greft Hasat. </li></ol> Fareler içine Çift numaralı seribaşı PiPSC Graft 6. Tırnak <ol><li> Kullanım NOD.CB17-Prkdc scid / damar grefti alıcı olarak NcrCrl erkek fareler. 35 gr, ve iyi sağlık koşulları içinde - Her zaman fareler, yaklaşık 10 haftalık olan yaklaşık 25 tartmak emin olun. </li><li> Periton boşluğu içine Hypnorm (25 mg / kg) ve Hypnovel (25 mg / kg) &#39;in bir bileşimini vermek suretiyle alıcı fare anestezisi. Anestezi altında iken kuruluğu önlemek için göze vazelin oftalmik merhem sürün. Fareler rahat kasları var ve sürekli nefes sağlayarak verimli anesthetization onaylayın. <ol><li> Onun boynu tıraş ve genişletilmiş bir yatar pozisyonda fare sabitleyin. Fare solunum yolu açık kalmasını sağlamak için anestetikler ile kombinasyon halinde atropin sülfat (1,7 mg / kg) uygulayınız. </li></ol></li><li> Fare sternum alt çenenin bir orta hat kesi hazırlayın. 5- ila 10 kat büyütme ile bir mikroskop altında, yanal sağ tükürük bezleri kaldırın ve sağ karotis arter ortaya çıkarmak için doğru cleidomastoid kas çıkarın. </li><li> Yavaşça yakın ucuna doğru uzak ucundan sağ ortak karotid arteri harekete geçirmek için bağlanmış dokular çıkarın. Bir 8-0 ipek sütür ile iki kez karotis arter orta kısmını bağlayan ve iki bağları arasında teşrih. </li><li> Her gemi sonunda otoklav naylon tüp yapılmış bir manşet geçmek ve microhemostat kelepçeleri her ucunu sabitleyin. </li><li> Bir ucunda dikiş bağı sökün ve heparinin bir damla (100 U / ml) uygulanır. Hemen sonra, th uzak ucunu terse arter tüm manşet vücudu kapsayacak ve manşete bir 8-0 ipek sütür ile ters gemi düzeltmek için. <ol><li> Arterin diğer kısmına aynı işlemi tekrarlayın. Tuzlu su çözeltisi ile yıkayın arter kan pıhtıları kaldırmak için. </li></ol></li><li> Arter manşetleri aşkın decellularized damar uçlarını sürgülü ve 8-0 ipek sütür ile sabitlemek karotis arter iki ucu arasında bir decellularized damar grefti implante. Greft atışını değerlendiren önce ya biter vasküler kelepçeleri çıkartın. </li><li> Geri orijinal konumuna doğru tükürük bezi yerleştirin. 6-0 polyglactin sütür kullanarak bir kesintiye sütür ile cerrahi yere cilt kapatın. </li><li> Prosedür tamamlandıktan sonra bilincini yeniden başlayıncaya kadar tutarlı, fare hayati belirtilerini gözlemlemek. Servikal dislokasyon ve hasat damar grefti ile 24 saat ya da daha sonra daha fazla analiz için 3 hafta ya alıcı fareler Kurban. </li></ol>

<ol><li>Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Tissue-Engineered+Vascular+Grafts+for+Cardiac+Surgery%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).</li>
<li>Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+follow-up+of+patients+with+synthetic+right+heart+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits.</a> Circulation. 72, II77-II83 (1985).</li>
<li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+insight%3A+the+evolution+of+tissue-engineered+vascular+grafts-from+research+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Clin+Pract+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice.</a> Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).</li>
<li>Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+blood+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of blood vessel.</a> J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).</li>
<li>Cearbhaill, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+mesenchymal+stem+cells+to+the+biomechanical+environment+of+the+endothelium+on+a+flexible+tubular+silicone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate.</a> Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).</li>
<li>Gong, Z., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+%28hMSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs).</a> FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+HSP47+augments+mouse+embryonic+stem+cell+smooth+muscle+differentiation+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis.</a> PLoS One. 9 (1), e86118(2014).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+CD34%2B+progenitor+cells+by+combined+modulation+of+the+MEK%2FERK+and+BMP4+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways.</a> Blood. 116, 5762-5772 (2010).</li>
<li>Samuel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functionally+competent+and+durable+engineered+blood+vessels+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).</li>
<li>Margariti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+fibroblasts+into+endothelial+cells+capacble+of+angiogenesis+and+reendothelialization+in+tissue-engineered+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).</li>
<li>Karamariti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cells+differentiated+from+reprogrammed+embryonic+lung+fibroblasts+through+DKK3+signaling+are+potent+for+tissue+engineering+of+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts.</a> Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).</li>
<li>Udelsman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+operator-independent+method+for+seeding+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).</li>
<li>Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+human+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin-based+vascular+tissue+engineering+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs.</a> Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+control+vascular+stem%2Fprogenitor+cell+plasticity+through+tumor+necrosis+factor-%CE%B1-mediated+nuclear+factor-%CE%BAB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirolimus+stimulates+vascular+stem%2Fprogenitor+cell+migration+and+differentiation+into+smooth+muscle+cells+via+epidermal+growth+factor+receptor%2Fextracellular+signal-regulated+kinase%2F%CE%B2-catenin+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+State+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: State of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).</li>
<li>Hung, H. S., Hsu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Advances+of+stem+cell-based+approaches+to+tissue-engineering+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22OA+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts.</a> OA Tissue Engineering. 1 (1), 2(2013).</li>
<li>Quint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).</li>
<li>Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+antiplatelet+adhesion+layer+on+an+electrospun+scaffold+using+porcine+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells.</a> J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).</li>
<li>Hibino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+use+of+an+induced+puripotent+stem+cell+sheet+for+the+construction+of+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+to+engineer+small-diameter+vascular+grafts+from+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).</li>
<li>Tsai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+stem+cells+to+neointimal+formation+of+decellularized+vessel+grafts+in+a+novel+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model.</a> Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).</li>
<li>Kasimir, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+decellularization+procedures+of+porcine+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves.</a> Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).</li>
<li>Stephenson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+propagation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+from+frozen+embryos+in+an+animal+product-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment.</a> Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).</li>
<li>McCall, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarction+and+intramyocardial+injection+models+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine.</a> Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).</li>
<li>Olausson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+an+allogeneic+vein+bioengineered+with+autologous+stem+cells%3A+a+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study.</a> Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi çatışan mali çıkarları var.

Mevcut protokol fonksiyonel doku mühendisliği kaplar insan fibroblastlardan PiPSC kullanılarak üretilebilir olan bir ses, hızlı, basit, verimli ve tekrarlanabilir bir strateji gösterir. Bu teknik, yakın gelecekte rejeneratif tıp, doku mühendisliği ve potansiyel hastaya özgü hücre tedavisi için değerli bir araç temsil eder. Protokol etkinliğini sağlamak için kritik adım vasküler biyoreaktör içinde PiPSC hazırlanmasını, steril ve tamamen hücresizleştirilmiş aort greft, iskeleleri PiPSC başarılı tohum ve farklılaşmasının h...

vasküler kanalların yapımı kardiyovasküler hastalıklar sonucu hasar ve yaralı damarların cerrahi onarımı için bir temel stratejidir. , Alograftlarını, otolog doku (perikard veya safen ven) ve xenografts 1; Bugüne kadar, cerrahide kullanılan greft materyalleri biyouyumlu sentetik polimerler ([Gore-Tex ePTFE] veya polietilen tereftalat [Dacron] politetraflüoroetilen [Teflon], genişletilmiş politetrafloroetilen) içerir. Yapay greftler (örn, Gore-Tex ve Dacron) en sık kullanılan iken, bu malzemeler büyük olasılıkla darlık, kalsiyum birikimi, trombo-embolizasyon ve enfeksiyonlar dahil birçok kısa ve uzun vadeli komplikasyonlara neden. Ile mevcut biyolojik greft olan hastalar tromboembolik olaylar azalmış olsa da, hala bu tür kireçlenme bozulması 2 sayesinde ikincil greft yetmezliği ve kısaltılmış dayanıklılık gibi sınırlamalarla karşılaşabilirler. Bu nedenle, cerrahi t önemli gelişmelere rağmenyaş, araştırmacılar ve klinisyenler üzerinde tekniki hala damar hastalıkları için ideal bir kanal tanımlamak için ihtiyaç yükü vardır. Daha yakın zamanlarda, vasküler doku mühendisliği araştırma alanı hücreleri başarılı aşılama 1 için fonksiyonel gemi özetler bir biomimetic ortamı yaratmak amacı ile, biyolojik olarak parçalanabilen iskeleleri dahil edildiği bir kavram üretti. Temelde, vasküler yapıların başarısı üç temel bileşenleri bağlıdır; yani iskele, bir endotelyal hücre iç tabaka ve bir düz kas hücresi tabakası, ana damar karşılaştırılabilir mekanik özelliklerinin temin edilmesi için uygun olan hücre dışı matris içeren bir iskele ve / regülatör başlatılması için gerekli olan hücre / moleküler sinyali meydana getiren hücreler onarım. Uzun vadeli greft açıklığı ve neo-dokuların sürekli gelişim, inci iskelelerinin etkin hücre tohumlama son derece bağımlı olanereby kritik öneme sahip, hücre tipi kararını hale getirir. Çeşitli raporlar, küçük çaplı devreleri 3-6 geliştirmek için olgun endotelyal ve çeşitli kaynaklardan yumuşak kas hücrelerinin kullanımını göstermektedir. Umut verici olmasına rağmen, yeterli otolog damarların olmaması, olgun endotel ve düz kas hücrelerinin önemli bir yük olarak kalmaktadır elde edildi. Daha yakın zamanlarda, çeşitli kaynaklardan alınan kök hücreler vasküler doku mühendisliği uygulamaları için istismar edilmiştir. Gerçekten de, embriyonik kök hücreler 7 de dahil olmak üzere, kök hücre tipleri, çeşitli uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, kemik iliğinden türetilmiş mononükleer hücreler, 12, mezenkimal kök hücreler 13, endotelyal progenitör hücreler ve erişkin damar duvarı kök türevi hücre antijeni-1 (Sca-1) + 14,15 tanımlanmış tüm ortam yanıt olarak fonksiyonel endotel veya düz kas hücreleri ya da farklılaşma yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir kök / progenitör hücreleri veKültür koşulları. Ayrıca, kök hücrelerin sınırsız kendini yenileme kapasitesi onlara olgun endotel ve sadece büyüme tutuklama ve yaşlanmayı geçiren kez önce sonlu sayıda bölebilirsiniz düz kas hücrelerinin aksine daha aday olun. aşılama gibi biyouyumluluk, biyomekanik özellikleri ve biyolojik ayrışma oranı gibi çeşitli faktörlere bağlıdır için iskele malzemesinin seçimi başarılı doku mühendisliği gemi üretmek için. Temelde, malzeme biyobozunur olmalıdır greft için iskeleler oluşturmak için kullanılan ve gereksiz alıcı bağışıklık yanıtları monte olmaz. Ayrıca, hücre eki ve sonraki yaşam için uygun bir gözeneklilik ve mikro kapsaması gerekir. Bugüne kadar, vasküler doku mühendisliği iskeleleri için kullanılan en yaygın malzeme poliglikolik asit, polilaktik asit, ve poli ε-kaprolakton 16 polimerleri içerir. Daha yakın zamanlarda, decellularized biyolojik maddeler varAyrıca bazı başarı ile uygulanmıştır. Çeşitli laboratuarlar otolog hücreler hücresizleştirilmiş bir insan, köpek veya domuz damarları tohumlama pıhtılaşma ve intimal hiperplazi 17-19 karşı biyolojik bir greft mesafede olduğunu göstermiştir. Vasküler doku mühendisliğinde diğer stratejiler iskele desteği 20, 21 olmadan örneğin hücre dışı matriks proteinleri tabanlı vasküler greft, fibrin jel 13 tohumlama hücreleri ve üreten hücre tabakaları içerir. Mevcut protokol fonksiyonel endotel ve düz kas hücreleri, ağır kombine immün yetmezlik içine doku mühendisliği gemilerin fonksiyonel PiPSC türetilmiş damar hücrelerini liman için decellularized damar iskele oluşan biyoreaktör ve grefti nesil (SCID içine insan PiPSC farklılaşmasını gösteriyor ) fareler. PiPSC bu hücreler farelerde tümörler oluşturur ya da etik zam yok, çünkü damar greft doku mühendisliği için kullanılacak optimum hücre tipi veallo-immün yanıtlar. Ayrıca, biz pip-endotel hücreleri ve tırtıl-düz kas hücrelerinin üretilmesi için strateji verimli ve 10,11 tekrarlanabilir olduğunu göstermiştir. Bundan sonra, biz, böylece aşılama ve hayatta kalma etkinliğini arttırmak, yakından bir yerli geminin içinde var matriks proteinleri taklit etmek PiPSC türetilmiş vasküler hücrelerin tohumlama için bir decellularized gemi tasarladı. Bundan başka, tohumlama PiPSC damarların decellularization makrofajlar gibi bağışıklık hücre tipleri ile monte enflamatuar yanıtların ortaya çıkmasını engellemektedir. Daha da önemlisi, bu protokol sadece insanlar içine çeviri için damar olukları umut oluşturmak için bir metodoloji temsil etmez, aynı zamanda eğitim ve fare modelleri ile vasküler doku yenilenmesini yöneten moleküler mekanizmaları anlamak değerli bir araç sağlar.

<table><tbody><tr><td>İnsan Fibroblastları CCL-153</td><td>ATCC</td><td>CCL-153</td><td>Prenatal insan embriyonik fibroblastları</td></tr><tr><td>ATCC F-12K Ortamı (Kaighn'in Ham'ın F-12 Ortamının Modifikasyonu)</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Embriyonik kök hücreler için optimize edilmiş nakavt DMEM ortamı</td><td>Yaşam teknolojileri (Gibco)</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt Serum Replasman Ömrü</td><td>teknolojileri (Invitrogen)</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Temel FGF-2&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-837</td><td></td></tr><tr><td>alfa-MEM ortamı</td><td>Yaşam teknolojileri (Invitrogen)</td><td>32571093</td><td></td></tr><tr><td>İnsan PDGF</td><td>Ar-Ge D Sistemi</td><td>120-HD-001</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin Çözeltisi% 2</td> <td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)</td> <td>Addgene</td><td>20866</td><td></td></tr> <tr><td>ve nbsp; PvuI Kısıtlama Enzimi</td><td>New England Biolabs</td><td>RO150S</td><td></td></tr><tr><td>SureClean Plus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>Nükleofeksiyon Kiti (NHDF Kiti)</td><td>LONZA</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Neomisin</td><td>SIGMA</td><td>G418</td><td></td></tr><tr><td>KL 1500 LCD, Stereo Mikroskopi için Aydınlatma</td><td>SCHOTT</td><td>KL 1500 LCD</td><td>Stereo mikroskopi</td></tr> <tr><td>için soğuk ışık aydınlatmasıNikon Zoom Steromikroskop SMZ800</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>%10 SDS Stok Çözelti Moleküler Biyoloji Reaktifi</td><td>Severn Biotech</td><td>CAS 151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (10mg/ml)</td><td>BD</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalayıcı IKA Vibrax Çalkalama platformu VX 7&nbsp;</td><td>Jepson Bolton'ın, Janke& Kunkel</td><td>S32-102</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Dijital Pompa Tahriki</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 6 kanallı, 6 silindirli kartuşlu pompa kafası</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-15</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S pompa kafası için büyük kartuşlar</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-75</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex platinle kürlenmiş silikon pompa hortumu, L/S 14, 25 ft</td><td>Cole-Parmer&nbsp;</td><td>WZ-96410-14</td><td>Boru peristaltik pompadan geçer</td></tr><tr><td>0,5 mm ID, 0,8 mm OD Silikon Boru</td><td>SILEX</td><td>N/A</td><td>Borular inkübasyon odasını, ortam rezervuarını ve uyumluluk odasını birbirine bağlar;</td></tr><tr><td>Montaj Redüktörü 0,5 ila 1,6, doğal Polipropilen</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td>Adaptör iki tip boruyu birbirine bağlar</td></tr><tr><td>1/32 "Boru, ID 0.01" (250 & mikro; m) Malzeme: PEEK</td><td>LabSmith</td><td>T-132-010P</td><td>Grefti dış boruya bağlayan inkübasyon odası duvarından</td></tr> geçen Boru <tr><td>Tek Parça Bağlantı Parçaları&nbsp;</td><td>LabSmith</td><td>T-132-100</td><td>Yukarıdaki boruları kuluçka odası duvarından sabitleyin</td></tr><tr><td>Naylon tüpler (OD 0,9 mm, ID 0,75 mm)&nbsp;</td><td>Smiths Medical</td><td>N/A</td><td>Tüpleri, aort greft NOD'unun iki ucuna yerleştirilir</td></tr><tr><td>. CB17-Prkdcscid/NcrCrl fare</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi sütürler, 8-0&nbsp; ipek</td><td>ETHICON</td><td>W819</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>Vetapharm</td><td>Vm21757/4000</td><td>Farelerde kullanım için nöroleptanaljezik</td></tr><tr><td>Hypnovel (Midazolam)</td><td>Roche</td><td>59467-70-8</td><td>Anestezi indüksiyonu</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Naylon Boru</td><td>Portex LTD</td><td>800/200/100/200</td><td>0,65 mm çapında ve 1 mm uzunluğunda; arter manşet yapmak için</td></tr><tr><td>Elektrokoagülatör</td><td>Martin&nbsp;</td><td>SN 54.131</td><td>Aort</td></tr><tr><td>Bipolar mikro hemostat forsepslerinde</td> arter dallarının bağlanması <td>Martin</td><td>80-91-12-04</td><td>Damar uçlarının fiksasyonu</td></tr><tr><td>Damar Dilatör</td><td>S & T</td><td>JFX-7</td><td></td></tr><tr><td>Damar Dilatör</td><td>S & T</td><td>JFL-3dZ</td><td></td></tr><tr><td>Damar Dilatör</td><td>S & T</td><td>D-5aZ</td><td></td></tr><tr><td>Mini uygulayıcı ve nbsp;</td><td>AESCULAP</td><td>FE572K Mikro</td><td></td></tr><tr><td>kanama durdurucu klipsleri</td><td>AESCULAP</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi sütürler, 6-0 VICRYL</td><td>ETHICON</td><td>V489</td><td></td></tr></tbody></table>

bir fare modeli doku mühendisliği kapların Üretimi ve tırnak

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Vasküler kanalların inşası, kardiyovasküler hastalıklardan kaynaklanan hasarlı ve yaralı damarların cerrahi onarımı için temel bir stratejidir. Mevcut protokol, insan fibroblastlarından kısmen indüklenmiş pluripotent kök hücre (PiPSC) kullanılarak fonksiyonel doku mühendisliği yapılmış damar greftlerinin oluşturulabileceği verimli ve tekrarlanabilir bir strateji sunmaktadır. Farelere aşılamadan önce PiPSC-endotel hücrelerinin veya düz kas hücrelerinin tohumlanması için, doğal bir damar içinde bulunan matris protein yapısını ve kan akışını yakından taklit eden hücrelerden arındırılmış bir damar iskele biyoreaktörü tasarladık. Bu yaklaşımın avantajlı olduğu gösterilmiştir, çünkü PiPSC'den türetilmiş greftlerle aşılanan bağışıklık eksikliği olan fareler, ameliyattan 3 hafta sonra belirgin şekilde artmış sağkalım oranı ile sunulmuştur. Bu protokol, yakın gelecekte rejeneratif tıp, doku mühendisliği ve potansiyel olarak hastaya özgü hücre tedavisi için değerli bir araçtır.

PiPSC başarılı üretimi 4 transkripsiyon faktörleri, Oct4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) taşıyan bir doğrusallaştırılmış pCAG2LMKOSimO plazmitle insan fibroblastları nucleofecting 4 gün sonra doğrulanmıştır. PiPSC fibroblastlar (Şekil 2A) ile karşılaştırıldığında belirgin bir şekilde farklı bir fenotipini gösterdi ve mRNA (Şekil 2B) ve protein (Şekil 2C) seviyelerinin 10 4 yeniden programlama faktörleri olarak ifade edilmiştir. Bir PiPSC tabanlı vasküler greft et...

Burada, biz çift tohumlama kısmen uyarılmış pluripotent kök hücre ile farelere aşılama için fonksiyonel doku mühendisliği gemi greft oluşturmak için bir protokol mevcut (PiPSC) - Bir decellularized damar iskele biyoreaktör üzerinde elde edilen endotel hücreleri - düz kas hücreleri ve PiPSC türetilmiş.

Bir Fare Modeli Doku mühendisliği Kapların Üretimi ve Tırnak

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Bu prosedürün genel amacı, farelere nakledilmeye uygun, fonksiyonel doku mühendisliği damar greftleri oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle insan fibroblastlarının in vitro ortamda, endotel ve düz kas hücrelerine diferansiye olabilen kısmi indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, kurban edilen bir fareden aort çıkarılır ve deselülerize aort greftlerini hazırlamak için sodyum dodesil sülfat veya SDS çözeltisi ile deselülerizasyon işlemi uygulanır.Ardından, biyoreaktör akış devresi, kısmen indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin çift ekimi için kurulur. Son adım, çift ekimli, kısmen indüklenmiş pluripotent kök hücre greftinin farelere nakledilmesidir. Nihayetinde, nakilden üç hafta sonraki fare mortalite oranlarının analizi, doku mühendisliği ile üretilen damar greftlerinin işlevselliğini göstermek için kullanılır.Bu tekniğin etkileri, PIPS hücrelerini kullanarak kısa sürede fonksiyonel kan damarlarının başarıyla oluşturulabildiği gösterildiğinden, kardiyovasküler hastalıkların tedavisine kadar uzanmaktadır. Genel olarak, özellikle bu yöntemde yeni olan kişiler için, tüm işlem boyunca damar greftini sağlam ve steril tutmak çok önemlidir. Bu prosedüre, insan dermal fibroblast nükleer affeksiyon kiti kullanarak, hücreleri dört mikrogram lineerize OSKM plazmidi ile transfekte ederek insan fibroblastlarının kısmi uyarılmış pluripotent kök hücrelere veya PIPS hücrelerine yeniden programlanmasıyla başlayın.İnsan fibroblastları, dört günlük yeniden programlamanın ardından PIPS hücrelerine dönüşür. Farelerin boyun dislokasyonu ile sakrifiye edilmesini takiben, fareyi bir diseksiyon mikroskobu altında sırt üstü pozisyonda yerleştirin.Ardından sternumu ve göğüs kafesinin çevresini keserek torasik boşluğu açın. Aortu açığa çıkarmak için kalbi, akciğerleri ve özofagusu çıkarın ve ardından peri aort yağını pensle nazikçe temizleyin. Aortu anterior ucundan makasla kesin ve ucu küt uçlu pensle nazikçe tutun.Ardından, aorta arkadaki omurga sütunundan künt diseksiyonla ayırın. Aortadan ayrılan tüm dallanan arterleri, bipolar elektrokoagülatör ile ligasyon yaparak ve ligasyonun ucundan makasla keserek dikkatlice kapatın. Aorta lümenini 100 unit heparin içeren üç mililitre salin solüsyonu ile yıkamak için beş mililitrelik bir şırınga kullanın.Kan pıhtısı oluşumunu önlemek için, aortanın renal arterlere ayrılmadan önceki posterior ucunu kesin. Tüm prosedür boyunca aortanın bütünlüğünü korumak çok önemlidir. Ardından, aorta lümenini beş mililitre 0.075 ile yıkayın.Fosfat tamponlu tuzlu su veya PBS içerisinde seyreltilmiş sodyum dodesil sülfat veya SDS çözeltisi kullanılarak, sıçan aortu 10 santimetrelik bir petri kabı içinde %0,075'lik SDS çözeltisinde, oda sıcaklığında, orbital çalkalayıcıda 150 RPM'de iki saat boyunca bekletilir. Ardından aort lümeni 5 ml PBS ile yıkanır. Sonrasında aort, 10 santimetrelik bir petri kabındaki PBS içerisinde, oda sıcaklığında, orbital çalkalayıcıda 150 RPM'de iki saat boyunca bekletilir.İki saat sonra her 20 dakikada bir PBS yenilenir. Aort lümeni beş mililitre PBS ile yıkanır. Başlamak için, biyoreaktör akış devresini metin protokolünde açıklandığı şekilde kurun.Ardından, aortayı oda sıcaklığında, orbital sarsıcı üzerinde, 10 santimetrelik bir Petri kabı içerisinde bir saat boyunca 50 RPM'de diferansiyasyon medyumunda bekleterek deselülarize damarı kültür medyumu ile yeniden koşullandırın. Mikroskop altında deselülarize damarın her iki ucuna bir santimetre uzunluğunda naylon tüpler yerleştirin. Daha sonra damarı ve tüpleri sekiz sıfır ipek sütürlerle bağlayın.Naylon tüpleri oda duvarındaki giriş ve çıkış portlarına bağlayarak deselülarize aorta greftini inkübasyon odasında birleştirin. İnkübasyon odasını her seferinde beş mililitre besiyeri ile muhafaza edin. Ardından, önceden ısıtılmış tripsin ekleyerek PIPS hücrelerini tripsinizleyin.Kültür kabını kapatın ve kabı 10 kez hafifçe sallayın. Pipet uçlarını atın ve kabı iki ila üç dakika boyunca inkübatörde bekletin. Ardından kaba önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin ve ortamı hücrelerle karıştırın.Ardından, hücre sayısını bir hemositometre santrifüjü kullanarak sayın. Her biri yarım milyon hücre içeren iki hücre süspansiyonu alikotunu beş dakika boyunca 300 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatanttan sonra, PIPS hücre peletlerinden birini tamamen resüspande edin. 50 µL dm içinde, hücre süspansiyonunu deselülarize edilmiş damar lümenine enjekte edin.Ardından, diğer PIPS hücre peletini 100 µL matrigel içinde resüspande edin. Karışımı deselülerize aorta grefti üzerine dikkatlice pipetleyiniz. Karışım jel benzeri bir hale gelene ve damarın dış yüzeyini eşit şekilde sarana kadar 10 ila 15 dakika bekleyin.Bu aşamada, inkübasyon odasını dm ile oluşturun. Biyoreaktör düzeneğinin tamamını 37 °C'de %5 karbondioksit içeren bir inkübatöre yerleştirin. Ardından, medya rezervuarı ile uyum odası (compliance chamber) arasında bağlı olan tüpleri peristaltik pompaya yerleştirin.İnkübatörde. Hücrelerin tutunmasını sağlamak için kültürü 12 saat boyunca statik durumda beklettikten sonra, ilk iki saat boyunca deselülerize grefti her yarım saatte bir uzunlamasına eksen etrafında 90 derece manuel olarak döndürün. Düz kas hücresi diferansiyasyonunu indüklemek için peristaltik pompa aracılığıyla lümenden DM verin. Başlangıç akış hızını dakikada beş mililitre olarak ayarlayın.Ardından, dolaşım ortamı akış hızını 24 saat boyunca 20 mililitre/dakika seviyesinde tuttuktan sonra, 24 saat boyunca dakikada 20 mililitre şeklinde kademeli bir artış uygulayın, ortam akışını durdurun ve biyoreaktörü inkübatörden çıkarın. Sonra, tripsin sayımı ve santrifüjleme yoluyla 1 milyon PIPS hücresi kullanarak greft lümenini PIPS hücreleri ile yeniden doldurun. Daha önce olduğu gibi, hücreleri 50 mikrolitre endotelyal büyüme ortamında yeniden süspanse edin.Mililitrede 50 nanogram vasküler endotelyal büyüme faktörü içeren iki adet. Ardından, hücre karışımını greft lümenine enjekte edin. Endotelyal diferansiyasyonu indüklemek için inkübasyon odasındaki ve tüm dolaşımdaki besiyerini VEGF içeren e GM iki ile değiştirin.Biyoreaktör düzeneği inkübatöre geri taşındıktan sonra, ilk iki saat boyunca grefti her yarım saatte bir manuel olarak 90 derece döndürün ve ardından 12 saat boyunca statik kültürde tutun. 12 saat sonra, dakikada beş mililitre ile başlayarak kademeli artışla dakikada 35 mililitreye ulaşacak şekilde sirkülasyon akışını başlatın ve ardından akış hızını beş gün boyunca dakikada 35 mililitrede tutun. Daha sonra, naylon tüplerin uçlarını keserek mühendislik ürünü grefti ortaya çıkarın.Alıcı fare anestezi altındayken, fareye greftleme hazırlığı için taze e GM two medyum içeren bir Petri kabını temel alın. Fareyi, boynu tıraşlanmış ve uzatılmış şekilde sırt üstü pozisyonda sabitleyin. Beş ila 10 kat büyütmeli bir diseksiyon mikroskobu altında, farenin alt çenesinden sternumuna kadar orta hat üzerinden bir insizyon hazırlayın.Sağ submandibüler bezleri yan tarafa kaldırın ve sağ gleno-mastoid kası çıkarın. Sağ ortak karotis arterini açığa çıkarmak için, arterin distal ucundan proksimal ucuna doğru mobilizasyon sağlamak amacıyla yapışık dokuları nazikçe uzaklaştırın. Ortak karotis arterinin orta kısmını sekiz sıfır ipek sütür ile iki kez bağlayın ve iki bağ arasında disseksiyon yapın. Her bir damarın içinden otoklavlanabilir naylon tüpten yapılmış bir manşet geçirin.Uçları belirleyin ve her bir ucu mikro hemostat klempleriyle sabitleyin. Ardından, bir uçtaki sütür bağlarını çıkarın ve hemen ardından bir damla heparin uygulayın. Arterin distal ucunu, tüm manşet gövdesini örtecek şekilde ters çevirin ve ters çevrilmiş damarı sekiz sıfır ipek sütür ile manşete sabitleyin.Aynı prosedür arterin diğer bölümüne de uygulandıktan sonra, kan pıhtılarını uzaklaştırmak için arteri salin solüsyonu ile yıkayın. Ardından, deselülize damar uçlarını arter manşetinin üzerine kaydırarak ve 8-0 ipek sütürlerle sabitleyerek, karotis arterinin iki ucu arasına deselülize bir damar grefti implante edin. Greftin pulsasyonunu değerlendirmeden önce her iki uçtaki vasküler klempleri kaldırın ve ardından sağ submandibular bezi orijinal konumuna geri yerleştirin.Cerrahi bölgedeki deri, 6/0 prolaktin sütür kullanılarak ayrı ayrı dikişlerle kapatılır. Cerrahi sonrası bakıma, metin protokol temsilcisinde açıklandığı şekilde devam edin. İnsan fibroblastlarının PIPS hücrelerine yeniden programlanmasından dört gün sonraki morfolojisi burada gösterilmektedir.PIPS hücreleri, fibroblastlarla karşılaştırıldığında belirgin şekilde farklı bir fenotip sergiledi. Beklendiği üzere, iki saatlik SDS uygulamasıyla aortun tamamen deselülerizasyonu sağlandı. Bunun sonucunda, deselülerize edilmiş aort, taze olarak alınan bir aortla karşılaştırıldığında yarı saydam, aselüler bir iskele görünümündeydi.PIPS hücrelerinin deselülarize aort içine çift aşılımlı ekilmesiyle birlikte, mühendislik ürünü vasküler greftler, deselülarize damar greftlerinden farklı olarak endotelyal ve düz kas hücresi özellikleri sergilemektedir. Bu durum burada, endotelyal hücreler için yeşil boyama ve düz kas hücreleri için kırmızı boyama ile görselleştirilmiştir. PIPS hücreli damar greftleri nakledilen fareler, beklendiği üzere transplantasyondan üç hafta sonra %60'lık bir sağkalım oranı göstermiştir.Deselülerize damarların greftlendiği farelerde, gelişimden hemen sonraki birinci günde bile belirgin şekilde daha yüksek mortalite oranları görülmüştür. Bu teknik, kardiyoloji alanındaki araştırmacıların, fonksiyonel doku mühendisliği vasküler kanallar oluşturmada PIPS hücrelerinin ve deselülerize damar greftlerinin kullanımını keşfetmelerine olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, deselülerize damar greftinin nasıl hazırlanacağı, biyoreaktörün nasıl kurulacağı ve yeniden hücrelendirilmiş greftin farelere nasıl implante edileceği konusunda kapsamlı bir anlayış kazandığınızı umuyorum.

generation-and-grafting-of-tissue-engineered-vessels-in-a-mouse-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bir fare abdominal aort bir bölüm sadece bir allojenik veya sinjenik alıcı olarak renal arterler aşağıda orthotopically transplante edildiği bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, birörnek büyük arter nakli avantajlı olarak kabul edilir olan çalışmalarda yararlı olabilir.

Damar Hastalığı Çalışmaları Farelerde Ortotopik Aort Nakli

Biz fare greft arteriosclerois (GA) aynı doğuştan gerginlik bir alıcıya bir fare damar segmentinin interpozisyonu içeren modeller için protokolleri tarif. Damar donör içine ek genetik değişiklikler geri melezlenmesine tarafından, model GA belirli genlerin etkisini değerlendirebilir.

Greft damar sertliği için fare modelleri

Sıçangil modeli servikal kalp nakli immünolojik hem de iskemi reperfüzyon yaralanması çalışmasından için uygundur. Biz olmayan bir dikiş manşet tekniği kullanılarak prosedür değiştirilmiş ve bu yaklaşım ile 1.000 'den fazla başarılı nakli gerçekleştirildi.  Burada, videoyu tamamlamak için bu tekniğin ek ayrıntıları.

Modifiye Manşet Tekniği Sıçangiller Servikal Kalp Nakli Modeli

Hücresel ve moleküler neotissue oluşumu hakkındaki bilgi geliştirmek için, TEVG bir fare modeli yakın zamanda geliştirilmiştir. Greftler C57BL / 6 farelerinde Infrarenal vena kava araya girme greft olarak implante edildi. Bu model bizim klinik araştırmada elde edilenlere benzer sonuçlar elde, ama çok kısaltılmış zaman zarfında.

Fare Modeli Inferior Vena Cava İnterpozisyon Greft İmplantasyonu

Kombine katı organ ve vaskülarize kompozit allotransplantasyonu incelemek için, servikal dikişsiz manşet tekniği kullanarak farelerde yeni bir heterotopik en blok göğüs duvarı, timus ve kalp nakli modelini açıklıyoruz.

Farelerde A Novel Mikrocerrahi Heterotopik Modeli, En Bloku Göğüs Duvarı, Thymus ve Kalp Nakli

Biz farelerde kol tekniği kullanarak bir orthotopic aort nakli modeli mevcut. Bu damar hastalığı çalışmalarda istihdam bir çok hızlı anastomoz yöntemdir.

Kol tekniği aort transplantasyonu - eğitici bir Video bir fare Model kullanma

Greft stenoz mühendislik doku hava yolu değiştirme kritik bir engel teşkil etmektedir. Stenoz temel hücresel mekanizmaları araştırmak için bir fare modeli doku Mühendisliği trakeal değiştirme numaralı seribaşı kemik iliği mononükleer hücreler (BM-MNC) kullanmaktadır. Burada, iskele imalatı, BM-MNC yalıtım, greft tohum ve implantasyon dahil olmak üzere bizim Protokolü ayrıntılı.

Tohum ve bir biyosentetik doku Mühendisliği trakeal greft bir fare modeli implantasyonu

Burada servikal mürin modelinde sütür olmayan manşet tekniği ni kullanarak farelerde heterotopik aort transplantasyonu protokolünü salıyoruz. Bu model kronik allogreft vaskülopatinin (CAV) altta yatan patolojisini incelemek için kullanılabilir ve oluşumunu önlemek için yeni terapötik ajanların değerlendirilmesine yardımcı olabilir.

Modifiye Dikişsiz Manşet Tekniği Kullanılarak Murine Servikal Aort Transplantasyon Modeli

Fare kardiyak transplantasyon modelleri, transplantasyon immünolojisini incelemek için değerli araştırma araçlarını temsil etmektedir. Mevcut protokol, laminer kan akışına izin vermek için alıcının ortak karotis arterine ve donörün pulmoner arter gövdesine manşetlerin yerleştirilmesini içeren fare heterotopik servikal kardiyak transplantasyonunu detaylandırmaktadır.

Vasküler Manşetler Kullanılarak Fare Heterotopik Servikal Kardiyak Transplantasyonu

Burada, doku mühendisliği yapılmış bir vasküler greftin manşet tekniği kullanılarak fare karotis arterine implantasyonu için bir protokol sunulmakta ve vasküler doku rejenerasyon mekanizmalarının araştırılması için uygun bir hayvan modeli sağlanmaktadır.

Fare Karotis Arterine Manşet Tekniği ile Doku Mühendisliği Yapılmış Vasküler Greft İmplantasyonu

Bu çalışma, femoral arterlerdeki küçük çaplı greftleri değerlendirmek için bir domuz modeli sunmaktadır. Model, insan vasküler dinamiklerini taklit eder ve greft açıklığını, hemodinamiği ve vasküler yeniden şekillenmeyi kapsamlı bir şekilde değerlendirir. Vasküler greftleri test etmek ve Doppler ultrason ve anjiyografi ile izlemek için değerli bir platform sunar.

Küçük çaplı vasküler greftleri test etmek için bir domuz modelinde femoral vasküler greft implantasyonu

Öğrenin fare modelinde doku mühendisliği damar greftleri üretmeyi; PiPSC'lerin çift tohumlanması ve biyoreaktör kullanımıyla fonksiyonel greftler geliştirilir. Bu yöntem rejeneratif tıpta vasküler onarım için umut vadeder.

Bir Fare Modeli Doku mühendisliği Kapların Üretimi ve Tırnak

Daha fazla video keşfet